Auswahl der Methoden

Für die Untersuchung der Serumproben wurde ein kommerziell erhältlicher ELISA, basierend auf der Detektion von YOPs, verwendet. Die Kodierung für diese Proteine liegt auf einem 70 kb großen Virulenzplasmid, das nur bei pathogenen Yersinia spp.

(Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis) zu finden ist (CORNELIS et al.

1998). Dadurch sind Kreuzreaktionen mit apathogenen Spezies unwahrscheinlich (HEESEMANN et al. 1987). In der vorliegenden Studie wird davon ausgegangen, dass die Antikörpernachweise auf einer Infektion mit Y. enterocolitica beruhen, da Y. pestis als Erreger der Pest in Europa nicht vorkommt und Y. pseudotuberculosis, obwohl auch zu den enteropathischen Yersinia spp. gehörend, eher in Nordosteuropa beobachtet wird. So wurde in den Tonsillen finnischer Mastschweine von einer mittleren Prävalenz von 4% berichtet (NISKANEN et al. 2002).

Untersuchungen in Deutschland zum Vorkommen von Y. pseudotuberculosis beim Schwein sind selten. 1981 konnte aus fünf Kotproben von 631 klinisch gesunden Schweinen Y. pseudotuberculosis isoliert werden (WEBER u. LEMBKE 1981).

Aufgrund dessen wurde eine Infektion des Bestandes mit Y. enterocolitica angenommen, untermauert durch die bakteriologischen Nachweise des Erregers, auch wenn eine (Ko-)Infektion mit Y. pseudotuberculosis nicht ausgeschlossen werden konnte.

In einer Studie konnte nach künstlicher Infektion von fünf bis sieben Wochen alten Minipigs mit dem Serotyp O:3 mithilfe des auch in der vorliegenden Untersuchung eingesetzten Testverfahrens eine Antikörperentwicklung zwischen dem 7. und 14.

Tag beobachtet werden, während alle mit Serotyp O:8 infizierten Schweine seronegativ blieben (SCHAAKE et al. 2014). Zu den anderen Serotypen gibt es bislang keine vergleichbaren Untersuchungen mit dem verwendeten Testsystem, so dass über die Aussagekraft bei entsprechenden Infektionen keine Angaben möglich sind. Laut Hersteller macht der Test keine Unterschiede zwischen den einzelnen Serotypen. Durch den gleichzeitigen bakteriologischen Nachweis von

Y. enterocolitica Serotyp O:3 kann jedoch davon ausgegangen werden, dass die Antikörperaktivitäten auf einer Infektion mit diesem Serotyp beruhten.

5.1.4.2 Bakteriologie

Ein Ziel dieser Studie war die Bestimmung des Infektionszeitpunktes der Ferkel mit Y. enterocolitica. Daher wurden diese ab ihrer Geburt regelmäßig untersucht. Dies erfolgte neben der serologischen Überwachung mittels kultureller Methoden, kombiniert mit einer PCR. Kulturelle Methoden weisen im natürlichen Probenmaterial eine eingeschränkte Sensitivität und somit niedrigere Nachweisraten auf (NESBAKKEN et al. 1991). FREDERIKSSON-AHOMAA und KORKEALA (2003) halten ineffektive Isolierungsmethoden für den Hauptgrund niedriger Nachweisraten pathogener Y. enterocolitica in vielen Studien. Sie schlussfolgerten, dass Anreicherungsmedien nicht selektiv genug sind und außerdem Stoffe enthalten, die bestimmte pathogene Stämme im Wachstum hemmen und somit andere, in erster Linie den Bioserotyp 4/O:3, favorisieren. PCR-Methoden ermöglichen demnach eine bessere Beurteilung des Vorkommens von pathogenen Y. enterocolitica in klinischem Untersuchungsmaterial, Lebensmittel- und Umweltproben. Vor allem der Fortschritt in der Real-Time-PCR ließe nach FREDRIKSSON-AHOMAA u.

KORKEALA (2003) zukünftig auf bessere, weniger störanfällige, automatisierte Nachweismethoden hoffen. Solche Methoden standen für das in dieser Arbeit verwendete Probenmaterial zum Zeitpunkt der Studie im entsprechenden Labor jedoch nicht zur Verfügung. Aus anderen Arbeiten und vorangegangenen Voruntersuchungen bestanden allerdings gute Erfahrungen mit der kulturellen Methode und anschließender PCR.

Da unter natürlichen Bedingungen nur von einer geringen Anzahl des Erregers und einer großen Zahl an Begleitflora im Probenmaterial auszugehen ist (FREDRIKSSON-AHOMAA u. KORKEALA 2003), wurde keine direkte Isolierung, sondern ein Anreicherungsschritt vor dem Ausstrich auf CIN-Agar vorgenommen.

Dieses Vorgehen brachte gleichzeitig den Vorteil, dass nur lebende,

vermehrungsfähige und potentiell infektiöse Erreger weiter untersucht und in der anschließenden PCR nachgewiesen wurden.

Eine Anreicherung ist bei symptomlosen Trägern im Regelfall immer nötig, während bei Patienten mit akuter Diarrhöe, bedingt durch die sehr hohe Ausscheidungsrate, ein direkter Ausstrich ausreicht (ALEKSIC u. BOCKEMÜHL 1999). Da unter den natürlichen Bedingungen im Bestand nicht von einem hohen Erregeraufkommen auszugehen war (FREDRIKSSON-AHOMAA u. KORKEALA 2003), wurde eine Voranreicherung der Tupferproben in ITC-Bouillon vorangestellt. Eine selektive Voranreicherung in ITC-Bouillon oder MRB ist, vor allem bei Tonsillen- und Lymphknotenproben, der Kälteanreicherung überlegen (DE BOER u. NOUWS 1991, FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2001a). Ein weiterer Vorteil der Voranreicherung ist der geringere Zeitaufwand gegenüber der Kälteanreicherung.

Es kann allerdings nicht ausgeschlossen werden, dass durch diesen Schritt eine Selektion Richtung Serotyp O:3 erfolgt, da das Anreicherungsmedium speziell für die Isolation dieses in Europa am häufigsten vorkommenden Serotyps entwickelt wurde (FREDRIKSSON-AHOMAA u. KORKEALA 2003). Schlechte Nachweisraten für den Serotyp O:9 sind mit ITC-Bouillon erwiesen (DE ZUTTER et al. 1994). Der alleinige Nachweis von Y. enterocolitica O:3 in der vorliegenden Arbeit scheint dieses zu bestätigen. Fraglich ist jedoch, ob überhaupt andere Serotypen im Bestand und bei diesen Tieren vorkamen, denn Y. enterocolitica 4/O:3 wurde bislang am häufigsten aus Schweinen oder deren Produkten isoliert (FREDRIKSSON-AHOMAA u.

KORKEALA 2003).

In eigenen Voruntersuchungen mit verschiedenen Voranreicherungen und Nährböden erwies sich die Kombination von ITC-Bouillon, Ausstrich auf CIN-Agar, gefolgt von der anschließenden Bestätigung verdächtiger Kolonien durch Oxidasenachweis, Kligler-Eisen-Nährboden, Urease-Nachweis und abschließender Objektträgerschnellagglutination und ail-Nachweis per PCR als zuverlässigste Methode und erbrachte die höchsten Nachweisraten. Ähnliche Methodik wurde auch in anderen Untersuchungen verwendet (GÜRTLER et al. 2005, BOWMAN et al.

2007). Eine Selektion Richtung Serotyp O:3 und auch eine möglichen Inhibition der späteren PCR durch das Voranreicherungsmedium, bei ITC-Bouillon durch das

enthaltende Magnesiumchlorid, konnte damit nicht ausgeschlossen werden. Um Fehler oder Kontaminationen bei den einzelnen Arbeitsschritten zu erkennen, wurden stets Positiv- und Negativ-Kontrollen mitgeführt und nach entsprechenden Laborstandards gearbeitet.

Auch wenn durch die Methodenwahl in der aktuellen Studie nicht ausgeschlossen werden konnte, dass weitere Serotypen vorkamen und diese durch die Selektion der Voranreicherung unterdrückt und somit nicht isoliert wurden, deuten die beobachtete Antikörperbildung nach vorausgegangenem Erregernachweis sowie die herausragende Nachweisrate des Serotyps O:3 generell beim Schwein auf das Vorkommen dieses Serotyps hin.