Aus dem Zentrum für Anatomie
Abteilung Funktionelle und Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover
angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung
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Veränderungen der Zellzusammensetzung und des Zytokinmusters in der Milz nach der Resektion der mesenterialen Lymphknoten und
nach gleichzeitiger Gabe von Cholera-Impfstoff
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Nadja Thiessen aus Perewolozk/Orenburg
Hannover 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 20.07.2009
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. Reinhard Pabst
Referent: Prof. Dr. Heike Nave Korreferent: Prof. Dr. Torsten Witte
Tag der mündlichen Prüfung: 20.07.2009
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Ernst Ungewickell Prof. Dr. Peter Claus Prof. Dr. Roland Jacobs
Meinen Eltern in Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... 4
1. Einleitung ... 6
1.1 Das Immunsystem ... 6
1.1.1 Darstellung der angeborenen und erworbenen Immunantwort ... 6
1.1.2 Einteilung des lymphatischen Systems ... 7
1.1.3 Das Immunsystem der Schleimhaut ... 8
1.1.4 Ablauf einer Immunantwort ... 9
1.1.4.1 Die Rolle der Dendritischen Zellen ... 9
1.1.4.2 Die Rolle der T-Lymphozyten ... 10
1.1.4.3 Die Rolle der B-Lymphozyten ... 10
1.1.5 Funktionelle Einteilung der peripheren lymphatischen Organe ... 12
1.1.5.1 Aufbau eines Lymphknotens ... 12
1.2 Besonderheit der mesenterialen Lymphknoten ... 13
1.2.1 Neue Erkenntnisse durch mLK-Resektion ... 14
1.2.2 Spezifische Immunantwort nach Impfstoffgabe ... 14
1.3 Warum kommt die Milz in Frage? ... 16
1.3.1 Aufbau der Milz ... 17
1.3.2 Die angeborene Immunantwort in der Milz ... 18
1.3.3 Die erworbene Immunantwort in der Milz ... 19
1.4 Fragestellungen ... 20
2. Methoden ... 21
2.1 Versuchstiere ... 21
2.1.1 Die Narkose ... 21
2.1.2 Kontrolltiere ... 21
2.1.3 Behandelte Tiere ... 22
2.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) ... 23
2.2.1 RNA-Isolierung aus Gewebe ... 23
2.2.2 Reverse Transkriptase (RT)-PCR ... 24
2.2.3 PCR ... 24
2.2.4 Gelelektrophorese ... 25
2.2.5 Real-time PCR ... 25
2.3 Histochemie ... 26
2.3.1 Herstellen der histologischen Schnitte ... 26
2.3.2 Oberflächenfärbung und Anti-BrdU-Darstellung ... 27
2.4 Durchflusszytometrie ... 28
2.4.1 Probenvorbereitung ... 28
2.4.1.1 Herstellung der Zellsuspension ... 28
2.4.1.2 Zellzahlbestimmung... 29
2.4.2 Darstellung von Adhäsionsmolekülen und Aktivitätsmarkern auf den Subpopulationen der T-Lymphozyten (Dreifarbenfluoreszenz) ... 29
2.4.3 Färbung der B-Lymphozyten (Dreifarbenfluoreszenz) ... 30
2.4.4 Färbung der Dendritischen Zellen (Vierfarbenfluoreszenz) ... 30
2.4.5 Darstellung der Zellzusammensetzung in den mLK (Dreifarbenfluoreszenz) ... 31
2.5 Auswertung ... 31
2.5.1 Auswertung der Durchflusszytometrie ... 31
2.5.2 Auswertung der Histologie ... 31
2.5.3 Auswertung der Real-time PCR... 32
3. Ergebnisse ... 33
3.1 Versuche ... 33
3.1.1 Resektion der mesenterialen Lymphknoten ... 33
3.1.2 Körper- und Milzgewicht nach vier Wochen ... 34
3.1.3 Bestimmung der Zellzahl der unbehandelten Milz... 35
3.1.4 Prozentualer Anteil der mLK am Körpergewicht ... 36
3.2 Einfluss der Cholera-Impfstoffgabe auf die mLK ... 36
3.2.1 Zellzusammensetzung der mLK bei den Scheinoperierten ... 36
3.2.2 Aktivitätsstatus der mLK in der Histologie ... 37
3.3 Untersuchung der Zellpopulationen im Durchflusszytometer ... 38
3.3.1 Die Zusammensetzung der Subpopulationen der T-Lymphozyten änderte sich nicht .... 38
3.3.2 Der Einfluss der mLK-Resektion auf die B-Lymphozyten ... 39
3.3.3 Einfluss der mLK-Resektion auf die Dendritischen Zellen ... 41
3.3.4 Der Phänotyp der CD4+ Lymphozyten ... 43
3.3.5 Der Phänotyp der CD8+ Lymphozyten ... 46
3.4 Darstellung der lymphatischen Organe in der Immunhistologie ... 49
3.4.1 Histologische Veränderungen in der Milz der Kontrollgruppe ... 49
3.4.2 Histologische Veränderungen in der Milz der behandelten Gruppe ... 51
3.4.3 Einfluss der mLK-Resektion auf die peripheren lymphatischen Organe ... 52
3.5 Auswertung der Real-time PCR ... 53
4. Diskussion ... 54
4.1 Veränderungen durch die Resektion der mLK auf die Milz ... 54
4.1.1 Resektion erhöht den Gehalt der Dendritischen Zellen in der Milz ... 54
4.1.2 T-Lymphozyten erfahren keine Veränderungen ... 55
4.1.3 Migration und Aktivierung der B-Lymphozyten nehmen zu ... 56
4.1.4 Das Zytokinmilieu ändert sich nicht durch die Resektion ... 58
4.2 Die Wirkungen des Impfstoffs in der behandelten Gruppe ... 59
4.2.1 Die Wirkung des Impfstoffs auf die mLK der Scheinoperierten ... 59
4.2.2 Die Wirkung des Impfstoffs auf die Milz ... 60
4.2.3 Folgen der mLK-Resektion in der Milz bei den behandelten Tieren ... 62
5. Zusammenfassung ... 64
6. Anhang ... 66
6.1. Materialverzeichnis ... 66
6.1.1 Geräte und Laborbedarf ... 66
6.1.2 Puffer, Medien und Materialien ... 67
6.1.2.1 Gewebeaufreinigung ... 67
6.1.2.2 Reverse Transcriptase PCR ... 67
6.1.2.3 PCR ... 67
6.1.2.4 Agarosegel ... 68
6.1.2.5 Real-time PCR ... 68
6.1.2.6 Histochemie ... 68
6.1.2.7 Histochemie / BrdU-Färbung ... 68
6.1.2.8 Zellsuspension ... 69
6.1.2.9 Durchflußzytometrie ... 69
6.1.3 Antikörper ... 69
6.1.3.1 Primäre Antikörper... 69
6.1.3.2 sekundäre Antikörper, Enzyme und Substrate ... 71
6.1.4 Zytokine ... 72
6.2 Abkürzungsverzeichnis ... 73
6.3 Literaturverzeichnis ... 75
6.4 Abbildungsverzeichnis ... 81
6.5 Tabellenverzeichnis ... 82
7. Erklärung ... 83
8. Lebenslauf ... 84
9. Danksagung ... 85
1. Einleitung
1.1 Das Immunsystem
1.1.1 Darstellung der angeborenen und erworbenen Immunantwort
Als Mensch ist jeder in seiner Umgebung permanent einer großen Anzahl von Mikroorganismen ausgesetzt, unter anderem auch pathogenen Erregern, die zu Infektionen und verschiedenen Erkrankungen führen können.
Haut und Schleimhäute stellen die erste Barriere für Pathogene dar. Mit einer Oberfläche von ca. 2 m2 umgibt die Haut den gesamten Körper und bildet somit die äußere Barriere.
Der Schutz kann jedoch durch Verletzungen, wie Insektenstiche, verloren gehen und das Eindringen von Keimen ermöglichen. Einen inneren Schutz bieten die Schleimhäute; die Geschlechtsorgane mit einer Oberfläche von ca. 0,5 m2 sind verhältnismäßig klein, während die Atemwege mit 150 m2 und der Magen-Darm-Trakt mit ungefähr 300 m2 eine weitaus größere Oberfläche darstellen (Westermann et al, 2001). Ihre Aufgabe besteht darin, die Kolonisierung von Bakterien und Viren zu verhindern (Janeway et al, 2002).
Zum Schutz vor dieser Gefahr, besitzt der menschliche Körper einen angeborenen als auch erworbenen Abwehrmechanismus. Durchbrechen Krankheitserreger dennoch die Barriere, benötigt der Körper nur wenige Minuten, um die angeborenen bzw.
unspezifischen Abwehrmechanismen zu aktivieren, was auf unterschiedlichen Komponenten beruht: Auf der einen Seite können eingedrungene Bakterien von Fresszellen (Makrophagen und neutrophilen Zellen) phagozytiert und andererseits von löslichen, im Plasma zirkulierenden, Proteinen besetzt werden. Eine Bindung der Komplementproteine markiert den Erreger und garantiert so dessen Erkennung durch die Phagozyten. Für die Abwehr von Viren sind v. a. die Natürlichen Killerzellen zuständig. Das permanent aktive angeborene Immunsystem ist häufig erfolgreich und kann eine Ausbreitung der eingedrungenen Pathogene und eine mögliche Infektion verhindern. Im Falle eines Versagens aktiviert es die erworbene bzw. spezifische Abwehr, an der auch Lymphozyten beteiligt sind. Jeder Lymphozyt ist gegen ein bestimmtes Antigen von Bakterien gerichtet, was folglich ein großes Repertoire an Zellen des spezifischen Immunsystems voraussetzt.
Die zelluläre Komponente der spezifischen Abwehr bilden die T-Lymphozyten. Sie tragen ihre Antigenerkennungsmoleküle, den T-Zell-Rezeptor, auf der Zelloberfläche, der nur eine ganz bestimmte Kombination aus einem fremden Peptid und körpereigenem MHC-Molekül erkennt. Immunglobuline stellen die humorale bzw. nicht-zelluläre Komponente der spezifischen Abwehr. Membrangebunden dienen sie als
Antigenerkennungsstelle der B-Lymphozyten. Sie können allerdings auch von den B- Lymphozyten als lösliche Antikörper sezerniert werden, um den gesamten extrazellulären Raum des Körpers nach ihrem spezifischen Antigen zu durchsuchen.
Neben der Spezifität gegen Antigene verfügt das erworbene Immunsystem über ein immunologisches Gedächtnis. Es entsteht bei jeder Immunantwort durch das Ausbilden von Lymphozyten, den so genannten Gedächtniszellen, die sich eine Antigenstruktur
„merken“ und so bei einer erneuten Antigenexposition schneller und effizienter eingreifen können.
1.1.2 Einteilung des lymphatischen Systems
Innerhalb des lymphatischen Systems wird zwischen zentralen und peripheren Organen differenziert, die über Lymph- und Blutgefäße miteinander in Verbindung stehen.
Knochenmark und Thymus zählen zu den zentralen bzw. primären Organen. Im Knochenmark entstehen Lymphozyten aus den dort ansässigen Stammzellen. Während die B-Lymphozyten u. a. hier heranreifen, also ihre speziellen Rezeptoren gegen ein bestimmtes Antigen erhalten, wandern die Vorläufer der T-Lymphozyten in den Thymus ab. Im Thymus findet die positive Selektion der T-Lymphozyten statt, wobei nur reife T- Lymphozyten, welche gegen körperfremde Antigene gerichtet sind, den Thymus verlassen können. Über den Blutkreislauf gelangen Lymphozyten zu den peripheren bzw. sekundären lymphatischen Organen, die von Lymphknoten, Milz und mucosaassoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) gebildet werden. Alle lymphatischen Zellen in den Peyerschen Plaques, dem Appendix, dem Waldeyerschen Rachenring und den isolierten lymphatischen Follikeln der Schleimhaut werden dem MALT zugeteilt, von denen sich die wichtigsten in den Bronchien und im Darm befinden. Dabei umfasst das darmassoziierte lymphatische Gewebe (GALT) die Peyerschen Plaques und die intraepithelialen Lymphozyten (Brandtzaeg und Pabst, 2004).
Lymphozyten zirkulieren zwischen dem Blut und den peripheren lymphatischen Organen bis sie auf ein Antigen treffen. Antigene gelangen in freier Form oder mit Dendritischen Zellen über die Lymphgefäße, welche die extrazelluläre Flüssigkeit (Lymphe) aus dem Gewebe transportieren, in die Lymphknoten. Diese sind darauf spezialisiert, Antigene einzufangen und den zirkulierenden Lymphozyten zu präsentieren, womit eine spezifische Immunantwort eingeleitet werden soll. Außerdem empfangen Lymphozyten in den peripheren lymphatischen Organen wichtige Signale, die das Überleben und das Aufrechterhalten der Zellpopulationen sichern, damit sie die Suche nach dem spezifischen Antigen fortsetzen können.
Aus den Lymphknoten führen efferente Lymphgefäße, wovon jedes einen Anschluss an das Blutsystem erhält. Die Lymphgefäße aus dem Verdauungstrakt (Trunci intestinales) und den unteren Extremitäten, sowie den Beckeneingeweiden (Trunci lumbares) vereinen sich zum Hauptlymphstamm des Körpers, dem Ductus thoracicus. Er mündet in den linken Venenwinkel und befördert so ca. drei Viertel der Lymphe des Körpers in das zirkulierende Blut zurück (Janeway et al, 2002).
1.1.3 Das Immunsystem der Schleimhaut
Wie bereits erwähnt, kann das Immunsystem in verschiedene Kompartimente unterteilt werden, die Darmschleimhaut stellt das Größte dar. Es unterscheidet sich von den anderen Kompartimenten vor allem durch zwei Eigenschaften: Einerseits bleibt eine hier hervorgerufene Immunantwort weitgehend auf diesen Bereich begrenzt, andererseits sind Lymphozyten aufgrund von gewissen Rezeptoren (homing-Rezeptoren) auf bestimmte Areale beschränkt. Die Schleimhäute nehmen im Bereich der Immunabwehr eine besondere Rolle ein. Bedingt durch ihre permeable Oberfläche, sind sie sehr empfindlich. Zum gleichen Zeitpunkt muss sowohl die Aufnahme von Nahrungsbestandteilen, als auch die Beseitigung der Pathogene zuverlässig und sicher bewerkstelligt werden. Dabei ist es wichtig, dass innerhalb der enormen Summe an Antigenen die Nahrungsbestandteile toleriert werden und nur gegen Krankheitserreger eine Immunantwort induziert wird. Eine weitere Herausforderung wird dem Immunsystem durch die Kommensalen gestellt. Mit einer Anzahl von 1014 besiedeln sieden Darm und leben hier in Symbiose mit dem menschlichen Körper, der im Laufe der Evolution gelernt hat, auf Kommensalen nicht anzusprechen, was auch als orale Toleranz bezeichnet wird.
Gelangen pathogene Erreger in den Darm, so werden sie durch die dort befindlichen Leukozyten wie Dendritische Zellen aufgenommen und über die Lymphgefäße zu den drainierenden Lymphknoten transportiert. Die mesenterialen Lymphknoten (mLK) erhalten die gesamte Lymphe des Magen-Darm-Traktes. Alle Antigene, welche über die Darmschleimhaut eingedrungen sind, werden in den mLK den Lymphozyten präsentiert, um eine spezifische Immunantwort auszulösen. Befinden sich die passenden Lymphozyten in den mLK, werden diese aktiviert und gelangen über den Ductus thoracicus in den Blutkreislauf. Von hier aus verteilen sie sich auf die Schleimhautoberflächen von Darm, Lunge, Mandeln, Urogenitaltrakt und anderen Organen. Es wurde beobachtet, dass Lymphozyten aus dem Darm bevorzugt in den Darm zurückkehren, was detaillierter im Kapitel 1.2 beschrieben wird. Basierend auf dem
beschriebenen Migrationsverhalten wird die spezifische Immunität auf den gesamten Körper ausgeweitet und so ein größerer Schutz vor dem Erreger erwirkt.
1.1.4 Ablauf einer Immunantwort
Krankheitserreger im Darm können die Schleimhautbarriere durchbrechen. Betroffene Enterozyten schütten reaktiv Botenstoffe (Zytokine und Chemokine) aus und induzieren damit die angeborene Immunabwehr. Zuerst werden neutrophile Zellen und Monozyten von den Botenstoffen angelockt, es entsteht eine lokale Entzündung, die sich als Folge der Zytokinwirkung in Form von Erwärmung, Rötung und Schwellung des betroffenen Areals äußert. Um die Einwanderung von Lymphozyten in das betroffene Gewebe einzuleiten, müssen unreife Dendritische Zellen die Pathogene aufnehmen und zum nächsten Lymphknoten transportieren. Bedingt durch die Entzündungsreaktion ist die Flußrate der Lymphe erhöht und somit auch die Migrationsgeschwindigkeit der Antigen- tragenden Dendritischen Zellen zum lymphatischen Gewebe.
1.1.4.1 Die Rolle der Dendritischen Zellen
Dendritische Zellen werden wegen ihrer Funktion zu den Antigen-präsentierenden Zellen gezählt. Sie stammen aus dem Knochenmark und verteilen sich von hier aus im gesamten Körper, um pathogene Antigene zu phagozytieren. In diesem Stadium werden sie als unreif bezeichnet, weil sie noch nicht in der Lage sind, naive T-Lymphozyten zu aktivieren. Diese Fähigkeit wird erst nach einer Antigenaufnahme erlangt, die dazu führt, dass die Dendritische Zelle mit dem phagozytierten Antigen zum drainierenden Lymphknoten wandert. In dem peripheren lymphatischen Organ durchlaufen die Zellen einen Phänotypwechsel der Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Sie exprimieren v. a. den MHC-Rezeptor II und das B7-Molekül in größerer Menge. Über die Bindung an den geeigneten Rezeptor auf der T-Zelloberfläche verleihen die Rezeptoren den Dendritischen Zellen die Fähigkeit, die T-Lymphozyten zu aktivieren, während die Fähigkeit weitere Antigene aufzunehmen, verloren geht. Eine Dendritische Zelle in diesem Stadium wird als reife Zelle bezeichnet. Es ist entscheidend, dass neben dem MHC-Rezeptor II auch das B7-Molekül bei der Bindung aktiv ist, da T-Lymphozyten neben der Bindung zum Erkennen des spezifischen Antigens noch zusätzlich ein costimulatorisches Signal von dem B7-Molekül benötigen. Präsentieren Dendritische Zellen ein Antigen, dessen Oberflächenstruktur mit dem Rezeptor der T-Zelle übereinstimmt, werden T-Lymphozyten aktiviert und wechseln ebenfalls den Phänotyp.
Entsteht ein Kontakt ohne das costimulatorische Signal, bleibt die T-Zelle naiv und wird anerg. Sie verliert die Fähigkeit aktiviert zu werden und kann sich somit nicht mehr an der Abwehr von Krankheitserregern beteiligen.
1.1.4.2 Die Rolle der T-Lymphozyten
Naive Lymphozyten zirkulieren im Blut und Lymphsystem bis sie auf ein geeignetes Antigen treffen und ihre Wanderung beenden können. Durch die Präsentation des Antigens wird innerhalb weniger Tage aus einer naiven T-Zelle eine aktivierte T-Zelle, welche zurück zum Entzündungsherd migriert. Das veränderte Wanderungsverhalten der unterschiedlichen Zellpopulationen beruht auf dem veränderten Expressionsmuster der Adhäsionsmoleküle.
Ein wichtiger Rezeptor, der nach der Aktivierung vollständig exprimiert wird, ist der IL-2- Rezeptor, der nach der Bindung von IL-2 die Proliferation und Differenzierung der T- Lymphozyten induziert. IL-2 wird von T-Lymphozyten synthetisiert, was zur Folge hat, dass dem Immunsystem bereits nach einigen Tagen tausende Tochterzellen zur Verfügung stehen; alle entstandenen Lymphozyten verfügen über den gleichen Antigenrezeptor. Aktivierte T-Zellen differenzieren innerhalb von 4 bis 5 Tagen zu reifen T-Effektorzellen. Antigen-spezifische reife T-Effektorzellen vermehren sich hundert- bis tausendfach, bevor sie den Lymphknoten über die efferente Lymphe verlassen. Der große Vorteil besteht darin, dass nach Bindung des Antigens der Erreger sofort getötet werden kann, ohne dabei auf ein costimulierendes Signal angewiesen zu sein. Allerdings sind nur CD8+ T-Lymphozyten dazu in der Lage, den Erreger im Effektorstadium auf diese Art und Weise zu töten. Haben CD4+ T-Lymphozyten das Effektorstadium erreicht, können diese B-Zellen und Makrophagen, die das gesuchte Antigen gebunden haben, aktivieren.
Durch diese Bindung erhalten Makrophagen die Information, das phagozytierte Material zu lysieren und damit zu beseitigen. Werden B-Lymphozyten durch die Hilfe von T- Lymphozyten aktiviert, proliferieren sie und differenzieren zu Lymphoblasten, welche Antikörper gegen das aufgenommene Antigen synthetisieren. Neben der Aktivierung von anderen Zellpopulationen sind Effektorzellen vor allem durch die Sekretion von Zytokinen unerlässlich für die Immunantwort.
1.1.4.3 Die Rolle der B-Lymphozyten
Wie in Kapitel 1.4.2. beschrieben, sind reife Effektorzellen der T-Zellpopulation in der Lage, B-Lymphozyten zu aktivieren, wenn sie das Antigen (Bakterien, Toxine, bakterielle Polysaccharide) bereits phagozytiert und abgebaut haben. Um aktiviert zu werden,
benötigen B-Lymphozyten analog zu der T-Zellpopulation zwei Aktivierungssignale, wobei die Internalisierung des Antigens das erste Signal aussendet. Das zweite Signal erhalten die B-Lymphozyten von den aktivierten Effektorzellen, wenn diese den passenden Rezeptor zu dem präsentierten Antigen der B-Zelle tragen. Gibt es hier eine Übereinstimmung, so erhält die B-Zelle das zweite Aktivierungssignal und differenziert zu einer Antikörper-produzierenden Plasmazelle. Man unterscheidet mehrere Klassen von Antikörpern. Naive B-Lymphozyten tragen vor allem IgM und IgD. Bei einer Aktivierung der Zellen wird nach ca. einer Woche der Klassenwechsel durch Zytokine eingeleitet (Jacob et al, 1991). Zusätzlich läuft ein Prozess in der Zelle ab, der als somatische Hypermutation bezeichnet wird. Es entstehen Antikörper, die schneller und effizienter an das Antigen binden. Nach einem Klassenwechsel wird vor allem IgG gebildet, welches die längste Halbwertszeit der Immunglobuline besitzt und am häufigsten im Körper verbreitet ist. Eine Ausnahme stellen die B-Lymphozyten im Darm bzw. im Bereich der Schleimhäute dar. In einem gesunden Organismus ohne Entzündungsreize machen IgM, IgG und IgE insgesamt nur 10% der Immunglobuline im Magen-Darm-Trakt aus (MacPherson et al, 1996). Hier wird nach dem Klassenwechsel vor allem IgA sezerniert.
und zwischen sekretorischem IgA im Darmlumen und dem IgA im Serum unterschieden.
Das sekretorische IgA verhindert im Magen-Darm-Trakt, dass sich Bakterien oder Toxine an Epithelzellen anlagern, auf diese Weise ist es an der primären anti-inflammatorischen Abwehr beteiligt (Snoeck et al, 2006). Im Serum führt das IgA zur Neutralisierung von Bakterien und Toxinen, welche die Schleimhautbarriere durchbrochen haben. Zusätzlich kann die Bindung an das Antigen die Phagozytose und über die Aktivierung des Komplementsystems auch die beschleunigte Lyse dieser Strukturen induzieren (Otten und van Egmond, 2004).
Es besteht weiterhin die Möglichkeit, B-Lymphozyten ohne das Mitwirken von T- Lymphozyten zu aktivieren. Dann erfolgt die zweifache Signalgabe durch das gebundene Antigen, welches durch seine spezielle Struktur die Rezeptoren auf der Zelloberfläche quervernetzt. Zu den Antigenen, die dazu in der Lage sind, zählen bakterielle Polysaccharide, polymere Proteine und Lipopolysaccharide. Dieser Aktivierungsmodus benötigt weniger Zeit und ist entscheidend bei der Abwehr von extrazellulären Bakterien, allerdings wird hierbei v. a. IgM synthetisiert und die Bildung von Gedächtniszellen bleibt aus. Gedächtniszellen entstehen sowohl in der T-Zellpopulation, als auch in der B- Zellpopulation nach einer Aktivierung durch T-Zellen. Sie vermitteln dem Körper nach einer durchgemachten Infektion einen Schutz für mehrere Jahre, ggf. ein Leben lang, weil beim nächsten Eindringen des gleichen Erregers die spezifische Immunantwort
unmittelbar in Kraft tritt, indem sofort aktive Effektorzellen und Antikörper-bildende Plasmazellen die Abwehr übernehmen.
1.1.5 Funktionelle Einteilung der peripheren lymphatischen Organe
Alle peripheren lymphatischen Organe sind klar gegliedert, wobei sich die Aufteilung der Kompartimente nach der am Häufigsten vorliegenden Zellpopulation richtet. Die vorliegende Untersuchung beschäftigt sich mit den mLK und der Milz, deshalb wird im Folgenden nur der Aufbau dieser beiden Organe erklärt.
1.1.5.1 Aufbau eines Lymphknotens
Abb.: 1 Aufbau eines Lymphknotens (modifiziert nach Pabst R., 2004 a)
In einem Lymphknoten laufen die Lymphgefäße zusammen und münden hier in den Randsinus. Über diesen Weg gelangen vor allem Antigen-tragende Zellen und Antigene in den Lymphknoten. Der Außenbereich (Cortex) des Lymphknotens enthält überwiegend B-Lymphozyten, sie sind in so genannten Follikeln organisiert und werden auch als Primärfollikel bezeichnet, wenn sie keine aktivierten und proliferierenden B- Lymphozyten enthalten (Steiniger und Barth, 2000).
In Nachbarschaft zum Cortex befindet sich die paracorticale Zone, welche vor allem diffus verteilte T-Lymphozyten enthält und daher auch als T-Zell-Bereich bezeichnet wird. Diese Region enthält wichtige zuführende Blutgefäße, die wegen ihrer speziellen Epithelauskleidung auch hochendotheliale Venolen (HEV) heißen. Zum Zentrum hin ist die Markzone zu finden, von der aus den Lymphozyten ein Anschluss an die efferenten Lymphgefäße ermöglicht wird.
Der größte Teil der Lymphozyten erreicht mit dem Blutkreislauf die T-Zell-Zone über die HEV. In diesem Bereich stellen sich Dendritischen Zellen bereit, welche über die afferente Lymphe in den Lymphknoten gelangt sind,den T-Lymphozyten aufgenommene Antigene zu präsentieren. B-Lymphozyten passieren die T-Zell-Zone zügig und wandern von hier aus in die Primärfollikel. Stoßen sie allerdings auf ihr spezifisches Antigen, bleiben sie für ein paar Tage in der T-Zell-Zone und gehen eine Bindung mit der passenden reifen Effektorzelle ein. Die entstehende Zellansammlung wird Primärfocus genannt, welcher sich nach einigen Tagen zurückbildet. Aus dieser Zellansammlung gehen Plasmazellen hervor, von denen ein Teil zu den Marksträngen des Lymphknotens oder in die rote Pulpa der Milz wandert. Ein anderer Teil begibt sich zu den Primärfollikeln in der B-Zell-Zone, wo die Vermehrung fortgeführt wird. Der Ort der Proliferation wird als Keimzentrum bezeichnet. Enthalten Follikel Keimzentren, so werden sie Sekundärfollikel genannt (Steiniger und Barth, 2000). B-Lymphozyten, welche in einem Keimzentrum proliferieren, sezernieren ihre Antikörper später, diese können auf Grund der Affinitätsreifung die Antigene effektiver beseitigen. Nach ca. 48 Std. verlassen T-Lymphozyten den Lymphknoten über die efferente Lymphe und sind später im gesamten Körper verteilt (Westermann et al, 2001).
1.2 Besonderheit der mesenterialen Lymphknoten
Die mesenterialen Lymphknoten (mLK) sind von zentraler Bedeutung für den Körper, sind sie doch kontinuierlich einer besonders großen Anzahl an Antigenen, Bakterien und Viren ausgesetzt. Um dem Körper eine adequate Energiezufuhr über die Nahrungsaufnahme zu ermöglichen, ist neben dem Schutz vor Pathogenen auch eine Toleranz gegenüber harmlosen Bestandteilen des Darminhaltes notwendig. Andernfalls könnte jegliche Nahrungsaufnahme zu einer starken Entzündung im Magen-Darm-Trakt führen.
Eine weitere Eigenschaft der mLK besteht in der Rückkehr von T-Lymphozyten bevorzugt in das Areal, in dem sie aktiviert wurden. Im Bereich des Magen-Darm-Traktes sind diese T-Lymphozyten auch in den Peyerschen Plaques und in der Lamina Propria wiederzufinden. Ob der Grund für diese gezielte Migration durch das Mikroenvironment der mLK beeinflusst wird, wurde von Bode et al (2001) genauer untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass T-Lymphozyten, die im Zytokinmilieu der mLK aktiviert wurden, nach Wiedereintritt in ein solches Milieu schneller zu proliferieren beginnen und die Apoptoserate reduziert wird. Verantwortlich dafür wird die dominierende Präsenz von TGF-β und IL-4 gemacht. Dementsprechend reagieren T-Lymphozyten, welche im peripheren Lymphknoten generiert worden sind, sensibel auf IL-2 und IFN-γ, weil sie in
diesem Bereich vom Mikroenvironment geprägt werden. Neben den T-Lymphozyten nehmen auch B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen an der Bildung einer Antigen- spezifischen Barriere teil. Allerdings sezernieren Plasmazellen an der Kryptenbasis primär nicht IgM und IgG, die in vielen Organen und im Plasma den Immunschutz gewährleisten, sondern IgA, welches über Transcytose in das Darmlumen zur Neutralisierung von Pathogenen und Toxinen gelangt (Apodaca et al, 1991).
1.2.1 Neue Erkenntnisse durch mLK-Resektion
Wie oben beschrieben, ist die Aufgabe der mLK sehr vielseitig und komplex, entsprechend interessant schien es herauszufinden, ob die mLK ganz alleine diese Aufgabe bewältigen können. Basierend auf den Erkenntnissen wissenschaftlicher Untersuchungen, die bereits bewiesen haben, dass die afferente und efferente Lymphe nach Entfernung der mesenterialen Lymphknoten bei der Ratte wieder verwachsen (Yrlid und McPharson, 2003), wurde dieser Eingriff für die Versuchsreihen durchgeführt. Daher stellte sich die Frage, ob der Prozess, nachdem ein bedeutender Ort der Antigenpräsentation im Darm nicht mehr zur Verfügung steht, von einem anderen lymphatischen Organ übernommen werden kann. Es wird angenommen, dass das Immunsystem in der Lage ist, sich der neuen Situation anzupassen und Antigene sowie lymphatische Zellen verstärkt in der Milz zu finden sind. Sie stellt nicht nur das größte sekundäre lymphatische Organ dar, sondern sie verfügt auch über einen besonderen Aufbau des lymphatischen Gewebes und durch ihre Stellung im Blutkreislauf tritt sie mit einem großen Teil der lymphatischen Zellen in Kontakt. Eigenschaften, die dem Organ eine erfolgreiche Immunantwort gegen Antigene aus dem Darm möglich machen.
1.2.2 Spezifische Immunantwort nach Impfstoffgabe
Versuchstiere ohne mLK müssen die täglichen Antigene in einem anderen lymphatischen Organ verarbeiten. Dabei lässt sich nicht vorhersagen, ob die Versuchstiere in dem beobachteten Zeitraum eine ausreichende Anzahl an pathogenen Stoffen aufnehmen, um eine nachweisbare Immunantwort hervorzurufen. Aus diesem Grund wurde in einer weiteren Versuchsreihe den Tieren Cholera-Impfstoff oral appliziert. Das darin enthaltene Choleratoxin gehört zu den Adjuvantien, die, gebunden an ein Antigen, die lymphatischen Zellen der Darmschleimhaut stimulieren. Nach der hervorgerufenen Immunstimulierung wird eine Antigen-spezifische IgA und IgG Antwort induziert (Elson et Ealding, 1984; Spangler, 1992). Das Choleratoxin bindet an die intestinalen Epithelzellen und regt diese zur Zytokinproduktion und -freisetzung an (Bromander et al, 1991; McGee, 1993). Über die M-Zellen der Mukosa wird das
Choleratoxin in die Peyerschen Plaques transportiert und so eine Kontaktaufnahme zu den lymphatischen Zellen ermöglicht (Kraehenbuhl et Neutra, 2000). Dendritische Zellen, die in der intestinalen Epithelschicht sesshaft sind, nehmen die Antigene auch aus dem Darmlumen auf. Dabei führt das Choleratoxin zu einer Phänotypänderung und Reifung der Dendritischen Zellen (Martin et al, 2002). Diese exprimieren verstärkt die beiden costimulatorischen Rezeptoren MHCII und B7.1, während CD40 und ICAM1 hingegen geringer exprimiert werden (Eriksson et al, 2003). In der Gruppe der Zytokine wurde eine erhöhte Synthese von IL-1β festgestellt. Eine Erhöhung der Expression von Chemokin- Rezeptoren induziert die Migration der Dendritischen Zellen in den drainierenden Lymphknoten, in dem sie Kontakt zu naiven T-Zellen aufnehmen (Gagliardi et De Magistris, 2003; Shreedhar et al, 2003). Die Bindung des Choleratoxins an B- Lymphozyten führt ebenfalls dazu, dass diese die costimulatorischen Moleküle verstärkt exprimieren und als Antigen-präsentierende Zelle fungieren. Bei B-Lymphozyten der Milz konnte ein Anstieg der Synthese von IgG und IgA beobachtet werden (Lycke et al, 1990), wobei der Klassenwechsel zu IgA über TGF-β induziert wurde (Kim et al, 1998).
Auch eine erhöhte Durchlässigkeit der Darmschleimhaut wurde auf die Wirkung des Choleratoxins zurückgeführt (Lycke et al, 1991).
Die aufgeführten Auswirkungen des Choleratoxins bezogen sich auf das vollständige Choleratoxin, bestehend aus den beiden Untereinheiten A und B. Über die Bindung der Untereinheit B an den GM1-Gangliosid-Rezeptor, der sich auf der Membranoberfläche befindet, wird die Aufnahme des Toxins in die Zelle ermöglicht. Von der Untereinheit A geht eine enzymatische Aktivität des Toxins aus, die im Zytosol die ADP- Ribosyltransferase anregt. Im Rahmen der folgenden Versuchsreihe konnte auf Grund von Lieferschwierigkeiten das Choleratoxin nicht verwendet werden. Publikationen, die nur mit der nicht toxischen Untereinheit B gearbeitet haben, zeigen, dass die Untereinheit B nicht in der Lage, ist eine Immunantwort im Darm zu induzieren (Rappuoli et al, 1999). Es konnte lediglich beobachtet werden, dass rekombinantes Choleratoxin B eine orale Toleranz im Körper hervorruft (Williams et al, 1999). Untereinheit B dient nur zur Aufnahme der gebundenen Antigene in die Zellen und wird von unreifen Antigen- präsentierenden Zellen endocytiert, wobei die Reifung der Dendritischen Zellen ausbleibt (Shreedhar et al, 2003). Außerdem wurde eine erhöhte Sekretion von TGF-β festgestellt.
Insgesamt lässt sich nur eine immunmodulatorische Wirkung der Untereinheit B erkennen, weshalb die Versuche der vorliegenden Arbeit mit dem Impfstoff des Choleratoxins durchgeführt wurden. Dieser enthält neben der rekombinanten Untereinheit B auch inaktivierte Bestandteile der Vibrio cholerae Stämme. Angeregt durch den Impfstoff leitet das Immunsystem eine spezifische monoklonale Immunantwort
im Darm ein, die in den mLK generiert wird und somit ebenfalls für die vorliegende Untersuchung geeignet ist.
1.3 Warum kommt die Milz in Frage?
Wie bereits erwähnt zählen zu den peripheren lymphatischen Organen nicht nur die Lymphknoten, sondern auch die Milz. Sie ist das größte periphere lymphatische Organ, einzigartig in ihrem Aufbau (Mebius et al, 2005), stellt sie einerseits die größte Filterstation des Blutes dar und übernimmt andererseits eine beachtliche Rolle bei der Verteidigung von bekapselten Bakterien (Kraal, 1992). Entsprechend der speziellen Beteiligung an der Immunabwehr konnten 30 % der i. v. injizierten T-Lymphozyten in der Milz nachgewiesen werden, obwohl sie nur 2 % des Herzzeitvolumens erhält. Weiterhin wurde dokumentiert, dass 24 Std. nach der Injektion der Anteil in der PALS anstieg, wie es sonst nur in den Peyerschen Plaques und im Lymphknoten zu beobachten war. Der Gehalt an T-Lymphozyten in der Marginalzone und roten Pulpa sank entsprechend den Zellen im Knochenmark und in der Lunge (Westermann et al, 2001). Bezüglich der ähnlichen Verläufe zwischen lymphatischen Strukturen des Darmes und der Milz fanden weitere Untersuchungen an Mäusen und Ratten mit einer inflammatorischen Darmerkrankung (Colitis ulcerosa und Morbus Crohn) statt. Auswertungen belegten eine Beteiligung von CD4 + T-Lymphozyten der Milz durch die Erkennung enteraler, bakterieller Antigene (Brimnes et al, 2001; Matsuda et al, 2000). Brimnes et al (2000) veröffentlichten, dass Immunglobuline, die bei Colitis Ulcerosa in lymphatischen Zellen des Darmes beobachtet wurden, auch in Zellen der Milz und der mLK vertreten waren.
Mercier et al (2002) verfolgten in einem Rattenmodell spezielle Veränderungen des Proteinstoffwechsels, welche auf die Induktion einer chronischen Entzündung im Darm zurückgeführt werden konnten, auch in der Milz. Somit bleibt die Immunantwort nicht nur lokal im Focus der Erkrankung, sondern wird systemisch auf die Milz und die mLK ausgeweitet. Forschungsergebnisse, wie diese, lassen Vermutungen über Mechanismen zur Kooperation zwischen dem Darm und der Milz bei den chronischen inflammatorischen Darmerkrankungen zu und bestätigen die systemische Komponente der Milz mit komplexeren Funktionen.
1.3.1 Aufbau der Milz
Abb.: 2 Aufbau der Milz (modifiziert nach Pabst R., 2004 b)
Grundsätzlich ist die Milz in zwei verschiedene Kompartimente aufgeteilt.
In der roten Pulpa, dem Ort für die Blutfilterung, münden die Blutgefäße. Da sie keine afferenten Lymphgefäße erhält, gelangen über den Blutweg nicht nur die Erythrozyten, sondern auch lösliche Antigene und alle Populationen der Leukozyten in die rote Pulpa.
Bedingt durch die offene, spezielle Struktur der venösen Sinus verfangen sich hier alte Erythrozyten und werden abgebaut.
In der weißen Pulpa wird zwischen einem B- und T-Zellareal differenziert. Die örtliche Trennung erinnert an den Aufbau des Lymphknotens. Innerhalb des arteriellen Gefäßsystems sind im Bereich der Arteriolen die Gefäße von einer periarteriellen lymphatischen Scheide (PALS) umgeben, die auch als T-Zellzone bezeichnet wird. Hier nehmen T-Lymphozyten Kontakt zu Makrophagen, Dendritischen Zellen und B- Lymphozyten auf. Wie auch im Lymphknoten, halten sich B-Lymphozyten in den Follikeln auf, was von dem jeweiligen Areal über Chemokine vermittelt wird. Eine weitere Struktur, die in der Milz von Nagetieren nachgewiesen werden konnte, ist die Marginalzone. Im Vergleich zu der menschlichen Milz, wo sie primär nur um Follikeln sichtbar wurde (Steiniger und Barth, 2000), umgibt sie bei Ratten T- und B-Zellareale und symbolisiert auf diese Weise eine Grenze zwischen der roten und weißen Pulpa. Sie dient Zellen, die den Blutfluss verlassen, um in die weiße Pulpa zu gelangen, als mehrschichtige Eintrittspforte. Zuerst wird ein Bereich von so genannten Marginal-
Zonen-Makrophagen passiert. An der inneren Grenze zur weißen Pulpa befindet sich eine Schicht aus metallophilen Makrophagen. Der Hauptbestandteil der Zellen liegt zwischen den beiden Makrophagenpopulationen. Es handelt sich dabei um B- Lymphozyten, die sich von den follikulären B-Lymphozyten durch unterschiedliche Rezeptoren auf der Oberfläche unterscheiden. Marginalzonen-B-Lymphozyten exprimieren IgM. Das IgD, das stark von den follikulären B-Lymphozyten synthetisiert wird, tritt nur vereinzelt auf. Dendritische Zellen sind ebenfalls in der Marginalzone nachweisbar.
1.3.2 Die angeborene Immunantwort in der Milz
Die angeborene Immunantwort in der Milz findet vor allem innerhalb der Marginalzone statt. Zellen der Marginalzone exprimieren spezielle Rezeptoren, um aus dem Blut stammende Pathogene und Antigene zu binden. Diese Zone verfügt über zwei Makrophagenpopulationen, welche mit Hilfe von spezifischen Rezeptoren Antigene beseitigen. Sie haben als erste Kontakt zu den Antigenen und beginnen mit der Expression von unterschiedlichen Zytokinen. Es wird angenommen, dass die Marginalzonen-B-Lymphozyten vor allem durch bakterielle Bestandteile, die von Komplementfaktoren opsoniert worden sind, aktiviert werden. Hat die Aktivierung stattgefunden, entwickeln sich diese zu IgM produzierenden Plasmazellen. Wurden dabei lösliche Antigene aufgenommen, erhalten die Zellen die Fähigkeit als Antigen- präsentierende-Zelle zu fungieren. Aktivierte Zellen bleiben nicht in der Marginalzone.
Subpopulationen der Dendritischen Zellen und Marginalzonen-B-Lymphozyten migrieren anschließend in die weiße Pulpa. Dabei aktivieren die potenten Antigen- präsentierenden-Zellen der B-Zellpopulation naive CD4+ T-Lymphozyten (Attanavanich et Kearney, 2004). B-Lymphozyten, die über Lipopolysaccharide stimuliert wurden, sind durch eine veränderte Expression von Rezeptoren sehr sensibel gegenüber CXCL 13.
Dieses wird in den B-Zell-Follikeln synthetisiert und lockt B-Lymphozyten in das Kompartiment (Cinamon et al, 2004). Nach einem ähnlichen Prinzip gelangen Dendritische Zellen in die weiße Pulpa. Um neben der angeborenen auch die erworbene Immunantwort ggf. einzuleiten, ist der Prozess notwendig. Wie wichtig die Milz bei der angeborenen Immunantwort ist, wird erst deutlich, wenn Tieren oder Menschen diese operativ entfernt wurde. Nagetiere z. B. sind nicht mehr in der Lage, eine adäquate Immunantwort herzustellen; Menschen sind lebenslang auf präventive Maßnahmen wie Impfungen und Antibiotika angewiesen.
1.3.3 Die erworbene Immunantwort in der Milz
Im letzten Kapitel wurde deutlich, dass die angeborene Immunantwort auf die Marginalzone beschränkt und erforderlich ist, um die erworbene Immunantwort in Gang zu bringen. Somit besitzt neben der weißen Pulpa auch die Marginalzone eine gravierende Bedeutung bei der Initialisierung der erworbenen Immunantwort. Alle Zellen betreten die weiße Pulpa über die Marginalzone. Diese enthält bereits die Zellen der angeborenen Immunantwort, wobei die B-Lymphozyten aus dem Blut stammende Pathogene effektiv beseitigen. Hinzu kommen Dendritische Zellen aus dem Blutkreislauf, welche zusätzlich Pathogene aus dem Blut in die Milz transportieren. Sie leiten die Differenzierung von B-Lymphozyten zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen ein und sichern somit das Überleben. Es wird vermutet, der soeben beschriebene Prozess ereignet sich v. a. in den so genannten bridging channels (Balazs et al, 2002), die sich von der weißen Pulpa aus durch die Marginalzone erstrecken und in der roten Pulpa enden.
Gelangen Antigen-präsentierende-Zellen in die weiße Pulpa, führen sie zur Aktivierung der T-Lymphozyten, wenn sie das geeignete Antigen gebunden haben. Die Aktivierung leitet, wie auch im Lymphknoten, einen Phänotypwechsel ein. T-Lymphozyten vermindern die Expression von CCR7 und erhöhen die Expression von CXCR5. Durch diesen Phänotypwechsel erlangen die T-Lymphozyten die Fähigkeit, in die B-Zell-Areale zu wandern (Ansel et al, 1999). In der follikulären B-Zell-Population wird mit der Bindung des geeigneten Antigens eine Erhöhung der CCR7-Expression induziert, wodurch diese angeregt werden, sich zur Randzone der B-Zellfollikel zu begeben (Reif et al, 2002). Die Grenze zwischen dem T- und B-Zellbereich ist ein wichtiger Ort der Kommunikation. Hier treten die aktivierten T- und B-Lymphozyten in Kontakt, wenn es sich um eine von T- Zellen abhängige Immunantwort handelt. Analog zu den Vorgängen in den Lymphknoten bilden B-Lymphozyten anschließend im Follikel ein Keimzentrum aus. Nachdem der Klassenwechsel und die Reifung der Antikörper abgeschlossen ist, können diese zur Marginalzone wandern und in die rote Pulpa übertreten. Dabei wird vermutet, dass die bridging channels eine Leitstruktur darstellen (J. Mitchell, 1973).
1.4 Fragestellungen
Aus der Einleitung wird deutlich, wie sich der Lymphknoten gegen eingedrungene Pathogene verteidigt. Offensichtlich ist, dass der Lymphknoten nicht das einzige lymphatische Organ darstellt, in dem eine gezielte Immunantwort entstehen kann.
Arbeiten der letzten Jahre verdeutlichen die Vielfältigkeit der Milz im Detail und rücken das Bild der reinen Filterfunktion für Erythrozyten in den Hintergrund. Um hier noch weitere Erkenntnisse zu erlangen, wurden immunologische Prozesse in der Milz fokussiert. Wichtig hierbei ist, nicht nur die zellulären Veränderungen festzuhalten, sondern auch darzustellen, in welchem Kompartiment welche Zellpopulation aktiv ist. Im Rahmen von zwei Versuchsreihen wurde deshalb überprüft, in wie weit das Immunsystem die Regulation der Darmantigene nach der mLK-Resektion in die Milz verlagert. Es wurde nicht nur der gesunde Körper untersucht, sondern auch durch die Gabe eines Cholera-Impfstoffs eine spezielle Immunantwort im Darm induziert. Folgende Fragestellungen sollten beantwortet werden:
Führt die mLK-Resektion zu einem Anstieg an lymphatischen Zellen in der Milz?
Sind die Dendritischen Zellen durch die mLK-Resektion verstärkt in der Milz zu finden?
Hat der Eingriff zu einer Änderung des Phänotyps bei den Dendritischen Zellen geführt?
Führte die mLK-Resektion zu einer Phänotypänderung der T-Lymphozyten bzw. den Subpopulationen?
Hat die mLK-Resektion zu einer Aktivierung der B-Lymphozyten geführt? Hatte dies Auswirkungen auf die Expression und Reifung von Immunglobulinen auf der Membranoberfläche?
Sind die abgelaufenen Prozesse auf bestimmte Kompartimente der Milz beschränkt?
Hatten die Eingriffe einen Einfluss auf das Zytokinmilieu in der Milz?
Welche Auswirkungen hatte die Gabe des Cholera-Impfstoffs auf die mLK von normalen Tieren?
Wie verhalten sich die Zellpopulationen und das Zytokinmilieu bei Gabe des Cholera- Impfstoffs in der Milz von normalen Tieren?
Welche Auswirkungen zeigt die Gabe des Cholera-Impfstoffs auf die Zellpopulationen der Milz bei den Resezierten?
2. Methoden
2.1 Versuchstiere
Es wurden männliche Lewis-Ratten mit der Tierschutznummer 05/960 eingesetzt. Alle Tiere wurden entweder von Charles River (Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld) oder aus der eigenen Zucht des zentralen Tierlabors der MHH bezogen. Zu Versuchsbeginn wogen sie zwischen 150 g und 250 g. Zugang zu Wasser und Futter war frei.
2.1.1 Die Narkose
Mit 0,14 mg/kg Körpergewicht Dormitor (Orion Corporation, Espoo, Finnland) und 100 mg/kg Körpergewicht Ketamin (A. Albrecht GmbH, Aulendorf) wurden die Tiere narkotisert.
2.1.2 Kontrolltiere
Bei der Schein-OP wurde den Tieren mit einem 5 cm langen Bauchschnitt die Bauchhöhle eröffnet und der Darm freigelegt. Die Darmschlingen wurden mit sterilem PBS feucht gehalten und anschließend in die Bauchhöhle reponiert. Den resezierten Tieren ist nach der Eröffnung des Bauchraumes die Gruppe der mesenterialen Lymphknoten (Lymphozentrum mesenterium craniale und coeliacale) entfernt worden (Abb.: 2). Nach dem Eingriff wurde das Peritoneum mit resorbierbaren Fäden zugenäht und die Haut mit Klammern wieder verschlossen, welche nach 10 Tagen entfernt wurden.
Nach der Operation folgte eine vierwöchige Regenerationsphase (Abb.: 3). Eine Stunde vor der Organentnahme erhielten die Tiere unter Isoflorannarkose 5 mg BrdU/kg Körpergewicht in die Schwanzvene injiziert. Anschließend erfolgte die Tötung der Tiere durch CO2-Begasung und einer Herzpunktion zur Entblutung. Neben den Tieren selbst wurde auch die Milz von jedem Tier gewogen, um einerseits die Größe des Organs in den verschiedenen Gruppen gegenüber zu stellen und andererseits den prozentualen Anteil der Milz am Körpergewicht zu ermitteln. Zusätzlich wurden bei den Scheinoperierten die mLK gewogen. Für die Histologie und PCR sind die entnommenen Organe in flüssigem Stickstoff eingefroren worden.
2.1.3 Behandelte Tiere
Die Gruppe der behandelten Tiere erhielt vier Wochen nach der Schein-OP und der mLK-Resektion 300 µl von dem Choleratoxin-Impfstoff (CtxB) „Dukoral“ (SBL Vaccin AB, Stockholm, Schweden). Eine Stunde vor und nach der Operation hatten die Tiere keinen Zugang zum Futter, damit sich zum Zeitpunkt der Gabe möglichst wenig Nahrung im Magen befand. Der Impfstoff wurde unter Isoflorannarkose oral mit einer Kanüle in den Magen appliziert. Am dritten Tag nach der ersten Impfstoffgabe erhielten die Tiere eine weitere Dosis nach dem gleichen Verfahren. Vier Tage nach der ersten Immunisierung mit dem Choleratoxin-Impfstoff sind die Organe entnommen worden (Abb.: 4). Analog zur Kontrollgruppe wurde den behandelten Tieren eine Stunde vor der Herzpunktion 5 mg BrdU/kg Körpergewicht in die Schwanzvene injiziert, das Körpergewicht festgehalten, die Organe gewogen und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Abb.: 3 Die Einteilung der Gruppen
Männliche Lewis Ratten
Kontrollgruppe
Behandelte Gruppe
Schein-OP
mLK-Resektion und Cholera-Imfpstoffgabe
mLK-Resektion
Schein-OP und Cholera-Impfstoffgabe
Abb. 4: Versuchsverlauf der Kontrollgruppe
Abb. 5: Versuchsverlauf der behandelten Gruppe
2.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) 2.2.1 RNA-Isolierung aus Gewebe
Das genetische Material wurde mit Hilfe der Gewebereinigung, welche mit dem Mini Kit dem Herstellerprotokoll entsprechend durchgeführt wurde, aus dem Gewebe gewonnen.
In flüssigem Stickstoff wurden die gewogenen Organe zu feinem Pulver gemörsert und in einer Lösung aus RLT-Puffer und β-Mercaptoethanol resuspendiert. Bei diesem Prozess sind die RNA und DNA freigesetzt worden. Mit Hilfe der Qia-Shredder-Säulen wurde die RNA und DNA aus dem Lysat per Zentrifugation (2 min) herausgefiltert. Anschließend wurden die Säulen, an denen das grobe Gewebematerial haftete, entsorgt. Um das noch darin enthaltene Gewebe zu entfernen, wurde das restliche Lysat ein weiteres Mal zentrifugiert. Die vorhandene DNA im Überstand wurde abgenommen, mit 70% Ethanol ausgefällt und ein weiteres Mal zentrifugiert. Von der Säule wurde nur die enthaltene RNA gebunden. Um diese weiter von zellulären Bestandteilen zu reinigen, wurde sie mit RW1 gewaschen und anschließend zentrifugiert. Für die spätere Verwendung war es wichtig, dass die Proben reine RNA enthielten und somit nötig die restliche DNA, welche sich noch in der Säule befand, vollständig herauszufiltern. Zu diesem Zweck wurde ein mit DNAse versetzter Puffer (RDD Buffer) auf die Säule gegeben und 15 min lang inkubiert. Es folgten drei weitere Waschschritte (ein Mal mit RW1 und zwei Mal mit RPE).
Sobald die Reinigung der RNA abgeschlossen war, konnte sie mit Aqua bidest. aus der Säule eluiert werden. Mit Hilfe eines Photometers wurde die gewonnene Menge an RNA bestimmt. Um Reste von DNA-Strängen oder andere Verunreinigungen auszuschließen, wurde zusätzlich eine Gelelektrophorese durchgeführt.
2.2.2 Reverse Transkriptase (RT)-PCR
Um RNA in DNA umzuschreiben, mussten sich zunächst Primer an die RNA-Matrize anlagern. Anschließend wurde mittels der Reversen Transkriptase von einem RNA- Strang eine cDNA-Kopie erstellt (Mühldardt, 2003). Für jede Probe wurden 1,5 µg RNA in vier 0,2 ml Cups pipettiert, um möglichst schnell eine größere Menge an cDNA zu gewinnen. Zusätzlich wurde für die Gelelektrophorese ein 0,5 ml Cup für jede Probe bereitgestellt.
Bei der RT-PCR wurden zwei Ansätze (s. Kapitel 6.1.2.2) benötigt. Der erste Ansatz enthielt, in Aqua bidest. gelöst, die vier Basen (dNTP-Mix) und die Oligo(dt)Primer, die sich bei der mRNA an den Poly-A-Schwanz anlagerten. Für diesen Schritt wurden die Proben mit dem Ansatz 5 min bei 65°C im Mastercycler inkubiert und anschließend auf Eis gelagert. Es folgte die Zugabe des zweiten Ansatzes, der neben dem First Strand Buffer und DTT auch einen Rnase Inhibitor enthielt, um einen vorzeitigen Abbau der RNA zu verhindern. Nach einer kurzen Zentrifugation inkubierten die Proben für 2 min bei 37°C im Mastercycler, bevor die Reverse Transkriptase hinzugefügt werden konnte.
Nach Zugabe des Enzyms wurden die Proben noch weitere 50 min. bei 37°C inkubiert, wobei in diesem Zeitraum die RNA umgeschrieben wurde. Zum Abschluss wurden die Proben für 15 min auf 70°C erwärmt, um sowohl die RNA zu denaturieren, als auch das Enzym zu inaktivieren.
2.2.3 PCR
Zur Vorbereitung auf die PCR wurde der Master Mix (s. Kapitel 6.1.2.3) erstellt. Die zu testenden Housekeeping Gene wurden mit den DNA-Proben zusammen pipettiert. Zum Starten der PCR musste dem Probenansatz noch der Master Mix hinzugefügt werden.
Bei der PCR wurden drei Phasen durchlaufen. Zu Beginn sind die Proben auf 95°C erhitzt worden, um den Verlust der Sekundärstruktur der cDNA-Stränge zu induzieren, danach wurde die Temperatur auf 57 – 59°C gesenkt und die Primer konnten sich an die cDNA-Stränge anlagern. In der dritten Phase betrug die Temperatur 72°C, weil das der optimalen Reaktionstemperatur der Taq-Polymerase entspricht. In Gegenwart der dNTPs verlängerte diese die einzelsträngige, denaturierte DNA-Matrize (Mühldardt, 2003). Der neu entstandene Doppelstrang wurde mit dem Beginn des nächsten Cyclus
wieder denaturiert, um die Doppelstränge zu trennen. Insgesamt wurden 35 Cyclen durchlaufen.
2.2.4 Gelelektrophorese
Um zum einen das passende Housekeeping Gen und zum anderen die Reinheit der gewonnen RNA zu bestimmen, wurde die Gelelektrophorese verwendet.
Die Gelelektrophorese begann mit der Herstellung des Trägermaterials aus Agarose.
Hierfür wurden 2 g Agarosepulver mit 100 ml 1x TAE in einen Erlenmeyerkolben gefüllt und für mindestens 3 min bei 500 Watt in der Mikrowelle erwärmt. Nach dem sich das Agarosegel im Erlenmeyerkolben vollständig gelöst hatte, wurde es aus der Mikrowelle genommen und nach einer kurzen Abkühlphase mit 4-5 µl Ethidiumbromid angerührt.
Die Agaroselösung wurde in den Gelschlitten gegossen und für 30 min in den Kühlschrank gestellt. Nachdem Festwerden des Gels, konnte es in die Gelkammer gesetzt werden, die mit 1x TAE (Laufpuffer) gefüllt war. Daraufhin wurden die mit Auftragspuffer versetzten Proben (um die DNA-Lösung zu beschweren) in die einzelnen Auftragstaschen pipettiert. Parallel wurde ein 100 bp Standardleiter aufgetragen, um die DNA-Stränge später zuordnen zu können. Mit einer Spannung von 90 V wurde die Elektrophorese gestartet. Nach ca. 75 min war sie beendet, wurde unter UV-Licht betrachtet und digital festgehalten.
2.2.5 Real-time PCR
Mit der Real-time PCR existiert die Möglichkeit Nukleinsäuren auf quantitativer Basis nachzuweisen. Es stehen zwei Quantifizierungsstrategien zur Verfügung: Die gesuchte Menge kann anhand einer Kalibrierkurve (absolute Quantifizierung) oder mit Hilfe eines Referenzgens (relative Quantifizierung) bestimmt werden. Alle Daten dieser Arbeit wurden mit der relativen Quantifizierung erstellt und ausgewertet.
Bei der Real-time PCR wurde die PCR-Maschine mit UV-Lampe und CCD-Kamera ausgestattet. Für die Durchführung wurde ein vorgefertigter Mix der Firma Quiagen verwendet, welches den Farbstoff SYBR Green I enthält. Dieser Farbstoff wird in die doppelsträngige DNA unspezifisch eingebaut und verstärkt die zu messende Fluoreszenz (Mühldardt, 2003). Neben dem dNTP Mix, dem Reaktionspuffer und MgCl2
enthält der Ansatz ROX als Referenzfarbe zur Positivkontrolle und die HotStarTaq DNA Polymerase.
Die Real-time PCR wurde entsprechend dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Dabei wurden zunächst die jeweiligen DNA-Proben und Primer mit Aqua bidest in eine Lösung gebracht. Für die Proben wurden 2 µl DNA (0,5 – 1 µg) in 7,5 µl Wasser überführt. Eine
Negativkontrolle erfolgte mit Aqua bidest. Um die Reaktion starten zu können, wurden jedem Ansatz 12,5 µl SYBR Green hinzugefügt. Insgesamt wurden 45 Zyklen durchlaufen und jeder Zyklus in drei Phasen gegliedert. Mit dem Ziel die Denaturierung in der ersten Phase einzuleiten, wurde die Temperatur von 95°C für 15 Sekunden eingehalten. Anschließend folgte eine 30 sekündige Annealingphase, in der sich die Primer an die DNA anlagerten. Um die komplementären Stränge zu synthetisieren, erhöhte sich die Temperatur zum Schluß für weitere 30 Sekunden auf 72°C. Für die einzelnen Primer unterschieden sich die Reaktionsbedingungen nur in der Wahl der Annealingtemperatur, welche sich aus dem Gehalt an verschiedenen Nukleotiden nach folgender Formel errechnete:
Tm = 2°C x (A+T) + 4°C x (C+G)
(Tm = Bindungstemperatur; C = Cytosin; G = Guanidin; A = Adenosin; T = Tyrosin)
Formel 1: Berechnung der Annealingtemperatur
Ergänzend zu der Formel wurde die errechnete Annealingtemperatur mit ± 1 °C in einer normalen PCR und einer Gelelektrophorese überprüft. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in der Milz der mRNA-Gehalt von verschiedenen Zytokinen ermittelt. Als Housekeeping Gen, mit dem die ermittelten Werte der anderen Zytokine normalisiert wurden, diente mLN51, dessen Programm sich nur aus zwei Phasen pro Zyklus zusammensetzte. In der ersten Phase wurde für 30 Sekunden eine Temperatur von 95°C gehalten. Die folgenden zwei Phasen wurden zusammengefasst und das Gerät senkte die Temperatur für 60 sek auf 60°C ab. In der Tabelle 7 im Anhang sind detaillierte Informationen zu den Primern angegeben.
2.3 Histochemie
2.3.1 Herstellen der histologischen Schnitte
Um die eingefroren Organe histologisch zu untersuchen, wurden am Cryostaten 5 – 7 µm dicke Schnitte hergestellt. Dabei wurden von jedem Organ Objektträger mit mehreren Querschnitten aus mindestens drei Ebenen versehen. Bei der Milz hatten die Ebenen einen Mindestabstand von 1mm zueinander (Abb.: 6). Wegen der geringeren Größe der mLK wurde ein Mindestabstand von 500 µm beim Schneiden eingehalten.
2.3.2 Oberflächenfärbung und Anti-BrdU-Darstellung
In der immunhistochemischen Färbung wurden für die Darstellung der weißen Pulpa die T-Lymphozyten mit dem primären Antikörper R73 gefärbt und die B-Lymphozyten mit HIS14 markiert.
Um Zellen in der S-Phase des Zellzyklus darzustellen, wurde den Tieren eine Stunde vor der Organentnahme BrdU i. v. injiziert. Ist es in den DNA-Strang von proliferierenden Zellen eingebaut worden, konnte es mit einem Anti-BrdU-Antikörper markiert werden.
Nach 10 minütiger Fixation bei -20°C in Methanol/Aceton konnte mit der Markierung der Oberfläche bzw. der verschiedenen Subpopulationen der Lymphozyten begonnen werden. Gespült in TBS-Tween wurden 50-100 µl vom primären Antikörper in der jeweiligen Verdünnung auf die Präparate pipettiert und auf die Kontrollen die entsprechende Menge an Waschpuffer. Es folgte eine Inkubationszeit von 30 min auf einem Rüttler bei 64 U/min in einer feuchten Kammer. Die Präparate wurden mit TBS- Tween gewaschen und anschließend mit dem sekundären Antikörper (Z 259) weitere 30 min auf dem Rüttler inkubiert. Daraufhin wurde mit einem tertiären Antikörperkomplex (D651), welcher APAAP gebunden hatte, auf die gleiche Weise verfahren. Zur Signalverstärkung wurden der sekundäre und tertiäre Antikörper wiederholt aufgetragen, allerdings betrug die Inkubationszeit nur 15 Minuten.
Die Oberflächenantigene, an die der primäre Antikörper gebunden hatte, wurden durch die Inkubation (25 min) des APAAP-Substrates mit Naphthol-AS-MX-Phosphat und Fast Blue in blau dargestellt (Bode et al., 1997).
Die Oberflächenfärbung war an diesem Punkt beendet, es folgten die Vorbereitungen für
Abb.: 6 Herstellung der Schnitte
min mit 70% Ethanol fixiert und anschließend 30 min oder über Nacht vor dem Ventilator getrocknet.
Für die bevorstehende Denaturierung wurden zwei Küvetten mit Formamid und eine mit TBS-Tween auf 70°C erwärmt. Einer Formamid-Küvette wurden 10 ml NaOH hinzugegeben, welche 8 min lang gerührt werden musste, bevor die Präparate für 30 sek in die Lösung getaucht wurden. Nach dem Spülen in dem warmen TBS-Tween wurden die Präparate für 15 min in die zweite Formamidlösung, welche 10 ml Trinatrium enthielt, gegeben. Es folgte ein gründlicher Waschschritt in kaltem TBS-Tween.
Nach dem Denaturieren wurden die Schnitte fixiert, wobei die Präparate bei Raumtemperatur erst 30 min lang in 1% Formaldehyd und anschließend nach kurzem Spülen für 10 min in 0,2% Glutaraldehyd getaucht wurden. Bevor das Anti-BrdU auf die Präparate gegeben werden konnte, wurden diese mit TBS-Tween mehrmals gespült.
Das Anti-BrdU inkubierte über Nacht in einer feuchten Kammer im Kühlschrank.
Am nächsten Tag schloß sich die BrdU-Darstellung mit Fast Red an. Dazu wurden nach gründlichem Waschen der sekundäre und tertiäre Antikörper zuerst für 30 min und bei der Wiederholung 15 min lang inkubiert. Das Anti-BrdU, welches im Zellinneren an BrdU gebunden hatte, wurde durch die Inkubation (25min) des APAAP-Substrates mit Naphthol-AS-MX-Phosphat und Fast Red in rot gefärbt. Ein letzter Waschgang war nötig, bevor die Präparate für 30 sek in Hämalaun gegengefärbt und eingedeckelt wurden.
2.4 Durchflusszytometrie 2.4.1 Probenvorbereitung
2.4.1.1 Herstellung der Zellsuspension
Für die Herstellung der Zellsuspension wurde ein gewogener Teil der frisch entnommenen Milz mit dem Stempel einer 5 ml Spritze durch ein Sieb gerieben, welches in einer Petrischale mit PBS (pH 7,2) lag, bis nur noch das bindegewebige Gerüst auf dem Sieb übrig blieb. Die gewonnen Zellen wurden in ein großes Blue Cap überführt, auf 50 ml mit PBS aufgefüllt und bei 400g 10 min lang zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das rote Pellet erst in 10 ml einer Lösung nach Schwinzer resuspendiert und mit dieser auf 50 ml aufgefüllt. Nach 1-2 min Inkubation, in der die Erythrozyten lysiert wurden, konnte die Lösung weitere 10 min bei 400 g zentrifugiert werden. Das weiße Pellet wurde in 4-5 ml Waschpuffer resuspendiert.
2.4.1.2 Zellzahlbestimmung
Für die Färbung der Zellen im FACS wurden 1,5 Mio Zellen pro Well benötigt. Um diese zu ermitteln, wurden die Zellsuspension in einer 1:50 Verdünnung mit 16% Trypanblau zusammenpipettiert und auf die Neubauer Zählkammer gegeben. Nur hell leuchtende, vitale Zellen wurden gezählt. Aus der Summe der vier Zählquadranten wurde der Mittelwert gebildet. Um die absolute Zellzahl zu berechnen wurde folgende Formel 2 angewendet: absolute Zellzahl =
Mittelwert x Volumen x Verdünnungsstufe x Kammerfaktor
Aus der Beschreibung zur Erstellung der Zellsuspension sind folgende Daten zu entnehmen:
Volumen – 4000-5000µl Verdünnungsstufe – 50 (10µl : 490µl) Kammerfaktor – 10
2.4.2 Darstellung von Adhäsionsmolekülen und Aktivitätsmarkern auf den Subpopulationen der T-Lymphozyten (Dreifarbenfluoreszenz)
1,5 x 106 Zellen wurden in jedes Well der 96 Well-Platte pipettiert und mit 100 µl Waschpuffer aufgefüllt. Die Platte wurde bei 1800 U eine Minute lang zentrifugiert und der Überstand ausgeschlagen. Das durch die Zentrifugation entstandene Pellet wurde anschließend aufgelöst, indem die Platte für 15 sek auf den Rüttler gestellt wurde. Auf die gereinigten Zellen wurden zur Phänotypisierung 50 µl unkonjugierte primäre Antikörper in der entsprechenden Verdünnung aufgetragen. Da es sich hierbei um unkonjugierte primäre Antikörper handelte, wurden 50 µl eines sekundären Antikörpers (Ratte Anti-Maus Kappa PE) zur Detektion von CD45RC+ (Ox22), IL-2 Rezeptor (Ox39), L-Selektin (Ox85), HP2/1 (α4-Integrin), LFA-1 (WT1) und ICAM-1 (1A29) nach dem oben beschriebenen Verfahren aufgetragen und abgewaschen.Den Kontrollen wurden 50 µl Waschpuffer hinzu gegeben. Nach jeder Antikörpergabe (50 µl des Antikörpers) war eine Inkubationszeit von 20 min einzuhalten. Anschließend wurden die Antikörper in zwei identischen Waschschritten, wie oben beschrieben, heraus gewaschen. Darauf folgte die Gabe der Antikörper zur Färbung der T-Lymphozyten und deren Subpopulationen. Dazu wurden die T-Lymphozyten mit dem primären biotinylierten Antikörper R73 dargestellt. Für den Nachweis wurde als sekundärer Antikörper Red 670 verwendet, um die Antigen-Antikörper-Interaktion indirekt zu detektieren (Luttmann et al, 2004). Zur weiteren Unterteilung der Subpopulationen der T- Lymphozyten wurden die R73 markierten Zellen noch zusätzlich mit W3/25 für die CD4+
und Ox8 für die CD8+ Zellen inkubiert. Diese beiden primären Antikörper haben Fluoresceinisothiocyanat (FITC) gebunden und können auf diese Weise direkt ohne Bindung weiterer Antikörper detektiert werden. Alle erwähnten Antikörper wurden, wie oben beschrieben, 20 min lang inkubiert und abgewaschen. Nach dem letzten Aufschütteln wurde in jedes Well Messpuffer pipettiert und die Zellsuspension für die Messung in Falcon-Röhrchen überführt. Daraufhin wurden in jeder Probe 50.000 lebende Zellen mit dem Durchflusszytometer gemessen.
2.4.3 Färbung der B-Lymphozyten (Dreifarbenfluoreszenz)
Der Ablauf der Färbung der B-Lymphozyten entspricht der Beschreibung von Kapitel 4.2.
Allerdings wurde hier zur Markierung der B-Lymphozyten Ox33 verwendet. Da es sich um einen unkonjugierten Antikörper handelte, wurde Anti-Maus gekoppelt mit PE zur Detektion der Bindung an der Oberflächenstruktur benötigt. Für weitere Details zum Phänotyp der B-Lymphozyten wurde IgM bio, ein Antikörper, welcher an das IgM auf den B-Lymphozyten binden sollte, auf die Zellen gegeben. Um diese Bindung zu visualisieren, wurde als sekundärer Antikörper Red 670 nach demselben Verfahren inkubiert.
2.4.4 Färbung der Dendritischen Zellen (Vierfarbenfluoreszenz)
Die Färbung der Dendritischen Zellen (DC) ist ebenfalls eine Oberflächenfärbung, mit deren Hilfe Oberflächenmoleküle detektiert wurden. Die Messung erfolgte am FACScalibur, da das Gerät mit vier Fluoreszenzfarbstoffen ausgestattet ist.
Zunächst konnten die T- und B-Zellpopulation durch die Inkubation von Ox12 und R73 PE konkjugierter Antikörper identifiziert werden. Unter den doppelt negativen Zellen wurden DC durch MHCII (Ox6 FITC) und αε-Integrin (Ox62 bio) detektiert. Die Phänotypisierung dieser doppelt positiven Zellen erfolgte durch die Inkubation von ED9 (SIRP), HP2/1 (α-Integrin), 8A2 (CD11c), B7.1 (CD80L), 3.2.3 (NKR) und Ox39 (IL-2 Rezeptor), welche durch Anti-Maus gekoppelt mit APC, als sekundären Antikörper, nachgewiesen wurden. Der Ablauf der Färbung entsprach der Oberflächenfärbung, wie sie in Kapitel 4.2. beschrieben steht, indem 1,5 x 106 Zellen in jedes Well pipettiert und gewaschen wurden, um anschließend die unkonjugierten primären Antikörper zu inkubieren.
