3. Ergebnisse
3.4 Darstellung der lymphatischen Organe in der Immunhistologie
Im vorangegangenen Teil der Arbeit wurden die Veränderungen der verschiedenen Zellpopulationen gezeigt. Allerdings konnte diesen Ergebnissen nicht entnommen werden, in welchen Arealen der Milz sich diese Veränderungen ereigneten. Waren bestimmte Kompartimente besonders beteiligt? Um auf diese Frage eingehen zu können, wurde jede Milz einer immunhistologischen Färbung unterzogen, wobei B-Lymphozyten (blau) und BrdU+ proliferierende Zellen (rot) spezifisch dargestellt wurden.
Die Hauptveränderungen wurden in den folgenden Abbildungen repräsentativ für jede Versuchsgruppe festgehalten.
3.4.1 Histologische Veränderungen in der Milz der Kontrollgruppe
Die Abbildungen 41 und 42 zeigen die beiden Kompartimente der Milz. In der weißen Pulpa befindet sich das T-Zellareal (TZ), auch PALS genannt, welches die Arterien (dicker Pfeil) umgibt. Weiterhin erkennbar sind die beiden B-Zellpopulationen, wovon eine Population das B-Zellareal (BZ) formt, in welchem die Follikel reifen und die zweite Population, welche die Marginalzone (MZ) bildet. In beiden Kompartimenten treten nach der mLK-Resektion die roten proliferierenden Zellen insgesamt häufiger auf und lagern sich im Follikel verstärkt zusammen (dünner Pfeil). Außerdem sind noch in der Marginalzone die so genannten „bridging channels“ zu erkennen, der Ort, von wo aus die Lymphozyten in die rote Pulpa gelangen, um über den Blutweg das Organ zu verlassen (Liu et Banchereau, 1996).
(PALS)
Um die beschriebenen Veränderungen semiquantitativ zu erfassen, wurden aus jeder Ebene drei Querschnitte herangezogen und auf jedem die Anzahl an BrdU+ Zellen ermittelt, welche sich zusammengelagert im Follikel befanden. Zell-Cluster ab 28 BrdU+ Zellen wurden notiert und mit den anderen Ansammlungen aus der gleichen Ebene verglichen, um so einen genaueren Eindruck von dem dreidimensionalen Gebilde zu erhalten. Die Zählung aller Querschnitte bestätigte die Zunahme der proliferierenden Zellansammlungen im Follikel nach mLK-Resektion (Abb.:43).
Abb. 41: Milz der Kontrollgruppe Abb. 42: Milz der Kontrollgruppe vor der mLK-Resektion nach der mLK-Resektion
Dargestellt sind die rote Pulpa (RP) und die weiße Pulpa (PALS) der Milz in den 10x Vergrößerungen.
Die PALS besteht aus dem T-Zellbereich (TZ), den die Arterie (dicker Pfeil) unmittelbar umgibt. An den T-Zellbereich lagern sich in blau dargestellt die Lymphozyten (BZ) an. Um die T- und B-Zellbereiche formt eine gesonderte B-Zellpopulation die Marginalzone (MZ), die von den bridging channels (BC) unterbrochen wird. In rot sind die proliferierenden Zellen (dünner Pfeil) dargestellt.
Abb. 43: Darstellung der proliferierenden Zellansammlungen in der Milz der Kontrollgruppe.
Die verwendeten Symbole stellen die Summe der Follikel dar, die mindestens 28 BrdU+ Zellen enthalten. Angegeben sind die Mittelwerte als durchgezogene Linie.
MZ TZ
BZ
Ansammlung an proliferierenden Zellen in der
Milz bei der Kontrollgruppe
0 10 20
Schein-OP Resektion
*
Anzahl der BdrU+ Ansammlungen
TZ
BC BZ
MZ
3.4.2 Histologische Veränderungen in der Milz der behandelten Gruppe
Im direkten Vergleich waren die BrdU+ Zellen in der gesamten Milz nach der Resektion stärker vertreten und auch die Ansammlungen in den Follikeln kamen häufiger vor (Abb.:44 und 45), was durch die Zählung aller Querschnitte bestätigt wurde (Abb.: 46). Neu war die ausgeprägte bandförmige Formation der BrdU+ Zellen an der Grenze zur Marginalzone, besonders bei den Resezierten (Abb.: 45).
Abb. 44: Milz bei der behandelten Gruppe Abb. 45: Milz bei der behandelten Gruppe vor der mLK-Resektion nach der mLK-Resektion
Dargestellt sind die rote Pulpa (RP) und die weiße Pulpa (PALS) der Milz in den 10x Vergrößerungen.
Die PALS besteht aus dem T-Zellbereich (TZ), den die Arterie (dicker Pfeil) unmittelbar umgibt. An den T-Zellbereich lagern sich, in blau dargestellt, die Lymphozyten (BZ) an. Um die T- und B-Zellbereiche formt eine gesonderte B-Zellpopulation die Marginalzone (MZ). In rot sind die Ansammlungen der proliferierenden Zellen (dünner Pfeil) dargestellt. Eingekreist ist die bandförmige Formation der proliferierenden Zellen.
Abb. 46: Darstellung der proliferierenden Zellansammlungen in der Milz der behandelten Gruppe. Die verwendeten Symbole stellen die Summe der Follikel dar, die mindestens 28 BrdU+ Zellen enthalten. Angegeben sind die Mittelwerte als durchgezogene Linie.
RP
Ansammlung an proliferierenden Zellen in der
Milz bei der behandelten Gruppe
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0
Schein-OP Resektion
*
Anzahl der BdrU+ Ansammlungen
MZ
BZ TZ
3.4.3 Einfluss der mLK-Resektion auf die peripheren lymphatischen Organe
Neben der Situation in der Milz nach der mLK-Resektion stellte sich die Frage, ob der Eingriff auch Auswirkungen auf andere lymphatische Organe hat. Dazu wurde repräsentativ aus jeder Versuchsreihe ein axillärer Lymphknoten (axLK) immunhistologisch gefärbt, weil dieser unter den SPF Bedingungen der Tierhaltung einer geringen Anzahl an Antigenen ausgesetzt war. Folglich ist eine Vermehrung von aktivierten Lymphozyten nach einem möglichen Antigenkontakt eher histologisch darstellbar. Die Betrachtung der histologischen Bilder zeigte keine Unterschiede zwischen Scheinoperierten und den Resezierten (Abb.: 47 bis 50).
Abb. 47: axLK der Kontrollgruppe Abb. 48: axLK der Kontrollgruppe vor der mLK-Resektion nach der mLK-Resektion
Abb. 49: axLK der behandelten Gruppe Abb. 50: axLK der behandelten Gruppe vor mLK-Resektion nach der mLK-Resektion
Dargestellt sind in blau die Lymphozyten (BZ), welche sich im Kortex zu Follikeln anordnen. Dem B-Zellareal folgt zur Mitte hin das ebenfalls zellreiche T-B-Zellareal, welches im Paracortex gelegen ist. In rot sind die Ansammlungen der proliferierenden Zellen (dünner Pfeil) dargestellt. Relativ zellarm ist die Markzone (M) des axillären Lymphknotens zu sehen.
TZ
BZ
TZ BZ
TZ M
M
TZ
M
M BZ
BZ
Zytokinexpression der behandelten Gruppe
IL-1a Schein-OP IL-1a Resektion IL-1b Schein-OP IL-1b Resektion IL-6 Schein-OP IL-6 Resektion IL-10 Schein-OP IL-10 Resektion IL-12 Schein-OP IL-12 Resektion IFN-γ Schein-OP IFN-γ Resektion TNF-α Schein-OP TNF-α Resektion TGFβ Schein-OP TGF-β Resektion 0
5 10 15
copies/copy mLN51
3.5 Auswertung der Real-time PCR
Die Auswertung ergab eine signifikante Hochregulierung von TGF-β1 in beiden Versuchsreihen (Abb.: 51 und 52), wobei in der Kontrollgruppe die Genexpression nach der mLK-Resektion (11fach) schwächer ausfiel als bei den Schein-OPs (14fach).
In der behandelten Gruppe betrug die Erhöhung bei den Resezierten das 10fache, während die Regulation bei den Schein-OPs um das 5fache angehoben war. Neben TGF-β1 war auch die Genexpression von IL-1β um das 3fache bei den Scheinoperierten und Resezierten nach oben reguliert, hier konnten keine großen Unterschiede durch die mLK-Resektion nachgewiesen werden.
Abb. 51: Genexpression der Zytokine in der Kontrollgruppe
Abb. 52: Genexpression der Zytokine in der behandelten Gruppe
In den Abbildungen 51 und 52 ist das Verhältnis des RNA-Gehalts der Zytokine zu mLN51 anhand der Anzahl der Kopien (n = 3) dargestellt. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen indiziert, wenn die Genexpression > 3fache hochreguliert wurde.
Zytokinexpression der Kontrollgruppe
IL-1a Schein-OP IL-1a Resektion IL-1b Schein-OP IL-1b Resektion IL-6 Schein-OP IL-6 Resektion IL-10 Schein-OP IL-10 Resektion IL-12 Schein-OP IL-12 Resektion IFN-γ Schein-OP IFN-γ Resektion TNF-α Schein-OP TNF-α Resektion TGF-β Schein-OP TGF-β Resektion 0
5 10 15
copies/copy mLN51
*
*
*
* *
*