Aus der Klinik für Rinder
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Bedeutung und Funktion der somatotropen Achse im Rahmen der metabolischen Adaptation in der Trächtigkeit
bei Milchkühen
Habilitationsschrift
zur Erlangung der VENIA LEGENDI an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
vorgelegt von
JProf. Dr. med. vet. Marion Schmicke, geb. Piechotta
Hannover 2016
Tag der nichtöffentlichen wissenschaftlichen Aussprache: 02.11.2016
Die Studien dieser Habilitationsarbeit wurden durch Pfizer Animal Health, Zoetis, das EMIDA-ERA Network awarded to Prof. M. Sheldon und die Dr. Dr. h.c. Karl Eibl-Stiftung finanziell unterstützt.
Für meine Eltern,Christian, Mathea und Emilian.
Inhaltsverzeichnis
1. Liste der verwendeten Publikationen ... 1
2. Abkürzungsverzeichnis ... 3
3. Einleitung ... 5
3.1. Endokrine Stoffwechseladaptation an die Trächtigkeit und Laktation ... 6
3.2. Die somtatotrope Achse und das lokale IGF-System ... 7
3.2.1. Regulation der Wachstumshormonausschüttung und seine biologische Wirkung ... 10
3.2.2. Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren ... 14
3.2.3. Modulation der IGF-Bioverfügbarkeit durch Bindungsproteine ... 16
3.3. Bedeutung und Funktion der somatotropen Achse im Rahmen der Stoffwechseladaptation an die Trächtigkeit und frühe Laktation der Milchkuh ....18
3.3.1. Die somatotrope Achse und das IGF-System in der frühen Trächtigkeit ... 18
3.3.2. Die somatotrope Achse während der späten Trächtigkeit und der frühen Laktation .... 21
4. Ziele der Arbeit ...26
5. Ergebnisse ...27
5.1. Pathophysiologischer Zusammenhang zwischen der somatotropen Achse und dem Auftreten postpartaler Produktionserkrankungen bei der Milchkuh ...27
5.2. Detaillierte Charakterisierung der somatotropen Achse während der späten Trächtigkeit mit besonderem Augenmerk auf tierindividuelle Unterschiede ...29
5.3. Einfluss von Steroidhormonen auf die somatotrope Achse ...36
5.4. Metabolische Adaptation während der frühen Trächtigkeit der Milchkuh ...38
6. Übergreifende Diskussion...41
6.1. Stoffwechseladaptation in der späten Trächtigkeit der Milchkuh – die somatotrope Achse ...41
6.1.1. Entkopplung der somatotropen Achse ... 43
6.1.2. Tierindividuelle Unterschiede in der antepartalen peripheren IGF-1-Konzentration ... 45
6.2. Stellenwert der somatotropen Achse für die postpartale Gesundheit von Milchkühen ...48
6.3. Die Rolle von Steroidhormonen und der frühen Trächtigkeit auf die somatotrope Achse ...52
6.3.1. Zusammenhänge zwischen Steroidhormonen und der somatotropen Achse ... 52
6.3.2. Zusammenhänge zwischen der frühen Trächtigkeit und der somatotropen Achse ... 54
6.4. Ausblick...58
7. Zusammenfassung ...60
8. Summary ...62
9. Literaturverzeichnis ...64
10. Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen ...85
11. Danksagung ...90
1
1. Liste der verwendeten Publikationen
Publikation 9
Meyerholz M M, Mense K, Knaack H, Sandra O, Schmicke M (Piechotta). Pregnancy induced ISG-15 and MX-1 gene expression is detected in the liver of Holstein Frisian heifers during late peri-implantation period.Reprod Domest Anim. 2016 Feb; 51(1):175-177.
Publikation 8
Meyerholz M M, Mense K, Lietzau M, Kassens A, Linden M, Knaack H, Wirthgen E, Hoeflich A, Raliou M, Richard C, Sandra O, Schuberth H-J, Hoedemaker M, Schmicke M (Piechotta). Serum IGFBP4 concentration decreased in dairy heifers towards day 18 of pregnancy. J Vet Sci. 2015 Dec 30; 16(4):413-21.
Publikation 7
Mense K, Meyerholz M, Araujo MG, Lietzau M, Knaack H, Wrenzycki C, Hoedemaker M, Piechotta M. The somatotropic axis during the physiological estrus cycle in dairy heifers- Effect on hepatic expression of GHR and SOCS2. J Dairy Sci. 2015; 98(4):2409-18.
Publikation 6
Antepartal insulin-like growth factor 1 and insulin-like growth factor binding protein 2 concentrations are indicative of ketosis in dairy cows. Piechotta M, Mysegades W, Ligges U, Lilienthal J, Hoeflich A, Miyamoto A, Bollwein H. J Dairy Sci. 2015;98(5):3100-9.
Publikation 5
Antepartal insulin-like growth factor concentrations indicating differences in the metabolic adaptive capacity of dairy cows. Piechotta M, Holzhausen L, Araujo MG, Heppelmann M, Sipka A, Pfarrer C, Schuberth HJ, Bollwein H. J Vet Sci. 2014;15(3):343-52.
2 Publikation 4
Effects of parturition and feed restriction on concentrations and distribution of the insulin-like growth factor-binding proteins in plasma and cerebrospinal fluid of dairy cows. Laeger T, Wirthgen E, Piechotta M, Metzger F, Metges CC, Kuhla B, Hoeflich A. J Dairy Sci. 2014 May;97(5):2876-85.
Publikation 3
Hepatic mRNA expression of acid labile subunit and deiodinase 1 differs between cows selected for high versus low concentrations of insulin-like growth factor 1 in late pregnancy.
Piechotta M, Kedves K, Araujo MG, Hoeflich A, Metzger F, Heppelmann M, Muscher-Banse A, Wrenzycki C, Pfarrer C, Schuberth HJ, Hoedemaker M, Bollwein H, Kaske M. J Dairy Sci.
2013 Jun;96(6):3737-49.
Publikation 2
Short communication: Prepartum plasma insulin-like growth factor-I concentrations based on day of insemination are lower in cows developing postpartum diseases. Piechotta M, Sander AK, Kastelic JP, Wilde R, Heppelmann M, Rudolphi B, Schuberth HJ, Bollwein H, Kaske M. J Dairy Sci. 2012 Mar;95(3):1367-70.
Publikation 1
Ex vivo phagocytic overall performance of neutrophilic granulocytes and the relation to plasma insulin-like growth factor-I concentrations in dairy cows during the transition period.
Piechotta M1, Sander AK1, Schlamberger G, Bollwein H, Kaske M, Sipka A, Schuberth HJ. J Dairy Sci. 2011 Apr;94(4):1762-71.
1both authors contributed equally to this work
3
2. Abkürzungsverzeichnis
ALS Acid labile subunit
BCS Body conditioning score
BHB β-Hydroxybutyrat
bST bovines Somatotropin
CIS Cytokine-inducible SH-containing Protein
DIO1 Deiodinase 1
GH Wachstumshormon engl. Growth Hormone
GHBP Growth Hormone Binding Protein
GHIH Growth Hormone Inhibiting Hormone
GHR Wachstumshormonrezeptor engl. Growth hormone receptor
GHRH Growth Hormone Releasing Hormone
IGF Insulinähnlicher Wachstumsfaktor engl. Insulin-like Growth Factor
IGF-1 Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 engl. Insulin-like Growth Factor-1
IGF-2 Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-2 engl. Insulin-like Growth Factor-2
IGFBP Insulin-like Growth Factor Binding Protein
IFNƬ Interferon Ƭ
IGFR Insulinähnlicher Wachstumsfaktor Rezeptor engl. Insulin-like Growth Factor Receptor
4 IRS-1 Insulin-Rezeptor Substrat-1
ISG IFNƬ-stimulierte Genexpression
ISG15 Interferon-stimulated gene 15 kDa protein
JAK Januskinase
ml Milliliter
mRNA messenger Ribonukleinsäure
MX1 myxovirus resistance gene 1
NEFA non-esterified fatty acids
ng Nanogramm
PAPPA Pregnancy-associated plasma protein-A
PCR Polymerasekettenreaktion
PIAS Protein Inhibitor of Activated STAT SOCS Suppressor of Cytokine Signaling
STAT Signaltransducer and Activator of Transcription
T3 Triiodothyronin
T4 Thyroxin
TMA Trockenmasseaufnahme
TNFα Tumornekrosefaktor-α
5
3. Einleitung
Für die Etablierung und Aufrechterhaltung einer Trächtigkeit und die Stoffwechselumstellung nach der Geburt zugunsten der einsetzenden Laktation sind komplexe immunologische, metabolische und endokrinologische Adaptationsvorgänge nötig. Pluripare Milchkühe etablieren die erneute Trächtigkeit während der Hochlaktation, einer Phase besonderer Stoffwechselanforderung. Demnach ist neben lokalen immunologischen, auto- sowie parakrinen Prozessen am Endometrium, die zur Erkennung und Aufrechterhaltung einer Gravidität erforderlich sind, auch eine metabolische Anpassung des maternalen Stoffwechsels an den erhöhten Energiebedarf während einer Gravidität wichtig. Nach der Geburt ist durch das Einsetzen der Laktation der Hochleistungsmilchkuh eine Stoffwechselanpassung an den erhöhten Energiebedarf nötig, denn begleitet wird dieser von einer verringerten Trockenmasseaufnahme (TMA) der Kuh. Bereits in der späten Trächtigkeit beginnt die TMA zu sinken und in der letzten Woche vor der Geburt ist die TMA deutlich reduziert (Hayirli et al., 2002). Daraus resultiert eine in der Literatur als negative Energiebilanz beschriebene katabolen Stoffwechsellage (Grummer et al., 2004; Weber et al., 2013; Hayirli et al., 2002). Diese wiederum wurde in den vergangenen Jahrzehnten immer wieder auch mit einer sinkenden Fertilität der Milchkuh und einer erhöhten Inzidenz von postpartalen Produktionserkrankungen assoziiert, zu denen sowohl metabolische Erkrankungen wie Ketosen, Leberverfettung, Hypokalzämien und Pansenazidosen als auch entzündliche Erkrankungen (v. a. Mastitiden und Metritiden) gezählt werden (Chagas et al., 2007; Esposito et al., 2014). Für gesunde Milchkühe ist demnach eine adäquate metabolische Anpassung an den erhöhten Energiebedarf in der Trächtigkeit und zu Beginn der Laktation von enormer Bedeutung.
Um den modernen Ansprüchen an eine effektive Milchproduktion gerecht zu werden, die gleichzeitig mit einem hohen Tierwohl vereinbar sein soll, ist ein vertieftes physiologisches Verständnis der komplexen metabolischen Adaptation an die frühe Laktation, aber auch an die Trächtigkeit unabdingbar. Erzielte Ergebnisse können dazu beitragen, zukünftig das Auftreten postpartaler Produktionserkrankungen mit geeigneten züchterischen oder Managementstrategien zu minimieren oder gezielt durch meta- oder prophylaktische Maßnahmen eingreifen zu können. Im Folgenden werden einige wesentliche Grundlagen der endokrinen Stoffwechseladaptation kurz zusammengefasst und ein zentrales endokrines System, die somatotrope Achse, vertieft dargestellt. Die somatotrope Achse hat eine zentrale
6 Bedeutung bei der Stoffwechseladaptation während der Trächtigkeit und frühen Laktation und ist Hauptfokus dieser Habilitationsschrift.
3.1. Endokrine Stoffwechseladaptation an die Trächtigkeit und Laktation
Bereits früh in der Gestation kommt es zu einer Anpassung des maternalen Stoffwechsels, um den Organismus auf einen erhöhten Energiebedarf während der fortschreitenden Gravidität einzustellen. Für das Rind bzw. die Milchkuh ist zur Stoffwechselanpassung in der frühen Trächtigkeit wenig bekannt (siehe dazu Kapitel 3.3.1). Von anderen Säugetierspezies weiß man, dass es zum Beispiel bereits im ersten Trimester der Gestation zur Einlagerung von Fett als Energiereserve kommt. Hinsichtlich der maternalen metabolischen Anpassung an die Frühlaktation spielen vor allem Steroidhormone eine Rolle. Bei Ratten begünstigt beispielsweise die verlängerte Progesteronsekretion in Verbindung mit niedrigen Östrogenspiegeln in der Frühgestation eine erhöhte Futteraufnahme. Durch gastrointestinale Hormone wie Gastrin oder Sekretin wird laut Svennersten-Sjaunja und Olsson (2005) ein trophischer Effekt auf die Leber ausgeübt oder aber auch die Produktion von Galle und pankreatischen Enzymen gesteigert. Bei der Frau hat humanes Choriogonadotropin einen direkten stimulierenden Einfluss auf die Schilddrüse (Moleti et al., 2014).
Im Gegensatz zur frühen sind über die späte Trächtigkeit weitaus mehr endokrine Grundlagen zur Stoffwechselanpassung beim Rind bekannt, hier vor allem nach dem Trockenstellen und in der Frühlaktation. Diese Stoffwechselanpassung resultiert insbesondere aus dem erhöhten Energiebedarf der Milchkuh, der durch den plazentaren Verbrauch von Glucose und Aminosäuren um 3050% höher ist als bei einer nichttragenden Kuh. Einige Tage nach der Geburt steigt der Energiebedarf der Milchkuh durch die einsetzende Laktation noch um ein Vielfaches (Bell, 1995). Wie bereits angedeutet, führt die gleichzeitig stattfindende Futteraufnahmedepression, die bereits ante partum einsetzt (Hayirli et al., 2002), dazu, dass Milchkühe bei einsetzender Laktation in eine katabole Stoffwechsellage gelangen und zur Deckung der benötigten Energie diese vor allem durch Lipolyse akquirieren (Bell, 1995).
Die Mobilisation körpereigenen Fettgewebes wird dabei durch niedrige Leptin-, Insulin- und Schilddrüsenhormonkonzentrationen sowie erhöhte Wachstumshormon(GH)-Konzentra- tionen, als auch ein erhöhtes Glukagon-/Insulinverhältnis und hohe Kortisolkonzentrationen bedingt. Das komplexe Ineinandergreifen dieser endokrinen Systeme führt zu einer Verminderung der Lipogenese und einer reduzierten Ansprechbarkeit des Fettgewebes gegenüber Insulin (Insulinresistenz). Zusätzlich kommt es zu einer verstärkten Antwort des
7 Fettgewebes auf Katecholamine und sympatho-adrenerge Signale, die zu einer Verstärkung des lipolytischen Signals beitragen und somit die Lipolyse begünstigen (Bell, 1995; Herdt, 2000; Vernon, 2005; Vernon et al., 2002; Weber et al., 2013; Accorsi et al., 2005; Sartin et al., 1988). Auch das aus dem Fettgewebe stammende Adiponektin-1 spielt eine Rolle im Rahmen des Energiemetabolismus (Ohtani et al., 2012). Ghrelin, ein Hormon des Pankreas, hat seinerseits Einfluss auf die Ausschüttung von GH und führt zur Stimulation der Glucose- und Insulinfreisetzung bei laktierenden Kühen und ist ebenfalls im komplexen Netzwerk der peripartal stattfindenden endokrinen Adaptation der Milchkuh wichtig (Itoh et al., 2006). Die Steroidhormone Progesteron, Östradiol und Östron haben ebenfalls Einflüsse auf metabolische Hormone und somit auf den Stoffwechsel und sind demnach im Rahmen der metabolischen Adaptation an die Trächtigkeit und Frühlaktation von Bedeutung (Kim et al., 2014; Fernández-Pérez et al., 2013; Nadal et al., 2009; Ropero et al., 2008; Van der Walt and Linington, 1990; Tahboub and Arafah, 2009; Meinhardt and Ho, 2006; Caufriez et al., 2009).
Die Laktation post partum wird endokrinologisch vornehmlich durch Prolaktin und GH gesteuert, wobei bei Rindern, im Vergleich zu Mensch und Nagetier, GH eine dem Prolaktin übergeordnete Rolle spielt (Svennersten-Sjaunja and Olsson, 2005). Innerhalb der komplexen endokrinen Regulationsebenen und verschiedenen beteiligten Hormonsysteme ist GH durch seine übergeordnete Rolle im Hinblick auf die Lakto- und Galaktopoese für die Milchkuh von zentralem Interesse. Im Folgenden soll daher detailliert auf die somatotrope Achse der Milchkuh während der Trächtigkeit und Frühlaktation eingegangen werden, die wissenschaftlicher Fokus dieser Habilitationsarbeit ist.
3.2. Die somtatotrope Achse und das lokale IGF-System
Zentrale Komponenten der „somatotropen Achsen“ sind das in den somatolaktotropen Zellen der Adenohypophyse gebildete GH (auch Somatropin, Somatotropin oder somatotropes Hormon genannt) und der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor (Insulin-like Growth Factor, IGF), der in der Leber, aber auch in vielen anderen Geweben/Zellen gebildet wird (Lucy, 2008; Renaville et al., 2002; Frago and Chowen, 2005).
Die Ausschüttung von GH wird dabei durch hypothalamische Peptide, das Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) und das Growth Hormone Inhibiting Hormone (GHIH) reguliert.
Letzteres ist auch unter den Begriffen Somatostatin oder Somatotropin-Inhibitor Hormone bekannt. Primär wird GHIH im Hypothalamus gebildet, aber auch in D-Zellen des Pankreas (Abbildung 1).
8 Abbildung 1: Schematische Darstellung der somatotropen Achse [ALS: Acid labile subunit, GH:
Growth Hormone, GHIH: Growth Hormone Inhibiting Hormone, GHR: Growth Hormone Receptor, GHRH: Growth Hormone Releasing Hormone, IGF-1: Insulin-like Growth Factor 1, IGFBP: Insulin- like Growth Factor Binding Protein]
„Somatotrop“ bedeutet dabei „auf den Körper wirkend“. Die Namensgebung verdeutlicht bereits, dass diese endokrine Achse vielfältige Funktionen im Organismus ausübt. GH wirkt dabei sowohl direkt auf Zellen, die den Wachstumshormonrezeptor (Growth Hormone Receptor, GHR) exprimieren, als auch indirekt auf den Organismus, indem IGF-1 oder IGF-2 gebildet werden, die wiederum über entsprechende IGF-Rezeptoren (IGFR) Wirkungen auf Zellebene haben (Frago and Chowen, 2005). Überdies werden die IGFs an verschiedene Bindungsproteine gekoppelt im Blut transportiert, die einerseits die Bioverfügbarkeit und den Transport von IGFs regulieren, andererseits aber auch direkte Effekte auf Zielzellen ausüben können (Jones and Clemmons, 1995).
Beschäftigt man sich mit den biologischen Wirkungen der Komponenten der somatotropen Achse, muss der endokrine Anteil von para- und autokrinen Funktionen des lokalen IGF-
9 Systems unterschieden werden. Als endokrin wird die Sekretion von Hormonen aus einer Hormondrüse in die Blutbahn bezeichnet, wobei die Wirkung der Hormone an weiter entfernten Zielzellen erfolgt. Im Gegensatz dazu bezeichnet der parakrine Sekretionsmodus von Zellen eine Wirkung der Hormone auf benachbarte Zellen und der autokrine eine lokale Hormonwirkung auf dieselbe Zelle. Neben der in Abbildung 1 dargestellten endokrinen somatotropen Achse werden sowohl GH als auch IGF und die IGFBPs von einer Vielzahl anderer Zellen gebildet und haben in lokalen Körperkompartimenten parakrine und autokrine Funktionen, die von der endokrinen somatotropen Achse getrennt werden müssen. Das lokale endometriale IGF-System ist beispielsweise für embryonales Wachstum und die Konzeptuselongation während der frühen Trächtigkeit der Milchkuh von Bedeutung. Es besteht aus den zwei Liganden IGF-1 und IGF-2 sowie den zugehörigen Rezeptoren IGFR-1 und IGFR-2 und sechs verschiedenen spezifischen IGF-Bindungsproteinen (IGFBP1-6) (McCarthy et al., 2012). Es werden noch weitere Bindungsproteine in der Literatur be- schrieben: IGFBP7, IGFBP8, IGFBP9 und IGFBP10 (Chen et al., 2011; Cagnone and Sirard, 2013; Minchenko et al., 2015), die aber bisher wenig bis gar nicht beim Rind untersucht worden sind.
Interaktionen zwischen der endokrinen somatotropen Achse und dem lokalen IGF-System sind für die Milchkuh bisher nur ansatzweise untersucht. Aufgrund der bedeutenden endokrinologischen Adaptationen innerhalb der somatotropen Achse im Rahmen der Stoffwechselanpassung an die Trächtigkeit sind gerade solche Verbindungen von besonderem Interesse. Im Folgenden werden kurz die einzelnen Komponenten der somatotropen Achse näher beschrieben.
10 Abbildung 2: Schematische Darstellung des lokalen IGF-Systems am Beispiel des Endometriums [GHR: Growth Hormone Receptor, IGF-1: Insulin-like Growth Factor 1, IGF-2:
Insulin-like Growth Factor 2, IGFBP: Insulin-like Growth Factor Binding Protein, IGFBPR:
Insulin-like Growth Factor Binding Protein Receptor, IGFR-1: Insulin-like Growth Factor-1 Receptor, IGFR-2: Insulin-like Growth Factor-2 Receptor]
3.2.1. Regulation der Wachstumshormonausschüttung und seine biologische Wirkung
Die hypophysäre Ausschüttung von GH erfolgt pulsatil (Enright et al., 1988; Butler et al., 2003). Die Modulation von Frequenz und Amplitude der GH-Pulsatilität wird durch neuro- endokrine und andere periphere Signale gesteuert (Kim, 2014). Für die Modulation der somatotropen Achse im Rahmen der Trächtigkeit haben auch bei der Milchkuh Sexualsteroidhormone als periphere Signale einen Einfluss auf die hypophysäre GH- Ausschüttung. Die Applikation von Östradiol führt zu einer erhöhten Ausschüttung von GH (Colak et al., 2011). Hierbei ist nicht nur die Gesamt-GH-Menge erhöht, sondern auch die
Frequenz und Amplitude der GH-Pulse. Progesteron hingegen vermindert die
11 GH-Konzentration, führt aber zu keinerlei Änderungen von Frequenz und Amplitude der GH-Pulsatilität. Auch die gleichzeitige Applikation von Östradiol und Progesteron hat keinen Einfluss auf die GH-Pulsatilität (Colak et al., 2011).
Der Transport von GH erfolgt im Blut gebunden an ein GH-Bindungsprotein (GHBP), das strukturell die extrazelluläre Domäne des GHR dargestellt. Der GHR kann beim Rind durch Proteolyse von der Zelloberfläche abgespalten werden und als Transportprotein dienen (Massart et al., 1996; Devolder et al., 1993). Der Nachweis eines hochaffinen GHBP gelang 1996 Massart et al. bei Bullen der Rasse Weißblaue Belgier, bei denen ein 24-Stunden-Profil eine deutliche zirkadiane Rhythmik von GHBP aufwies, die aber nicht kontinuierlich mit GH korrelierte. Bei anderen Spezies wird vermutet, dass die GHBP-Konzentration im Blut auch das GHR-Level in der Leber reflektieren könnte bzw. die Proteolyse des GHBP von der Leber, auch als „shedding“ bezeichnet, eine Ursache für eine verminderte hepatische GHR- Dichte sein könnte. Verantwortlich für das „shedding“ ist eine Metalloprotease (Tumornekro- sefactor α Converting Enzyme /ADAM 17; Zhang et al., 2000), die allerdings spezifisch beim Rind in der Trächtigkeit bisher nicht untersucht wurde.
Hinsichtlich der biologischen Wirkung von GH auf Zielzellen müssen zwei funktionelle Ebe- nen voneinander unterschieden werden. Indirekt vermittelte GH-Effekte an Zielzellen über den Mediator IGF-1 und den entsprechenden IGF-Rezeptor (Renaville et al., 2002) sowie direkte Effekte von GH auf Zielgewebe wie Leber, Muskulatur und Fettgewebe. Diese direk- ten Effekte werden über den GHR vermittelt, der zur Familie der Klasse-1-Hämatopoetin- Rezeptor-Superfamilie gezählt wird. Beim Rind existieren drei Promotorregionen (P1, P2 und P3) und somit drei Transkripte des GHR-Gens (GHR1A, GHR1B und GHR1C), die zum glei- chen GHR-Protein umgesetzt werden (Kim, 2014). In der Leber wird hauptsächlich das GHR1A-Transkript gebildet, das circa 50% der Gesamt-GHR-Transkripte ausmacht (Lucy et al., 2001; Kobayashi et al., 1999). Nach Bindung von GH an den GHR wird durch eine Re- zeptordimerisierung und Konformationsänderung der intrazellulären Domäne eine rezeptor- assoziierte Tyrosinkinase (Januskinase2, Jak2) aktiviert. Nachfolgend können mehrere Signaltransduktionswege induziert werden. Hierzu zählen neben dem Phosphatidylinositol- 3‘-Kinase- und dem Mitogen-activated-protein-kinase-Signalweg der Januskinase(Jak)-Sig- naltransducer-and-Activator-of-Transcription(STAT)-Signalweg. Letzterer ist der Hauptweg für die Vermittlung der GH-Wirkung am GHR und der nachfolgenden IGF-1-Expression (Birzniece et al., 2009). Hierbei wird neben STAT1, STAT3 und STAT5a vor allem STAT5b für die Vermittlung der GH-Wirkung phosphoryliert. Die Translokation eines Dimers aus zwei
12 phosphorylierten STAT5b-Molekülen in den Zellkern induziert dort eine spezifische Zielgen- aktivierung (Abbildung 3).
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Signaltransduktionsweges des Wachstumshormonrezeptors (GHR) [GH: Growth Hormone, IGF-1: Insulin-like Growth Factor 1, JAK: Januskinase, STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription; P:
Phosphat] (modifiziert nach Dissertation Mense (2014)).
Die GH-Wirkung kann neben der Modulation der Expressionshöhe des GHR auch über die Aktivierung oder Inhibition dieses Signaltransduktionsweges beeinflusst werden. Nach Frank (2001) zählt beispielsweise das Molekül SH2B-β zu den positiven Regulatoren des GHR- Signaltransduktionsweges, da es die Jak2-Aktivität steigert. Als wichtige Inhibitoren der GH- Wirkung gelten die Proteine aus der Familie Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS), die auch in der hier beschriebenen Habilitationsschrift bei der Milchkuh untersucht wurden.
Sieben SOCS-Proteine (SOCS1-7) und das Cytokine-inducible SH-containing Protein (CIS) sind bekannt und können zu einer Verminderung der Jak2-Aktivierung beitragen und so zu einer erhöhten GHR- und Jak2-Degradation führen (Frank, 2001; Krebs and Hilton, 2000).
13 Die biologische Funktion von GH beschränkt sich nicht auf die als erstes entdeckte und namensgebende Bedeutung für das Längenwachstum. Bereits in den zwanziger Jahren beschrieben Evans and Long (1921) die Stimulation des Wachstums bei Ratten durch ein Extrakt aus Hypophysen. Im Jahr 1944 wurde dann das Proteohormon-GH aus der Hypophyse extrahiert (Li and Evans, 1944). Die „Somatomedinhypothese“ von Salmon und Daughaday (1957) beschrieb dann zunächst, dass GH über seinen Mediator IGF-1 stimulierend auf das Wachstum der Knochenepiphyse wirkt. Diese Hypothese wurde aber in den darauffolgenden Jahren immer wieder erweitert und 1985 von Green et al. als „dual effector theory“ weiter entwickelt. Diese besagt, dass sowohl GH als auch IGF-1 das Wachstum positiv beeinflussen.
Neben der dem Hormon namensgebenden Wirkung auf das Wachstum am Knochen zeigt GH wichtige Effekte auf den Stoffwechsel und das Immunsystem. Sowohl die humorale als auch zelluläre Immunfunktion wie Immunglobulinsekretion von B-Zellen, die Phagozytose- kapazität von neutrophilen Granulozyten als auch die Aktivität natürlicher Killerzellen können durch GH beeinflusst werden (Auernhammer and Strasburger, 1995). Diese immunendokrine Interaktion kann auch für die postpartale Gesundheit von Milchkühen von Bedeutung sein, da eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionserkrankungen in einen Zeitraum hoher GH- Konzentrationen nach der Geburt fällt. Eine Pilotstudie zu dieser Fragestellung ist Bestandteil dieser Habilitationsschrift (Sander et al., 2011).
Die direkten Effekte von GH auf den Stoffwechsel sind vielfältig und können als insulin- antagonistisch zusammengefasst werden. Auf Fettgewebe hat GH einen lipolytischen Effekt.
Nach Gabe von GH an Kühe beobachtet man eine Erhöhung der freien Fettsäuren, die aus dem Abbau von Fettgewebe stammen (Carmean et al., 2014; Richelsen et al., 2000;
Renaville et al., 2002). Gleichzeitig hemmt GH die Lipogenese, also die Einlagerung von Fett in subkutanes und viszerales Fettgewebe (Renaville et al., 2002; Vijayakumar et al., 2011).
Im Kohlenhydratstoffwechsel hat GH direkte Effekte auf den Leberstoffwechsel, GH steigert die Glukoneogenese und hemmt die Glykogenolyse (Renaville et al., 2002; Vijayakumar et al., 2011). Der Nettoeffekt von GH auf den Proteinmetabolismus ist die Partitionierung von Aminosäuren zugunsten des Protein- bzw. Muskelaufbaus und zu Lasten des oxidativen Abbaus von Aminosäuren über den Zitratzyklus und die Atmungskette (Chikani and Ho, 2014; Møller and Nørrelund, 2003; Renaville et al., 2002). Um die direkten endokrinen Effek- te von GH von denen des Mediators IGF-1 zu trennen, bedient man sich Mausmodellen mit spezifischen Gendeletionen, z.B. des hepatischen GHR. Diese Tiere zeigen phänotypisch interessanterweise keinerlei Verminderung des Körper- oder Längenwachstums, allerdings
14 ist die Mineralisierung der Knochen vermindert. Die Haupteffekte einer spezifischen hepati- schen GHR-Deletion werden auf metabolischer Ebene beobachtet. Die Tiere zeigen 4-fach erhöhte GH-Konzentrationen aufgrund des Mangels an hepatischer IGF-1-Synthese, eine Insulinresistenz, Glukoseintoleranz und erhöhte Konzentrationen freier Fettsäuren im Blut durch gesteigerte Lipolyse. In der Leber werden vermehrt Triglyzeride synthetisiert, aber in geringer Menge ausgeschleust, was zu einer deutlichen Lebersteatose führt (Fan et al., 2009). Nachdem beobachtet wurde, dass GH die Milchproduktion pseudogravider Kaninchen erhöht, konnte später auch bei vielen anderen Spezies gezeigt werden, dass GH die Lak- tationsleistung steigern kann. Bei der Milchkuh ist die Wirkung auf den Intermediärstoff- wechsel während der Frühlaktation von besonderem Interesse. Die Bedeutung von GH im Zusammenhang mit der Laktation der Milchkuh wird auch dadurch verdeutlicht, dass die Gabe von bovinem GH [bovines Somatotropin (bST)] an Milchkühe die Milchproduktion deutlich erhöht (Etherton and Bauman, 1998). Auf diesen Punkt wird in Kapitel 3.4.
gesondert eingegangen.
3.2.2. Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren
Historisch wurde zunächst ein Faktor beschrieben, der zur Sulfatierung von Knorpelgewebe führt und als „sulfation factor activity of growth hormone“ bezeichnet (Salmon und Daughaday, 1957). In den darauffolgenden Jahren entdeckte man vielfältige pleiotrope Effekte dieses „sulfation factor activity of growth hormone“ und in den frühen 70er-Jahren benannte man den Faktor in Somatomedin, Effektor von Somatotropin, um (Daughaday et al., 1972). Im Jahr 1976 wurde dann die Strukturhomologie zu Insulin bestätigt und aufgrund dieser Tatsache und der, dass Somatomedin die Glukoseaufnahme in Zellen stimulierte, wurde das Protein in Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF) umbenannt (Rinderknecht and Humbel, 1978).
Die Produktion von IGF-1 ist in einer Vielzahl von Zellen bekannt und hat lokal innerhalb des IGF-Systems eine auto- oder parakrine Funktion und wirkt hierbei vor allem stimulierend auf Zellwachstum, -differenzierung und -proliferation. Davon zu trennen ist der endokrine Anteil der somatotropen Achse. Nach Bindung von GH an den GHR wird IGF-1 produziert.
Aufgrund der hohen Dichte an GHR in der Leber, wird hepatisch rund 75% des im Blut zu messenden IGF-1 synthetisiert und an Bindungsproteine gebunden. Nur ein geringer Teil des Gesamt-IGF-1 ist frei im Blut vorhanden. Wie bereits unter 3.2. aufgeführt, bewirkt IGF-1 einen klassischen endokrinen Feedbackmechanismus auf die hypophysäre GH-Ausschüt- tung. Mäuse mit einer hepatischen IGF-1-Gendeletion (LI-IGFI-/--Mäuse) weisen bis zu 80%
niedrigere IGF-1-Konzentrationen im Vergleich zu Kontrolltieren auf. Ein geringer Anteil,
15 circa 20% des Gesamt-IGF-1 in der Blutzirkulation, stammt aus anderen Geweben. Niedrige IGF-1-Konzentrationen führen zu einem verminderten negativen Feedback und somit zu einer erhöhten hypophysären GH-Ausschüttung, die über eine verstärkte Expression von GHRH und Ghrelin-Rezeptoren in der Hypophyse gesteuert wird und in einer erhöhten Sen- sitivität der Hypophyse gegenüber GHRH und Ghrelin resultiert. Das LI-IGFI-/--Mausmodell zeigt zudem eindrucksvoll, dass durch Veränderungen der hepatischen IGF-1-Synthese die hypophysäre GH-Ausschüttung gesteuert werden kann und deutet an, welche Regulations- kraft hepatisch gebildetes IGF-1 für die hypophysäre GH-Ausschüttung hat (Sjögren et al., 2002).
Die biologische Wirkung von IGF-1, neben dem endokrinen Feedback auf die Hypophyse, wird auf Zellebene über den IGF-Rezeptor vermittelt. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit sind Insulin und IGF-2 ebenfalls in der Lage, an den IGFR zu binden, allerdings mit einer 100- bis 1000-fach niedrigeren Affinität im Vergleich zu IGF-1. Die Bindung von IGF-1 an den Insulinrezeptor ist ebenfalls nur mit 100-fach niedrigerer Affinität angegeben als die von Insulin (LeRoith et al., 1992; Siddle et al., 2001). Die Bindung von IGF-1 an den IGFR führt zu einer Tyrosinphosphorylierung des Insulin-Rezeptor-Substrat-1 (IRS-1), dessen Bindung an ein SH-enthaltenes Protein (SH2-containing protein) zur Aktivierung verschiedener Postrezeptorsignalkaskaden führen kann (Jones and Clemmons, 1995).
Auch IGF-1 hat einen stimulatorischen Einfluss auf das somatische Wachstum. Davon sind metabolische Funktionen oder auch Wirkungen von IGF-1 auf das Immunsystem zu unter- scheiden. Das Längenwachstum betreffend ist festzuhalten, dass die lokale IGF-1-Pro- duktion am Knochen der endokrinen IGF-1-Wirkung übergeordnet ist. Dies zeigen Untersu- chungen an Mäusen mit einer hepatischen IGF-1-Deletion, die noch 25% des im Blut zu messenden Gesamt-IGF-1 im Vergleich zur Kontrolle produzieren. Diese Menge reicht für ein annähernd normales Längenwachstum aus (Mohan and Kesavan, 2012). Da der IGFR in der Membran einer Vielzahl von Zellen exprimiert wird, sind auch die biologischen Funktionen von IGF-1 vielfältig. Im Allgemeinen kann man zusammenfassen, dass IGF-1 auf Zellebene die Zellproliferation und -differenzierung fördert und die Apoptose inhibiert (Jones and Clemmons, 1995). Im Stoffwechsel liefert IGF-1 das Signal, um ausreichend Nährstoffe zur Verfügung zu stellen, wobei dies in enger Koordination mit Insulin am Zielgewebe geschieht (Clemmons, 2012). Der große Unterschied zu Insulin besteht darin, dass der akute hypoglykämische Effekt von IGF-1 an der Zelle durch die Bindung an spezifische Bindungsproteine verhindert wird. Im Gegensatz zu GH hat IGF-1 keinen direkten Effekt am Fettgewebe, da reife Adipozyten keinen IGF-1-Rezeptor tragen (Scavo et al., 2004).
16 Der insulinähnliche Wachstumsfaktor-2 (IGF-2) ist ebenfalls wichtig für somatisches, vor allem aber für fetales Wachstum sowie für Zellteilung und -differenzierung während der fetalen Entwicklung. Vergleichbar zu IGF-1 wird auch IGF-2 sowohl in der Leber als auch lokal in verschiedenen Zellpopulationen gebildet und an die spezifischen IGFBPs gebunden transportiert und entfaltet seine Wirkung über den IGFR-2, bindet aber auch mit geringerer Affinität an den IGFR-1 und den Insulinrezeptor. Die Wirkung von IGF-2 auf das fetale Wachstum ist von besonderer Bedeutung. Nager mit einem IGF-2-Knock-out zeigen eine fetale Wachstumsretardierung (O’Dell and Day, 1998; Jones and Clemmons, 1995; Fowden, 1995).
3.2.3. Modulation der IGF-Bioverfügbarkeit durch Bindungsproteine
Im Blutsystem, aber auch im Extrazelluarraum ist der Großteil der IGFs an IGFBPs gebun- den. Die IGFBPs kontrollieren die lokale Wirkung von IGFs an der Zelle. Alle IGFBPs zeigen strukturelle Ähnlichkeiten und koordinieren sowie regulieren die Bioverfügbarkeit von IGFs.
Sie kontrollieren als Transportproteine den Transport von IGFs aus dem Blut in den Extra- zellulärraum oder inhibieren den Efflux von IGFs zur Zellebene. Die Halbwertzeit von freiem IGF-1 beträgt nur circa 20 min und wird durch die Bindung an IGFBPs um ein Vielfaches verlängert. IGFBPs modulieren die Interaktion zwischen IGFs und seinen Rezeptoren und werden ebenfalls von einer Vielzahl an Zellen produziert. Wiederum ein Großteil der IGFBPs, die in der Blutzirkulation zu finden sind, wird in der Leber gebildet. Gewebespezifische Proteasen können IGFBPs lokal spalten und somit IGFs bioverfügbar machen. Zudem wurde gezeigt, dass IGFBPs selbst an Rezeptoren binden und die proteolytischen Produkte der IGFBPs eigene Funktionen aufweisen (Mazerbourg et al., 2004; Brandt et al., 2015; Monzavi and Cohen, 2002; Lelbach et al., 2005; Fowlkes et al., 1994; Claussen et al., 1997;
Clemmons, 2012, 1998; Clemmons et al., 1998). Die Kontrolle der Expression dieser Bindungsproteine ist von den einzelnen IGFBPs und den Geweben abhängig, in denen sie gebildet werden. Die Expression einiger dieser Bindungsproteine, beispielsweise IGFBP2, steht unter der Kontrolle von GH (Clemmons, 1998) und kann somit als eine Komponente der somatotropen Achse bezeichnet werden. Auch Steroidhormone wie Östradiol haben einen Einfluss auf die Bildung von IGFBPs. Östradiol vermindert zum Beispiel die Bildung von IGFBP4 (Jones and Clemmons, 1995; Scharf et al., 1996).
Durch Studien an Mausmodellen, die gezielt Bindungsproteine überexprimieren oder die eine spezifische IGFBP-Deletion aufweisen sowie durch In-vitro-Studien an unterschiedlichen Zellen und Zelllinien, wurde die Funktion einzelner Bindungsproteine genauer spezifiziert.
Man unterscheidet im Allgemeinen eine inhibitorische Funktion von IGFBPs; dies bedeutet,
17 dass die Bindung von IGF-1 an das IGFBP die Interaktion von IGF-1 am IGFR inhibiert oder auch den Transport durch das Endothel verhindert. Auf der anderen Seite weiß man aus experimentellen Arbeiten auch, dass einzelne IGFBPs einen potenzierenden Effekt auf die IGF-1-Wirkung haben können. Diese ist oftmals spezifisch für ein Gewebe und meist aus einer gezielten Spaltung des entsprechenden Bindungsproteins hervor geht, wodurch IGF-1 an der Zielzelle frei wird und am IGFR binden kann. Um IGF-1 bioverfügbar zu machen, sind solche spezifischen proteolytischen Spaltungen beispielsweise im Serum schwangerer Frauen bekannt, aber auch in anderen biologischen Flüssigkeiten wie zum Beispiel Seminal- plasma (Jones and Clemmons, 1995; Mazerbourg et al., 2004; Rajaram et al., 1997; Giudice et al., 1990; Hossenlopp et al., 1990; Cohen et al., 1994; Gargosky et al., 1992). Auf einige spezifische Funktionen von ausgewählten IGFBPs soll im Folgenden näher eingegangen werden. Der Fokus soll auf den drei im Serum in hoher Konzentration vorkommenden Bindungsproteinen IGFBP2, IGFBP3 und IGFBP4 liegen, da diese auch in den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Studien bei der Milchkuh näher untersucht wurden.
Das IGFBP-2 ist ein negativer Regulator des postnatalen Wachstums. Diese Wirkung wird wahrscheinlich unter anderem durch eine Reduktion der lokalen Bioverfügbarkeit von IGF-1 an den Zellen vermittelt (Hoeflich et al., 1999). Aber auch stimulierende Wirkungen auf die IGF-1-Wirkung an Zellen sind für IGFBP2 bekannt. Im Blut ist dieses Bindungsprotein das in zweithöchster Konzentration vorkommenden IGFBP (Frank, 2001). Es ist in der Lage, das Endothel zu passieren und somit IGF-1 in den extravaskulären Raum zu transportieren (Rajaram et al., 1997). Die hepatische Expression von IGFBP2 ist post partum und nach einer Futterrestriktion bei der Milchkuh erhöht (Gross et al., 2011); auch bei Bullen konnte nach Futterrestriktion eine deutlich erhöhte IGFBP2-Expression in der Leber gemessen wer- den (Keogh et al., 2015). Im Uterus ist die IGFBP2-Konzentration höher als im Plasma. Auch die mRNA-Expression ist im ipsilateral zum Corpus luteum gelegenen Uterushorn höher, was zu der Annahme führte, dass Progesteron lokal die Bindungsproteinexpression im Uterus beim Rind beeinflusst (Costello et al., 2014). Inwieweit auch in der Peripherie IGFBP2 durch Steroidhormone in der Frühträchtigkeit beeinflusst wird, ist in einer Studie dieser Habilitationsschrift untersucht worden (Meyerholz et al., 2015).
Der größte Anteil des im Blut zirkulierenden IGF-1 ist in einem Komplex aus IGFBP3 und einem weiteren hepatisch gebildeten Protein, der Acid-Labile Subunit (ALS) gebunden. Das IGFBP3 wird deshalb auch als Haupttransportprotein für IGF-1 beschrieben. Der Komplex aus IGF-1, ALS und IGFBP3 ist zu groß für die Passage durch das Endothel, verbleibt daher im Blut und stellt ein Reservoir für IGF-1 dar (Rajaram et al., 1997; Jones and Clemmons,
18 1995). Das IGFBP3 hat eine höhere Affinität zu IGF-1 als der IGFR und unterbindet so die Interaktion von IGF-1 am Rezeptor. Metabolisch hat IGFBP3 zusammen mit IGF-1 eine dem Katabolismus vorbeugende endokrine Eigenschaft (Clark et al., 1993). Bei der Milchkuh kommt es zu einem Abfall der hepatischen IGFBP3-Expression von der späten Trächtigkeit bis zur Geburt (Gross et al., 2011).
Im Gegensatz zu den bisher genannten Bindungsproteinen wird für IGFBP4 eine vorwiegend inhibierende Wirkung auf IGF-1 beschrieben. Eine proteolytische Spaltung von IGFBP4 an der Zelloberfläche führt dazu, dass IGF-1 frei wird. Die am besten charakterisierte Protease für IGFBP4 ist Pregnancy-Associated Plasma Protein-A (PAPP-A), die nicht nur während der Schwangerschaft des Menschen von Bedeutung ist, sondern beispielsweise auch von huma- nen Fibroblasten gebildet wird (Monget et al., 2003; Oxvig, 2015; Lawrence et al., 1999;
Boldt and Conover, 2007). Auch in präovulatorischen Follikeln des Rindes wurde PAPP-A nachgewiesen und ist dort verantwortlich für die IGFBP4-Spaltung und somit für die Freisetzung von IGF-1 (Mazerbourg et al., 2001).
3.3. Bedeutung und Funktion der somatotropen Achse im Rahmen der Stoffwechseladaptation an die Trächtigkeit und frühe Laktation der Milchkuh
3.3.1. Die somatotrope Achse und das IGF-System in der frühen Trächtigkeit Eine physiologische Trächtigkeit ist grundlegend vom Wachstum des Konzeptus sowie der Fruchthöhlen und des Uterus abhängig. Vor allem in der frühen Phase der Trächtigkeit ist ein adäquates embryonales Wachstum mit entsprechender Konzeptuselongation von entscheidender Bedeutung für die Etablierung einer physiologischen Trächtigkeit. Das Wachstum des Konzeptus korreliert mit der Fähigkeit des Trophoblasten, das embryonale Erkennungssignal Interferon (IFN)Ƭ zu produzieren, das die Luteolyse des mütterlichen Gelbkörpers verhindert. Die ausreichende Bildung der Histiotrophe und lokaler Wachstumsfaktoren sind für das intrauterine Wachstum von Bedeutung, wobei Komponenten des lokalen IGF-1-Systems eine entscheidende Rolle spielen (Robinson et al., 2000; Velazquez et al., 2008; McCarthy et al., 2012). In Geweben des Reproduktionstraktes (Ovar, Ovidukt und Uterus) wird der IGFR-1 und -2 exprimiert. Bereits die Zygote, die 2- und 4-Zellstadien als auch die Morula, die Blastula und der elongierte Embryo weisen Rezeptoren für IGF-1 auf und sind auf diesen Wachstumsfaktor angewiesen (Velazquez et al., 2008). Die Bedeutung von IGF-1 wird experimentell dadurch untermauert, dass in vitro
19 produzierte Embryonen, denen in Kultur IGF-1 zugesetzt wurde, in Studien zu besseren Trächtigkeitsraten nach einem Embryotransfer führten (Block et al., 2003, 2007). Mithilfe quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) wurde in endometrialen Homogenisaten von McCarthy et al. (2012) das lokale IGF-System im bovinen Endometrium näher charakterisiert. Hierbei fiel auf, dass es zwischen den Tagen 5 und 16 des Zyklus, d.h. in dem Zeitintervall, in dem das Endometrium auf eine potenzielle Trächtigkeit vorbereitet wird, zu einer verminderten mRNA-Expression von IGF-1 und IGFBP6 kommt und im Gegensatz dazu IGFR-1 und IGFBP2 hochreguliert sind. Diese spezifischen Expressionsmuster von Genen der IGF-Familie im Endometrium sind sowohl für das zeitgerechte Wachstum vor der Implantation des Embryos wichtig (McCarthy et al., 2012).
Bisher nicht gänzlich aufgeklärt ist, ob das IGF-System des Endometriums überwiegend für die lokale Bereitstellung von IGF-1 und IGFBPs sorgt oder ob auch die endokrine maternale somatotrope Achse bei der Milchkuh eine Rolle spielt. Als Bindeglied beider Systeme ist die Proteolyse von Bindungsproteinen im maternalen Blut eine Möglichkeit des Organismus, den Embryo lokal mit IGF-1 zu versorgen. Dieses Phänomen ist gut bei der Frau und bei Ratten beschrieben, bei denen es in der Schwangerschaft zur gezielten Proteolyse inhibitorischer IGFBPs kommt und somit IGF-1 vermehrt lokal bioverfügbar wird (Fowlkes et al., 1994; Wu et al., 1999; Hossenlopp et al., 1990; Giudice et al., 1990).
Eine experimentelle Arbeit, in der GH appliziert wurde, weist darauf hin, dass nicht nur das lokale IGF-1-System, sondern auch die somatotrope Achse, eine Rolle während der frühen Trächtigkeit spielt (Ribeiro et al., 2014). So führte die Applikation einer niedrigen Dosis GH zu einer Verbesserung der Konzeptusentwicklung und die Fertilität (Abkalbungsrate) konnte um 27% gesteigert werden. Die positive Wirkung leiteten die Autoren nicht nur aus den größeren Embryonen und Amnionvesikeln in der Behandlungsgruppe ab, sondern auch aus einer erhöhten Expression IFNƬ-stimulierter Genexpression (ISG), die mit einer erhöhten IFNƬ-Produktion des Konzeptus korrelierte (Ribeiro et al., 2014). In dieser Studie wurde nachgewiesen, dass die GH- und IGF-1-Konzentrationen im Blut nach der GH-Behandlung anstiegen. Die Autoren folgerten daraus, dass diese erhöhten Hormonkonzentrationen auch zur Verbesserung des uterinen Kompartiments beitragen und damit indirekt einen positiven Einfluss auf die Fertilität haben könnten. Nicht nur indirekte, über IGF-1 vermittelte Effekte am Endometrium sind möglich; es ist auch bekannt, dass der GHR vom Endometrium gravider Kühe selbst exprimiert wird und diese Expression während der frühen Etablierung einer Trächtigkeit ansteigt (Kölle et al., 1997). Zudem wurde gezeigt, dass nach der systemischen Gabe von bST zum Zeitpunkt der Insemination die lokale IGF-2-Konzentration
20 im Ovidukt erhöht war, die IGFBP3-mRNA im Uterus vermehrt und die GHR-Genexpression vermindert war (Bilby et al., 2006; Ribeiro et al., 2014; Bilby et al., 2004; Guzeloglu et al., 2004; Pershing et al., 2002).
Fasst man Studien zusammen, die die endokrine maternale IGF-1-Konzentration mit Repro- duktionsparametern korrelieren, so sind diese Korrelationen häufig nur moderat und die Literaturdaten hierzu widersprüchlich (Velazquez et al., 2008). In einigen Arbeiten scheinen aber Korrelationen zwischen IGF-1 bzw. bestimmten IGFBPs und der Fertilität zu bestehen, obgleich hierbei unklar bleibt, ob es sich um kausale Zusammenhänge handelt. Kühe, die postpartal eine niedrige IGF-1-Konzentration aufweisen, zeigen eine verminderte Fertilität (Fenwick et al., 2007; Pushpakumara et al., 2003; Taylor et al., 2004). Kühe mit geringerer Fertilität wiesen in der Leber eine höhere Expression von IGFBP2, IGFBP4, IGFBP5 und IGFBP6 auf (Cummins et al., 2012) , in einer anderen Studie waren niedrigere IGFBP3- Werte mit höherer Fertilität assoziiert (Grimard et al., 2013).
Gegenwärtig wird davon ausgegangen, dass die endokrine Gesamt-IGF-1-Konzentration nicht die Verhältnisse im das auto- und parakrine IGF-System widerspiegelt. Daher sei das IGF-1 kein geeigneter Messwert ist, um alleinstehend die Situation der somatotropen Achse und ihre Bedeutung für eine erfolgreiche Trächtigkeit darzustellen. Vor allem die maternalen Bindungsproteine könnten bei dem Zusammenspiel zwischen endokriner somatotroper Achse und dem lokalen IGF-1-System eine Schlüsselrolle einnehmen. Das Ziel einer Studie der vorliegenden Habilitationsschrift war daher, die Änderungen maternaler IGFBPs während der Frühträchtigkeit beim Rind zu untersuchen (Meyerholz et al., 2015).
Die aufgeführten Literaturdaten zeigen deutliche Assoziationen zwischen dem lokalen IGF-1- System bzw. der somatotropen Achse und der Trächtigkeit. Wie bereits angedeutet, geht aber aus den meisten Arbeiten nicht eindeutig hervor, inwieweit es sich tatsächlich um kausale Zusammenhänge handelt, denn niedrigere IGF-1-Werte sind post partum auch mit einer negativen Energiebilanz assoziiert. Außerdem sind die IGF-1-Werte bei Kühen niedriger als bei Färsen (Wathes et al., 2007). Gleichzeitig sind aber bei diesen Tieren auch andere Stoffwechselmetabolite, wie zum Beispiel nicht veresterte Fettsäuren, in hohen Konzentrationen im Blut vorhanden. Auch diese Stoffwechselprodukten üben einen negativen Effekt auf die Eizellqualität aus (Van Hoeck et al., 2014).
Es stellt sich daher die Frage, inwieweit es zu einer physiologischen Adaptation der somato- tropen Achse des maternalen Organismus an die Trächtigkeit kommt und welche Trächtig- keitssignale hierbei eine Bedeutung haben.
21 Wenige Autoren haben sich bisher mit der Analyse der Komponenten der somatotropen Achse in der frühen Trächtigkeit der Milchkuh beschäftigt. Der Vergleich trächtiger und nicht trächtiger zyklischer pluriparer Kühe vier Tage nach Beginn Östrus zeigt, dass zwischen beiden Tiergruppen Unterschiede hinsichtlich der Komponenten der somatotropen Achse in der Leber bestanden (gravide Tiere wiesen im Vergleich zu nicht graviden Kühen eine erhöhte GHR-und IGFBP2-Expression auf), ein Unterschied in der uterinen Expression dieser Gene konnte nicht dargestellt werden (Rhoads et al., 2008). Sullivan et al. (2009) wiesen einen Abfall der IGF-1- und Gesamtbindungsproteinkonzentration zwischen den Tagen 200 und 280 der Gestation nach. Die Gabe von Rohprotein in der Trächtigkeit führte zu einer erhöhten IGF-1-Konzentration im maternalen Blut. Die IGF-1-Konzentration im letzten Trimester korrelierte ferner mit der Größe des Kalbes. Die Plasma-IGF-1- Konzentration ist 15 Wochen nach Besamung bei graviden Kühen höher als bei nicht graviden Tieren, steigt während des ersten und zweiten Trimesters an und sinkt im dritten Trimester wieder ab. Es wurde vermutet, dass dieser Effekt durch die sich im Laufe der Gravidität ändernde Futteraufnahme bedingt sein könnte. Genauere Untersuchungen liegen hierzu zum gegenwärtigen Zeitpunkt allerdings nicht vor (Humphrys, 2003).
Steroidhormone haben ebenfalls einen deutlichen Einfluss auf die somatotrope Achse.
Östradiol führt zu einer erhöhten hypophysären GH-Ausschüttung und auch die IGF-1- Produktion in der Leber nimmt zu (Colak et al., 2011; Kawashima et al., 2007). Am Endometrium stimuliert während der Trächtigkeit IFN die lokale IGFBP1-Expression (Simmons et al., 2009). An Schafen wurde gezeigt, dass IFN nicht nur lokal am Endometrium eine Wirkung zeigt, sondern es auch konnte IFN -stimulierte Genexpression am Ovar, in der Leber und im Gehirn gemessen werden (Bott et al., 2010; Oliveira et al., 2008). Bei der Milchkuh ist es bisher fraglich, ob IFN in der Frühträchtigkeit zentrale metabolische Organe wie die Leber erreicht und ob dadurch auch die Genexpression von Genen aus dem IGF-1 System beeinflusst werden. Dieser Fragestellung wurde daher in einer Studie dieser Habilitationsschrift nachgegangen (Meyerholz et al., 2016).
3.3.2. Die somatotrope Achse während der späten Trächtigkeit und der frühen Laktation
Die Milchproduktion post partum wird durch GH und dem laktogenen Hormon Prolaktin sowie anderen Stoffwechselhormonen kontrolliert. Im Gegensatz zu Ratte und Mensch dominiert beim Rind GH über Prolaktin, was verdeutlicht, dass die Stoffwechseladaptation innerhalb der somatotropen Achse für die hochleistende Milchkuh einen hohen Stellenwert hat
22 (Renaville et al., 2002; Etherton and Bauman, 1998; Svennersten-Sjaunja and Olsson, 2005). Die biologischen Effekte von GH bezüglich der Laktation sind vielfältig und bedingen vor allem eine Nährstoffpartitionierung zugunsten der Laktation. Einer der grundlegenden Mechanismen, durch den GH die Nährstoffpartitionierung steuert, ist beispielsweise die Modulation der Gewebeansprechbarkeit für Insulin (Tabelle 1).
Tabelle 1. Physiologische Wirkung des Wachstumshormons während der Laktation bei Milchkühen (adaptiert nach Etherton und Bauman (1998) und Renaville et al. (2002))
Organ/Gewebe Physiologische Wirkung
Euter
↑
↑
↑
↑
Milchsynthese
Aufnahme von Nährstoffen für die Milchsynthese Aktivität sekretorischer Zellen
Blutfluss entsprechend der erhöhten Milchleistung
Fettgewebe
↓
↓
↑
↓
↑
↑
Glukoseaufnahme und -oxidation Lipogenese bei positiver Energiebilanz Lipolyse bei negativer Energiebilanz
Insulinstimulierte Lipidsynthese und Insulinsensitivität Katecholaminstimulierte Lipolyse
Fähigkeit von Insulin, Lipolyse zu inhibieren Leber
↑
↑
↓
Glukoneogenese Proteinsynthese
Fähigkeit von Insulin, die Glukoneogenese zu inhibieren Darm
↑
↑
↑
Absorption von Kalzium und Phosphat für die Milchproduktion Fähigkeit von 1,25-Vitamin-D3, die Produktion des
Kalziumbindungsproteins zu stimulieren Kalziumbindungsprotein
Weitere systemische Effekte
↑
↓
↓
↑
IGF-1 und IGFBP3 IGFBP2
Aminosäureoxidation und Glukoseclearance und -oxidation Oxidation freier Fettsäuren bei negativer Energiebilanz
Ein bedeutender Effekt von GH liegt vor allem in der Steuerung der Lipolyse, die bei Kühen post partum grundlegende Voraussetzung für eine hohe Milchleistung ist. Die bereits ante partum einsetzende Futteraufnahmedepression trägt neben dem erhöhten Energiebedarf dazu bei, dass die Tiere in der frühen Laktation nicht ausreichend Energie aufnehmen, sondern diese durch Lipolyse körpereigenen Fettgewebes bereitstellen (Etherton and Bauman, 1998; Renaville et al., 2002). Eine adäquat gesteuerte Lipolyse ist Bedingung für stoffwechselgesunde Kühe post partum. Kommt es zu einer übersteigerten Lipolyse, sind Stoffwechselstörungen wie Ketose und Fettleber die Folge. Ein weiteres Ziel dieser Habilita- tionsschrift war es daher, Untersuchungen zur Beteiligung von Regulationsmechanismen innerhalb der somatotropen Achse, die bei der Entstehung postpartaler Stoffwechsel- störungen eine Rolle spielen könnten, durchzuführen.
23 Nach Einsetzen der Laktation wird auch die Laktationspersistenz durch endokrine Mechanis- men gesteuert. Auch in dieser Zeitperiode finden sich deutliche Assoziationen zwischen Milchleistung und GH. Vor allem die Gabe von bST, die in verschiedenen Ländern zur Stei- gerung der Milchleistung eingesetzt wird, verdeutlicht den Effekt von GH auf die Laktation.
Die Milchleistung lässt sich durch bST um 6 bis 30% steigern, wobei es in der Folge nicht zu einer erhöhten Futteraufnahme kommt, sondern appliziertes bST zu einer erhöhten Mobilisa- tion von körpereigenen Energiereserven führt. Auch gibt es Hinweise, dass GH die Milchfettsynthese beeinflusst, wohingegen Prolaktin eher auf die Protein- und Laktosesyn- these wirkt (Rose et al., 2009; Speicher et al., 1994; Baldi, 1999; Svennersten-Sjaunja and Olsson, 2005).
Aufgrund der Bedeutung von GH für die Laktogenese, sind post partum hohe GH-Konzen- trationen physiologisch sinnvoll. Bereits vor der Geburt kommt es demnach, neben anderen endokrinologischen Veränderungen, zu wichtigen Adaptationsmechanismen innerhalb der somatotropen Achse (Entkopplung der somatotropen Achse), die die postpartal notwendige endokrine Konstellation begünstigen, welche zur Lipolyse und zur Milchbildung nach der Geburt beiträgt. Bisher ist nicht gänzlich aufgeklärt, welcher Faktor oder welche Faktoren ante partum zur Entkopplung der somatotropen Achse führt bzw. führen.
In den letzten drei Wochen der Trächtigkeit vor der Abkalbung nach dem Trockenstellen der Kühe setzt eine hepatische GH-Resistenz ein, die mit einer verminderten Expression von GHR1A einhergeht. Das GHR1A-Transkript ist, wie bereits beschrieben, das Haupttranskript in der Leber zur Produktion des GHR. Durch eine Verminderung des GHR in der Leber kommt es zu einer reduzierten Produktion von IGF-1 und der für IGF-1 wichtigen Bindungs- proteine IGFBP-3 und ALS. Als Folge sinkt die IGF-1-Konzentration im Blut. Reduzierte Gesamt-IGF-1-Konzentrationen bedingen einen verminderten negativen Feedback an der Hypophyse und es wird vermehrt GH ausgeschüttet (Abbildung 4; (Radcliff et al., 2003a, b;
Kobayashi et al., 1999).
24
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Entkopplung der somatotropen Achse [GH: Growth Hormone, GHIH: Growth Hormone Inhibiting Hormone, GHR: Growth Hormone Receptor, GHRH:
Growth Hormone Releasing Hormone, IGF-1: Insulin-like Growth Factor-1]
Eine hepatische GH-Resistenz wird generell auch bei anderen Tierarten im Rahmen einer katabolen Stoffwechsellage beobachtet (Thissen et al., 1994, 1999). Eine Hypothese zur Entstehung einer hepatischen GH-Resistenz in der Leber beim Rind ist das Absinken der Insulinkonzentrationen, verursacht durch die sinkende Futteraufnahme ante partum, den erhöhten Energiebedarf der fetoplazentaren Einheit und der somit bereits einsetzenden negativen Energiebilanz vor der Geburt sowie die damit verbundene verminderte Expression des GHR1A. Allerdings zeigen Studien, die nicht während der späten Trächtigkeit sondern bei nicht graviden Rindern durchgeführt wurden, dass eine deutlich verringerte TMA zu einer verminderten IGF-1-Produktion führen kann, aber die GHR1A-Expression vergleichbar bleibt.
Demnach kann, neben einer Reduktion der GHR1A-Expression, auch eine davon unabhängig zu sein scheinende verminderte IGF-1 Produktion additiv zu niedrigeren IGF-1 Werten zu führen und auch unabhängig von der Entkopplung der somatotropen Achse auftreten. Im Rahmen einer restriktiven Fütterung kommt es zu einer Minimierung der IGF-1- Plasmakonzentration und der hepatischen IGF-1-mRNA-Expression, aber wie beschrieben
25 nicht zwangsläufig auch zu einer Reduktion der Expressionshöhe des hepatischen GHR1A- Transkripts (Radcliff et al., 2006; Gross et al., 2011; Kobayashi et al., 2002).
Die Hypothese, dass sinkende Insulinkonzentrationen zur Verminderung des hepatischen GHR1A-Transkriptlevels führen, wird durch das Ergebnis einer experimentellen Studie bekräftigt. Diese Studie bestätigt allerdings bisher lediglich den Umkehrschluss, denn bei der Injektion supraphysiologischer Insulinkonzentrationen kam es zu einer Erhöhung des GHR1A-Transkriptlevels in der Leber (Butler et al., 2003). Eine andere Studie zeigt, dass im Vergleich zur GH-Resistenz, die bei einer deutlichen Futterrestriktion zu beobachten ist, die peripartale GH-Resistenz wesentlich ausgeprägter ist (Gross et al., 2011). Bei Ratten in der späten Gestation wird eine dem Rind vergleichbare Entkopplung der somatotropen Achse beschrieben (Escalada et al., 1997). Die geringe IGF-1-Produktion wird, neben einer Verminderung der GHR-Expression, vor allem auf eine Inhibition des Post-GHR-Signalwegs durch die Induktion negativer Regulatoren zurückgeführt. Zu diesen gehören die bereits erwähnten SOCS-Proteine, CIS sowie Protein Inhibitor of Activated STAT (PIAS). Bei tragenden Mäusen wurde eine spezifische Induktion von CIS gezeigt, die zu einer Desensibilisierung des GHR führt (Leong et al., 2004; Frank et al., 1994; Miquet et al., 2005;
Deng et al., 2012). Die Bildung dieser Inhibitoren wird wiederum durch verschiedene Plasmafaktoren wie zum Beispiel Östradiol und/oder proinflammatorische Zytokine (Tumornekrosefaktor α(TNFα) bzw. Interleukin 6) induziert (Escalada et al., 1997; Winkelman et al., 2008; Lang et al., 2005). Es ist bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht bekannt, ob diese bei Ratte und Maus nachgewiesenen Faktoren auch bei der Milchkuh einen Einfluss auf die Signaltransduktion des hepatischen GHR haben. Erste Hinweise bietet hierzu aber die Arbeit von Winkelman et al. (2008), die einen Anstieg von SOCS2 vor der Geburt feststellten, was zu einer zusätzlichen Reduktion der IGF-1-Produktion in der Leber beigetragen haben könnte. Inwieweit diese intrazellulären Inhibitoren des GHR-Signalwegs auf die Stärke der Entkopplung der somatotropen Achse wirken und welche Signale ursächlich sein könnten, wurde in Studien dieser Habilitationsschrift untersucht (Piechotta et al., 2014; Mense et al., 2015).
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4. Ziele der Arbeit
Die somatotrope Achse stellt eine zentrale endokrine Achse dar, die für die Nährstoff- partitionierung der Milchkuh während der Adaptation an die Trächtigkeit und Laktation von besonderer Bedeutung ist. Hohe GH-Konzentrationen sind nach der Geburt für die Lakto- genese und Galaktopoese der Milchkuh unabdingbar. Bereits vor der Geburt kommt es zu enormen Anpassungen innerhalb dieses komplexen endokrinen Systems. Zentrale Frage- stellungen der Habilitationsschrift waren, inwiefern sich pluripare Kühe in ihrer antepartalen Stoffwechseladaptation im Hinblick auf die somatotropen Achse, aber auch in anderen grundlegenden endokrinen Systemen unterscheiden und ob solche Unterschiede mit dem Risiko für postpartale infektiöse oder metabolische Erkrankungen assoziiert sind. Des Weiteren wurde die Stoffwechselanpassung des maternalen Organismus während der frühen Trächtigkeit mit besonderer Bedeutung der somatotropen Achse und Signale analysiert, die in der Trächtigkeit eine metabolische Adaptation des maternalen Stoff- wechsels bedingen könnten.
Im Einzelnen standen dabei folgende Ziele im Fokus der Forschungsarbeiten:
1) Pathophysiologische Zusammenhänge zwischen der somatotropen Achse und dem Auftreten postpartaler Produktionserkrankungen bei Holstein Friesian Kühen
a. Zusammenhang zwischen der IGF-1-Plasmakonzentration und der Funktionalität neutrophiler Granulozyten
b. Bedeutung der antepartalen IGF-1-Konzentration für das Risiko postpartaler Produktionserkrankungen
2) Detaillierte Charakterisierung der somatotropen Achse in der späten Trächtigkeit mit besonderem Augenmerk auf tierindividuelle Unterschiede
3) Einfluss von Steroidhormonen auf die somatotrope Achse
4) Bedeutung der somatotropen Achse im Hinblick auf die metabolische Adaptation während der frühen Trächtigkeit von Milchkühen der Rasse Holstein Friesian und mögliche ursächliche Signale
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5. Ergebnisse
5.1. Pathophysiologischer Zusammenhang zwischen der somatotropen Achse und dem Auftreten postpartaler Produktionserkrankungen bei der Milchkuh
Bisherige Studien zeigen, dass die Weichen für eine adäquate Adaptation an die frühe Laktation nach der Geburt bereits während der späten Trächtigkeit/Trockenstehphase gestellt werden und ein komplexes Zusammenspiel multipler Mechanismen erfordern (Kessel et al., 2008; Grala et al., 2011, Publikation 2, Publikation 6). Hierbei ist nicht nur das endokrine System, sondern eine komplexe Interaktion zwischen Endokrinum, Immunsystem und Stoffwechselmetaboliten maßgeblich beteiligt. Eine „Imbalance“ dieser Stoffwechsel- adaptation kann mit einer überschießenden Lipomobilisation assoziiert sein und sowohl zu immunologischen Dysfunktionen als auch zu metabolischen Stoffwechselerkrankungen wie zum Beispiel klinischen Ketosen führen (Ster et al., 2012; Herdt, 2000, Publikation 6). Da GH pulsatil ausgeschüttet wird und eine sinnvolle Aussage über die GH-Konzentration nur durch frequente Blutprobenentnahmen möglich ist, bietet die Analyse des hepatischen IGF-1 eine gute Möglichkeit, vor allem die Stärke der hepatischen GH-Resistenz einzuschätzen.
Daher wurde die Analyse von Gesamt-IGF-1 gewählt, um zu untersuchen, ob niedrigere antepartale Konzentrationen dieses Hormons, das die Entkopplung der somatotropen Achse widerspiegelt, mit einem erhöhten Risiko für infektiöse oder metabolische postpartale Produktionserkrankungen einhergeht (Publikation 2; Publikation 6).
Die beeinträchtigte Funktion neutrophiler Granulozyten wird als eine Ursache für eine erhöhte Anfälligkeit für infektiöse Produktionserkrankungen post partum beim Rind angesehen (Mehrzad et al., 2009; Vangroenweghe et al., 2005). Aus diesem Grund wurde in Publikation 1 zunächst die Hypothese geprüft, inwieweit die IGF-1-Konzentrationen drei Wochen vor bis vier Wochen nach der Geburt mit der Phagozytoseaktivität und -kapazität neutrophiler Granulozyten korrelieren und ob Unterschiede zwischen primiparen und pluriparen Kühen bestehen. In Publikation 1 wurde bestätigt, dass es vor der Abkalbung zu einem deutlichen Abfall der Gesamt-IGF-1-Konzentration bei primiparen sowie bei pluriparen Kühen kommt, wobei Kühe im Vergleich zu primiparen Kühen postpartal deutlich niedrigere IGF-1-Konzentrationen aufwiesen (Wathes et al., 2007; Kobayashi et al., 1999; Lucy, 2008a, Publikation 1).
28 Parallel zum Abfall der IGF-1-Konzentration wurde ein deutlicher Anstieg der Konzentration nichtveresterter Fettsäuren (non-esterified fatty acids, NEFA) gemessen, die bei Kühen aufgrund einer deutlicheren Lipolyse höher war als bei Färsen. In Publikation 1 wurde gezeigt, dass IGF-1 hochsignifikant mit der Gesamtphagozytoseleistung der neutrophilen Granulozyten bei pluriparen Kühe korrelierte. Dabei kam es jedoch entgegen anderer Literatur (Mehrzad et al., 2009) nicht zu einer deutlichen Verminderung der Gesamtphago- zytoseleistung neutrophiler Granulozyten im peripartalen Zeitraum der Milchkuh. Interessant war, dass die NEFA-Konzentration in der Transitionsperdiode nicht mit der Phagozytose- aktivität, -kapazität oder -leistung korrelierte, im Gegensatz zu IGF-1, das zu allen drei genannten Phagozytoseparametern bei pluriparen Kühen signifikante Korrelationen zeigte.
Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert, dass durchaus ein Zusammenhang zwischen der IGF-1-Konzentration bzw. der Stärke der Entkopplung der somatotropen Achse und der Phagozytoseleistung neutrophiler Granulozyten beim Rind bestehen kann. Da allerdings noch eine Vielzahl anderer Faktoren, die sich während der Transitperiode verändern, die Gesamtphagozytoseaktivität dieser Immunzellen beeinflussen kann, war anhand der Daten der genannten Studie unklar, ob die berechneten Korrelationen auch kausale Zusam- menhänge zwischen dem IGF-1-System und der Anfälligkeit für Infektionserkrankungen bei der pluriparen Milchkuh widerspiegeln. Aus diesem Grund ging Publikation 2 der Fragestellung nach, ob es eine Assoziation zwischen IGF-1 und dem Risiko für postpartale infektiöse Produktionserkrankungen bei der Milchkuh (Mastitis oder Metritis) gibt.
In einer ersten orientierenden Studie mit 41 Milchkühen (Publikation 2) wurde geprüft, inwieweit die antepartale IGF-1-Konzentration als Biomarker der Entkopplung der somato- tropen Achse mit dem Risiko eines erhöhten Auftretens postpartaler Produktionserkran- kungen bei der Milchkuh assoziiert ist. Dabei wurde erstmals gezeigt, dass Kühe, bei denen post partum eine Produktionserkrankung auftrat, im Vergleich zu gesunden Milchkühen, in einem Zeitfenster von 242 bis 262 Tagen nach der Besamung niedrigere IGF-1-Konzen- trationen aufwiesen. Parallel dazu war auch die NEFA-Konzentration bei Kühen mit einem vermehrten Risiko an postpartalen Produktionserkrankungen zu erkranken, erhöht, was auf eine frühe bzw. hohe Lipolyse hindeutete. Wurden nur Kühe ohne Ketosen betrachtet, so waren keine Unterschiede in der IGF-1-Konzentration in Abhängigkeit von den anderen Erkrankungen festzustellen. Daraus wurde gefolgert, dass der Zusammenhang zwischen IGF-1 und Stoffwechselerkrankungen post partum deutlicher zu sein scheint, als derjenige zwischen IGF-1 und inflammatorischen Erkrankungen.
Diese Annahme konnte in einer größeren Stichprobe (Publikation 6) bestätigt und spezifiziert werden. Bei 377 gesunden, pluriparen Milchkühen eines Betriebs wurden ante-
