6. Übergreifende Diskussion
6.3. Die Rolle von Steroidhormonen und der frühen Trächtigkeit auf die
6.3.2. Zusammenhänge zwischen der frühen Trächtigkeit und der somatotropen Achse
Neben den Erkenntnissen zur Beeinflussung der somatotropen Achse durch Steroidhormone (siehe Kapitel 3.3.) im Zyklus, kommt es auch zu entsprechenden Veränderungen der Ste-roidhormonausschüttung in der frühen Trächtigkeit. Vor allem eine über die zyklische Luteal-phase hinausgehende hohe Progesteronsekretion kann die hypophysäre GH-Ausschüttung beeinflussen. Bei Ratten wurde eine höhere hypophysären GH-Sekretion über die Gestation
55 hinweg nachgewiesen, bei der aber die Pulsfrequenz nicht beeinflusst war. In der frühen Trächtigkeit bei Färsen (Tag der Ovulation bis Tag 18) unterschieden sich die Verän-derungen innerhalb der somatotropen Achse (GH- oder IGF-1 Ausschüttung, Publikation 8) nicht von den davon abzugrenzenden deutlichen Einflüssen des Zyklus (Colak et al., 2011;
Kawashima et al., 2007, Publikation 7). Durch die intravaginale Applikation von Progesteron reduzierten sich bei Kühen sowohl die Pulsatilität als auch die Gesamtmenge des sezernierten GH (Colak et al., 2011). In den Publikationen 7 und 8 wurde nur die GH-Konzentration gemessen und im „Rank-sum Plot“ ausgewertet doch es kann folglich keine Aussage über die Pulsatilität der GH-Freisetzung in der frühen Gravidität getroffen werden.
Inwieweit die erhöhte GH-Ausschüttung während des Östrus bzw. die Unterdrückung der GH-Freisetzung durch Progesteron, die auch bei graviden Tieren andeutungsweise zu sehen war (Publikation 8), Auswirkungen auf die Trächtigkeitsetablierung oder Stoffwechselanpas-sung des maternalen Organismus hat, bleibt vorerst offen. Vor dem Hintergrund der sehr nie-drigen peripheren Progesteronkonzentrationen der hochleistenden Milchkuh und der Stoff-wechselbelastung durch die gleichzeitige Laktation scheint die Aufklärung weiterer physiolo-gischer Details in diesem Kontext zukünftig sinnvoll. Der bereits erwähnte positive Einfluss einer niedrigen bST-Gabe auf die Konzeptusentwicklung und Fertilität könnte ebenfalls darauf hindeuten (Ribeiro et al., 2014), dass die endogene Regulation der GH-Ausschüttung durch Steroidhormone auch einen wichtige physiologische Funktion bei der Etablierung einer Trächtigkeit hat.
Ein interessantes Ergebnis im Rahmen der Adaptation der somatotropen Achse während der Frühträchtigkeit des Rindes erbrachte die Analyse der IGFBPs. Hier konnte gezeigt werden, dass es zwischen dem Tag der Ovulation und Tag 18 zu einem Abfall des mit vornehmlich inhibitorisch wirkenden IGFBP4 kommt (Publikation 8). Dies führt dazu, dass vermehrt IGF-1 bioverfügbar ist und für Wachstum und Differenzierung der uteroplazentaren Einheit zur Verfügung steht.
Die während der Schwangerschaft der Frau von den Synzytiotrophoblasten gebildete Zink-abhängige Metalloproteinase PAPP-A spaltet spezifisch IGFBP4, was zu einem Abfall der IGFBP4-Konzentrationen während der Schwangerschaft führt (Mazerbourg et al., 2004;
Oxvig, 2015; Mazerbourg et al., 2001). Die Genexpression von PAPP-A-mRNA wurde nicht nur in den Synzytiotrophoblasten, sondern wurde in vielen anderen Geweben nachgewiesen.
In der humanen Plazenta ist die Expression allerdings am höchsten. Die periphere PAPP-A-Konzentration ist dort um das 10.000-fache erhöht (Oxvig, 2015). Bei Rindern ist PAPP-A bisher vor allem im Zusammenhang mit der Follikulogenese am Ovar beschrieben, wo sie in
56 hohen Mengen in Granulosazellen differenzierter Follikel gebildet wird und IGF-1-unabhängig IGFBP4 spaltet (Mazerbourg et al., 2001). Dem Enzym PAPP-A wird eine bedeutende Rolle bei der Selektion des dominanten Follikels zugesprochen (Spicer, 2004).
Inwieweit PAPP-A auch für den IGFBP4-Abfall in der Frühträchtigkeit des Rinds eine Rolle spielt, bleibt zukünftigen Studien vorbehalten.
Es wäre auch möglich, dass es in der Frühträchtigkeit beim Rind zu einer verminderten Bildung von IGFBP4 kommt. Allerdings vermindert Östradiol die Bildung von IGFBP4 und seine Konzentration ist in der frühen Trächtigkeit zugunsten der Progesteronsekretion niedriger (Jones and Clemmons, 1995; Scharf et al., 1996). Die Produktion von IGFBP4 konnte auch in der Leber sowie in den Nebennieren, Hoden, der Milz, dem Herzen, der Lunge, den Nieren, dem Magen, dem Hypothalamus und der Hirnrinde nachgewiesen worden (Zhou et al., 2003). Die Tatsache, dass zumindest die hepatische IGFBP4-mRNA-Expression an Tag 18 sich nicht zwischen graviden und nichttragenden Färsen (Publikation 8) unterschied, könnte darauf hinweisen, dass es auch beim Rind in der frühen Trächtigkeit zur Proteolyse dieses Bindungsproteins kommt, um IGF-1 für embryonales Wachstum bioverfügbar zu machen.
Die Studienergebnisse, die zeigten, dass es zu einer Erhöhung von Trächtigkeitsraten durch die Applikation von bST kommt, führten zu der Hypothese, dass GH im Endometrium die embryo-maternale Kommunikation beeinflussen könnte (Ribeiro et al., 2014). Badinga et al.
(2002) untersuchten vor diesem Hintergrund, dass die systemische Applikation von GH lokal am Endometrium mit dem embryonalen Signal IFNƬ interagiert und auf die Prostaglandin-F2α-Sekretion zu einem kritischen Zeitpunkt der embryo-maternalen Kommunikation wirkt.
Diese Ergebnisse führten zu der Vermutung, dass es zu einer Interaktion zwischen IFNƬ und der maternalen somatotropen Achse in der Frühträchtigkeit kommen könnte. Damit IFNƬ überhaupt einen Einfluss auf die maternale somatotrope Achse ausüben kann, müsste es früh in der Trächtigkeit eine direkte Wirkung im Hypothalamus, der Hypophyse oder der Leber haben. Da der Nachweis von IFNƬ mithilfe von Immunoassays aufgrund der geringeren Konzentration sehr schwierig ist, bedient man sich der Messung von durch IFNƬ stimulierter Genexpression. Diese wurde bereits früh in der Gravidität beim Rind in peripheren Leukozyten gemessen (Green et al., 2010; Shirasuna et al., 2012; Matsuyama et al., 2012). Erste Ergebnisse dazu, dass IFNƬ die maternale Blutbahn erreicht, wurden von Oliveira et al. (2008) und Bott et al. (2010) an Schafen publiziert. Letztgenannte Autoren haben eine IFNƬ-stimulierte Genexpression nicht nur in peripheren Leukozyten, sondern auch im Gelbkörper entdeckt. Bott et al. (2010) konnten zudem eine IFNƬ-stimulierte
57 Genexpression in der Leber von Schafen feststellen. Weitere Hinweise darauf, dass IFNƬ
einen Einfluss auch auf den Stoffwechsel haben könnte, ergeben sich anhand der bei Ratten beobachteten Gewichtsabnahme nach oraler IFNƬ-Gabe (Tekwe et al., 2013). Die von Romero et al., (2015) gezeigte Induktion der IFNƬ-Genexpression (MX1 und ISG15) in der Leber beim Schaf wurde in Publikation 9 in vivo für das Rind am Tag 18 der frühen Gravidität gezeigt. Bisher sind aber Aussagen über einen Einfluss von IFNƬ auf die somatotrope Achse rein spekulativ. Im Endometrium führt IFNƬ zu einer herab Regulation von IGF-2 (Chen et al., 2006) und vermag auch die SOCS2-Expression zu induzieren (Carvalho et al., 2014), sodass es auch in der Leber zu einer Beeinflussung von metabolischen Signalwegen kommen könnte.
58 6.4. Ausblick
Ziel der Studien war es, die somatotrope Achse als zentrales endokrines Zentrum, das die Nährstoffpartitionierung steuert, detaillierter zu charakterisieren. So wurde durch die Studien die Komplexität der Regulationsebenen in dieser Achse weiter aufgeschlüsselt und dabei insbesondere auch auf tierindividuellen Unterschiede geachtet. Die Untersuchungen zeigten eine deutliche Assoziation zwischen der individuellen Adaptations- und Regulationsfähigkeit der somatotropen Achse und dem Risiko für die Entwicklung postpartaler Ketosen. Ferner stellte sich heraus, dass auch während der frühen Trächtigkeit und des Zyklus die somato-trope Achse den maternalen Metabolismus reguliert. Allerdings fehlen beim Rind noch Studien, zu folgenden Fragestellungen:
Eignen sich IGF-1 oder andere Parameter der somatotropen Achse (z.B. IGFBP2) als betriebsübergreifende Biomarker, um frühzeitig Kühe mit einem erhöhten Risiko für Stoffwechselerkrankungen zu erkennen?
Welche Ursachen haben tierindividuelle Unterschiede in der Adaptation der somatotropen Achse während der späten Trächtigkeit und welche Rolle spielen diese Ursachen für die Pathophysiologie der Ketose der Milchkuh?
Welche Faktoren beeinflussen die hepatische IGFBP3- und ALS-Produktion bei Milchkühen und in welchen hepatozytären Kompartimenten werden diese Bindungs-proteine beim Rind unter welcher Kontrolle gebildet?
Wird IGFBP4 wie beim Menschen ebenfalls bei der Milchkuh durch PAPP-A während der Frühgravidität proteolytisch gespalten und welche Funktion hat die Proteolyse von Bindungsproteinen für den Erhalt einer Trächtigkeit beim Rind?
Welchen Einfluss hat IFNƬ in der maternalen Leber? Kommt es dort zu einer Induktion von SOCS-Proteinen?
Zur Beantwortung letzterer Fragen könnten zunächst gezielt Faktoren oder Faktorenkombi-nationen in vitro an bovinen Hepatozyten getestet werden, um anschließend im Tiermodell Gründe herauszufinden, die dazu führen, dass einige Kühe in der Lage sind, adäquat auf eine hohe einsetzende Laktationsleistung mit angepasster Lipolyse zu reagieren und andere nicht. Zu diesem Ziel wurde bereits eine primäre Zellkultur boviner Hepatozyten als Sandwich-Kultur etabliert (Ehrhardt et al. 2015; Abbildung 7). Die Ergebnisse solcher Studien
59 könnten künftig dazu dienen, Maßnahmen in den Bereichen Genetik und Tierhaltung zu entwickeln, um gesunde hochleistende Milchkühe mit adäquater Lipolyse zu erhalten.
Abbildung 7: Darstellung vitaler boviner primärer Hepatozyten in Sandwich-Kultur zwischen zwei Lagen Kollagenmatrix (a: nativ und b: Live/Dead® Viability/Cytotoxicity Kit, Life technologies, grüne Fluoreszenz zeigt lebende Zellen)
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7. Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die somatotrope Achse als ein zentrales endokrines System für die Nährstoffpartitionierung während der Adaptation an die Trächtigkeit und Laktation bei der Milchkuh detailliert zu untersuchen. Hierbei stand die zentrale Frage im Vordergrund, inwiefern sich pluripare Kühe in ihrer antepartalen Stoffwechseladaptation in dieser endokrinen Achse voneinander unterscheiden und ob solche Unterschiede mit dem Risiko für postpartale infektiöse oder metabolische Erkrankungen assoziieren. Vor diesem Hintergrund wurden Tiere aufgrund ihrer antepartalen IGF-1-Konzentration selektioniert und die zentralen Komponenten der somatotropen Achse in der späten Trächtigkeit mit beson-derem Augenmerk auf tierindividuelle Unterschiede untersucht. Dazu gehörte die Analyse der peripheren GH- und IGF-1-Konzentrationen, als auch der IGF-Bindungsproteine (IGFBP2, 3 und 4). Darüber hinaus wurden in Leberbiopsien die mRNA-Expressionen des Wachstumshormonrezeptors und eines Inhibitors des GHR-Signaltransduktionswegs (Supressor of Cytokine Signalin2; SOCS2) als auch die hepatische Expression von Bindungsproteinen untersucht.
Des Weiteren wurde der Frage nachgegangen, welchen Einfluss endogene Sexualsteroid-hormone 17β-Östradiol und Progesteron auf die hypophysäre und hepatische Ebene der so-matotropen Achse haben. Dazu wurden zum einen Färsen während des Zyklus und zum anderen in der Frühgravidität bis Tag 18 untersucht. Neben dem GH und IGF-1 wurde vor allem der hepatische GHR-Signaltransduktionsweg in Leberbiopsien detailliert betrachtet. Es wurde ferner untersucht, ob es bereits zu Beginn einer Trächtigkeit beim Rind zu metabolischen Adaptationen innerhalb der somatotropen Achse kommt oder diese vornehmlich in der späten Trächtigkeit auftreten. Neben dem Einfluss von Steroidhormonen ergab sich schliesslich im Laufe der Studien die Frage, ob auch das embryonale Signal IFNƬ die Leber in der frühen Trächtigkeit erreicht und theoretisch ebenfalls eine Rolle bei der maternalen metabolischen Adaptation spielen könnte.
Die Studien dieser Habilitationsarbeit zeigen, dass die IGF-1-Konzentration während der späten Gravidität und der frühen Laktation mit der Phagozytosekapazität neutrophiler Granulozyten korreliert, aber kein Zusammenhang zwischen der IGF-1 Konzentration und dem Risiko an infektiösen postpartalen Erkrankungen zu erkranken, besteht. Tiere mit niedrigen antepartalen IGF-1-Konzentrationen entwickelten aber häufiger postpartale Stoffwechselstörungen (Ketosen). Pluriparen Kühe mit niedrigen antepartalen
IGF-1-61 Konzentrationen wiesen auch niedrigere Insulinspiegel und als Ausdruck einer frühen gesteigerten Lipolyse höhere Konzentrationen an nichtveresterten Fettsäuren auf im Vergleich zu Kühen mit hohen IGF-1-Konzentrationen. Interessanterweise gab es bei Kühen mit unterschiedlichen IGF-1-Konzentrationen keine Differenzen in der hepatischen GHR-Expression. Kühe mit einer niedrigen IGF-1-Konzentration wiesen aber eine niedrigere ALS-Expression auf. Dieses Bindungsprotein verbindet IGF-1 mit IGFBP3 und eine verminderte Menge führt zu einer erhöhten Freisetzung von IGF-1, dessen Halbwertszeit ohne die Bindung an IGFBPs nur kurz ist. Die Hypothese, dass auch der dem GHR nachgeschaltete Signaltransduktionsweg bei Kühen mit niedrigen IGF-1-Konzentrationen durch die Induktion inhibitorischer Proteine (SOCS2) blockiert sein könnte, wurde in den durchgeführten Studien bei Kühen in der späten Trächtigkeit nicht bestätigt.
Im physiologischen Zyklus wurde vor der Ovulation die höchste 17β-Östradiolkonzentration gemessen. Zu diesem Zeitpunkt waren auch die GH- und die IGF-1-Konzentration im Serum am höchsten. Der Effekt von Östradiol auf die hypophysäre GH-Ausschüttung wurde damit bestätigt. Überdies kam es während des Zyklus auch zu Veränderungen der hepatischen Komponenten der somatotropen Achse. Vor der Ovulation wurde zunächst eine erhöhte GHR-Expression festgestellt, die mit der Induktion von SOCS2 assoziiert war. Folglich wird in der Leber entweder die GH-Wirkung durch die GH-induzierte SOCS2-Expression unterdrückt oder 17β-Östradiol initiiert direkt die SOCS2-Expression. Während der frühen Trächtigkeit fiel die IGFBP4-Konzentration ab. Dieses Phänomen ist bereits bei anderen Spezies beschrieben und dient der vermehrten Freisetzung von freiem IGF-1, da IGFBP4 als vornehmlich inhibitorisches Bindungsprotein bekannt ist. Die Beobachtung, dass es bereits an Tag 18 der Gravidität in der Leber von Färsen zu einer INFƬ-induzierte Genexpression kommt und so möglicherweise neben Steroidhormonen zur Adaptation des maternalen Metabolismus während der Frühträchtigkeit beiträgt, ist ein Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen zur Stoffwechseladaptation während der Trächtigkeit beim Rind.
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8. Summary
The aim of this habilitation treatise was the detailed characterization of the somatotropic axis, a pivotal endocrine system for nutrient partitioning during metabolic adaption towards pregnancy and lactation in dairy cows. The question was whether pluriparous cows may show differences within this endocrine axis and if those differences may be associated with an increased risk of post partal infectious or metabolic production diseases. Therefore cows were selected based on their antepartal IGF-1 concentration and main endocrine endpoints were examined during late pregnancy. These examinations included the analyses of the peripheral GH- and IGF-1 concentrations as well as their corresponding binding proteins (IGFBP2, 3 and 4). Moreover liver biopsies were analyzed for mRNA-expression of the hepatic growth hormone receptor (GHR) and inhibitors of the GHR-signal transduction pathway (SOCS2) and IGF binding proteins.
The influence of endogenous sexual steroid hormones (17β-estradiol and progesterone) on the somatotropic axis (pituitary and hepatic level) was examined. Therefore Holstein-Friesian heifers during a physiological cycle and early pregnancy until day 18 were used, and main components of the somatotropic axis were analyzed in blood and liver biopsies. Additionally the question arose if the embryonic signal IFNƬ enters the blood stream and central metabolic organs like the liver during early pregnancy; and therefore may also play a role in metabolic adaption during early pregnancy.
The results of the conducted studies indicated that the IGF-1 concentration was associated with the phagocytic performance of neutrophilic granulocytes during late pregnancy and early lactation. But an association with an enhanced risk to infectious production diseases after calving was not found. However, cows with low antepartal IGF-1 levels had a higher risk for clinical ketosis after calving. Pluriparous dairy cows with low IGF-1 concentrations before calving also exhibits lower insulin- and higher NEFA-concentrations indicating an enhanced lipolysis. Interestingly, cows with different peripheral IGF-1 concentrations had similar GHR1A-expression measured in liver biopsy specimens. However the mRNA-expression of the ALS was lower in cows with low IGF-1 concentration. The ALS forms together with IGFBP3 a ternary complex with IGF-1 and a lower concentration lead to an enhanced release of IGF-1 resulting in low IGF-1 concentrations because the half-life of IGF-1 is low
63 without these binding proteins. The hypothesis that the GHR signal transduction pathway is inhibited by the induction of SOCS2 could not be confirmed by the studies carried out.
During a physiological cycle the highest 17β-estradiol concentration was found before ovulation and contemporary the GH- and IGF-1 concentration was high in serum compared to the luteal phase. The enhancing effect of estradiol on the pituitary GH-release could be confirmed. Moreover also the hepatic components of the somatotropic axis were affected during a physiological cycle. Before ovulation the GHR-expression was high and this was associated with higher SOCS-expression when comparing with the luteal phase. Hence the SOCS2-expression may inhibit the GH-effect on the liver by induction of SOCS by GH or estradiol directly induces the SOCS2-expression.
The IGFBP4 concentration decreased during early pregnancy. This phenomenon is already known from other species and provides the basis for an enhanced release of unbound IGF-1 because IGFBP4 is known as an inhibitory binding protein.
On day 18 of pregnancy an INFƬ-induced gene expression was detected in the liver of Holstein Friesian heifers and this observation provide the basis for further studies on the underlying mechanism for metabolic adaption during early pregnancy in dairy cows.
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9. Literaturverzeichnis
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