Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Immunhistochemische Diagnostik
von intraokulären Melanomen bei Hund und Katze
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Silke Glage aus Gronau/Leine
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer
1. Gutachterin(nen)/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer 2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M.H. Boevé
Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2001
„ Der Gesichtssinn ist der Treffpunkt zwischen Dingen und Denken, er ist das Perlentor
zwischen Sonne und Sinn.“
(Jostein Gaarder)
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 6
2 Literatur 7
2.1 Auftreten von intraokulären Tumoren . . . 7
2.1.1 Sekundäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze . . . 8
2.1.2 Primäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze . . . 9
2.1.3 Klinische und lichtmikroskopische Diagnose und Differentialdiagno- se des okulären Melanoms . . . 17
2.1.4 Therapie und Prognose . . . 18
2.1.5 Okuläre Melanome beim Menschen . . . 19
2.2 Immunhistochemie zur Differenzierung von Melanomen . . . 21
2.2.1 Immunhistochemie der Melanomdiagnostik in der Humanmedizin . . 21
2.2.2 Immunhistochemie in der Diagnostik der Veterinärmedizin . . . 22
3 Eigene Untersuchungen 27 3.1 Material . . . 27
3.1.1 Untersuchungsmaterial . . . 27
3.1.2 Präparation des Bulbus . . . 31
3.1.3 Paraffineinbettung . . . 31
3.1.4 Schnittherstellung . . . 32
3.2 Methoden . . . 32
3.2.1 Lichtmikroskopische Untersuchung . . . 32
3.2.2 Auswertung der lichtmikroskopischen Untersuchungen . . . 33
3.2.3 Immunhistochemische Untersuchung . . . 34
3.2.4 Kontrollen . . . 37
3.2.5 Auswertung . . . 38
3.3 Ergebnisse . . . 39
3.3.1 Vorberichte und makroskopische Untersuchungsergebnisse der Hun- de . . . 39
3.3.2 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse der Hunde . . . 47
3.3.3 Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse der Hunde . . . . 52
3.3.4 Vorberichte und makroskopische Untersuchungsergebnisse der Kat- zen . . . 61
3.3.5 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse der Katzen . . . 69
3.3.6 Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse der Katzen . . . . 75
3.3.7 Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse anderer okulärer Tumore . . . 83
4 Diskussion 85 5 Zusammenfassung 96 6 Anhang 100 6.1 Bezugsadressen . . . 100
6.2 Reagenzien für die Immunhistologie . . . 101
6.2.1 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung . . . 101
6.2.3 Bleichen von Melanin mit Wasserstoffperoxid . . . 101 6.3 ABC-Methode der immunhistochemischen Färbungen . . . 101
7 Literaturverzeichnis 104
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AEC 3- Amino-9-ethylcarbazol bzw. beziehungsweise
chron. chronisch
DAB 3,3-Diaminobenzidin-tetra-hydrochloriddihydrat EKH Europäisch Kurzhaar
E.-Nr. Einsendungsnummer epith.Typ epitheloider Typ Fa. Firma
GAM “goat anti mouse”
GAR “goat anti rabbit”
ÆC Grad Celsius ggr geringgradig
H.&E. Hämalaun-Eosin Färbung hgr hochgradig
infiltr. infiltriert k. kastriert
Ln. Lymphonodus m. männlich mgr mittelgradig Min. Minuten nm Nanometer Nr. Nummer
PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Sp.A Spindelzelltyp A
Sp.B Spindelzelltyp B Tab. Tabelle
w. weiblich
WHO World Health Organisation z.B. zum Beispiel
m Mikrometer
1 Einleitung
Immunhistologische Färbungen haben in den letzten 15 Jahren in der Humanmedizin, ins- besondere nach Etablierung der monoklonalen Antikörpern, zu einem enormen Fortschritt in der Tumordiagnostik geführt. So können aufgrund der Oberflächenantigene Neoplasien genau ihrem zytologischen Ursprungsgewebe zugeordnet werden und bieten dem Patho- logen eine wesentliche Entscheidungshilfe bei der Diagnostik (HASTKA 1997). Auch in der Veterinärmedizin hat die immunhistologische Diagnostik an Bedeutung gewonnen. Viele in der Humanmedizin verwendeten Antikörper weisen eine Kreuzreaktivität zu Geweben tierischen Ursprungs auf und sind so auch in der veterinärpathologischen Diagnostik ver- wendbar. Sie sollten jedoch vor ihrer routinemäßigen Anwendung auf ihre Spezifität im jeweiligen Gewebe sowie in den unterschiedlichen Tierarten geprüft werden.
Das von zwei Arbeitsgruppen nahezu zeitgleich entdeckte Gen eines für Melanome spezi- fischen Proteins und der dazu entwickelte Antikörper Melan A wird in der Humanmedizin bereits routinemäßig eingesetzt (KAWAKAMI et al. 1994, COULIE et al. 1994, CHEN et al. 1996, FETSCH et al. 1997). Da dieser Antikörper eine Kreuzreaktivität zu caninen Ge- webe aufweist, ist er auch für die veterinärmedizinische Diagnostik von Bedeutung. Seine Spezifität und andere Eigenschaften an tierischen Geweben gilt es jedoch noch genau zu evaluieren. In der Dissertation von VON REISWITZ 1999 wurden verschiedene canine Gewebe und canine Tumoren auf eine Reaktion mit dem Antikörper Melan A untersucht.
Der Antikörper konnte dabei regelmäßig in kutanen und oralen Melanomen und in einem okulären Melanom nachgewiesen werden. Des weiteren sind die in der Literatur bekann- ten positiven Reaktionen mit Sertoli- und Leydigzellen, den Granulosazellen der Ovarien und Neoplasien der Nebennierenrinde aufgetreten. Positive Reaktionen traten außerdem in epithelialen Gewebe der unveränderten Mamma auf.
Sowohl beim Hund als auch bei der Katze ist das okuläre Melanom der häufigste primäre
ziert. Ob für diesen Anstieg die verbesserte Augenuntersuchung in der Kleintiermedizin die Ursache ist, oder ob Umweltfaktoren wie eine erhöhte ultraviolette Einstrahlung eine Rolle spielen, ist dabei noch ungeklärt. Ein für Melanome spezifischer Antikörper würde die Unterscheidung zu anderen pigmentierten Tumoren erleichtern bzw. die Diagnostik von amelanotischen Melanomen absichern. Ebenso würde es dem Kliniker ermöglichen, dem Patientenbesitzer genauere Aussagen hinsichtlich der Prognose zu machen und die weitere Therapie abzukären. Die vorliegende Arbeit untersucht die Spezifität und färberi- schen Qualitäten des Antikörpers Melan A an caninen und felinen okulären Melanomen im Vergleich zu den in der Veterinärmedizin routinemäßig zur immunhistologischen Dia- gnostik von Melanomen eingesetzten Antikörpern S100 und Vimentin, die jedoch nicht spezifisch für Melanome sind. Dabei soll die Kreuzreaktivität dieses Antikörpers sowohl zu caninen als auch zu felinen Material gezeigt werden. Die zur Untersuchung ausge- wählten Tumore am Auge von Hund und Katze sind im Rahmen der Auftragsdiagnostik am Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in der lichtmikroskopi- schen Beurteilung (H. & E.-Färbung) als Melanom befundet worden. Diese Diagnose soll hier mittels des neuen Immunmarkers Melan A überprüft werden.
2 Literatur
2.1 Auftreten von intraokulären Tumoren
Bei dem Auftreten von intraokulären Tumoren werden primäre und sekundäre oder meta- statische Neoplasien unterschieden. Dabei sind metastatische Uveatumoren sowohl beim Tier als auch beim Menschen häufiger zu finden als bisher angenommen wurde, wenn systematisch nach ihnen gesucht wird (BARRON et al. 1963, SCHAEFFER u. JOSTEN 1999). So werden die uveovaskulären Karzinommetastasen beim Menschen als die häu- figsten intraokulären Tumoren betrachtet (NELSON et al. 1983).
2.1.1 Sekundäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze
Da das Auge frei von Lymphbahnen ist, erfolgt die Metastasierung von Sekundärtumoren in das Auge ausschließlich auf hämatogenem Weg (SCHAEFFER u. JOSTEN 1999).
In den meisten Fällen der in der Literatur beschriebenen metastatischen intraokulären Tu- moren handelt es sich um einen epithelialen Primärtumor (BARRON et al. 1963), wobei zu beachten ist, daß epitheliale Tumore häufiger vorkommen als mesenchymale (SCHAEF- FER u. JOSTEN 1999). Dabei treten Mammakarzinome (LADDS et al. 1979, WEST et al. 1979) und Lungenkarzinome am häufigsten als Primärtumoren auf (HAMILTON et al.
1984, GIONFRIDDO et al. 1990, HEIDER et al. 1997). Aber auch Adenokarzinome (DUNN O´ROURKE u. GEIB 1970, BELLHORN 1972, MOISE et al. 1982, MURPHY et al. 1989, ZIPS u. ZIPS 1991, HABIN u. ELSE 1995) und Plattenepithelkarzinome (COOK et al.
1984, HAYDEN 1976) sowie Metastasen von Nierenkarzinomen (HAIMOVICI et al. 1997) und Sticker-Tumoren (BARRON et al. 1963, MILLER et al. 1990) werden diagnostiziert.
Selten kommen Medulloepitheliome (WILCOCK u. WILLIAMS 1980) und Metastasen von Seminomen (HOGEN ESCH et al. 1987) vor. Von den mesenchymalen Tumoren werden Metastasen von Hämangiosarkomen (SZYMANSKI 1972), Leiomyosarkomen, Fibrosar- komen (VERWER u. THIJE 1967, PEIFFER et al. 1978, PEIFFER 1983), Lymphomen (SAUNDERS u. BARRON 1964, DARBES et al. 1999), Osteosarkomen (RENDER et al.
1982) und Gangliomen (SAUNDERS et al. 1969) mit Lokalisation im Auge beschrieben.
WILIAMS et al. (1981) nennt das uveale Lymphosarkom als den häufigsten intraokulären metastatischen Tumor der Katze.
HABIN u. ELSE (1995) sind der Meinung, daß ein unilateral auftretender okulärer Tu- morprozeß für eine primäre Neoplasie spricht, während ein bilaterales Auftreten auf ei- ne Metastasierung hindeutet. Jedoch werden die Mehrzahl der Fälle von metastatischen Uveatumoren mit bekanntem Primärtumor als unilateral beschrieben, so daß dies nicht
Bei der Katze wird als einziger Tierart ein post-traumatisches Tumorsyndrom beschrieben.
Dabei lag das Trauma bei der Diagnose typischerweise bereits mehrere Jahre zurück. Dia- gnostiziert wurden dabei Osteosarkome und undifferenzierte Sarkome. Da in den meisten Fällen die Linsenkapsel rupturiert war, vermutet man bei dem post-traumatischen Tumor- syndrom das Linsenepithel als Ausgangsgewebe für das Tumorwachstum (WOOG et al.
1983, DUBIELZIG 1984, DUBIELZIG u. EVERITT 1986, PEIFFER 1986, MILLER et al.
1987, HAKASON et al. 1990).
Das Durchschnittsalter der betroffenen Tiere bei der Diagnose eines sekundären intrao- kulären Tumors liegt bei 10 Jahren (Hund) bzw. 11 Jahren (Katze). Die Prognose der betroffenen Tiere wird als schlecht beurteilt, meist erliegen sie bald nach der okulären Diagnose der Primärerkrankung (HASTKA 1997).
2.1.2 Primäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze
Primäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze sind selten (ACLAND 1979, DITERS et al. 1983). Genaue statistische Angaben fehlen daher bislang in der Literatur (RYAN u.
DITERS 1984). Bei beiden Tierarten sind jedoch Melanome die am häufigsten beschrie- benen primären okulären Neoplasien (GWIN et al. 1982, AGUIRRE et al. 1984, DUGAN et al. 1993). In einer Statistik des Armed Forces Institute of Pathology wurden die Ursachen von Enukleationen in 404 enukleierten caninen Augen erhoben. In 12% der Fälle waren hier primäre Melanome der Grund, in 14% andere primäre okuläre Tumore und in 9% wur- den okuläre Metastasen diagnostiziert (GELATT et al. 1979). In einer anderen Erhebung des North Carolina Center for Comparative Ophthalmology waren 12 von 69 enukleierten Augen uveale Melanome der Pars anterior (PEIFFER 1981).
Die Primärlokalisation des Melanoms befindet sich meist in Iris und Ciliarkörper, Uvea anterior (ACLAND 1979, DITERS et al. 1983), selten im hinteren Augensegment, Uvea postalis, wie es beim Menschen der Fall ist (WEISSE et al. 1985, BORNFELD et al. 1986).
So ist das klinische Bild eines sekundären Glaukoms häufig, da infolge des Dickenwachs- tums der Iris der Abflußwinkel für das Kammerwasser verlegt wird. Auch können frei in der Augenkammer schwimmende Tumorzellen den Abflußwinkel verlegen. Weitere klinische Merkmale sind Pigmentveränderungen, Linsentrübungen und Umfangszunahme des be- troffenen Auges (COLLINSON u. PEIFFER 1995).
Es werden auch Fälle mit Primärlokalisation in der Uvea postalis beschrieben (McCLEL- LAND 1941, SAUNDERS u. BARRON 1958, WEISSE et al. 1971, DITERS et al. 1983).
Alle Autoren sind sich einig, daß diese Lokalisation selten beschrieben wird. Als klinischer Befund ist hier eine Ablösung der Retina zu finden. Histologisch läßt sich eine hypertro- phierte retinale Pigmentschicht feststellen. In einer Studie von fünf Melanomen mit Loka- lisation in der Uvea postalis beschreiben DUBIELZIG et al. (1985) ein im Vergleich zum Melanom der Uvea anterior auffallend gutartiges histologisches Erscheinungsbild und ein Fehlen von infiltrativen Wachstum ebenso wie Anzeichen von Anaplasien der Tumorzel- len. Sie folgern daraus ein vorwiegend benignes Verhalten von primären Melanomen der Uvea postalis beim Hund, wie es auch beim Mensch bekannt ist. Allerdings räumen sie eine schlechtere Prognose für Neoplasien ein, die auf den Nervus opticus übergreifen. Sie vermuten außerdem, daß das vermehrte Diagnostizieren von Melanomen der Uvea ante- rior auf die oft ungenügende Augenhintergrunduntersuchung bei Hunden zurückzuführen sei (WEISSE et al. 1985). O‘TOOLE u. MURPHY (1983) stellen Ähnlichkeiten mit den uvealen Melanomen der Uvea postalis des Menschen fest. Sie vermuten den Ursprung dieser ihrer Meinung nach ebenfalls benignen Veränderungen in Naevi und beschreiben im Fall eines Schnauzers eine Ruptur der Bruchschen Membran, naevus-ähnliche Zellen und ein orange-gelbes Pigment, welches ebenfalls beim Menschen im uvealen Melanom der Pars posterior gefunden wird.
Das okuläre Melanom tritt meist unilateral und ohne Seitenbevorzugung auf (SAUNDERS u. BARRON 1958), es werden jedoch auch sehr seltene Fälle von bilateralem Auftreten
Zur Metastasierung der primären okulären Melanome fehlen genaue systematische Un- tersuchungen bei Hund und Katze (SCHAEFFER u. FUNKE 1985). Es werden dazu in der Literatur sehr unterschiedliche Angaben und Vermutungen geäußert. Alle Aussagen bestätigen jedoch, daß das primäre okuläre Melanom metastasiert, auch nach Bulbusent- fernung und teilweise mit mehreren Jahren Inzidenzzeit.
Die histologische Klassifizierung der Melanome erfolgte meist nach den 1974 von KIR- CHER und Mitarbeitern ausgearbeiteten und von der WHO übernommenen morphologi- schen Kriterien für das primär-okulare maligne Melanom. Diese Einteilung orientierte sich an der ursprünglich von CALLENDER (1931) für das primäre intraokulare Melanom beim Menschen begonnenen Einteilung der morphologischen und klinischen Kriterien. Dabei wird von einer zunehmenden Malignität in der folgenden Reihenfolge der histologischen Befunde ausgegangen:
Spindelzelltyp A (längliche Tumorzellen mit ovoiden Kernen ohne Kernkörperchen)
Spindelzelltyp B (plumpe, teilweise pigmentierte Spindelzellen mit großen Kernen und deutlichen Kernkörperchen)
epitheloider Zelltyp (pigmentreiche, polyedrische Zellen mit großen Kernen und deutlichen Kernkörperchen)
gemischtzelliger Typ (variierend aus spindelförmigen und epitheloiden Zellen zusammen- gesetztes Zellbild)
Diese Malignitätseinteilung konnten SCHAEFFER et al. 1985 in ihrer Studie bestätigen.
Sie berücksichtigten außerdem weitere histologische Kriterien wie einen hohen Pigment- gehalt, eine hohe Mitoserate, ein geringer Gehalt an von Tumorzellen produzierten Re- tikulinfasern und das Vorkommen von Tumorzellnekrosen. Auch ein expansiv-infiltratives Wachstum mit Skleraeinbruch und Hornhautinfiltration gehört zu den Malignitätszeichen.
Dabei muß beachtet werden, daß der Pigmentgehalt des epitheloiden Zelltypes bei der Katze auffallend gering ist und auch Retikulinfasern weniger vorkommen (SCHAEFFER
u. FUNKE 1985).
Primäre intraokuläre Melanome beim Hund
Beim Hund treten die okulären Tumore vorwiegend in der vorderen Uvea auf. Melanome sind dabei etwa doppelt so häufig wie andere Neoplasien und damit die häufigsten pri- mären intraokulären Tumore beim Hund (SAUNDERS u. BARRON 1958, ACLAND 1979, DITERS et al. 1983). Insgesamt treten intraokuläre Melanome beim Hund seltener auf als kutane und orale Melanome (SCHAEFFER u. FUNKE 1985).
Das durchschnittliche Alter der Hunde zum Zeitpunkt der Diagnose eines okulären Mela- noms liegt bei 9 Jahren (MARTIN 1994) bzw. 8 Jahren (DITERS et al. 1983, SCHAEFFER u. FUNKE 1985).
Das histologische Erscheinungsbild beim Hund wird als vorwiegend benigne beschrieben, es kommen oft sogenannte “baloon cells” vor. Dies sind große, runde Zellen mit kleinem Zellkern und viel feingranuliertem Melanin, deren Entstehung unbekannt ist (CALDER- WOOD MAYS et al. 1985). Auch WEISSE et al. (1985) beschreiben das Auftreten von plumpen Zellen, die mit Melanosomen gefüllt sind. Sie können nicht unterscheiden, ob es sich hierbei um Melanocyten oder Makrophagen handelt. Sie beschreiben außerdem ei- ne Autophagozytose, die abhängig vom Alter in unveränderten Melanosomen auftritt, und die sie ebenfalls in malignen Melanozyten beim Tier gefunden haben. In einer Studie von insgesamt 23 okulären Melanomen beim Hund ordnen DITERS et al. (1983) 12 Tumoren dem Spindelzell A-Typ zu, vier dem Spindelzell B-Typ, nur eines dem Epitheloidzelltyp und fünf dem gemischtzelligen Typ. Die großen, mit viel Pigment beladenen Zellen, die an be- ladene Makrophagen erinnern, bezeichnen sie als Tumorzellen mit eigener Synthese von Melanosomen.
Das Auftreten von intraokulären Melanomen beim Hund ist spontan (SCHAEFFER u.
FUNKE 1985), konnte allerdings beim Beagle durch eine einmalige intravenöse Injektion
Eine Disposition wird bei den Hunden bei Dackel, Boxer und Schäferhund vermutet (RY- AN u. DITERS 1984, SCHAEFFER u. FUNKE 1985). DITERS et al. (1983) konnten in ihrer Untersuchung von 23 intraokulären Melanomen allerdings keine Rassedisposition nachweisen. AGUIRRE et al. (1984) stellen ein gehäuftes Auftreten von Melanomen in der Uvea postalis beim Beagle fest.
Es herrscht ein ausgeglichenes Geschlechterverhältnis (COLLINSON u. PEIFFER 1995).
Zu der Frage nach dem Metastasieren von primären intraokularen Melanomen finden sich in der Literatur sehr unterschiedliche Meinungen. In einigen Untersuchungen sind Meta- stasierungen von primären okulären Melanomen beim Hund relativ selten (O´TOOLE u.
MURPHY 1983). In verschiedenen Studien werden 2 von 27, 2 von 31, 1 von 22 bzw. 7 von 129 Fälle mit Metastasen beschrieben (DITTER et al. 1983, RYAN u. DITERS 1984, WILCOCK u. PEIFFER 1985). SAUNDERS u. BARRON (1958) sind dagegen der Auf- fassung, eine Metastasierung tritt häufiger auf. RYAN u. DITERS (1984) differenzieren nach dem Zellbild. Sie halten die Metastasierungsgefahr bei epitheloiden und gemischt- zelligen Tumoren beim Hund für höher als bei einem spindelförmigen Zellbild. Für eine allgemeine Aussage reicht ihrer Meinung nach die alleinige Auswertung des histologi- schen Bildes allerdings nicht aus. Sie schließen sich damit weiteren Arbeitsgruppen an und fordern für eine sichere Aussage Untersuchungen aus Langzeitstudien (KIRCHER et al. 1974, O‘TOOLE u. MURPHY 1983). TRUCKSA et al. (1985) sind der Meinung, die einzigen Indikatoren für eine mögliche Metastasierung seien extrasklerale und sekundäre Glaukome, dagegen meinen WILCOCK u. PEIFFER (1985), eine Prognose bezüglich der Metastasierung sei nur anhand des Mitoseindexes zu stellen. Sie kommen dabei auf eine Metastasierungsrate von 5-7%. SCHAEFFER u. FUNKE 1985 ziehen aus den Aussagen ihrer Kollegen und aus eigenen Untersuchungen 1985 den Schluß, daß das primäre in- traokuläre Melanom beim Hund häufig, aber erst spät metastasiert.
Insgesamt scheinen beim Hund okuläre Adenokarzinome eher zur metastasieren als Me- lanome (MARTIN et al. 1994).
Primäre intraokuläre Melanome bei der Katze
Auch bei der Katze fehlen genaue statistische Angaben zum Auftreten von primären oku- lären Tumoren. Insgesamt sollen sie jedoch seltener auftreten, als beim Hund (ACLAND 1979, SCHAEFFER u. FUNKE 1985), wobei das Melanom bei der Katze ebenso wie beim Hund der häufigste intraokuläre Tumor ist (DUBIELZIG et al. 1985, WEISSE et a. 1985, COLLINSON u. PEIFFER 1995, DAY u. LUCKE 1995). Okuläre Melanome treten bei der Katze häufiger auf, als kutane und orale Melanome (PRIESTER u. McKAY 1980, PAT- NAIK u. MOONEY 1988). Vorwiegend tritt das primäre intraokuläre Melanom der Katze wie auch beim Hund in der vorderen Uvea auf (BELLHORN u. HENKIND 1970, SOURI 1978, ACLAND et al. 1980, DUNCAN u. PEIFFER 1991).
Im Rahmen der ophthalmopathologischen Diagnostik am GSF-Institut für Pathologie in den Jahren 1990-1992 fällt abweichend zu den Literaturangaben eine zunehmende Häu- figkeit von okulären Melanomen bei der Katze auf (SCHAEFFER u. GORDON 1993).
Klinisch ist bei der Katze das okuläre Melanom der Uvea anterior durch eine diffuse oder fokale braune Pigmentierung der Iris gekennzeichnet, die leicht erhaben zu sein scheint.
Durch ein fortschreitendes Dickenwachstum verformt sich die Iris wellenförmig und ver- engt so den Filtrationswinkel. Es entsteht ein sekundäres Glaukom. In 14 von 37 unter- suchten felinen okulären Melanomen am GSF-Institut für Pathologie konnte dieser Prozeß nachgewiesen werden (SCHAEFFER u. GORDON 1993). Des weiteren werden häufig Hydrophthalmus und Ophthalmie beobachtet (PATNAIK u. MOONEY 1988).
Das Durchschnittsalter bei der Katze zum Zeitpunkt der Diagnose wird mit neun Jahren (SCHAEFFER u. FUNKE 1985), zehn Jahren (SCHAEFFER u. GORDON 1993), bzw elf Jahren (PATNAIK u. MOONEY 1988) angegeben.
Bei der Katze ist das Zellbild der okulären Melanome vorwiegend maligne (BELLHORN u.
HENKIND 1970, ACLAND et al. 1980). Die Tumore sind häufig pigmentarm (SCHAEFFER
Zellen (PEIFFER 1981) und zeigen vielfach eine diffuse Wuchsform mit anaplastischen Epitheloidzellen und Kernpleomorphien. So waren in einer Studie dieser Arbeitsgruppe 35 von 37 intraokulären Melanomen der Katze vom epitheloiden Zelltyp. Zwei von 37 un- tersuchten Fällen waren vom gemischtzelligen Typ. Außerdem wurde ein hohen Anteil an Fällen mit Sklerainvasion beobachtet. Hierdurch kann es zum Eindringen von Tumorzel- len in den intraskleralen Plexus venosus und damit zur Metastasierung kommen. Diese Beobachtung steht mit der in der Literatur allgemeinen Meinung einer häufigen Meta- stasierung des felinen primären intraokulären Melanoms im Einklang (SCHAEFFER u.
GORDON 1993). Dies zeigt eine im Vergleich zu den primären intraokulären Melano- men der Hunden höhere maligne Potenz. Warum das primäre intraokuläre Melanom der Katze dabei jedoch häufig amelanotisch bzw. pigmentarm ist, bleibt ungeklärt (SOURI 1978, SCHULTZE SCHLEITHOFF u. OPITZ 1983). ACLAND et al. (1980) beschreiben in einer Veröffentlichung drei Fälle von primär-intraokulären Melanomen bei der Katze, die ein benignes histologisches Bild zeigen. Sie betonen jedoch das seltene Auftreten dieses Erscheinungsbildes bei der Katze. Die beobachteten Neoplasien zeigten ein lang- sames, diffuses Wachstum, das Auftreten sogenannter “baloon cells”, wie sie vom Hund und Menschen bekannt sind ebenso wie epitheloide Zellen mit Zeichen von Anaplasie, die den Abflußwinkel des Kammerwassers verlegen und so zu einem sekundären Glaukom führten. Es wurden keine Metastasen beobachtet.
Das Auftreten von intraokulären Melanomen ist auch bei der Katze spontan (SCHAEFFER u. FUNKE 1985). Es kann jedoch durch Injektion von felinen Sarkomavirus in die vordere Augenkammer induziert werden (ALBERT et al. 1981).
Bezüglich einer Disposition bestimmter Katzenrassen sind in der Literatur keine Angabe vorhanden. In ihrer Untersuchung von 16 intraokularen Melanomen fanden PATNAIK u.
MOONEY (1988) folgende Rasseverteilung: 11 Domestic short hair, 3 Domestic long hair, 1 Siamese und 1 Perser.
Bei der Katze wird von SCHAEFFER u. FUNKE (1985) sowie SCHAEFFER u. GORDON
(1993) ein vermehrtes Erkranken männlicher Tiere an primären intraokulären Melanomen beobachtet, dabei aber eingeräumt, daß sonst in der Literatur ein ausgeglichenes Ge- schlechterverhältnis beschrieben wird. BELLHORN u. HENKIND (1970) dagegen finden mehr weibliche Tiere, die an primären intraokulären Melanomem erkrankt sind.
Auch bei der Katze gibt es in der Literatur unterschiedliche Meinungen bei der Frage nach dem Auftreten von Metastasen des primär-intraokulären Melanoms. So wird ihm einerseits trotz des malignen Zellbildes und Skleraeinbrüchen eine allgemein geringe Neigung zu schnellem Wachstum und Metastasierung zugesprochen (SCHULTZE SCHLEITHOFF u.
OPITZ 1983, CHAUDIEU u. FONK 1981). DUNCAN u. PEIFFER (1991) beschreiben eine lange Latenzperiode der Metastasen des intraokulären Melanoms bei der Katze. ACLAND et al. beobachteten andererseits 1980 ein schnelles Wachstum und eine frühe Metastasie- rung. SCHAEFFER u. GORDON (1993) lehnen eine verbindliche Aussage zum Risiko des Metastasierens aufgrund unzureichender Folgeuntersuchungen der enukleierten Katzen ab. PATNAIK u. MOONEY (1988) fanden in einer Untersuchung von 16 intraokulären Mela- nomen der Katze in 63% eine Metastasierung. Von diesen Tieren konnten sie in 14 Fällen Informationen zum weiteren Krankheitsverlauf bekommen. So wurden von den 14 Katzen 10 nach einem Zeitraum von durchschnittlich 156 Tagen aufgrund des Tumors getötet, nur vier lebten nach durchschnittlich 255 Tagen noch. In einer Auswertung von 50 in der Literatur beschriebenen primär-okulären Melanome bei der Katze finden SCHAEFFER u.
GORDON (1993) insgesamt 18 Fälle mit Metastasen, im eigenen Untersuchungsmaterial 3 von 37. Die Metastasen traten dabei nach einer Latenzperiode von wenigen Monaten bis zu zwei Jahren post enukleationem auf. Der Hauptsitz lag dabei in der Leber, an zweiter Stelle stand die Lunge (DUBIELZIG 1990). Dieses Verteilungsmuster der Metastasen wird auch beim Menschen beobachtet (ZIMMERMANN 1986). PATNAIK u. MOONEY (1988) finden dagegen den Hauptsitz der Metastasen bei den Katzen in den mandibulären und submandibulären Lymphknoten (8 von 10), in den restlichen zwei Tieren lag eine diffuse
vor.
2.1.3 Klinische und lichtmikroskopische Diagnose und Differentialdiagnose des okulären Melanoms
Das primär-intraokulare Melanom zeigt ein klinisch wie morphologisch variables und dif- ferenzialdiagnostisch schwieriges Erscheinungsbild (SCHAEFFER u. FUNKE 1985). So wurden nur 14 von 37 zur Diagnostik an das GSF-Institut für Pathologie eingesandte enu- kleierte Augen mit Melanomen von Katzen vom Kliniker als solche im Vorfeld diagnostiziert (SCHAEFFER u. GORDON 1993). Lichtmikroskopisch zeigen vor allem die Melanome der Katze ein variables Erscheinungsbild. Sie sind häufig pleomorph, unregelmäßig pig- mentiert oder amelanotisch und zeigen Nekrosen und Blutungen (PATNAIK u. MOONEY 1988). Sie sind im Gegensatz zu den gut pigmentierten Melanomen schwierig zu dia- gnostizieren (SCHULTZE SCHLEITHOFF u. OPITZ 1983). Dies bestätigt auch HASTKA (1997). Er stellt fest, daß die melaninhaltigen Melanome histologisch meist keine diffe- renzialdiagnostischen Probleme machen, amelanotische Melanome dagegen häufig als entdifferenzierte Karzinome oder Lymphome fehldiagnostiziert werden. Er weist darauf hin, sich bei dem Verdacht des Vorliegens eines Melanomes nicht ausschließlich auf die Immunhistologie zu verlassen und auch nach Melaningranula in den Zellen zu suchen.
Häufig weisen auch amelanotische Formen des Melanoms vereinzelt melaninhaltige Zel- len auf .
Für den Kliniker kommen differenzialdiagnostisch Pigmentflecken der Iris anderer Genese in Frage, wie zum Beispiel benigne hyperplastische Melanozyten (Sommersprossen) oder Irisnaevi (benigne Zellproliferation neuroektodermalen Ursprungs) (PEIFFER 1981). Unter Umständen kann mittels einer Biopsie ein Irismelanom histologisch ausgeschlossen wer- den. Ebenso sollte dies bei einer diffusen Pigmentveränderung mit Dickenwachstum der Iris erfolgen (SCHAEFFER u. FUNKE 1985). Dabei ist allerdings die Gefahr der intraoku-
lären Aussaat von Tumorzellen und damit der Metastasierung zu beachten (SCHAEFFER u. GORDON 1993). Beim Hund sind weiter frei in der Augenkammer schwimmende oder an Iris und Ziliarkörper fixierte, pigmentierte Zysten bekannt, die eine Glaukomsymptoma- tik auslösen können (CARTER u. MAUSOLF 1970). Bei der Katze gibt es altersbedingte oder als Folge von Entzündungen entstandene fokale Pigmentierungen der Uvea anterior.
Im Falle solch fraglicher Läsionen ist eine Kontrolle in regelmäßigen zeitlichen Abständen empfehlenswert (SCHAEFFER u. GORDON 1993).
Die klinische Unterscheidung zu Adenomen und Adenokarzinomen, der zweithäufigsten Tumorgruppe bei dem primären intraokulären Tumoren von Hund und Katze, ist äußerst schwierig und erfordert eine histologische Abklärung (KELLER 1981). Diese Tumore in- filtriern meist nicht diffus die Uvea anterior, sondern profilieren als nicht pigmentierter Tumor im vorderen Augensegment (Adenom) oder im gesamten okulären Binnenraum (Karzinom) (SCHAEFFER u. THYSSEN 1987). Das Lymphosarkom der Uvea anterior ist ebenfalls eine nichtpigmentierte, die Uvea anterior infiltrierende Tumorerkrankung, die allerdings meist nur bei dem systemischen Krankheitsbild der Leukose mit einer okulären Manifestation auftritt (SCHAEFFER u. GORDON 1993).
2.1.4 Therapie und Prognose
Das uveale Melanom wird von PFEIFFER et al. (1979) als eine lebensbedrohliche Tu- morerkrankung angesehen, dessen Prognose auch nach einer OP infaust ist. PATNAIK u.
MOONEY (1988) finden in ihrer Studie, in der 16 uveale Melanome von Katzen untersucht worden sind, bei 10 Tieren Metastasen. Weitere Arbeitsgruppen unterscheiden beim Hund hinsichtlich der Prognose zwischen benignen und malignen histologischen Erscheinungs- bildern. So sind ihrer Meinung nach die Mehrzahl der intraokulären Melanome benigne und damit nur lokal invasiv und zerstörend. Diese Melanome bedrohen aber das Leben
dagegen metastasieren häufig (DITERS et al. 1983, RYAN u. DITERS 1984, WILCOCK u. PEIFFER 1986).
Bei uvealen Melanomen, die kein diffuses Wachstum zeigen und noch keinen Visusver- lust verursacht haben, kann auch eine sektorenfömige Iridektomie bzw. Iridozyklektomie versucht werden (PEIFFER 1981).
Dagegen empfehlen SCHAEFFER u. GORDON (1993) nach der Diagnose eines okulären Melanoms bei der Katze die sofortige Enukleation, auch wenn an dem betroffenen Auge noch keine Folgeerscheinungen mit Visusverlust aufgetreten sind. Sie halten die Gefahr eines Einbruches des Tumors in die Sklera anterior und einer damit verbundenen Meta- stasierung für zu hoch. Ebenso empfehlen sie in ungeklärten Fällen mit dem dringenden Verdacht eines okulären Melanoms die sofortige Enukleation. Dabei sollte eine sorgfältige Allgemeinuntersuchung mit Röntgen von Thorax und Abdomen vorausgehen, um Meta- stasen auszuschließen. Beim Menschen ist bekannt, daß es während der Enukleation zu einer massiven Ausschwemmung von Tumorzellen in den Kreislauf kommen kann und somit das Risiko einer Metastasierung hoch ist. Deshalb sollte die Enukleation möglichst atraumatisch durchgeführt werden (ZIMMERMANN 1986).
2.1.5 Okuläre Melanome beim Menschen
In Mitteleuropa tritt das maligne Melanom beim Menschen mit einer Häufigkeit von 1-2 % aller diagnostizierten Tumoren auf. Der Anteil steigt jedoch bei Menschen, die in sonnen- reichen Gebieten leben. So beträgt die Häufigkeit in Australien 10 % aller diagnostizierten Tumoren (GARBE u. ORFANOS 1993). Davon tritt jedoch das primär-okuläre Melanom beim Menschen weitaus seltener als das kutane Melanom auf. Es wird mit einer Inzidenz- rate von 1:100.000 angegeben (CUTLER u. JUNG 1975). Im Gegensatz zu Hund und Kat- ze tritt das maligne Melanom der Iris in nur 8% der intraokulären Melanome auf (HOGAN u. ZIMMERMAN 1962, YANOFF u. FINE 1975). Hauptsitz der Neoplasie beim Menschen
ist die Uvea postalis (WEISSE et al. 1985, BORNFELD et al. 1986). Beim Menschen wer- den außerdem promovierende Faktoren wie Rasse, Alter und geographischer Lebens- raum beschrieben. Dazu kommen genetische und umweltbedingte Faktoren. Ebenfalls bekannt ist das Auftreten einer kongenitalen Melanosis oculi. Diese Hyperpigmentation begrenzter Areale im Auge ist bekannt dafür, häufig zu entarten (ZIMMERMANN 1986).
Das durchschnittliche Alter der Menschen bei der Diagnose des okulären Melanoms liegt bei den Frauen bei über 60 Jahren, bei den Männern bei über 70. Dabei tritt das oku- läre Melanom häufiger bei Männern als bei Frauen auf (NAUMANN 1980). Das uveale Melanom wird bei blauäugigen, blonden und hellhäutigen Menschenrassen häufiger dia- gnostiziert, als bei allen nichtweißen Rassen, wie Asiaten und Schwarzen. Damit liegt das höchste Tumorrisiko bei den Skandinaviern. ZIMMERMANN (1986) beschreibt eine inver- se Korrelation zwischen dem Pigmentgehalt des Auges und dem Tumorrisiko. Dement- sprechend tritt das uveale Melanom des Menschen in Afrika und Asien weitaus seltener auf als in Europa und Nordamerika. Es scheinen demnach auch die ultravioletten Strah- len nicht den Einfluß auf das Auftreten von uvealen Veränderungen zu haben, wie bei kutanen Neoplasien. Abgesehen von der geographischen Verteilung tritt das uveale Me- lanom beim Menschen hauptsächlich in der Uvea postalis auf, die gegen die Exposition von ultravioletten Strahlen durch ihre Lage viel besser geschützt ist als die Uvea anterior . Hinsichtlich der Prognose werden beim Menschen sowohl Lage, Größe und Pigmentge- halt als auch das histologische Erscheinungsbild berücksichtigt. Dabei werden die meisten der uvealen Melanome als maligne eingestuft (McLEAN et al. 1977, 1982). Eine Enuklea- tion steigert in der Meinung einiger Autoren das Risiko eines Metastasierens (ZIMMER- MANN u. McLEAN 1979, McLEAN et al. 1982).
2.2 Immunhistochemie zur Differenzierung von Melanomen
Die Immunhistochemie ist zu einer der wichtigsten Methoden in der humanen Tumor- diagnostik geworden (MIETTINEN 1993) und hat auch in der Veterinärmedizin eine weite Verbreitung gefunden, da viele in der Humanmedizin verwendete Antikörper eine Kreuzre- aktivität zu Geweben tierischen Ursprungs aufweisen (SANDUSKY et al. 1987, LAROCK u. GINN 1997). So können mit Hilfe von mono- und polyklonaler Antikörper zellassoziierte Antigene gefunden werden und bei der Identifizierung des Ausgangsgewebes neoplasti- scher Veränderungen wichtige Hinweise liefern. Aufgrund der häufig mangelnden Spe- zifität der Antikörper und der wechselnden Antigenexpression einiger Tumoren sollte die Immunhistochemie jedoch nur in Verbindung und zur Bestätigung der histopathologischen Diagnose verwendet werden (NEUMANN et al. 1990).
2.2.1 Immunhistochemie der Melanomdiagnostik in der Humanmedizin
Der immunhistochemische Nachweis von Melanomen in der Humanmedizin kann mit ver- schiedenen Antigenen erfolgen. Diese lassen sich folgendermaßen unterteilen (HASTKA 1997):
- Oberflächenantigene: Glykoproteine ( z.B. Epitope p94, p97a - c), Polypeptide ( z.B.
p210), Ganglioside.
- Plasmaproteine wie z.B.: S100 ( Ca-bindendes Protein), NKI/C3, HMB45 . - Peptide wie: Vimentin und Zytokeratine.
Die Oberflächenantigene sind alle mehr oder weniger spezifisch für Melanome. Am re- gelmäßigsten expremiert werden die 97 Kilodalton schweren Gykoproteine (WOODBURY et al. 1975). Diese sind jedoch am stärksten in melaninhaltigen Zellen nachweisbar, am schwächsten in amelanotischen Melanomen, was ihren Nachweis mittels Farbreaktion er- schwert. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß sie nur in relativ frischen Präparaten
nachweisbar sind (bis zu drei Tagen) (HASTKA 1997). Die Expremierung der anderen aufgeführten Antigene ist nur unregelmäßig ausgeprägt.
Das immunzytologische Bild normaler Melanozyten und maligner Melanome ist folgendes:
Zytokeratin Vimentin S100 HMB 45 negativ positiv positiv positiv
Dabei sind bei Vimentin und S 100 die kräftigsten Färbungen bei amelanotischen Mela- nomen zu beobachten, während sie in pigmentierten Zellen deutlich schwächer ausfällt (HASTKA 1997).
In der humanen Routinediagnose haben sich die Antikörper gegen S100 und HMB45 durchgesetzt. Großer Vorteil von HMB45 ist, daß mit ihm zum Teil maligne von benignen Läsionen abgegrenzt werden können. Bei PALAZZO u. DURAY (1989) waren drei von vier benignen Läsionen negativ. Allerdings sind auch oft maligne Melanome negativ, die aus benignen Veränderungen oder Naevi entstanden sind (GOWN et al. 1986, BUSAM et al.
1998) und die Färbung in malignen Melanomen ist häufig nur unregelmäßig und fleckig (PALAZZO u. DURAY 1989).
2.2.2 Immunhistochemie in der Diagnostik der Veterinärmedizin
Für die Immundiagnostik in der Veterinärmedizin scheidet HMB 45 als Marker aus. In einer Untersuchung von sieben verschiedenen humanen Antikörpern an caninen Melano- men stellten BERRINGTON et al. (1994) bei folgenden Antikörpern keine Kreuzreaktivität fest: HMB 45, HMB 50, 225.28S, NKI/C3 und NKI/beteb. Sie sind daher für die Immunhi- stologie in der veterinärmedizinischen Diagnostik ungeeignet. Zwei ihrer untersuchten An- tikörper, HMSA-1 und HMSA-5, zeigen in 60% bzw 69% der untersuchten Gewebeproben ein positives Ergebnis. Allerdings reagiert HMSA-1 ebenfalls mit einigen Plasmazytomen,
tiger zu machen, raten sie, die beiden Antikörper zu kombinieren. Sie kommen dann auf eine Positivreaktion von 83%. In ihrem Untersuchungsgut befanden sich zwei uveale Me- lanome. Diese sind von beiden Antikörpern als solche erkannt worden.
Ein weiterer monoklonaler Antikörper, der mit caninen Melanomen reagiert ist IBF9, der 1992 von OLIVER u. WOLFE entwickelt wurde. In ihrer Studie reagierten 24 von 38 ca- ninen Melanomen positiv. Es wurde ebenfalls bei einigen Karzinomen, Basalzelltumoren und kutanen Lymphosarkomen eine Kreuzreaktion festgestellt.
Zur Routinediagnostik von Melanomen in der Veterinärmedizin werden zur Zeit verschie- dene zellassoziierte Antigene benutzt, auf die im folgenden weiter eingegangen wird.
Intermediäre Filamente
Das Zytoskelett der Zelle setzt sich aus verschiedenen faserartigen Systemen zusam- men. In der Ultrastruktur kann man drei verschiedene Faserstrukturen unterscheiden: die ca. 6m im Durchmesser messenden Mikrofilamente, die 22 nm dicken Mikrotubuli und schließlich die 7-11 nm im Durchmesser messenden intermediären Filamente. Die zwei erstgenannten Strukturen bestehen in jeder Zelle, gleich welcher Herkunft, immer aus dem jeweils gleichen Protein: die Mikrofilamente aus Aktin, die Mikrotubuli aus Tubulin.
Dagegen setzen sich die intermediären Filamente aus unterschiedlichen Proteinen zu- sammen, die wiederum spezifisch für jedes Gewebe sind. Sie sind somit für den Nach- weis und die Beurteilung von Geweben von großer Bedeutung. Ein weiterer Vorteil der intermediären Filamente liegt darin, daß sie sowohl in gesunden Zellen als auch in de- ren neoplastischen Formen vorkommen (HASTKA 1997). Die in der Immunhistochemie wichtigsten intermediären Filamente sind Zytokeratine als spezifische Struktur von Epi- thelzellen, Vimentin für Zellen mesenchymaler Herkunft, Desmin für Muskelzellen, Glia- filament für Gliazellen und Neurofilament für neurogene Strukturen. Mit Ausnahme der Neurofilamente bestehen sie aus einem bzw. mehreren (Zytokeratin) Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von 40-68 kD. Das Neurofilament setzt sich aus einem Protein-
triplett zusammen mit den Molekulargewichten 68kD, 145kD und 220 kD (OSBORN et al.
1983). Alle intermediären Filamente besitzen eine Proteinuntereinheit, die eine zentrale alpha-Helixstruktur mit 311-314 Aminosäuren aufweist. Je nach ihrer Funktion variieren die jeweiligen C- und N-terminalen Enddomänen (STEINERT et al. 1985).
Von Bedeutung bei der Diagnostik der Melanome ist das eigentlich für Zellen mesen- chymaler Herkunft spezifische intermediäre Filament Vimentin. Es wiegt 58kD und ist in Fibrozyten, -blasten, Osteozyten, -blasten, Myozyten, -blasten, Lymphozyten, Neurobla- sten, Schwann-Zellen, Sertolizellen, Granulosaluteinzellen und in Melanozyten nachweis- bar (FRANKE et al. 1979, RAMAEKERS et al. 1982, DENK et al. 1983, SANDUSKY et al.
1985, MIETTINEN 1993, MOLL 1993). Ebenso positiv sind die meisten Knochentumore (LOENING et al. 1970), maligne Melanome (CASELITZ et al. 1983) und nichtmuskuläre Sarkome (ALTMANNSBERGER et al. 1986), ausgenommen des synovialen (MIETTINEN et al. 1984) und des epitheloiden Sarkoms (CHASE et al 1984). Lymphome reagieren meist nur heterogen positiv (GIORNO u. SCIOTTO 1985). In einer Studie von NEUMANN et al. (1990) waren 16% der untersuchten mesenchymalen Tumoren Vimentin-negativ.
Er führte dies auf eine weitgehende Enddifferenzierung der Neoplasien, verbunden mit einem Verlust der Antigene zurück.
S100
Das S100-Protein ist ein weiteres zelluläres Antigen im Zytoplasma, welches in der im- munhistochemischen Diagnostik von Melanomen Verwendung findet (HASTKA 1997). Es gilt heute als der klassische Melanommarker und wurde erstmals 1965 von MOORE aus Rinderhirnextrakten isoliert . Seinen Namen bekam es aufgrund seiner Löslichkeit in 100%
Ammoniumsulfat bei neutralem pH. Es werden drei Dimere unterschieden, die aus je zwei Untereinheiten, der alpha-Kette und der beta-Kette gebildet werden (ISOBE et al. 1981, 1978). Die physiologische Funktion dieses Eiweißes ist noch nicht geklärt. Aufgrund sei- ner Konfigurationsänderungen bei Kalium- und Kalziumeinwirkungen auf die Zelle wird
partielle Sequenzhomologien zu Calmodulin auf (ENZINGER u. WEISS 1995).
Es wurde zunächst als spezifisch für Nervenzellen angesehen und in der Diagnostik von Glia- und Ependymzelltumoren des Gehirnes als glialer Marker angewandt. Inzwischen wurde es jedoch in einer Reihe anderer Zellen und Tumore nachgewiesen. So fanden es MOELLER u. HELLMEN (1994) bei ihrer Untersuchung der caninen Milchdrüse außer in den Myoepithelien auch in Melanozyten und Adipozyten. Sie kommen zu dem Schluß, daß sowohl myoepitheliale als auch epitheliale Zellen das S100 Protein exprimieren. Bei einer Untersuchung von humanen Adenokarzinomen reagierte 42% des Untersuchungsgutes positiv (HERRERA et al. 1988). Weiter wurde es bei Speicheldrüsentumoren, Mammakar- zinomen und Phäochromozytomen nachgewiesen (KAHN et al. 1983). SANDUSKY et al.
(1985,1987) stellten in zwei Veröffenlichungen ihre Untersuchungen des S100 Antigens in der Melanomdiagnostik vor. In ihrer Studie von 1985 über weitgehend amelanotische canine Melanome färbten sich 26 von 31 Tumoren an. Davon ist bei einigen der Nachweis allerdings nur als schwach beschrieben worden. Trotzdem kommen sie zu dem Schluß, das S100 Protein sei ein guter Nachweis in der Diagnostik der amelanotischen caninen Melanome. 1987 untersuchte die gleiche Arbeitsgruppe 18 amelanoische canine Mela- nome, von denen sich zehn als positiv für S100 zeigten. Wieder war die Färbung jedoch meist scheckig oder diffus. In der aktuellen Diagnostik besteht die Bedeutung des S100 Proteins in dem regelmäßigen Nachweis bei malignen Melanomen (GAYNOR et al. 1981).
Das Protein ist in Gewebematerial mindestens vier Wochen lang nachweisbar und kann damit als sehr stabil bezeichnet werden (HASTKA 1997).
Melan A / MART 1
Melan A oder MART 1 (melanoma specific antigen recognized by T-cells) ist ein trans- membranes Protein, welches in den ersten Untersuchungen regelmäßig in Melanozyten der Haut und der Retina, Melanomen, ihren Metastasen und in kultivierten Melanozy- ten nachweisbar war, jedoch nicht in anderen Geweben gefunden wurde (COULIE et al.
1994). Es wird von tumor-infiltrierenden Lymphozyten erkannt, seine genaue physiologi-
sche Funktion ist bislang jedoch noch ungeklärt (KAWAKAMI et al. 1994). Das codierende Gen wurde 1994 nahezu zeitgleich von COULIE et al. und KAWAKAMI et al. entdeckt. Ein von CHEN et al. (1996) und FETSCH et al. (1997) in Mäusen hergestellter monoklonaler Antikörper kann in der immunhistologischen Diagnostik eingesetzt werden. Mit diesem An- tikörper gegen Melan A konnte in einer Studie bei humanen Melanomen eine Expression in 17 von 21 der untersuchten Fälle nachgewiesen werden. Dabei färbten sich bei den positiven Gewebeproben über 80% der Zellen. Bei dem Untersuchungsgut handelte es sich dabei sowohl um primäre als auch um sekundäre Melanome. FETSCH et al. (1997) verbesserten den Nachweis mit Melan A mit Hilfe einer Demaskierung durch Mikrowellen.
Von 23 untersuchten Gewebeproben reagierten 14 positiv. Mit einer Mikrowellenbehand- lung waren 21 Gewebeproben positiv. Außerdem wurde die Farbintensität der positiven Proben deutlich verbessert.
Obwohl erste Untersuchungen mit dem Antikörper nahelegten, er sei spezifisch für al- le adulten Melanozyten der Haut und Retina (CHEN et al. 1996, BEATY et al. 1997, FETSCH et al. 1997), fanden BUSAM et al. (1998) einige weitere Tumoren und Zellen, die sich mit diesem Antikörper anfärben lassen. Dazu gehören Zellen der Nebennieren- rinde. Hier färbt sich diffus die Zona fasciculata an. Die Leydig-Zellen färben sich deutlich an, während die Sertolizellen eine nur fleckige Färbung aufweisen. Die Theka- und Gra- nulosazellen der Ovarien und die Zellen des Corpus luteum reagieren ebenfalls deutlich positiv, sowie Adenome und Karzinome der Nebennierenrinde und ihre Metastasen. In diesen Geweben konnte jedoch kein Melan-A Antigen oder eine entsprechende m-RNA nachgewiesen werden, so daß eine Kreuzreaktion vermutet wird (BLESSING et al. 1998, JUNGBLUTH et al. 1998).
Übereinstimmend wird von verschiedenen Arbeitsgruppen berichtet, daß der Melan A- Nachweis in spindelzellförmigen und desmoplastischen Melanomen nur diffus oder ne- gativ ist (BLESSING et al. 1998, BUSAM et al. 1998, JUNGBLUTH et al. 1998). Dabei
Bei einem Vergleich der Melanom-Marker S100 und HMB45 mit Melan A stellten NI- COTRA et al. (1997) fest, daß Melan A zwar alle Zubildungen melanozytären Ursprungs kennzeichnet, jedoch nicht zwischen benignen und malignen Läsionen unterscheidet. Me- lan A ist also zu deren Nachweis, nicht jedoch zur Differenzierung geeignet. Sie konnten jedoch keine Reaktion von unveränderter Retina, Iris, Ciliarkörper und pigmentierten Cho- roideazellen feststellen. In ihrem untersuchten Probenmaterial waren weiterhin insgesamt 12 okuläre Melanome. Davon zeigten sich jedoch nur drei, also 25% Melan A positiv. Da- gegen ist in kutanen Gewebe der Melan A Nachweis in Melanozyten positiv, unabhängig von Differenzierung, Transformierung und Pigmentgehalt.
3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material
3.1.1 Untersuchungsmaterial
Insgesamt umfaßte das untersuchte Material 43 Augen von Hunden und Katzen beiderlei Geschlechtes mit Neoplasien. Davon stammten 20 Proben von Hunden und 23 Proben von Katzen. Von den 20 caninen Proben stand bei 17 Fällen im Vorfeld die Diagnose eines Melanomes. In den anderen Proben wurde eine Metastase eines Plattenepithel- zellkarzinoms, eines Lymphoms bzw. ein Fibrosarkom diagnostiziert. In 20 von 23 Fällen der Neoplasien der Katze wurde im Vorfeld histologisch ein Melanom diagnostiziert, in je einem Fall ein Lymphosarkom und ein undifferenzierter mesenchymaler Tumor sowie eine Irisreaktion nach einem perforierenden Korneaulcus. Das Durchschnittsalter bei der Dia- gnose eines Melanoms lag bei den Hunden bei 9, bei den Katzen bei 10 Jahren. Dabei variierte das Alter bei den Hunden zwischen 2 und 17 Jahren, bei der Katze zwischen 3 und 16 Jahren 8 (Tab. 1-3).
Das Untersuchungsmaterial stammte aus Einsendungen zu diagnostischen Zwecken an das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in der Zeit vom Januar 1996 bis zum Juli 2000 von Hunden, bzw. Januar 97 bis zum Juli 2000 von Katzen. Teil- weise wurde es im Rahmen einer Studie in Zusammenarbeit mit der Klinik für kleine Hau- stiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover von Frau Dr. Meyer-Lindenberg übersandt.
Es stand zum Teil bereits als in Paraffin eingebettetes Material zur Verfügung, oder wurde aus formalinfixiertem Naßmaterial aufgearbeitet. Dabei waren alle Proben mindestens 48 h formalinfixiert. Bei allen Färbevorgängen lief jeweils eine Positiv- und eine Negativpro- be mit. Es wurde ebenfalls ein unveränderter Hunde- bzw. Katzenbulbus gefärbt, um die Reaktion von Melan A mit unveränderten Melanozyten darzustellen.
In den folgenden Tabellen werden die Patientendaten soweit bekannt zusammenfassend dargestellt.
Tabelle 1: Zusammenfassung der Hunde mit intraokulären Melanomen.
Fall-Nr. E-Nr., Jahr Rasse Alter Geschlecht Diagnose
1 0015/00 Windhund-Mix 12 Jahre m Melanom des Ziliar-
körpers
2 0437/00 Golden Retriever 2 Jahre m Melanom des Ziliar- körpers
3 3104/00 Jagdterrier 9 Jahre m Melanom Pap. ner-
vus optici
4 2188/99 Mischling 15 Jahre w uveales Melanom
5 1191/98 Airdale Terrier 11 Jahre w, k uvealer Naevus pig- mentosus
6 2863/98 Alaskan Malamute 10 Jahre m Melanom des Ziliar- körpers
7 3787/98 Cairn Terrier 9 Jahre m uveales Melanom
8 4377/98 Cairn Terrier 16 Jahre m uveales Melanom
9 4487/98 Mischling 13 Jahre w, k Melanom des Ziliar-
körpers
10 4797/98 Cairn Terrier 16 Jahre m uvaeles Melanom,
Metastase LK
11 5435/98 Mischling 4 Jahre w, k Melanom des Ziliar-
körpers
12 2891/97 Airdale Terrier 11 Jahre m Melanom des Ziliar- körpers
13 2926/97 Labrador 5 Jahre w amelanotisches Me-
lanom der Iris
14 6472/97 Airedale Terrier 10 Jahre m Melanom des Ziliar- körpers
15 7641/97 Dackel - - uveales Melanom
16 4617/96 Rauhaardackel 10 Jahre m uveales Melanom
17 6451/96 unbekannt - - uveales Melanom,
Metastasen
Tabelle 2: Zusammenfassung der Katzen mit intraokulären Melanomen.
Fall-Nr. E-Nr., Jahr Rasse Alter Geschlecht Diagnose
18 0313/00 EKH 13 Jahre m, k amelan. Melanom ges. Bulbus
19 0536/00 EKH 13 Jahre w, k amelan. Melanom Iris
20 1424/00 EKH 13 Jahre k amelan. Melanom
21 0523/99 EKH 14 Jahre m Melanom der Iris
22 0809/99 EKH 5 Jahre m, k Melanom der Iris
23 1059/99 EKH 8 Jahre w benignes Melanom der Iris
24 1950/99 Burma 11 Jahre - Melanom der Iris
25 2044/99 Main Coon 6 Jahre w uveales Melanom
26 2838/99 EKH - - diffuses uveales Melanom
27 2908/99 Perser 9 Jahre w, k Melanom der Iris
28 3134/99 Perser 12 Jahre m, k Melanom der Iris
29 2315/98 EKH 13 Jahre w, k diffuses uveales Melanom
30 4415/98 - 8 Jahre w, k amelan. Melanom der Iris
31 4931/98 Mischling 15 Jahre m Melanom der Iris und Sklera
32 6008/98 Perser 17 Jahre m, k Melanom der Iris
33 1591/97 - - - Melanom der Iris
34 2156/97 EKH 14 Jahre w Melanom der Iris
35 2925/97 EKH 14 Jahre w, k Melanom der Iris
36 5955/97 - 16 Jahre m Melanom ges. Bulbus
37 7022/97 Perser 9 Jahre w, k Melanom der Iris
Tabelle 3: Zusammenfassung anderer intraokulärer Tumore von Hunden und Katzen.
Fall-Nr. E-Nr., Jahr Rasse Alter Geschlecht Diagnose Hunde
38 0340/98 Kuvasz 4 Jahre m V.a. Fibrosarkom
39 3656/97 Briard 7 Jahre m Lymphosarkom der
Iris
40 7312/97 Hoverward 8 Jahre m Adenokarzinom des
Ziliarkörpers Katzen
41 0506/00 Perser 11 Jahre w, k Lymphosarkom der
Iris
42 0378/98 EKH 10 Jahre w, k mesenchym. Tumor
ges. Bulbus
43 6246/97 EKH 13 Jahre w Iritis nach perforier-
tem Korneaulcus
3.1.2 Präparation des Bulbus
Die im Ganzen eingesandten Bulbi wurden vor der Einbettung in Paraffin in ihrer Längsach- se halbiert. Dabei sollte die Schnittebene im hinteren Bulbusabschnitt exakt durch den Nervus opticus liegen, um die Gefahr einer artifiziellen Retinaablösung zu minimieren.
Hier befindet sich neben der Ora serrata, der Umschlagstelle von innerer zu äußerer Re- tinalage im vorderen Bulbusabschnitt, die zweite feste Verbindung dieser beiden Schich- ten. Diese galt es für die nachfolgenden Präparationen zu erhalten. Des weiteren sollte die Schnittebene, soweit makroskopisch erkennbar, durch die veränderten Bulbusabschnitte geführt werden. Nach der Halbierung des Bulbus wurde die im Glaskörper ruhende Linse durch vorsichtigen Zug an den Processus ciliares entfernt. Dies konnte erfolgen, da ihre Struktur bei der geplanten Untersuchung von Melanomen nicht von Intresse war. Für das weitere Vorgehen war eine Entfernung der Linse von Vorteil, da das Linsenmaterial beim Herstellen von Paraffinschnitten nur schwer zu bearbeiten ist.
Jetzt erfolgte eine erste makroskopische Befundung, um zu gewährleisten, daß die Schnitt- ebene durch die veränderten Bereiche verlief. War dies nicht der Fall, so erfolgte eine Korrektur der Schnittführung unter Einbeziehung des veränderten Areals. Von jedem so bearbeiteten Bulbus wurde eine der Bulbushälften für die weitere lichtmikroskopische und immunhistologische Bearbeitung in Paraffin eingebettet. Die zweite Bulbushälfte wurde weiter in Formalin fixiert und für einen eventuellen Bedarf asserviert.
3.1.3 Paraffineinbettung
Jeweils eine Hälfte der formalinfixierten Augen wurde mit Hilfe des Automatensystems
“Hypercenter” der Firma Shandon aus Frankfurt bearbeitet. Dabei erfolgte zunächst ei- ne Lagerung der Proben in einer ungepufferten 10%igen Formalinlösung, anschließend eine Wässerung in Leitungswasser und schließlich die Dehydrierung in einer aufsteigen- den Alkoholreihe mit anschließender Lagerung der Probe in 60ÆC warmen Paraffin über 2
Stunden. Abschließend gelangte die Probe zur Einbettung mit Paraffin in eine Kunststoff- kapsel.
3.1.4 Schnittherstellung
Nach der Einbettung wurden mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms 2-4 m dicke Paraffin- schnitte angefertigt. Nachdem sich diese in einem Wasserbad bei ca. 40ÆC gestreckt hat- ten, wurden sie auf mit Chromalaungelantine beschichteten Objektträgern aufgezogen.
Anschließend gelangten sie zur Trocknung bei ca. 60ÆC für 30 Minuten in einen Wärme- schrank.
Für die immunhistologische Bearbeitung erfolgte die Herstellung der Paraffinschnitte in derselben Weise, nur wurden die Schnitte nach der Streckung auf Parafrost-Objektträger aufgezogen und anschließend getrocknet. Das Beschichtungsmittel dieser Objektträger gewährleistet eine besonders gute Haftung der Schnitte, welches bei den besonderen Manipulationen während der immunhistologischen Aufarbeitung nötig war, um die Gefahr eines Abschwimmens der Schnitte zu minimieren.
3.2 Methoden
3.2.1 Lichtmikroskopische Untersuchung
Für die lichtmikroskopische Beurteilung der Proben wurden die Schnitte zunächst entpa- raffiniert und rehydriert, dann mit Hämalaun-Eosin gefärbt (ROMEIS 1989), in aufsteigen- der Alkoholreihe dehydriert, mit Corbitbalsam eingedeckt und anschließend lichtmikro- skopisch befundet. Dabei wurde besonderer Wert auf das biologische Erscheinungsbild hinsichtlich der Malignitätsbeurteilung gelegt.
3.2.2 Auswertung der lichtmikroskopischen Untersuchungen
Zur Beurteilung des biologischen Verhaltens der Melanome wurde die in der Literatur am häufigsten benutzte Einteilung von KIRCHER, H.C. et al. (1974) gewählt. Dabei erfolgte eine Orientierung an folgenden histologischen Zellbildern:
Spindelzelltyp A: längliche Tumorzelle mit ovoidem Kern und ohne Kernkörperchen (Sp.A).
Spindelzelltyp B: plumpe Spindelzellen mit großem Kern und deutlichem Kernkörperchen (Sp.B).
epitheloider Zelltyp: polyedrische Zellen mit großem Kern und deutlichem Kernkörperchen (epith. Typ)
gemischtzelliger Typ: aus spindelförmigen und epitheloiden Zellen zusammengesetztes Zellbild (gem. Typ)
Es wird in dieser Reihenfolge von einer zunehmenden Malignität ausgegangen. Bei der weiteren Beurteilung des biologischen Verhaltens der Melanome wurden noch andere Malignitätszeichen beachtet, wie zum Beispiel ein hoher Pigmentgehalt, ein geringer Ge- halt an von Tumorzellen produzierten Retikulinfasern, das Auftreten von Nekrosen und Anzeichen von destruierendem Wachstum.
Als ein weiteres Malignitätszeichen wurde der Mitoseindex bewertet nach der Anzahl von Mitosefiguren pro Sichtfeld in der 40-fachen Vergrößerung. Dabei ist die Gradeinteilung ggr.(geringgradig) - mgr.(mittelgradig) - hgr.(hochgradig) folgendermaßen eingeteilt wor- den:
ggr.: Auftreten von 1-2 Mitosefiguren, mgr.: Auftreten von 3-5 Mitosefiguren, hgr.: Auftreten von 5 und mehr Mitosefiguren pro Sichtfeld.
3.2.3 Immunhistochemische Untersuchung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Primärantikörper verwendet, mit deren Hilfe der Ursprung der neoplastischen Veränderungen geklärt , bzw. die ursprüngliche Diagnose nachvollzogen werden sollte:
Antikörper Spezifität Herkunft
Melan A Klon A103 Dako Diagnostics, Vertrieb Hamburg, Art.Nr.: M-7196 Vimentin Klon V9 Dako Diagnostics, Vertrieb Hamburg, Art.Nr.: M-0725 S100 Polyklon Sigma Diagnostics, Deisenhofen, Art.Nr.: S-2644
Hiervon wurden die Antikörper Vimentin und S100 zur Identifizierung von Melanozyten bislang in der Melanomdiagnostik im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschu- le Hannover routinemäßig eingesetzt. Diese Reaktionen dienten als Vergleichsmaterial für die mit Melan A behandelten Schnitte, dem in der veterinärmedizinischen Diagnostik neuen Antikörper. Dabei ist Vimentin ein intermediäres Filament und wird als spezifische Struktur von Zellen mesenchymaler Herkunft angesehen. Im immunhistochemischen Bild von Melanozyten stellt sich der Nachweis von Vimentin ebenfalls als positiv dar, obwohl sie nicht mesenchymaler Herkunft sind. Als zweite Vergleichsfärbung wurde ein gegen das Plasmaprotein S100 gerichteter Antikörper verwendet. Auch dieser Nachweis stellt sich im immunhistochemischen Bild von Melanomen immer als positiv dar. Das Plasma- protein wird des weiteren in Myoepithelien und Adipozyten ausgebildet und zeigt somit auch in diesen Zellen eine positive Reaktion.
Als sekundäre Antikörper kommen in der ABC-Methode Immunglobuline gegen Antikörper der Spezies zum Einsatz, aus der die Primärantikörper gewonnen sind. Die Primärantikör- per für die Nachweise von Melan A und Vimentin wurden beide aus Mäusen gewonnen, so daß in diesen beiden Nachweisreihen als Sekundärantikörper ein biotinylierter “goat-anti
stammt aus dem Serum von Kaninchen. Aus diesem Grund mußte für diese Nachweisrei- hen als Sekundärantikörper ein biotinylierter “goat-anit-rabbit”-Antikörper verwendet wer- den.
So konnte in allen drei Fällen ein biotinylierter Sekundärantikörper eingesetzt werden, wel- cher die Avidin-Biotin-Komplex-Immunperoxidase-Methode (ABC-Methode) ermöglicht. Als farbgebende Reaktion wurde das 3-Amino-9-Ethylcarbazol-Substrat gewählt (ACE), da sich der rote Farbstoff gut gegen die braune Färbung der im Auge vorhandenen Me- lanozyten abgrenzen läßt. Es wäre ebenfalls als farbgebende Reaktion eine Behand- lung mit Diaminobenzidin-tetra-hydrochlorid (DAB-Methode) möglich gewesen. Wegen der schlechteren Unterscheidbarkeit des braunen Farbstoffes von der ebenfalls braunen Färbung der Melanozyten wurde diese Methode jedoch verworfen.
Als Protokollschema wurde bei allen drei Antikörpern die ABC-Methode durchgeführt. Die- se wird im folgenden allgemein wiedergegeben.
ABC-Methode:
I Entparaffinieren und Rehydrieren II Hemmung der endogenen Peroxidase III Spülen mit PBS-Puffer
IV Wechsel von Küvetten in Coverplates V Inkubation mit dem Blockserum
VI Inkubation mit dem primären Antikörper VII Spülen mit PBS-Puffer
VIII Inkubation mit dem sekundären biotinylierten Antikörper IX Spülen mit PBS-Puffer
X Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Immunperoxidase-Komplex XI Wechsel von Coverplates zu Küvetten
XII Inkubation mit AEC+Chromogen-Substrat XIII Spülen mit PBS-Puffer
XIV Verbringen in fließendes Leitungswasser XV Gegenfärben mit Hämalaun nach Meyer XVI Bläuen unter fließendem Leitungswasser XVII Eindecken mit Kaisers Glyceringelantine
Bei den immunhistochemischen Nachweisen von Vimentin und Melan A ist des weiteren eine Demaskierung der Paraffinschnitte notwendig, um die von der Fixation in Formalin vernetzten Antigene für den Antikörper erkennbar zu machen. Hierfür wird vor der Inku- bation mit dem Blockserum ein weiterer Schritt eingefügt. Die Demaskierung von Paraf- finschnitten ist mittels verschiedener Reagenzien erreichbar. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Methoden genutzt. Dabei erwies sich die Inkubation in Citratpuffer bei 121ÆC über 10 Minuten im Autoklaven als langwieriger und schwieriger im Handling. Außerdem
traten häufiger Schäden durch das Aufsteigen von Luftblasen während des Erhitzens in Form von teilweisen oder vollständigen Abschwimmen der Schnitte auf. Als die Methode der Wahl für das Demaskieren wurde die Demaskierungslösung G der Firma Biologo in einer Verdünnung von 1:4 mit PBS-Puffer gewählt. Hier betrug die Inkubationszeit 30 Mi- nuten bei einer Temperatur von 92-95Æ C im Wasserbad. Nach der Inkubationszeit in dem Demaskierungsreagenz erfolgte erneut ein Spülen in PBS-Puffer (Inkubationszeit 3x5 Mi- nuten), danach das Verbringen in Coverplates und das Auftragen des Blockserums.
Die jeweiligen Gebrauchsverdünnungen der Antikörper und des Blockserums in PBS- Puffer wurden nach den Herstellerangaben gewählt. Diese sind folgendermaßen ange- geben:
Blockserum:
Normal-Goat-Serum 1:5 Primärer Antikörper:
monoklonaler Maus-Melan A-Antikörper 1:15, monoklonaler Maus-anti-Human-Vimentin- Antikörper 1:15, Kaninchen-anti-S100-Antikörper 1:800.
Sekundärer Antikörper:
biotinyliertes Ziege-anti-Maus-Serum 1:200, biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen-Serum 1:200.
Die genaue Rezeptur des verwendeten PBS-Puffers wird im Anhang dieser Arbeit wieder- gegeben.
3.2.4 Kontrollen
Um die Spezifität der verwendeten Antikörper zu kontrollieren, sowie um falsch positive Reaktionen und auch um mögliche Vorgehensfehler ausschließen zu können, wurden bei jeder Färbereihe sowohl eine Positiv- als auch eine Negativkontrolle mitgeführt.
Von dem für die immunhistochemische Untersuchung vorhandenen Material wurden Se- rienschnitte angefertigt und je zwei Schnitte pro Färbung verwendet, so daß zu jedem Schnitt, der mit einem der aufgeführten primären Antikörper behandelt wurde, eine negativ- Kontrolle in der gleichen Färbereihe vorhanden war. Bei dieser negativ-Kontrolle ist statt des primären Antikörpers Balb C Mäuse-Ascites Serum in einer Verdünnung von 1:600 mit PBS-Puffer aufgetragen worden, während alle weiteren Schritte der immunhistoche- mischen Reaktion beibehalten wurden. So war zu überprüfen, ob der Sekundärantikörper mit anderen Strukturen des Gewebes und nicht einzig mit dem primären Antikörper rea- giert. Bei einem negativen Färbeergebnis der mit dem Balb C Mäuse-Ascites Serum inku- bierten Schnitte und einem gleichzeitig positiven Ergebnis des dazugehörigen Schnittes, der mit einem der drei Primärantikörper behandelt wurde, ist eine Spezifität des Sekun- därantikörpers als sicher anzusehen.
3.2.5 Auswertung
Bei der Beurteilung der erfolgten Reaktionen wurden zwei Aspekte berücksichtigt und sind in den Tabellen im Ergebnisteil als Zahlenkombination angegeben. Zum einen wurde die Anzahl der angefärbten Zellen bewertet. Dabei steht die 1 für einen angefärbten Zellanteil von bis 25 %, bzw. die 4 für einen angefärbten Zellanteil von 75 - 100 %. Zum anderen ist die Qualität der Farbreaktion ebenfalls in einer Skala von 1 bis 4 bewertet worden. Dabei steht die 1 für eine nur schwache Farbqualität, die 4 dagegen für eine deutliche Anfärbung der positiv reagierenden Zellen.
Grad Anzahl Qualität
1 -25% schwach
2 25-50% mäßig
3 50-75% gut
Die erste Zahl in der Tabelle der Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen steht für die Anzahl der positiv reagierenden Zellen, die zweite gibt die Qualität der Anfärbung an. Reaktionen werden im Folgenden als schwach bewertet, wenn sowohl die Anzahl der positiv reagierten Zellen als auch die Qualität der Farbausprägung mit nicht mehr als zwei beurteilt worden sind.
In drei Fällen wurde die Beurteilung der Färbeergebnisse aufgrund des starken Pigment- gehaltes des Tumors erschwert. Hier erfolgte ein 24 bzw. 48 stündiges Lagern der Schnitte in Wasserstoffperoxid zur Pigmentbleichung und anschließend wurde erneut die immun- histochemische Färbung durchgeführt und beurteilt.
Die Vergrößerung bei den abgebildeten Aufnahmen der histologischen Schnitte ist als Grundvergrößerung angegeben, d.h. als Vergrößerung des Negatives der Aufnahme.
3.3 Ergebnisse
3.3.1 Vorberichte und makroskopische Untersuchungsergebnisse der Hunde Aus dem Zeitraum vom Januar 1996 bis zum Juli 2000 sind 17 Augentumoren von Hunden im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover als Melanome diagno- stiziert worden.
Das Durchschnittsalter der betroffenen Hunde lag bei neun Jahren.
Insgesamt befanden sich unter den Tieren zehn männliche, zwei weibliche und drei weib- lich/kastrierte Tiere. Bei den restlichen Tieren fehlten diesbezüglich Angaben.
In zehn Fällen war das linke Auge, in drei Fällen das rechte Auge von den Veränderun- gen betroffen. Bei vier eingesandten Bulbi fehlte eine Seitenbezeichnung. In allen Fällen handelte es sich um ein unilaterales Auftreten.
Bei zwölf Tieren wurde eine Enukleation des betroffenen Auges durchgeführt und die Tie- re lebten zum Zeitpunkt der Diagnose noch. Über den weiteren Krankheitsverlauf fehlten
statistische Erhebungen. So kann in dieser Arbeit keine Aussage zum Metastasierungs- verhalten von primären okulären Melanomen bei Hunden gemacht werden.
Zur Äthiologie der Augenveränderungen konnte in keinem Fall vom Besitzer eine Angabe gemacht werden. Lediglich in einem Fall wird ein seit einem Jahr verdickter Ln. mandibu- laris vom Tierarzt beschrieben und der Verdacht einer Metastase geäußert. Bei diesem Tier befand sich außerdem ein malignes Melanom am gleichseitigen Augenlid.
Bei 16 der untersuchten 17 Melanomen von Hunden befand sich die Primärlokalisation der Veränderungen in der Uvea anterior (Abb. 1, 2, 4). Nur im Fall-Nr. 3 lag der Ausgangs- punkt der Veränderung in der Uvea posterior. Hier ragte von der Papilla nervi optici aus- gehend eine ca. 1 x 1,5 cm große, schwarze Neubildung ohne makroskopisch erkennbare Strukturierung in den Innenraum des Bulbus (Abb.3).
Bei 13 von den 17 untersuchten Melanomen der Hunde ist im Vorbericht eine Zeitan- gabe gemacht worden, seit wann Veränderungen vom Besitzer beobachtet worden sind (Tab. 4). Dabei wird in sechs Fällen eine sichtbare Vergrößerung des Bulbus verbunden mit Schmerzen, Rötung und getrübter Kornea beschrieben. Der Zeitraum dieser Beob- achtungen variiert von zwei Tagen bis drei Monaten. In einem dieser Fälle wurde vom Haustierarzt sechs bis acht Wochen zuvor eine Linsenluxation festgestellt.
In drei weiteren Fällen wird allgemein “seit einem Jahr Probleme mit dem Auge” angege- ben und ein starker Juckreiz beschrieben, der in zwei Fällen bis zum Blutigkratzen führte.
In einem Fall wird zusätzlich seit einer Woche ein purulenter Ausfluß beobachtet, in einem anderen Fall entwickelte sich eine dunkle Pigmentierung der Cornea.
Da diese Beobachtungen den klinischen Symptomen eines Glaukoms entsprechen und ein sekundäres Glaukom bei sieben von den neun Fällen in der histologischen Untersu- chung zu finden ist, kann davon ausgegangen werden, daß die Besitzer diese Entwicklung hier beobachtet haben. In einem der Fälle, in denen kein sekundäres Glaukom zu diagno-
konnte keine Verlegung des Kammerwinkels mit freischwimmenden Tumorzellen festge- stellt werden, wie sie häufig bei Melanomen der Iris auftreten und so zu einem sekundären Glaukom führen (Abb. 5).
Bei weiteren drei Fällen wurde seit zwei Monaten eine Trübung des Auges beobachtet, traten seit zwei Monaten Sehbeschwerden auf, bzw. wurde seit sechs Monaten eine Um- fangsvermehrung der Iris festgestellt.
Bei einem Fall wurde im Vorbericht nur der Zeitraum von zwei Wochen als Erkrankungs- dauer ohne weitere Angaben gemacht.
Tabelle 4: Angaben zum Krankheitsverlauf der untersuchten okulären Melanome der Hun- de.
Fall Nr. E-Nr., Jahr Rasse Beobachtungs zeitraum
Symtome
1 0015/00 Windhundmix 6 Monate Umfangsvermehrung der
Iris
2 0437/00 Golden Retriever 2 Monaten Sehbeschwerden
3 3104/00 Jagdterrier - -
4 2188/99 Mischling 6-8 Wochen Linsenluxation, Auge ver- größert
5 1191/98 Airdale Terrier - -
6 2863/98 Alaskan Malamute 2 Monate Trübung der Cornea
7 3787/98 Cairn Terrier 2 Tage Schwellung des Bulbus, Schmerzen
8 4377/98 Cairn Terrier 1 Jahr / 1 Wo- che
“Probleme mit dem Auge” / Juckreiz, dunkle Cornea 9 4487/98 Mischling einige Tage Schwellung des Bulbus,
Schmerzen
10 4797/98 Cairn Terrier 1 Jahr “Probleme mit dem Auge”, kratzt sich blutig
11 5435/98 Mischling 1 Monat vergrößerter Bulbus, ge- trübte Cornea, Schmerzen 12 2891/97 Airdale Terrier 1 Jahr / 1 Wo-
che
“Probleme mit dem Auge” / purulenter Ausfluß
13 2926/97 Labrador 3 Monaten vergrößerter Bulbus 14 6472/97 Airdale Terrier 4 Wochen Schwellung des Bulbus
15 7641/97 Dackel - -
16 4617/96 Rauhaardackel 2 Wochen keine weiteren Angaben
17 6251/96 unbekannt - -
Abbildung 1: Fall-Nr. 1, Windhundmix, m., zwölf Jahre, Melanom der Iris und des Ziliarkör- pers (Pfeile), makroskopische Aufnahme
Abbildung 2: Fall-Nr. 6, Alaskan Malamute, m., zehn Jahre, Melanom des Ziliarkörpers (Pfeile), makroskopische Aufnahme.
Abbildung 3: Fall-Nr. 3, Jagdterrier, m., neun Jahre, Melanom der Uvea posterior (Pfeile), makroskopische Aufnahme.
Abbildung 4: Fall-Nr. 11, Mischling, w.k., vier Jahre, Melanom der Iris (Pfeile), makrosko- pische Aufnahme.
