A2738 Deutsches Ärzteblatt⏐⏐Jg. 104⏐⏐Heft 40⏐⏐5. Oktober 2007
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ie Erkenntnis, dass Massenerkrankungen durch die Übertragung winziger Lebewesen verbreitet werden, ist etwas mehr als 100 Jahre alt. Seit dieser Zeit haben sich die Grundlagen der bakteriologischen Diagnostik überraschenderweise kaum geändert. Erst in den letzten Jahren verspricht der Einsatz mole- kularbiologischer Methoden, Verbesserungen bei der Diagnose, longitudinalen Überwachung und Therapie von Infektionskrankheiten. Vor diesem Hintergrund spricht man bereits von einem Paradigmenwechsel und von einigen Beobachtern wird sogar der Unter- gang der klassischen Bakteriologie heraufbeschwo- ren.Die Autoren berichten über die 6. Jahrestagung der Arbeitsgruppe Chipdiagnostik und 2. gemeinsame Jahrestagung der Arbeitsgruppen Chipdiagnostik und Bioinformatik der Deutschen Vereinten Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V.
am Starnberger See am 10. und 11. Mai 2007. Ziel der Jahrestagung war es, die Genchip-basierte Bakteriolo- gie im Hinblick auf die praktische Anwendbarkeit im Routinelabor zu überprüfen.
Chip-Diagnostik bereits Realität
Die Möglichkeiten der DNA-Chip-basierten Analytik wurden von PD Dr. Till Bachmann (School of Bio- medical Sciences, Edinburgh) anhand eines bereits fortgeschrittenen Projekts zur Diagnose von Sta- phylokokken mittels DNA-Mikroarrays vorgestellt.
Grundsätzlich ist das Verfahren zur Keimidentifizie- rung aus Primärmaterial geeignet. Problematisch ist jedoch der Nachweis der Vitalität der identifizierten Keime sowie eine ausführliche Resistenzbestimmung.
Derzeit überlegt man, ein modulares Nachweissystem zu verwenden, bei dem im ersten Schritt die Keim- identifizierung und abgeleitet davon im zweiten Schritt eine gezielte Fahndung nach Resistenzgenen vorgenommen wird. Das Problem der Resistenzbe- stimmung mittels DNA-Mikroarrays wurde von PD Dr. Guido Werner (Robert Koch-Institut, Wernigero- de) vertieft. Er hob hervor, dass es hierfür bisher kei- ne praktische Anwendung in der klinischen Diagnos- tik gibt.
Prof. Thomas Miethke (Technische Universität, München) betonte die Bedeutung der Polymerase- Kettenreaktions-basierten Diagnostik beim Nachweis
von pathogenen Escherichia-coli-Stämmen, bei der Aufklärung atypischer Pneumonien, bei dem Nach- weis von Oxacillin-resistenten Staphylococcus aureus sowie bei dem Nachweis von Bordetella pertussis.
Miethke wies aber darauf hin, dass die Entwick- lung solcher Verfahren sehr aufwendig ist. Die Sensitivität der Methode ist mit der Sensitivität der klassischen kulturbasierten Verfahren etwa vergleich- bar, allerdings ist eine Diagnose in 3 anstatt in 48 h verfügbar. Insbesondere PCR-Techniken sind bei dem Nachweis nicht oder nur schwer züchtbarer Erreger vorteilhaft.
Noch nicht routinetauglich
In diesem Zusammenhang berichtete Miethke, dass etwa 40 % aller akuten Pneumonien durch solche aty- pischen Erreger, und weitere 10 bis 30 % durch Viren verursacht werden. DNA-Chips, so Miethke, haben den Nachteil, dass nur bekannte Gene mittels eines Mikroarrays nachgewiesen werden können. Dabei sind derzeit längst nicht alle Resistenzgene bekannt.
Außerdem ist die Sensitivität von Genchips nicht im- mer ausreichend. Konventionelle Blutkulturen etwa haben eine Sensitivität von ungefähr einem „colony- forming unit“ (CFU)/mL (1 Keim/mL). Diese Sensiti- vität ist mit DNA-Chips nur schwer erreichbar. Aller- dings haben Blutkulturen in der Routine aufgrund von anderen Faktoren, wie zum Beispiel periodische Ausschwemmung der Keime in die Blutbahn, präana- lytische Faktoren einschließlich Abnahmetechnik und Bedingungen, eine derzeitige Sensitivität von insge- samt nur etwa 30 %. Ein Keimnachweis gelingt daher nur in etwa einem Drittel der Fälle, wenn eine Bakte- riämie tatsächlich vorliegt.
Ein vielversprechender kommerzieller Ansatz in diese Richtung bietet die Möglichkeit, 22 Keime im Blut direkt und gleichzeitig festzustellen, wie Dr.
Manfred Wehrmann (Roche Diagnostics, Basel) unterstrich. Als Nachteile dieses Systems nannte er jedoch das Fehlen einer Resistenzbestimmung, die lange manuelle Bearbeitungszeit von circa 6 h, der geringe Automatisierungsgrad sowie die derzeit noch hohen Kosten. Somit relativieren sich die Vortei- le des Systems, nämlich die Zeitersparnis bis zur Diagnosestellung sowie die möglicherweise höhere Sensitivität, verglichen mit der Blutkultur.
KONGRESSBERICHT
Genchiptechnologie
in der Erregerdiagnostik
Erste klinische Anwendungen bereits vorhanden Paul Cullen, Michael Neumaier
Medizinisches Versorgungszentrum für Laboratoriums- medizin, Mikro- biologie und Infektions- epidemiologie, Umweltmedizin und Hygiene Dr. Löer, Dr.
Treder und Partner, Münster:
Prof. Dr. med. Cullen Institut für Klinische Chemie (Zentrallaboratorien), Medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg,
Universitätsklinikum Mannheim: Prof. Dr.
med. Neumaier
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Rolle der Bioinformatik
Die Bioinformatik beschäftigt sich mit den Auswer- tungen der großen Datenmengen, die bei hochparalle- len molekularbiologischen Verfahren wie der DNA- Chipdiagnostik anfallen. So werden mathematische Modelle, Simulationen und Algorithmen zu diesem Zweck etabliert und getestet. Vom Swiss Institute for Bioinformatics (SIB) beziehungsweise der Proteome Informatics Group, die im europäischen Raum eine führende Rolle spielen (Dr. Pierre-Alain Binz und Prof. Denis Hochstrasser, Genf), wurden neue webba- sierte Auswertungssysteme demonstriert. Standardi- sierungen bei den biomathematischen Vorgehenswei- sen bringen Verbesserungen in der Klassifikationsge- nauigkeit, zeigen aber auch Grenzen, die häufig im ur- sprünglichen experimentellen Design begründet liegen.
Dies kann bedingen, dass für Fragen, die erst mit der Verfügbarkeit der neuen parallelisierten Technologien adressierbar wurden, viele Experimente unter neuen Gesichtspunkten – sozusagen zurück zum klassischen nasschemischen Labor – durchgeführt werden können und müssen. Schließlich zeigte Dr. Peter Findeisen (Universität Heidelberg) am Beispiel der massenspek- trometrie-basierten Klassifizierung von bakteriellen Krankheitserregern, wie in einem klinischen Umfeld die Patternerkennung mikrobieller Proteine für eine sehr schnelle und spezifische Diagnostik von Problem- keimen erreicht werden kann.
Bedeutung von Resistenzgenen und Wirtsfaktoren
Eine exakte Charakterisierung der Pathogene ist in vielen Fällen erforderlich, damit man mutations- abhängige Therapieresistenzen rechtzeitig erkennen kann.
Prof. Gundula Jäger (Max von Pettenkofer Institut, München) erläuterte an den Beispielen HIV-Infek- tionen und persistierende HBV-Infektionen die Not- wendigkeit einer Genotypisierung mithilfe der Nukle- insäurenanalytik vor der Einleitung kostenintensiver und nebenwirkungsbehafteter therapeutischer Maß- nahmen. Sie mahnte die Verwendung aktueller Algo- rithmen bei der Bewertung der erhaltenen Ergebnisse an.
Dass die Pathogenität eines Erregers nicht nur von dessen genetischer Ausstattung sondern auch von Wirtsfaktoren abhängt, zeigte Dr. Hanns-Georg Klein (IMGM, Martinsried) durch die Präsentation umfang- reicher statistischer Daten. Ebenso wies Prof. Stephan Bauer (Universität Marburg) anhand einer detaillier- ten Beschreibung der Funktionsweise von Toll-like- Rezeptoren, die sich in Zellen des Immunsystems be- finden, auf diesen Zusammenhang hin. Die Toll-like- Rezeptoren haben die Funktion, pathogen-assoziierte molekulare Muster („pathogen-associated molecular patterns“, PAMPS) zu erkennen und somit eine Immun-
antwort auszulösen.
TABELLE
Anwendung von Verfahren der molekularen Diagnostik in der Bakteriologie
Technologie Anwendungs- Vorteile Nachteile Zeit bis Klinische
gebiet zum Applikation
Befund vorhanden
DNA- Keimidenti- Genaue Identifizierung Setzt Kulturverfahren voraus 2 – 3 Ja
Sequenzierung fizierung Liefert Information Relativ teuer Tage
(Resistenz- über Resistenzen bestimmung) (bei bekannten Genen)
Massen- Keimidenti- Hohe Parallelität Setzt Kulturverfahren voraus 2 Tage Ja
spektrometrie fizierung Sehr schnell Genaue Identifizierung Preiswerte Analytik oft nicht möglich Automatisierbar Hohe Anschaffungskosten
Meistens keine Information zum Resistenzverhalten
DNA- Keimidenti- Hohe Parallelität Technisch anspruchsvoll 2 – 4 h Ja
Mikroarray- fizierung Genaue Keimidentifizierung und teuer in der Entwicklung Technologie (Resistenz- Liefert Information Setzt umfassende Kenntnisse
bestimmung) über Resistenzen über bakterielle Gensequenzen inklusive (bei bekannten Genen) aller Resistenzgene voraus
Kulturverfahren Nur bereits bekannte Gene können
nicht notwendig erfasst werden
Theoretisch in der Lage, Mutationen in 16S-ribosomalen Genen Keimidentifizierung mit oder in Resistenzgenen werden Resistogramm innerhalb nicht erfasst
weniger Stunden zu liefern Fehlender Nachweis eines Gens Automatisierbar für Resistenz gegen ein Antibiotikum Geeignet für „point-of-care“- bedeutet nicht, dass dieses Antibiotikum
Applikationen automatisch wirksam sein wird Möglicherweise unzureichende
Sensitivität
Fehlender Vitalitätsnachweis Derzeit noch teuer
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Fazit
Der Einsatz von molekularbiologischen Methoden verspricht große Fortschritte insbesondere in der Keimidentifizierung. Hierdurch wird nicht nur die Therapie, sondern auch die Überwachung von Infek- tionskrankheiten verbessert. Einige hochparallele Ansätze, besonders die DNA-Chip-Technologie, haben theoretisch das Potenzial, große Bereiche der konven- tionellen Diagnostik auf zeitsparende Weise zu erset- zen. Auf lange Sicht besteht die Perspektive einer Vollautomatisierung und der Entwicklung von Vor- Ort-Anwendungen („point-of-care diagnostics“).
Die Entwicklung von Systemen dieser Art, die in der Lage sind, aus Primärmaterial auf breiter Basis eine vollständige Keimidentifizierung und Resistenz- bestimmung durchzuführen, liegt jedoch noch in der Zukunft – obwohl einige Pioniersysteme bereits am Markt sind beziehungsweise erprobt werden. Die Gründe hierfür liegen einerseits in den hohen techni- schen Anforderungen, andererseits in der derzeit noch unzureichenden Kenntnis der teilweise sehr komple- xen genetischen Grundlagen der Resistenzentwick- lung, in einer noch unzureichenden Sensitivität sowie in der prinzipiellen Unfähigkeit solcher Systeme fest- zustellen, ob vorhandenes genetisches Material aus noch vitalen oder aus bereits abgetöteten Bakterien
stammt. Die Vorteile und die Nachteile der hauptsäch- lichen zurzeit verfügbaren molekularbiologischen Methoden in der Bakteriologie sind in der Tabelle dar- gestellt.
Mitglieder der Arbeitsgruppe Chipdiagnostik: Prof. Paul Cullen, Medizini- sches Versorgungszentrum für Laboratoriumsmedizin, Mikrobiologie und In- fektionsepidemiologie, Umweltmedizin und Hygiene Dr. Löer, Dr. Treder und Partner, Münster; Prof. Harald Funke, Universitätsklinikum Jena; Dr. Hanns- Georg Klein, Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin Dr. Klein und Dr. Rost, Martinsried; Prof. Thomas Langmann, Institut für Humangene- tik der Universität Regensburg; Prof. Michael Neumaier, Institut für Klinische Chemie, Medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg.
Folgende Unternehmen haben die Tagung durch finanzielle Beiträge für eine begleitende Industrie-Ausstellung unterstüzt: Applied Biosystems /Applera Deutschland GmbH, Eppendorf Biochip Systems GmbH, Roche Diagnostics GmbH, Scienion AG
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt im Sinne der Richtlinien des International Committee of Medical Journal Editors besteht.
Manuskriptdaten
eingereicht 25. 6. 2007, revidierte Fassung angenommen 17. 8. 2007 Anschrift für die Verfasser
Prof. Dr. med. Paul Cullen
Medizinisches Versorgungszentrum für Laboratoriumsmedizin, Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie,
Umweltmedizin und Hygiene Dr. Löer, Dr. Treder und Partner Hafenweg 11
48155 Münster
E-Mail: p.cullen@labor-muenster.de
REFERIERT
Hormontherapie erhöht Risiko für Ovarialkarzinom
Die Hormonersatztherapie in den Wechseljahren wird seltener verschrie- ben, nicht zuletzt wegen eines erhöhten Risikos für Brustkrebs und kar- diovaskuläre Ereignisse. 1999 wurden in Deutschland 1,156 Milliarden definierter Tagesdosen verordnet, wohingegen es im Jahr 2005 noch 483 Millionen Dosen waren. Bei der Gabe muss auch eine Nutzen-Risi- ko-Abwägung hinsichtlich eines erhöhten Risikos für Ovarialkarzinome berücksichtigt werden, auf das bereits in der WHI-Studie 2003 hingewie- sen wurde. In einer großen Kohortenstudie wurden diese Ergebnisse jetzt in Großbritannien bestätigt. Zwischen 1996 und 2001 haben 1,3 Millio- nen Frauen im Rahmen eines Brustkrebs-Screenings Fragebögen zu sozialen und demografischen Faktoren, zum Lebensstil sowie zu einer postmenopausalen Hormontherapie erhalten. Dabei ging es um Fragen zur Dauer der Behandlung, dem Alter bei Beginn und Ende der Therapie sowie Art und Dosierung der Hormonmedikation. Ein zweiter Fragebogen wurde zur Aktualisierung der Angaben nach 3 Jahren versandt. Im zentralen nationalen Gesundheitsregister wurden die Studienteilnehmer erfasst und die Untersucher beim Auftreten von Tod, Krebserkrankung
oder Wegzug informiert; die Krebsfälle wurden nach ICD 10 kodiert.
Die Autoren analysierten Daten von 948 576 postmenopausalen Frauen mit einem Durchschnittsalter von 57,2 Jahren, von denen zum Zeitpunkt der letzten Untersuchung 50 % Hormone eingenommen hat- ten. Die Auswertung von rund 5 Millionen Patientenjahren hinsichtlich Krebsinzidenz ergab bei den Hormonanwenderinnen ein um den Faktor 1,2 erhöhtes Risiko, ein Ovarialkarzinom zu entwickeln, gegenüber den Frauen, die nie Hormone eingenommen hatten (Inzidenz 2,6 gegenüber 2,2 pro 1 000 Frauen/5 Jahre). Eine Subgruppenanalyse gegenwärtiger Hormonanwenderinnen ergab ein um den Faktor 1,24 erhöhtes Risiko bei Einnahme über 5 bis 10 Jahre, von 1,31 bei Einnahme von mehr als 10 Jahren. Ein Alter über 60 war mit einem relativen Risiko von 1,33, die frühere Einnahme von Kontrazeptiva von 1,23, ein Body-Mass-Index von 25 bis 30 mit 1,28 und eine vorausgegangene Hysterektomie mit einem Faktor von 1,47 assoziiert.
Für Großbritannien errechneten die Autoren, dass seit 1991 insge- samt 1 300 Erkrankungen an einem Ovarialkarzinom und 1 000 zusätz- liche Todesfälle auf die postmenopausale Hormontherapie zurückgeführt
werden können. W
Beral V et al.: Ovarian cancer and hromone replacement therapy in the Million Women Study. Lancet 2007; 369: 1703–10. E-Mail: pa.valerie.beral @ceu.ox.ac.uk
