Aus der Abteilung für Nephrologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Die Rolle von uPAR beim akuten Nierenversagen und bei der akuten Nierentransplantatabstoßung im
Mausmodell
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Christian Clajus aus Chur, Schweiz
Hannover 2008
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.
Präsident: Professor Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer/Betreuerin der Arbeit: Professorin Dr. med. Faikah Güler
Professor Dr. med. Hermann Haller
Referent: PD Dr. med. Lars Pape
Korreferent: Professor Dr. med. Gregor Theilmeier
Tag der mündlichen Prüfung: 09.07.2008
Promotionsausschussmitglieder: Professor Dr. med. Michael Manns
Professor Dr. med. Arnold Ganser
Professorin Dr. med. Marion Haubitz
Für meine liebe Familie
Inhaltsverzeichnis
Seite
1 Einleitung 1
1.1 Akutes Nierenversagen 1
1.2 Nierentransplantatabstoßung 7
1.3 Das uPA/uPAR-System 7
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit 8
2 Material und Methoden 10
2.1 Material 10
2.1.1 OP-Materialien 10
2.1.1.1 OP-Geräte 10
2.1.1.2 Bestecke und Nahtmaterialien 10
2.1.1.3 Narkosematerialien 11
2.1.1.4 Sonstige OP-Materialien 11
2.1.2 Geräte für die immunhistochemischen Färbungen 11 2.1.3 Quantitative real-time-PCR 11
2.1.4 Tierstämme 12
2.1.5 Chemikalien 12
2.1.6 Antikörper 14
2.2 Methoden 15
2.2.1 Ischämie-Reperfusionsschaden 15 2.2.2 Heterotrope Nierentransplantation und Gewebeentnahme 15
2.2.3 Organentnahme 16
2.2.4 Blutabnahme und Kreatininbestimmung 16 2.2.5 Histologie und Immunhistologie 16
2.2.5.1 PAS-Färbung 17
2.2.5.2 Immunhistochemische Färbung 17
2.2.5.3 Dihydroethidium-Markierung 19
2.2.5.4 TUNEL-Assay (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated
dUTP Nick End-Labeling) 20
2.2.6 mRNA-Isolation und quantitative PCR 22
2.2.7 Statistische Analysen 23
3 Ergebnisse 24
3.1 Einfluss von uPA/uPAR-Defizienz auf den IR-Schaden 24
3.1.1 Nierenfunktion bei IR-Schaden 24 3.1.2 Histologie bei IR-Schaden 26 3.1.3 Zelluntergang beim IR-Schaden 27
3.2 uPA/uPAR bei allogener Nierentransplantation 29
3.2.1 Renale uPA/uPAR-Expression nach allogener
Nierentransplantation 29 3.2.2 Überleben nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und uPAR-Defizienz 33 3.2.3 Nierenfunktion nach allogener Nierentransplantation bei uPA-
und uPAR-Defizienz 34
3.2.4 Histologie nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und uPAR-Defizienz 37 3.2.5 Apoptose nach allogener Nierentransplantation bei uPAR- Defizienz 39 3.2.6 Freie Radikale nach allogener Nierentransplantation bei uPAR- Defizienz 41 3.2.7 Inflammatorische Zellinfiltrate nach allogener
Nierentransplantation bei uPAR-Defizienz 43
4 Diskussion 49
4.1 uPAR-Defizienz und die Generierung von ROS 49
4.2 uPAR-Defizienz und die Migration von inflammatorischen Zellen 52
5. Zusammenfassung 56
6 Literaturverzeichnis 57
7 Abkürzungsverzeichnis 62
8. Abbildungsverzeichnis 65
Danksagung 66
Lebenslauf 67
Erklärung 68
1 Einleitung
1.1 Akutes Nierenversagen
Die Niere ist ein Organ, welches sehr sensibel auf Sauerstoffunterversorgung reagiert. Schon bei kleineren Mangelzuständen werden verschiedene Signalwege in der Niere aktiviert und führen vorübergehend oder dauerhaft zu einer Einschränkung der Nierenfunktion (akutes Nierenversagen, ANV). Durch die Niere fließen ca. 25%
des Herzzeitvolumens. Um den Perfusionsdruck und auch die Sauerstoffversorgung des Nierenparenchyms konstant zu halten, verfügt diese über einen Autoregulationsmechanismus (Bayliss-Effekt). Über die Vasa afferentes und Vasa efferentes kann der Blutfluss reguliert werden, was es der Niere ermöglicht, systolische Blutdruckschwankungen zwischen 80-200 mmHg zu tolerieren. Sollte aber diese Autoregulation ausfallen, der Perfusionsdruck stark abfallen (z.B. durch Schock, Infarkt oder Urinabflussstörungen) und sich nachfolgend auch die Sauerstoffversorgung des Gewebes reduzieren, entstehen zum Teil reversible oder aber irreversible Schäden an der Niere, je nach Ausprägung der Ischämie.
Besonders betroffen ist der Abschnitt in der Niere, in der die niedrigsten Sauerstoffpartialdrücke herrschen. Dies ist das Segment 3 im äußeren Streifen der äußeren Medulla (outer-stripe of the outer-medulla, OSOM). Die Gefäßversorgung der Niere mit sauerstoffreichem arterialisiertem Blut erfolgt kortikal über die afferenten Arteriolen. Dieses durchfließt im Glomerulum das erste Kapillarbett und anschließend in den Vasa recta, zur Versorgung des Marks, das zweite Kapillarbett.
Die Vasa recta ziehen aber direkt herunter zur Papillenspitze, um erst dann wieder in den äußeren Teil der Medulla zu gelangen (dem Tubulusverlauf folgend). Dadurch befindet sich im OSOM, mit Sauerstoffpartialdrücken von ca. 10-20 mmHg, das Gebiet der geringsten Sauerstoffversorgung, im Kortex hingegen liegt der Sauerstoffpartialdruck bei 40-50 mmHg (Abb. 1.1.1).
Abb. 1.1.1 zeigt die Nierenarchitektur und die entsprechenden Sauerstoffpartialdrücke. Im OSOM Bereich herrscht der niedrigste Sauerstoffpartialdruck.
Ein weiterer Faktor, der neben der Sauerstoffunterversorgung zum ANV führt, ist die postischämische Reperfusion. Wird dem unterversorgten Gewebe nach dem ischämischen Ereignis nun wieder Sauerstoff angeboten, kommt es zur Ausbildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Diese Sauerstoffradikale fallen dann in so hoher Menge an, dass die antioxidative Kapazität des Nierengewebes überschritten wird. Dieser oxidative Stress führt dann in weiterer Konsequenz zur Apoptose von Nierenzellen mit nachfolgender Entzündungsreaktion und Funktionsverlust der Niere (ANV).
In der Klinik hat das akute Nierenversagen eine wichtige Bedeutung. Es handelt sich dabei um eine abrupt auftretende Verschlechterung der Nierenfunktion mit Anstieg
Äußere Medulla
ÄußererStreifen Innerer Streifen S3
S3
Innere Medulla
SammelrohrDünner absteigender
Ast
Kortex
S2 S1
Dicker aufsteigender
Ast
Kriz and Bankir, 1988 pO2 = 50 mmHg
pO2 = 10-20 mmHg
der Retentionsparameter (Serum-Harnstoff, Serum-Kreatinin) bis hin zur Urämie mit Bewusstseinsverlust und Multiorganversagen. Oftmals ist beim ANV die Harnbildung deutlich vermindert oder ganz versiegt (Oligo- oder Anurie).
Klinisch wird das ANV in drei Gruppen eingeteilt:
1. Prärenales akutes Nierenversagen: Aufgrund einer renalen Minderperfusion, z. B. im Rahmen von Schockzuständen, Blutverlusten oder Hypotensionen, kann ein ANV eintreten.
2. Intrarenales akutes Nierenversagen: Durch direkte toxische Tubulusschädigung (z.B. durch nephrotoxische Medikamente wie Aminoglykoside oder bestimmte Kontrastmittel) oder durch primäre Nierenerkrankungen (akute Glomerulonephritis oder interstitielle Nephritis) kann es zu einem ANV kommen.
3. Postrenales akutes Nierenversagen: Harnabflussstörungen durch Steinleiden oder Prostatahypertrophie können zu Stauungsnieren und somit zum ANV führen.
Die Ursachen für ein akutes Nierenversagen sind zumeist exogene oder endogene Gefäßverengungen, hypoxische Ereignisse im weitesten Sinne (z.B. intra-, peri- und postoperative Kreislaufinsuffizienz) und Nephrotoxine (z.B. Kontrastmittel, Antibiotika). Auch im Rahmen der Nierentransplantation spielt das akute Nierenversagen eine wichtige Rolle. Im Falle von Leichennierenspenden treten immer längere kalte Ischämiezeiten (im Mittel ca. 12 Stunden) der Spenderniere auf, so dass auch hier postoperativ ein ANV im Rahmen des IR-Schadens auftreten kann.
In der folgenden Tab. 1.1.2 sind Inzidenzzahlen für das Auftreten eines akuten Nierenversagens im Rahmen von kardiochirurgischen Eingriffen bzw. bei Sepsis und Intensivaufenthalten dargestellt.
10-15 ICU
19 - 50 Sepsis
1 - 2 5 - 20
Aminoglykosid Therapie
2 – 5 15 - 25 5 - 10
30 - 35 abdominelle Aortenaneurysma
Resektionen
2 - 5 5 - 20
Kardiochirurgie
schweres ANV (Kreatinin > 5 mg/dl)
in % mildes ANV
(Kreatinin < 3 mg/dl) in %
Tab.1.1.2 zeigt die Inzidenzzahlen für das Auftreten des ANV.
Das postischämische akute Nierenversagen ist das Resultat mehrerer pathophysiologischer Mechanismen. Zum einen entsteht durch die lokale Produktion von Vasokonstriktoren (Endothelin, Angiotensin-II) eine mikrovaskuläre Gefäßverengung, zum anderen wird eine ausgeprägte tubuläre Apoptose herbeigeführt (Bonventre, J. V. et al. 2003). In den Tubuli werden die postischämischen Ereignisse sehr deutlich, es entwickelt sich eine akute Tubulusnekrose (ATN). Dabei kommt es zum Verlust des Bürstensaums, einem Polaritätsverlust an der Basalmembran und schließlich zur Apoptose der Tubuluszellen mit Zelldetritus im Tubuluslumen (Abb. 1.1.3 und Abb. 1.1.4).
Schrier NEJM 2004
Abb.1.1.3 zeigt ein Schema der Pathophysiologie des ANV.
Tubulus- lumen
Na/K ATPase
Integrine
Zelltod Lebende Epithelzelle Verlust
Bürsten- saum apikal
baso- lateral Polaritäts-
verlust
Apoptose
Schrier JCI 2004
Abb. 1.1.4 zeigt die histologischen Veränderungen bei ANV. Zu sehen ist der Verlust des Bürstensaums, Tubulusepithelzellen im Lumen, ein interstitielles Ödem und vermehrt interstitielle Entzündungszellen; aus Gueler, F. et al. 2002.
Die aus den morphologischen Schäden resultierende renale Dysfunktion ist das Produkt aus mehreren pathopysiologischen Ereignissen. So spielen mikrovaskuläre Ereignisse in Kortex und Medulla, wie auch zelluläre Veränderungen der Tubuli eine wichtige Rolle.
Der IR-Schaden kann gut im Tiermodell simuliert werden. Durch passageres Abklemmen des Nierengefäßstiels kann im Mausmodell ein ANV mit konsekutivem Kreatininanstieg erzeugt werden. Diese Modelle eignen sich zur Analyse molekularer
Normale Niere Akute Tubulusnekrose
Verlust des Bürstensaums
Tubulusepithelzellen im Lumen
interstitielles Ödem
interstitielle Inflammation
Gueler et al., J. Am. Soc Nephrol.2002
Mechanismen, die zum ANV führen, zur Untersuchung von knock-out Mäusen und auch zum Erproben neuer therapeutischer Strategien.
Trotz der vielen erfolgreichen Ansätze zur Verhinderung eines ANV in tierexperimentellen Studien hat sich bisher keine einheitliche Therapie für dieses heterogene Krankheitsbild durchgesetzt (Dishart, M. K. et al. 2000).
1.2 Nierentransplantatabstoßung
Das akute Nierenversagen spielt auch in der Transplantationsmedizin eine große Rolle. Bei jeder Organtransplantation treten durch die Organentnahme und Transportwege Ischämiezeiten (Zeiten mit Sauerstoffmangel) auf, das bedeutet, dass die Organe im Durchschnitt 12-15 Stunden (zum Teil auch länger) nicht durchblutet werden und einen Sauerstoffmangel erleiden. Die Dauer der kalten Ischämiezeit ist ein wichtiger Trigger für die akute Nierentransplantatabstoßung (Land, W. G. 2005).
Durch die Hypoxie werden zelluläre Signalkaskaden aktiviert, die zu einer Aktivierung von immunkompetenten Zellen führen und somit auch eine Abstoßung vermitteln können. Auch für das chronische Transplantatversagen spielt die kalte Ischämiezeit eine erhebliche Rolle. Bereits 6 Monate nach Transplantation ist in ca. 40% der Nierentransplantate eine massive Bindegewebsvermehrung (Fibrosierung) mit einem erheblichen Verlust von niereneigenem Gewebe sichtbar. Wichtige Faktoren, die zu einer späteren Bindegewebsvermehrung beitragen, sind lange Ischämiezeiten vor der Transplantation und wiederkehrende Abstoßungsereignisse. Die Länge der kalten Ischämiezeit ist einer der wichtigsten Prädiktoren für die Ausbildung einer chronischen Nierentransplantatabstoßung (Schwarz, A. et al. 2002). Diese ist durch eine zunehmende Eiweißausscheidung (Proteinurie), einen zunehmenden Nierenfunktionsverlust und eine zunehmende Bindegewebsvermehrung und auch Entzündung (Inflammation) der Niere gekennzeichnet.
1.3 Das uPA/uPAR-System
Der Urokinase-Typ-Plasminogen-Aktivator (uPA) ist ein multifunktionelles Molekül, welches einerseits als ein proteolytisches Enzym und andererseits als Ligand zur Induktion von Signalkaskaden dient. Der entsprechende Urokinase-Typ- Plasminogen-Aktivator-Rezeptor (uPAR; CD87) war ursprünglich als
Proteinaserezeptor für uPA identifiziert worden. Er steuerte proteolytische Vorgänge, welche sich perizellulär abspielen. Vermehrt zeichnet sich in der Literatur jedoch ab, dass der uPA-Rezeptor auch andere intrazelluläre Signalwege aktivieren kann. Dies geschieht zum Beispiel über Interaktionen mit verschiedenen Zelloberflächenproteinen. Dazu gehören auch Integrine, Wachstumsfaktorrezeptoren und G-Protein-gebundene Membranproteine. Über diese Signalwege kann das uPA/uPAR-System nicht nur die perizelluläre Fibrinolyse oder Proteolyse steuern, sondern auch Vorgänge wie Zelladhäsion, Migration, Proliferation und Zelldifferenzierung (Blasi, F. et al. 2002) (Kiyan, J. et al. 2005).
Weiterhin werden immer mehr wichtige Funktionen des uPA/uPAR-Systems bekannt.
So konnte nachgewiesen werden, dass dieses System eine wichtige Rolle bei der Modulation von Abwehrreaktionen, sowohl des angeborenen als auch des erworbenen Immunsystems, innehat (Mondino, A. et al. 2004). Andere wichtige Schritte in der Immunmodolation bestehen in der Antigenprozessierung, der Antigenpräsentation des Abwehrsystems (Woodhead 2000) und der Lymphozytenaktivierung (Nykjaer, A. et al. 1994). Die genannten Funktionen von uPA/uPAR lassen vermuten, dass die beteiligten Signalkaskaden auch relevant bei der Ausbildung eines ANV (bzw. des IR-Schadens) und der Nierentransplantatabstoßung sein könnten. Viele der oben genannten Erkenntnisse wurden mit Hilfe von Untersuchungen an gendefizienten Mäusen erzielt. Durch gezieltes Ausschalten von uPA oder uPAR konnte deren Rolle in verschiedenen Signalkaskaden genauer analysiert werden.
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit
Bisher wurde die genaue Beteiligung des uPA/uPAR-Systems in der Entwicklung des akuten Nierenversagens und der akuten Nierentransplantatabstoßung nicht untersucht. Diese Arbeit sollte die Rolle des uPA/uPAR-Systems bei der Ausbildung des akuten Nierenversagens (IR-Schaden) und bei der allogenen akuten Nierentransplantatabstoßung untersuchen. Für das akute Nierenversagen (bzw. den IR-Schaden) und die Nierentransplantatabstoßung wurden standardisierte und gut charakterisierte Mausmodelle verwendet, die eine Untersuchung molekularer Zusammenhänge gestatten. Der Einsatz von uPA- bzw. uPAR-defizienten Mäusen in diesen Modellen sollte es ermöglichen, die Beteiligung von uPA und uPAR an
molekularen Mechanismen zu untersuchen, die das ANV bzw. die akute Nierentransplantatabstoßung vermitteln.
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 OP-Materialien
Für die Nierentransplantationen wurden folgende Geräte und Zubehör verwendet:
2.1.1.1 OP-Geräte
○ Chirurgisches Mikroskop (Firma Leica, Wetzlar Deutschland)
○ Elektrokoagulator ICC50 (Firma Erbe, Tübingen Deutschland)
○ Wärmetisch C10 (Firma Haake, Karlsruhe Deutschland)
2.1.1.2 Bestecke und Nahtmaterialien
Folgende Instrumente der Firma Aesculap (Tuttlingen, Deutschland) wurden verwendet:
○ Chirurgische Pinzette BD537 ○ Mikroschere OC498R
○ Nadelhalter für Bauchwandnähte BM54 ○ Mikronadelhalter FD243
○ Mikropinzette BD331R ○ Mikrogefäßklemmer 2x FE690K
○ gebogene Mikrofederschere OC497R ○ Mikropinzette BD329 für innere operative Eingriffe
Als Nahtmaterialien wurden folgende Fäden der Firma Ethicon (Hamburg, Deutschland) benutzt:
○ 4/0 Mersilene FS-2 für Bauchverschluss,
○ 7/0 Ethicon BV-1 für Gefäßligaturen,
○ 10/0 Prolene BV-6 für Mikrogefäßanastomosen und Ureteranastomosen.
2.1.1.3 Narkosematerialien
2,5%iges Avertin wurde als Narkosematerial benutzt. Avertin besteht aus 2,2,2 Tribromoethanol und 2-Methyl-2-Butanol. Eine 100%ige (w/v) Stammlösung des Avertin wurde durch das Lösen von 10g des 2,2,2-Tribromoethanol in 10ml 2-Methyl- 2-Butanol hergestellt. Die Lösung wurde abgedunkelt bei 4 °C aufbewahrt.
Vor Gebrauch wurde die 100%ige Stammlösung Avertin mit 0,9%iger Kochsalzlösung (NaCl) auf eine 2,5%ige Lösung verdünnt. Anschließend wurde das 2,5%ige Avertin bei Raumtemperatur aufbewahrt (bis sechs Monate haltbar).
Als Dosierung wurden 15 ml/kg Körpergewicht eingesetzt.
2.1.1.4 Sonstige OP-Materialien
○Kompressen ○ Spritzen 1 ml und 2 ml
○Wattestäbchen ○ Kanülen 21G, 27G, 30G
○ 0,9%ige Kochsalzlösung
2.1.2 Geräte für die immunhistochemischen Färbungen
Zur Herstellung der 3 μm Paraffinschnitte wurde ein Rotationsmikrotom der Firma Leica, RM 2245 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) benutzt.
Die kryokonservierten Proben wurden mit einem Kryostat der Firma Leica, CM 3050S (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) 6 μm dick geschnitten.
Die Proben wurden im Labor mit Hilfe der folgenden Mikroskope untersucht und fotografiert:
○ Leica LM DB (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland)
○ Zeiss Axioplan-2 (Zeiss, Jena, Deutschland)
Zur Fotografie und Archivierung der Bilder wurde das Computerprogramm Axio Vision 3.0 (Zeiss, Jena, Deutschland) verwendet.
2.1.3 Quantitative real-time-PCR
○ ABI PrismTM 7700 Sequence Detector, Perkin Elmer Boston, USA
2.1.4 Tierstämme
Die uPA- und uPAR-knock-out Mäuse (uPA-/- und uPAR-/-) waren ein großzügiges Geschenk von Peter Carmeliet und Mieke Dewerchin (Zentrum für transgene Technologie and Gentherapie, Universität von Leuven, Belgien) (Carmeliet, P. et al.
1996).
Die uPA-/- Mäuse wurden auf einem C57BL/6J-Hintergrund gezüchtet, die entsprechenden Wildtyp-Kontrollen (WT1) stammten aus einer reinen C57BL/6J- Population und wurden über die Firma Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bestellt.
Die uPAR-/- Tiere wurden auf einem Hybridhintergrund gezüchtet (75% C57BL/6J und 25% 129/SV), als Kontrolltiere dienten entsprechende Geschwistertiere mit dem gleichen Hintergrund (WT2). Für die Untersuchungen des IR-Schadens wurden 12- 14 Wochen alte uPA-/-, uPAR-/-, WT1- und WT2-Mäuse verwendet. Im Transplantationsmodell dienten homozygote weibliche uPA-/-, uPAR-/-, WT1- und WT2-Mäuse als Nierenspender. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Als Nierenempfänger wurden weibliche BALB/c(H2d)-Mäuse verwendet, welche ebenfalls von Charles River (Sulzbach, Deutschland) stammten. Die Mäuse waren zwischen 12 und 16 Wochen alt und wogen 25-30 g.
Die Tiere wurden unter artgerechten Bedingungen bei konstantem Tag-Nacht- Rhythmus mit freiem Zugang zu Wasser und Futter bei der Phenos GmbH, Hannover gehalten. Sämtliche Experimente entsprachen den Richtlinien des behördlichen Tierschutzkomitees.
2.1.5 Chemikalien
Für die immunhistochemischen Färbungen wurden Feinchemikalien und Lösungsmittel der Firmen Fluka Biochemika (Buchs, Schweiz), Merck (Darmstadt, Deutschland), Sigma Chemie (Deisenhof, Deutschland), der Pap-Pen (BioGenex, San Ramon, Kalifornien, USA) und Histoclear (Roth, Karlsruhe, Deutschland) verwendet.
Für Westernblots wurden Entwicklungslösungen der Firma Perkin Elmer (Boston, USA) und Tetenal (Noderderstedt, Deutschland) und Röntgenfilme der Firma Kodak (Rochester, USA) verwendet.
Zur RNA Isolation wurde Trizol-Reagenz und Superscript II reverse Transkriptase (Invitrogen, Deutschland) verwendet. Rox-Farbstoff, sowie Fam-Tamra markierte Primer (BioTez, Deutschland) und FastStart-Taq-Polymerase (Roche Diagnostics, Deutschland) kamen ebenfalls zur Anwendung.
2.1.6 Antikörper
Antikörper Firma Verdünnung
Rat anti Mouse
Monozyten/Makrophagen, F4/80 (Cl: A3-1)
Serotec, Oxford, UK 1:2500
Rat anti Mouse, CD 54
(ICAM-1) Serotec, Oxford, UK 1:10000
Rabbit anti Mouse, aktive Caspase-3
BD, PharMingen,
Heidelberg, Deutschland 1:250
Rat anti Mouse Neutrophile, GR-1
Geschenk von Prof.
Hoffmann, Med.
Hochschule Hannover, Deutschland
1:200
Armenischer Hamster anti Mouse, CD11c,
Dendritische Zellen (Cl:
HL3)
BD PharMingen, Heidelber,
Deutschland 1:500
Rat anti Mouse, CD4, T- Lymphozyten (L3T4)
BD PharMingen,
Heidelberg, Deutschland 1:750 Rat anti Mouse, CD8, T-
Lymphozyten (Ly-2)
BD PharMingen,
Heidelberg, Deutschland 1:1000 Rat anti Mouse, CD22, B-
Lymphozyten (Cl-2D6)
SouthernBiotech,
Birmingham, USA 1:100
Rabbit anti Mouse, uPAR Santa Cruz Biotechnology,
California, USA 1:50
Sekundärer Antikörper Donkey anti Rat (Cy3)
Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, USA
1:500
Sekundärer Antikörper Goat anti armenischer Hamster (Cy-3)
Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, USA
1:500
Tab. 2.1: Tabelle der verwendeten Antikörper
2.2 Methoden
2.2.1 Ischämie-Reperfusionsschaden
Sowohl der Ischämie-Reperfusionsschaden (IR-Schaden) als auch die Nierentransplantation wurden von Dr. Song Rong durchgeführt. Der renale IR- Schaden wurde durch bilaterales Klippen des Nierengefäßstiels induziert. Die Mäuse erhielten eine Inhalationsnarkose mit Isofluran. Anschließend wurde eine mediane Laparotomie durchgeführt und der Nierenhilus stumpf frei präpariert. Mit Hilfe von nichttraumatischen Gefäßklemmen wurde eine 35-minütige Ischämie erzeugt, anschließend die Perfusion freigegeben und der Bauch wieder verschlossen. Das Serumkreatinin (S-Kreatinin) wurde 24h nach dem ischämischen Ereignis mit einem Kreatinin-Analyzer (Beckman, Deutschland) bestimmt.
2.2.2 Heterotrope Nierentransplantation und Gewebeentnahme
Die Nierentransplantation wurde ebenfalls von Dr. Song Rong durchgeführt.
Dafür dienten homozygote weibliche uPA-/-, uPAR-/-, WT1-und WT2-Mäuse als Nierenspender und weibliche BALB/c (H2b) als Nierenempfänger. Hierbei wurde die Niere, einschließlich ihrer versorgenden Gefäße und dem Ureter, entsprechend der Arbeit von Ziegler et al. transplantiert (Ziegler, E. et al. 2006).
Nachdem die Spendertiere mit Isofluran anästhesiert worden sind, wurde ihnen die linke Niere, zusammen mit der Nierenarterie und einem Aortenpatch, der Nierenvene und einem kleinen V. cava-Patch und dem gesamten Ureter en bloc entnommen. Die Empfängertiere erhielten ebenfalls eine Isofluran-Anästhesie. Zunächst wurde die linke Eigenniere entnommen, dann erfolgte die Anastomose der großen Gefäße an die Aorta und an die V. cava. Die Gefäßanastomosen wurden kurz unterhalb der natürlichen Abgänge der Nierengefäße angelegt. Der Ureter wurde direkt mit der Harnblase des Empfängertieres verbunden (Han, W. R. et al. 1999). Für die Transplantate betrug die kalte Ischämiezeit 60 min. und die warme Ischämiezeit 30 min. Die Nephrektomie der bisher verbliebenen rechten Eigenniere des Empfängertieres erfolgte entweder am OP-Tag oder vier Tage später über einen Flankenschnitt.
Zur Beurteilung der Nierenfunktion wurde regelmäßig der Serumkreatininwert bestimmt.
2.2.3 Organentnahme
Für molekulare Analysen und histologische Untersuchungen erfolgte die Organentnahme der Transplantatniere nach 24h (zur Beurteilung des IR-Schadens) und nach 6 Tagen (Beurteilung der Abstoßungsreaktion).
Zur Organentnahme wurden die Tiere getötet und die Transplantatniere vorher mit ca. 20 ml kalter 0,9%ige Kochsalzlösung über das Herz perfundiert. Die entnommenen Nieren wurden gedrittelt und unterschiedlich fixiert: In 4% PFA für die Histologie, in Methylbutan auf Trockeneis für die Immunhistochemie und in flüssigem Stickstoff schockgefroren für die Molekularbiologie (mRNA- und Proteinisolation).
2.2.4 Blutabtnahme und Kreatininbestimmung
Im Zeitintervall zwischen Transplantation und Gewebeentnahme wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Kreatininwert bestimmt. Dafür wurde für jede Blutentnahme ca. 200 μl Blut aus dem Kapillarplexus am Auge entnommen.
Zur Bestimmung des S-Kreatinins wurde der Kreatinin Analyser 2 der Firma Beckman (Deutschland) verwendet. Nach den Angaben des Herstellers wurden 45 ml Pikrinsäure-Fertiglösung (Lsg. A) mit 180 ml alkalischer Puffer-Fertiglösung (Lsg.
B) gleichmäßig gemischt und für 10 min. bei 37 °C inkubiert. Mittels 30 μl eines Kreatininstandards wurde das Gerät auf 440 μmol/l geeicht. Nun wurde die Messung mit ca. 30 μl Serum durchgeführt. Aus drei aufeinander folgenden Messungen wurde der Mittelwert bestimmt.
2.2.5 Histologie und Immunhistologie
Zur Übersichtsfärbung wurde die „Perjodic-Acid-Schiff-Reaktion“ (PAS-Färbung) verwendet. Hierfür wurden 3 μm dicke Paraffin-Schnitte aus 4% Paraformaldehyd (PFA) fixierten Nierenpräparaten benutzt. Die Morphologie wurde unter Anleitung von Dr. Mengel (Nephropathologie der MHH) lichtmikroskopisch beurteilt und entsprechend der Banff Klassifikation (Racusen, L. C. 2004) ausgewertet. Der
Untersucher kannte die Gruppenzugehörigkeit der Präparate nicht. Für die immunhistochemischen Färbungen wurden vom kryokonservierten Gewebe mit Hilfe des Kryotoms 6 μm dicke Schnitte angefertigt. Nach der immunhistochemischen Färbung wurden die Präparate ebenfalls ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit beurteilt.
2.2.5.1 PAS-Färbung
Das Protokoll der einzelnen Färbeschritte sah wie folgt aus:
Entparaffinierung:
○ 3 x 5 min. Histoclear Rehydratation:
○ kurz in 50%iger Alkohollösung eintauchen
○ kurz in A. dest. eintauchen PAS-Färbung:
○ 10 min. in 0,5%iger Perjodsäure oxidieren
○ 3 x 5 min. in A. dest. spülen
○ 20 min. in Schiffscher-Reagenz (Merck, Darmstadt, Deutschland) inkubieren
○ 3 x 2 min. mit Sulfitwasser differenzieren
Sulfitwasser: 12 ml 10%ige Na2SO3-Lösung, 10 ml 1 normale HCl und 200 ml A. dest.
○ 10 min. spülen unter fließendem Leitungswasser
○ 2,5 min. Kerfärbung in Hämalaun (Hämatoxylin n. Delafield)
○ 10 min. bläuen unter fließendem Leitungswasser
○ Eindecken mit Histokitt
Anschließend wurden die Schnitte am Lichtmikroskop (Vergrößerung x200 und x400) histologisch ausgewertet.
2.2.5.2 Immunhistochemische Färbung
Die Immunfluoreszenzfärbung wurde 1941 von dem amerikanischen Mikrobiologen und Pathologen Albert Coons eingeführt. Seither gewann diese Technik in Diagnostik
und Forschung große Bedeutung, denn sie garantiert eine selektive Anfärbung von spezifischen Antigenstrukturen auf histologischem Gewebe.
Vor Beginn der eigentlichen Färbeschritte wurden die 6 μm dicken kryokonservierten Schnitte für 15 min. in -20 °C gekühltem Aceton fixiert. Danach trocknete das Präparat an der Luft.
Anschließend wurden alle Schnitte mit dem Pap-Pen eingekreist, um ein Verlaufen der Lösungen in den einzelnen Färbeschritten zu vermeiden.
Die einzelnen Schritte der immunhistochemischen Färbung gestalteten sich wie folgt:
○ 10 min. in feuchter Kammer mit 10%igem Donkey-Serum blockieren
○ 1h bei RT mit primärem Antikörper inkubieren (Verdünnung in TBS entsprechend der Antikörper-Tabelle 2.1.6)
○ 3 x 5 min. mit TBS waschen
○ 1h bei RT mit Sekundär-Antikörper (Cy3, 1:500) lichtgeschützt inkubieren
○ 3 x 5 min. mit TBS waschen
In dieser Arbeit wurde ausschließlich die indirekte Immunfluoreszenzfärbung verwendet (Abb. 2.2.5.2).
Abb. 2.2.5.2 zeigt ein Schema der indirekten Immunfluoreszenzfärbung.
Als sekundärer Antikörper wurde CY3 (Emissionsmaximum: 548 nm) verwendet, der das anzufärbende Antigen in der Mikroskopie rot erscheinen lässt. Die Eigenfluoreszenz des Nierengewebes war grün fluoreszierend. Diese eignete sich gut für die Darstellung der Topografie des Schnittes.
DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindol) wurde zur Darstellung der Zellkerne verwendet.
Es bildet spezifisch mit Doppelstrang-DNA einen Komplex, der unter dem Mikroskop blau fluoresziert (Emissionsmaximum: 359 nm).
Die Lagerung der gefärbten Schnitte erfolgte bei 4°C im Dunkeln, um das Ausbleichen des Chromogens zu verzögern.
2.2.5.3 Dihydroethidium-Markierung
Die Produktion freier Radikale (reactive-oxygen-species: ROS) wurde mit Hilfe von fluoreszierendem Dihydroethidium (DHE) nachgewiesen. Für diese Färbung wurden
frische kryokonservierte Nierenschnitte mit einer Schnittdicke von 6μm hergestellt (n=5 von jeder Gruppe). Diese inkubierten sofort in einer Lösung von 2,5 μl DHE und 10 ml Hepes-Tyrode-Puffer (siehe unten) für 12 min. bei Raumtemperatur.
Da die Markierung schnell an Intensität verliert und ihr Emissionsmaximum nach 12 min. erreicht ist, musste umgehend die Beurteilung unter dem Leica Mikroskop IM500 erfolgen (Ex: 520 nm, Em: 605 nm).
Zur Herstellung des Hepes-Tyrode-Puffer in 100 ml bidest. H2O werden benötigt:
NaCl 0,771g (≙ 132 mM) KCl 0,030g (≙ 4 mM) CaCl2 0,011g (≙ 1 mM)
MgCl2 0,010g (≙ 0,5 mM)
* HEPES 0,013g (≙ 0,5 mM) Glucose 0,099g (≙ 5 mM)
*HEPES: (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure) ist eine organische Pufferlösung zur Aufrechterhaltung des physiologischen pH- Wertes.
2.2.5.4 TUNEL-Assay (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End-Labeling)
Der TUNEL-Assay dient zur Darstellung von abgestorbenen Zellen. Die toten Zellkerne erscheinen grün fluoreszierend im Gewebe. Diese Methode kann nicht zwischen nekrotischen und apoptotischen Zellen unterscheiden, hierfür sind im Anschluss Zusatzfärbungen erforderlich. Für den TUNEL-Assay wurden 2 µm dicke Paraffinschnitte (n=5, pro Gruppe) angefertigt. Die einzelnen Färbeschritte gestalteten sich wie folgt:
Entparaffinierung:
○ 3 x 5 min. in Xylol
Rehydrierung in der absteigenden Alkoholreihe:
○ 2 x 5 min. in 100%iger Ethanollösung
○ 5 min. in 96%iger Ethanollösung
○ 5 min. in 70%iger Ethanollösung
○ Kurz in A. bidest spülen
TUNEL-Assay:
○ Einengung des Pipettierungsfeldes mit dem Pap-Pen
○ Demaskierung in der Mikrowelle: 2 min. bei 700 W in 10 mM Citratpuffer (pH 6,0)
○ Abkühlen auf Eis für 15 min.
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ Proteinase K (20 µg/ml) für 20 min. bei Raumtemperatur
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ 60 min bei 37°C mit 100 µl TUNEL-Reaktionsgemisch in einer feuchten Kammer inkubieren
(Das Gemisch wird kurz vor Gebrauch aus den beiden Stammlösungen:
- Enzymlösung: terminale Deoxynucleotidyl-Transferase aus Kälberthymus in Aufbewahrungspuffer und
- Labellösung: Nukleotidmischung in Reaktionspuffer im Verhältnis 1:10 hergestellt.)
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ ABC-Lösung wird aus 2 Tropfen A und 2 Tropfen B in 5 ml PBS hergestellt, anschließend 30 min auf Eis stellen.
○ Blocken mit 2 % BSA für 10 min.
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ 30 min. Inkubation mit ABC-Lösung
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ Inkubation mit 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,6)
○ 5 min. Inkubation mit DAB/NaCl
○ 3 min. mit Wasser waschen
○ 2 - 4 min. Gegenfärbung mit Methylgrün
○ 2 x 3 min. in 96% Ethanol waschen
○ 3 x 3 min. Inkubation in Histoclear
○ Eindecken
Die Negativkontrollen wurden ebenfalls nach dem obigen Protokoll gefärbt, jedoch wurde die terminale Deoxynucleotidyl-Transferase nicht zugefügt.
2.2.6 mRNA-Isolation und quantitative PCR
Um die mRNA-Expression in einer Probe zu bestimmen wurde die quantitative real- time PCR (qPCR) verwendet. Kurz beschrieben wird aus dem Gewebe die mRNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Mit Hilfe spezifischer Primer wird die cDNA während der PCR amplifiziert und am Ende die Konzentration des betreffenden Gens bestimmt. Bei der real-time PCR kann die amplifizierte cDNA Menge mittels Bezug auf einen Housekeeper (das ist ein Referenzgen, das immer in bestimmter Menge vorhanden ist und nicht reguliert wird) quantifiziert werden. Als Housekeeper wurde ß-Aktin verwendet.
Die qPCR wurde von Frau Nicolai durchgeführt.
Aus gefrorenem Nierengewebe, welches nach der Transplantatentnahme in flüssigem Stickstoff schockgefroren wurde, wurde die mRNA mit Hilfe von Trizol Reagenz (Invitrogen, Detuschland) isoliert. Nach Behandlung mit DNase wurde anschließend davon 1 µg mRNA mit Superscript II reverser Transkriptase versetzt (Invitrogen, Deutschland). Die qPCR wurde am SDS 7700 Gerät (Applied Biosystems, Deutschland) unter Verwendung von Rox dye (Invitrogen, Deutschland), FastStart taq Polymerase (Roche diagnostics, Deutschland), genspezifischen Primern und Fam-Tamra-labeled Proben (BioTez, Deutschland) durchgeführt.
Für die qPCR wurde ein standardisiertes Temperaturprofil verwendet. Dabei folgten auf einen einmaligen Denaturierungsschritt bei 95° C über 10 min. 40 Zyklen der Amplifikation bei 95° C für 10 sek. und 60° C für 1 min.
Die verwendeten Primer für den TaqMan sahen wie folgt aus (5’–3’):
mur MIP-2
sense: 5’- TGT GAC GCC CCC AGG A -3’
antisense: 5’- TTT GAC CGC CCT TGA GAG TG-3’
probe: 6-FAM- CCC ACT GCG CCC AGA CAG AAG TCA TA –TAMRA
mur ß-Aktin
sense: 5’- TCA CCC ACA CTG TGC CCA T -3’
antisense: 5’-AGC CAG GTC CAG ACG CAG -3’
probe: 6-FAM- AGG GCT ATG CTC TCC CTC ACG CCA T -TAMRA
mur MCP-1
sense: 5’- CCA ACT CTC ACT GAA GCC AGC -3’
antisense: 5’- CAG GCC CAG AAG CAT GAC A -3’
probe: 6-FAM- CTC TCT TCC TCC ACC ACC ATG CAG GT -TAMRA
mur uPA
sense: 5’- CGA TTC TGG AGG ACC GCT TA -3’
antisense: 5’- CCA GCT CAC AAT CCC ACT CA -3’
probe: 6-FAM- CTG TAA CAT CGA AGG CCG CCC AAC T -TAMRA
mur uPAR
sense: 5’- CCA CAG CGA AAA GAC CAA CA -3’
antisense: 5’- CGG TCT CTG TCA GGC TGA TGA -3’
probe: 6-FAM- ATG AGT TAC CGC ATG GGC TCC A -TAMRA
Für die quantitative Bestimmung wurde die qgene-Software benutzt (Muller, P. Y. et al. 2002).
2.2.7 Statistische Analysen
Für die statistischen Auswertungen der Daten wurde die Auswertungssoftware SPSS 12.01 verwendet. Dargestellt sind Mittelwerte (MW) ± bzw. Standardabweichungen (SD). Die Normalverteilung wurde durch den Klomogorov-Smirnov-Test überprüft.
Die statistische Signifikanz wurde mit dem T-Test berechnet, als signifikant wurde p<0,05 gewertet.
3 Ergebnisse
3.1 Einfluss von uPA/uPAR-Defizienz auf den IR-Schaden
3.1.1 Nierenfunktion bei IR-Schaden
Das uPA/uPAR-System ist an vielen Signalkaskaden beteiligt, welche die Ausbildung eines IR-Schadens begünstigen. Um herauszufinden, ob uPA oder uPAR beim IR- Schaden an der Niere beteiligt ist, wurde der Nierenhilus von uPA-/-, uPAR-/-, WT1- und WT2-Mäusen geklippt. Hierbei zeigte sich, dass 24h nach dem ischämischen Ereignis die Tiere beider WT-Kontrollgruppen (WT1 und WT2), und die der uPA-/- Gruppe schwere Nierenfunktionsstörungen mit Erhöhung des S-Kreatinins aufwiesen.
Die Tiere der uPAR-/- Gruppe zeigten einen signifikant geringeren Anstieg des S- Kreatinins gegenüber den anderen Gruppen und schienen so vor einem schweren IR-Schaden geschützt zu sein (Abb. 3.1.1).
Abb. 3.1.1 zeigt die S-Kreatininwerte vor (Kontrolle) und 24h nach IR-Schaden als Ausdruck der Nierenfunktion.
A) Der IR-Schaden verursachte eine schwere renale Dysfunktion, welche sich durch die stark erhöhten S-Kreatininwerte zeigte. Die schwere Nierenfunktionsstörung zeigte sich hier in beiden Gruppen, WT1 und uPA-/-, 24h nach dem ischämischen Ereignis. Die uPA-/- Tiere zeigten dabei eine etwas geringere Erhöhung des S-Kreatinins 24h nach dem ischämischen Ereignis als die Tiere der korrespondierenden WT-Gruppe.
B) Hier zeigte sich 24h nach dem ischämischen Ereignis eine deutlich geringere Nierenfunktionsstörung bei den uPAR-defizienten Mäusen als bei der WT2 Kontrollgruppe (*** p<0,001 vs. WT2), 7-12 Mäuse wurden in jeder Gruppe untersucht. uPAR-/- schien den Nierenfunktionsverlust nach IR-Schaden abzumildern.
0 100 200 300
Kontrolle d0
WT d1 uPA-/- d1
S-Kreatinin [µmol/l]
0 100 200 300
Kontrolle d0
WT d1 uPAR-/- d1
S-Kreatinin [µmol/l]
***
B
A
3.1.2 Histologie bei IR-Schaden
Die Übersichtshistologie korrelierte gut mit den Ergebnissen der Nierenfunktion. Die Tiere der WT1-, WT2- und uPA-/- Gruppen zeigten Zeichen einer schweren akuten tubulären Nekrose (ATN), 24h nach dem IR-Schaden. So waren Zelldetritus im Tubuluslumen, Zellinfiltrate, der Untergang von Tubuluszellen und der Verlust des Bürstensaums im Lichtmikroskop bei 200facher Vergrößerung zu erkennen. Im Gegensatz dazu zeigten sich bei den Präparaten der uPAR-/- Gruppe weitaus weniger Zeichen einer ATN (Abb. 3.1.2).
Abb. 3.1.2 zeigt die Nierenmorphologie in einer PAS-Färbung 24h nach IR- Schaden.
A) zeigt eine normale Histologie vor dem ischämischen Ereignis.
B) zeigt die Histologie der WT-Kontrollgruppen mit schwerer akuter Tubulusnekrose, C) zeigt die Histologie der uPA-/- Gruppe. Der IR-Schaden verursachte einen schweren Zellschaden im S3-Segment der Niere (outer- stripe-outer-medulla, OSOM). Die Präparate der WT1-, WT2- und uPA-/- Mäuse zeigten deutlich den Untergang des Bürstensaums und die Ablösung der Epithelzellen von der Basalmembran. Dies führte zum Bild der „nackten Basalmembran“ und der verstopften Tubuluslumen.
C A
D
B
D) zeigt die Histologie der uPAR-/- Gruppe. Auch hier war der Untergang des Bürstensaums und Ablösung der Epithelzellen von der Basalmembran zu erkennen, jedoch ist der Schaden wesentlich milder als in B) und C).
3.1.3 Zelluntergang beim IR-Schaden
Es existieren unterschiedliche Ergebnisse über die pro- oder antiapoptotischen Eigenschaften des uPA/uPAR-Systems. Da der IR-Schaden immer zum Zelluntergang führt, wurde der TUNEL-Assay verwendet, um abgestorbene Zellen in den ischämischen Nieren der WT1-, WT2-, uPA-/- und uPAR-/- Gruppen anzufärben (Abb. 3.1.3). Dabei zeigte sich, dass in den WT- und uPA-/- Gruppen 24h nach dem ischämischen Ereignis vermehrt TUNEL-positive Zellen vorhanden waren, die Zahl der toten Zellen in den Nierenpräparaten der uPAR-/- Nieren, im Vergleich zur WT2- Gruppe, war jedoch signifikant niedriger (Abb. 3.1.3). Dies ließ die Schlussfolgerung zu, dass uPAR, unabhängig von uPA, den hypoxisch induzierten Zelluntergang beeinflusste.
Abb. 3.1.3 zeigt die TUNEL-Färbung 24h nach IR-Schaden.
A) zeigt keine TUNEL-positiven Zellen im Nierengewebe von laparotomierten, jedoch nicht geklippten Tieren (Negativkontrolle).
B) zeigt den Zelluntergang in den Nieren der WT-Kontrolltiere (da die Ergebnisse der WT1- und WT2-Gruppen fast identisch waren, sind nur Abbildungen der WT2-Gruppe gezeigt) und C) zeigt die TUNEL-positiven Zellen von uPA-/- Nierenpräparaten. In beiden Fällen sind zahlreiche apoptotische Zellen, größtenteils im tubulären Epithel, zu erkennen.
D) zeigt die TUNEL-positiven Zellen von einem Nierenschnitt der uPAR-/- Gruppe. Es waren fast keine TUNEL-positiven Zellen zu sehen (je Gruppe wurden 7 Tiere untersucht, Vergrößerung x200).
A B
C D
0 10 20 30 40
uPA uPAR
TUNEL pos. Zellen/Gesich
WT knock out
E
E) zeigt die Quantifizierung der TUNEL-positiven Zellen pro Gesichtsfeld 24h nach IR-Schaden. 10 Gesichtsfelder wurden je Niere analysiert. Die Ergebnisse sind als MW ± SEM dargestellt. Die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen pro Gesichtsfeld waren bei beiden WT-Kontrollgruppen und den uPA-/- Nieren ähnlich hoch. In der Gruppe der uPAR-/- Tiere waren fast keine TUNEL-positiven Zellen zu sehen. Dies legte die Vermutung nahe, dass uPAR-Defizienz zu einem Schutz vor der ischämisch-induzierten Apoptose führt.
3.2 uPA/uPAR bei allogener Nierentransplantation
Das akute Nierenversagen hat auch einen erheblichen Einfluss auf die
Transplantationsmedizin. Die Dauer der kalten Ischämie ist ein wichtiger Prädiktor für die verzögerte Funktionsaufnahme des Nierentransplantates, das Ausmaß des
akuten Nierenversagens nach Transplantation und die akute Transplantatabstoßung.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte daher weiterführend auch die Rolle des
uPA/uPAR-Systems bei der akuten allogenen Nierentransplantationsabstoßung im Mausmodell untersucht werden.
3.2.1 Renale uPA/uPAR-Expression nach allogener Nierentransplantation
Die niederländische Arbeitsgruppe Roelofs et al. hat in einer Biopsiestudie bei humanen allogenen Nierentransplantationen mit akuter Abstoßungsreaktion eine Aktivierung des uPA/uPAR-Systems nachgewiesen (Roelofs, J. J. et al. 2003). Im ersten Schritt wurde nun überprüft, ob auch im Mausmodell bei allogener Nierentransplantation und akuter Abstoßungsreaktion eine Aktivierung des uPA/uPAR-Systems erfolgt. Hierfür wurde die mRNA-Expression in normalen WT2- Nieren (Kontrolle) und in WT2-Nierentransplantaten zu den Zeitpunkten 4h und 24h nach NTx gemessen. Es fand sich eine starke Erhöhung von uPA- und uPAR-mRNA vier Stunden nach NTx und eine weitere Erhöhung der Expression 24 Stunden nach NTx (Abb. 3.2.1.1) in den WT-Transplantaten.
Abb. 3.2.1.1 zeigt ein Diagramm der uPA/uPAR-mRNA-Expression bei akuter allogener Nierentransplantatabstoßung nach 0h, 4h und 24h. Die quantitative Bestimmung erfolgte mittels qPCR (* p<0,05/ **p<0,005 vs. Kontrolle, je 6 Mäuse pro Gruppe wurden untersucht).
A) Die uPA-mRNA-Expression war vier Stunden nach der allogenen Nierentransplantation, im Vergleich zur normalen Kontrolle, deutlich erhöht. Im weiteren Verlauf kam es nach 24h zu einer weiteren Erhöhung der uPA- Expression.
B) Auch die uPAR-mRNA-Expression war in den Transplantatgeweben vier Stunden nach der allogenen NTx bei den WT-Nieren deutlich erhöht. Nach 24 Stunden stieg auch die uPAR-mRNA-Expression weiter an.
Zur weiteren Bestätigung der Ergebnisse wurde eine immunhistochemische Färbung mit uPAR-spezifischen Antikörpern von normalen nicht operierten WT2-Nieren und den allogenen WT2-Transplantaten mit akuter Abstoßung angefertigt. Dabei wurden Gewebe zu den Zeitpunkten 24 Stunden und 6 Tage nach der NTx untersucht (Abb.
0 1 2 3
Kontrolle 4h d1
rel. uPA/b-Aktin mRNArel. uPAR/b-AKtin mRNA
A
B
0 1 2 3
Kontrolle 4h d1
uPA
uPAR
**
**
**
*
3.2.1.2). In den normalen Nieren lag eine geringe basale uPAR-Expression in den Glomerula und in den Tubuli des S3 Segmentes (OSOM) vor.
Im Rahmen der akuten Abstoßung bei allogenen WT2-Transplantaten nahm die uPAR-Expression sowohl in den Glomeruli als auch in den Tubuli deutlich zu. Am d6 erfolgte eine weitere deutliche Steigerung der uPAR Expression im Kortex und im OSOM (Abb. 3.2.1.2).
Zusammenfassend konnte sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebene eine deutliche Zunahme der uPA- und uPAR-Expression im Rahmen der akuten allogenen Nierentransplantatabstoßung nachgewiesen werden.
Abb. 3.2.1.2 zeigt die immunhistochemische Färbung von uPAR im Gewebe von normalen Nieren und rejezierenden Nieren am d1 und d6 nach allogener NTx in 200facher Vergrößerung. Oben dargestellt sind repräsentative Ausschnitte aus dem Kortex mit den Glomeruli, unten sind die Tubuli aus dem OSOM gezeigt.
A) Sowohl im Kortex als auch im OSOM war im gesunden Nierengewebe der WT2-Gruppe nur eine marginale basale uPAR-Expression nachweisbar.
B) Einen Tag (d1) nach allogener NTx war eine uPAR-Expression in den Glomerlula und in den Tubuli des S3-Segmentes nachweisbar.
C) 6 Tage (d6) nach NTx zeigte sich eine weitere Intensivierung der Signale, also eine noch stärkere Expression von uPAR in den allogenen Nierentransplantaten. Im Kortex war die Expression von uPAR nun nicht mehr nur noch auf die Glomerula begrenzt, sondern auch auf die umliegenden Tubuli erweitert.
Kortex
OSOM
Vor NTx d1 d6
A
A
B
B
C
C
3.2.2 Überleben nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und uPAR-Defizienz
Als nächstes wurde die Fragestellung untersucht, ob uPA- oder uPAR-Defizienz des Transplantates eine Auswirkung auf das Überleben der Mäuse nach allogener Nierentransplantation hatte. Hierfür wurden verschiedene allogene Nierentransplantationen durchgeführt. So dienten die uPA-, uPAR-defizienten Tiere (H2b) und ihre korrespondieren Wildtyp-Kontrolltiere (WT1 und WT2) als Nierenspender und Balb/C Mäuse (H2d) jeweils als Empfänger. Nach der Nierentransplantation erfolgte keine immunsuppressive Behandlung, und es wurde beobachtet, wie lange die Tiere überlebten. In der Gruppe der uPA-defizienten Tiere, der WT1- und der WT2-Gruppe verstarb der größte Teil der Tiere kurz nach der Nierentransplantation aufgrund der akuten Nierentransplantatabstoßung. Nach spätestens 8 Wochen waren alle Tiere aus diesen Gruppen verstorben (Abb. 3.2.2).
Eine wesentlich längere Überlebensrate konnte jedoch in der Gruppe der uPAR- defizienten Nierentransplantatempfänger, im Gegensatz zu ihrer WT2- Kontrollgruppe, beobachtet werden. Innerhalb der ersten 6 Tage kam es zu einer ca.
25%igen Mortalität bei den uPAR-defizienten Nierentransplantatempfängern, danach aber überlebten ca. 75% der Tiere den gesamten weiteren Beobachtungszeitraum von 20 Wochen nach der Organtransplantation, ohne jegliche immunsuppressive Therapie.
uPAR-Defizienz des Nierentransplantates verbesserte das Überleben der Empfänger nach allogener Nierentransplantation erheblich.
Abb. 3.2.2 zeigt die Überlebensrate von Mäusen, welche uPA- und uPAR- defiziente Transplantate erhielten, verglichen mit Tieren, die ein WT- Transplantat erhielten, in Prozent.
In diesem Diagramm ist das verbesserte Überleben der Tiere mit uPAR-/- Transplantaten gegenüber ihrer WT2-Kontrollgruppe zu sehen. Nach 20 Wochen (w20) waren noch ca. 75% der Tiere am Leben. Keinen Unterschied zur WT2- Kontrollgruppe fand sich in der Gruppe der Tiere mit den uPA-/- Transplantaten.
Hier lief die Überlebenskurve ähnlich wie die der WT-Kontrollgruppe, nach spätestens 8 Wochen (w8) waren alle Tiere dieser Gruppe verstorben. Das Überleben der Empfänger von WT1- und WT2-Organen war identisch.
3.2.3 Nierenfunktion nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und uPAR-Defizienz
Neben der Überlebenszeit des Empfängertieres wurde nun auch die Nierenfunktion überprüft. Um zu gewährleisten, dass ausschließlich die Folgen der Abstoßung des Transplantates die Kreatininwerte im Blut veränderten, wurden den Empfängertieren beide Eigennieren entnommen und anschließend das Transplantat eingesetzt. Es wurde wieder dieselbe Konstellation der Gruppen wie zur Bestimmung der Überlebenszeit (s. 3.2.2) verwendet. Um den S-Kreatininwert zu bestimmen, wurde
uPA-/-
Überlebensrate [%]
Zeit nach Nierentransplantation
w4 w8 w12 w16 w20
WT
uPAR-/-
0 2 5 7 10
d0 d2 d4 d6 d8 d10 d12 d14
Woche Tag
den Tieren vor der Operation (d0), einen Tag nach der Transplantation (d1) und sechs Tage nach der Transplantation (d6) Blut entnommen.
Vor der Operation zeigten alle Gruppen normale S-Kreatininwerte. Einen Tag nach der Transplantation konnte in allen Gruppen ein leichter Anstieg des S-Kreatinins gemessen werden (Abb. 3.2.3). Es zeigte sich aber bereits zu diesem Zeitpunkt ein wesentlich niedrigerer Kreatininanstieg bei den uPAR-/- Transplantatempfängern im Vergleich zu der korrespondierenden Kontrollgruppe (WT2). Im Gegensatz dazu waren die Kreatininwerte der Empfänger von uPA-/- Transplantaten ähnlich hoch wie die der WT1-Kontrollgruppe.
Sechs Tage nach der Operation konnte in der Gruppe der Tiere mit den uPAR-/- Transplantaten kein wesentlicher Anstieg des Kreatinins gemessen werden. Die Nierenfunktion war gut. In der Kontrollgruppe WT2 stieg der Kreatininwert jedoch stark an, was Ausdruck der schweren Nierenfunktionsstörung im Rahmen der Nierentransplantatabstoßung war. Auch bei den uPA-/- Transplantaten und der WT1- Gruppe war eine schwere Nierenfunktionsstörung in Form von sehr hohen Kreatininwerten erkennbar (Abb. 3.2.3).
Wie bereits unter 3.2.2 beschrieben, waren nach 8 Wochen alle Empfänger mit uPA- defizienten und WT-Transplantatnieren verstorben. Daher war der Kreatininwert ab diesem Zeitpunkt nur noch bei den Tieren der uPAR-/- Transplantatempfängern messbar. Diese wiesen bis 20 Wochen nach der Transplantation stabil niedrige S- Kreatininwerte ohne wesentliche Nierenfunktionsstörung auf.
Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass uPAR, nicht jedoch uPA, in der Transplantatniere im allogenen Nierentransplantationsmodell zu einem schweren Nierenfunktionsverlust mit akuter Transplantatabstoßungsreaktion führte.
Abb. 3.2.3 zeigt die Nierenfunktion durch Messung der S-Kreatininwerte von Tieren mit uPA-/- und uPAR-/- Transplantaten zu verschiedenen Zeitpunkten nach allogener Nierentransplantation im Vergleich zur WT-Kontrollgruppe.
Dieses Diagramm zeigt den S-Kreatininanstieg nach allogener Nierentransplantation von uPA-/- Nierentransplantatempfängern und ihrer Kontrollgruppe WT1. Vor der Operation waren die gemessenen Kreatininwerte der Empfängertiere normwertig niedrig. Bereits nach einem Tag (d1) zeigte sich ein schwerer Verlust der Nierenfunktion mit einem, vor allem in der uPA-/- Gruppe, um das 5-fache der Norm erhöhtem Kreatininwert. Dieser blieb auch nach 6 Tagen (d6) konstant hoch. Der Kreatininwert der Empfängertiere der WT1-Kontrollgruppe war nach einem Tag auch stark erhöht und wies nach 6 Tagen ebenfalls auf einen schweren Nierenfunktionsverlust mit massiv erhöhtem Kreatininwert hin.
Weiterhin werden in diesem Diagramm die S-Kreatininwerte von Tieren mit uPAR-/- Transplantaten nach allogener Nierentransplantation und ihrer Kontrollgruppe WT2 dargestellt. Auch hier waren vor der Operation die Kreatininwerte normwertig. Nach einem Tag (d1) zeigte sich bei der uPAR-/- Gruppe ein moderater Anstieg des S-Kreatinins um das 2-fache der Norm.
Aber auch nach 6 Tagen (d6) hielt sich der S-Kreatininwert auf diesem stabilen Level. Die WT2-Kontrollgruppe hingegen zeigte nach einem Tag bereits einen deutlichen Anstieg der Kreatininwerte und einen weiteren massiven Anstieg nach 6 Tagen, als Ausdruck der schweren
0 50 100 150 200 250
d0 d1 d6 w8 w12 w16 w20
WT uPA-/-
S-Kreatinin [µmol/l]
*** ***
uPAR-/-
Zeit nach Transplantation
Nierenfunktionsstörung. Auch nach 20 Wochen zeigte sich eine stabil niedrige Nierenfunktion in den Empfängertieren der uPAR-/- Transplantatnieren.
3.2.4 Histologie nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und uPAR-Defizienz
Nachdem festgestellt wurde, dass uPAR-defiziente Transplantate deutlich besseres Überleben gegenüber ihrer Kontrollgruppe und auch den uPA-defizienten Transplantaten haben, wurden die histologischen Veränderungen in den Geweben der allogenen Nierentransplantate von den uPA-/-, uPAR-/-, WT1- und WT2-Gruppen zu den Zeitpunkten einen (d1) und sechs (d6) Tage nach der allogenen Transplantation untersucht (Abb. 3.2.4).
Vierundzwanzig Stunden nach der Operation zeigte sich im Gewebe der uPA-/- Nieren (B) und allen WT-Kontrollen (A) eine akute Tubulusnekrose (ATN), mit Verlust des Bürstensaumes, Zelldetritus im Tubuluslumen und Untergang der Tubuluszellen.
Bei der Gruppe der uPAR-/- Transplantate hingegen fanden sich keine Zeichen einer ATN (C).
Sechs Tage nach der Transplantation konnte in allen Gruppen (WT1, WT2, uPA-/-, uPAR-/-) eine starke interstitielle Infiltration mit Entzündungszellen und Zeichen einer Tubulitis gefunden werden (Banff borderline und Banff 1A Rejektion). Die akute Tubulusnekrose konnte in den WT1- und WT2-Kontrollgruppen und der uPA-/- Gruppe nach wie vor festgestellt werden, wohingegen die Tubuli der uPAR-/- Gruppe keine Zeichen einer akuten Nekrose zeigten (D, E, F).
Da uPA-Defizienz weder im Modell des IR-Schadens noch im Modell der allogenen Nierentransplantation protektive Effekte aufwies, wurden in den folgenden Experimenten nur noch Mäuse mit uPAR-Defizienz und Tiere ihrer korrespondierende WT2-Kontrollgruppe verwendet.
Abb. 3.2.4 zeigt die Nierenmorphologie anhand einer PAS-Färbung von WT-, uPA- und uPAR-defizienten Transplantaten in 200facher Vergrößerung (je 6 Mäuse wurden pro Gruppe untersucht).
A) zeigt einen repräsentativen Schnitt eines Transplantates der WT2-Gruppe mit stark ausgeprägtem akuten Tubulusschaden.
B) zeigt die Histologie eines uPA-/- Transplantates 24 Stunden nach der allogenen Transplantation. Beide Abbildungen (A und B) zeigen Zeichen einer akuten Tubulusnekrose, mit Verlust des Bürstensaumes, Zelldetritus im Tubuluslumen und Untergang von Tubuluszellen.
C) zeigt einen Schnitt eines uPAR-/- Transplantates, 24 Stunden nach allogener Transplantation. Die Tubulusstruktur, ebenso der Bürstensaum, waren erhalten. Es waren keine Zeichen einer ATN zu erkennen.
D) zeigt die Histologie der WT-Gruppe und E) den Schnitt der uPA-/- Gruppe 6 Tage nach der Operation. Hier war die deutliche Infiltration mit Entzündungszellen zu erkennen. Die ATN war weiterhin zu sehen, ebenso eine Tubulitis (Banff borderline und Banff 1A Rejektion)
F) zeigt einen Schnitt der uPAR-/- Gruppe nach 6 Tagen. Hier war ebenfalls, wie auch in D) und E), eine deutliche Infiltration mit inflammatorischen Zellen und eine Tubulitis zu sehen. Eine ATN jedoch war auch nach 6 Tagen in dieser Gruppe nicht nachzuweisen.
WT uPA-/- uPAR-/-
A B C
D E F
d 6
24h
3.2.5 Apoptose nach allogener Nierentransplantation bei uPAR- Defizienz
Das pathophysiologische Korrelat zur akuten Tubulusnekrose ist die hypoxisch induzierte Apoptose. Zur Detektierung des Zelltodes wurde die TUNEL-Methode bei der uPAR-/- Gruppe und ihrer Kontrollgruppe 4 Stunden, 24 Stunden und 6 Tage nach der Transplantation durchgeführt (Abb. 3.2.5). In der WT2-Gruppe wurden im gesamten Schnitt bereits nach vier Stunden TUNEL-positive Zellen nachgewiesen (A). 24 Stunden nach der Transplantation erfolgte eine weitere deutliche Steigerung der Anzahl an TUNEL-positiven Zellen (C). Im Gegensatz dazu fanden sich bei der Gruppe der uPAR-/- Nierentransplantate vier und 24 Stunden nach Transplantation kaum TUNEL-positive Zellen (B und D).
Sechs Tage nach der Operation fanden sich in der WT-Gruppe noch mehr positive Signale als zu den Zeitpunkten 4 und 24 Stunden (E). Zwar wurden in der uPAR-/- Gruppe nach sechs Tagen eine leicht erhöhte Anzahl von TUNEL-positiven Zellen gefunden, diese war jedoch wesentlich niedriger als in der WT2-Kontrollgruppe zu diesem Zeitpunkt (F).
Um zu differenzieren, ob die TUNEL-positiven Zellen in den Schnitten der WT- und uPAR-/- Gruppen durch den programmierten Zelltod (Apoptose) oder durch Nekrose untergegangen sind, wurde eine immunhistochemische Anfärbung der Gewebe mit einem Antikörper gegen aktivierte Caspase-3 angefertigt. Aktivierte Caspase-3 ist ein verlässlicher Marker für Apoptose.
Vor allem im S3-Segment (OSOM), dem Abschnitt, der am empfindlichsten auf Sauerstoffmangel reagiert, und in der Media der Blutgefäße konnte 24 Stunden nach der Transplantation aktivierte Caspase-3 in den Schnitten der WT2-Kontrollgruppe nachgewiesen werden (Daten hier nicht gezeigt). Sechs Tage nach der Transplantation konnte in diesen Bereichen aktivierte Caspase-3 noch deutlicher nachgewiesen werden (G). Im Vergleich dazu zeigte sich bei der Gruppe der uPAR-/- Transplantate eine wesentlich geringere Anzahl von positiven Signalen für aktivierte Caspase-3 nach sechs Tagen (H).
Diese Ergebnisse korrelierten sehr gut mit denjenigen bei IR-Schaden (3.1.3) und demonstrierten deutlich, dass die lokale uPAR-Expression für die ischämisch- induzierte Apoptose ausschlaggebend ist.
Abb. 3.2.5 zeigt die TUNEL-Färbung nach allogener NTx bei uPAR-/- und WT2- Kontrollgruppe nach 4h, 24h und d6 und die immunhistochemische Färbung von aktivierter Caspase-3 nach d6. Zur Quantifizierung der TUNEL-positiven Zellen wurden 10 Gesichtsfelder pro Niere (je 5 Mäuse pro Gruppe) ausgezählt.
Die gezeigten Daten sind als MW ± SEM dargestellt.
4h
d 6
WT uPAR-/-
G H
24h
d 6
A B
C D
E F
0 25 50 75 100
WT uPAR-/-
Zellen/ 10 GF
0 25 50 75 100
WT uPAR-/-
Zellen/ 10 GF
0 25 50 75 100 125
WT uPAR-/-
Zellen/ 10 GF
Caspase-3
A) Dargestellt sind repräsentative Schnitte der WT2-Gruppe 4h (A), 24h (C) und sechs Tage (E) nach Transplantation. Im zeitlichen Verlauf kam es zu einem deutlichen Anstieg der TUNEL-positiven Zellen.
B) Dargestellt sind repräsentative Schnitte der uPAR-/- Transplantate 4h (B), 24h (D) und sechs Tage (F) nach Transplantation. Die uPAR-defizienten Transplantate wiesen signifikant weniger TUNEL-positive Zellen auf als die WT-Transplantate.
G) zeigt eine immunhistochemische Färbung mit aktivierter Caspase-3 an einem WT-Transplantat (G) sechs Tage nach der Transplantation im Vergleich zu einem uPAR-/- Transplantat (H). Im WT-Transplantat waren stark vermehrte Signale von aktivierter Caspase-3 zu sehen. In der uPAR-defizienten Transplantatniere kam es zu einer deutlich geringeren Caspase-3 Aktivierung.
3.2.6 Freie Radikale nach allogener Nierentransplantation bei uPAR- Defizienz
Sauerstoffmangel im Gewebe führt zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (Sauerstoffradikalen, ROS). Diese schädigen das Gewebe, zum Beispiel über einen Signalweg in den Mitochondrien, welcher zur Apoptose führt. Die Bedeutung von ROS bei der Aktivierung dieses Signalweges ist bereits gut erforscht (Jonassen, J. A.
et al. 2003). Die bisherigen Ergebnisse zeigten in den uPAR-defizienten Nieren eine stark reduzierte Zahl von apoptotischen Zellen nach ischämischen Ereignissen im Rahmen des akuten Nierenversagens und der Nierentransplantatabstoßung. Es wurde nun also die Hypothese überprüft, ob diese erniedrigte Zahl an apoptotischen Zellen durch eine Downregulation der Produktion von ROS zustande kam.
Dafür wurde die DHE-Färbung auf Schnitten von Kontrollnieren und Transplantatnieren 4h und 24h nach der Transplantation durchgeführt.
Tatsächlich fand sich ein wesentlicher Unterschied zwischen der uPAR-/- Gruppe und ihrer WT2-Kontrollgruppe (Abb. 3.2.6). Vor der Transplantation zeigten beide Gruppen eine niedrige basale Expression von ROS (A und B). Bereits 4h und auch noch 24h nach der Transplantation zeigte die WT2-Gruppe aber eine massive Hochregulation von ROS (C und E). Demgegenüber war die Expression von ROS im Gewebe der uPAR-/- Transplantate deutlich vermindert (D und F). Dieser Effekt
wurde gleichermaßen im tubulären Interstitium (Abb.3.2.6.1), wie auch in den Glomeruli (Daten hier nicht gezeigt) beobachtet.
Diese Versuche zeigten, dass uPAR nach hypoxischen Ereignissen zur Generierung von ROS beiträgt und somit Apoptose induziert.
Abb. 3.2.6 zeigt eine DHE-Färbung von ROS in Transplantaten der WT2- Kontrollgruppe im Vergleich zu uPAR-defizienten Transplantaten zu den Zeitpunkten 0h, 4h und 24h nach Transplantation.
A) zeigt die DHE-Färbung in normalen WT-Nieren, B) zeigt die DHE-Färbung in uPAR-/- Nieren. Es waren keine Unterschiede zwischen den Nieren feststellbar, die basale ROS-Generierung im Gewebe war minimal.
4h Vor NTx
WT uPAR-/-
24h
A B
C D
E F
C) zeigt die DHE-Färbung der WT-Gruppe 4h, E) 24h nach der Transplantation.
Gezeigt sind deutliche Signale der ROS im tubulären Interstitium. Die ROS- Generierung stieg im Tubulointerstitium deutlich an.
D) zeigt die DHE-Färbung der uPAR-/- Gruppe nach 4h, und F) nach 24h nach der Transplantation. ROS-Generierung war zwar zu erkennen, jedoch war diese weitaus weniger deutlich als in der WT2-Kontrollgruppe zu diesen Zeitpunkten.
3.2.7 Inflammatorische Zellinfiltrate nach allogener Nierentransplantation bei uPAR-Defizienz
Die Infiltration des Transplantates mit Empfängerleukozyten ist ein Kennzeichen der Transplantatabstoßung (El-Sawy, T. et al. 2005;Tinckam, K. J. et al. 2005). Um die Zusammensetzung der infiltrierenden Zellen zu analysieren, wurden immunhistochemische Färbungen auf verschieden Leukozytensubpopulationen angefertigt. Zuerst wurden die Nierenpräparate der WT2-Gruppe und der uPAR-/- Gruppe mit Antikörpern gegen neutrophile Granulozyten (Gr-1) und anschließend gegen Monozyten und Makrophagen (F4/80) angefärbt (Abb. 3.2.7.1). Hierbei fanden sich deutliche Unterschiede, was die Infiltration von WT2-Nieren und uPAR-/- Nierentransplantaten sechs Tage nach allogener Nierentransplantation betrifft. So zeigte sich eine erniedrigte Anzahl von infiltrierenden neutrophilen Granulozyten im tubulo-interstitiellen Bereich von uPAR-defizienten Transplantaten, im Vergleich zu der WT2-Kontrollgruppe (B). Die akute Transplantatabstoßung wird weiterhin auch durch Monozyten und Makrophagen gesteuert. Ihre Anzahl war, im Gegensatz zur WT2-Gruppe, bei der uPAR-/- Gruppe im tubulo-interstitiellen Bereich deutlich reduziert (D).
Abb. 3.2.7.1 zeigt die Einwanderung von neutrophilen Granulozyten (Gr-1) und Monozyten/Makrophagen (F4/80) 6 Tage nach allogener NTx.
A) zeigt die immunhistochemische Färbung von neutrophilen Granulozyten in WT2-Transplantaten. Es imponierten vor allem peritubulär eingewanderte Granulozyten.
B) zeigt die immunhistochemische Färbung von neutrophilen Granulozyten in uPAR-/- Transplantaten. Im Tubulointerstitium zeigten sich weniger infiltrierte Granulozyten als in den WT2-Transplantaten.
C) zeigt die immunhistochemische Färbung von Monozyten und Makrophagen in einem WT2-Nierentransplantat. Im Tubulointerstitium war eine Vielzahl von dichten Ansammlungen dieser infiltrierenden Zellen zu sehen.
D) zeigt die immunhistochemische Färbung von Monozyten und Makrophagen in einem uPAR-/- Transplantat. uPAR-Defizienz führte zu einer wesentlich geringeren Infiltration mit Monozyten und Makrophagen.
Zur weiteren Differenzierung der inflammatorischen Zellen erfolgten weitere Untersuchungen. Es wurden Färbungen mit T-Lymphozyten CD4- und CD8-
WT uPAR-/-
F4/80 pos.
Zellen
A B
C D
GR-1 pos.
Zellen
spezifischen Antikörpern und Antikörpern gegen dendritische Zellen (CD11c) durchgeführt. Hierbei fanden sich jedoch keinerlei Unterschiede zwischen den WT2- und uPAR-/- Transplantaten (Daten hier nicht gezeigt).
Dieses Ergebnis unterstrich die Rolle von lokal in der Niere produziertem uPAR bei der Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in das Nierengewebe.
Die Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in entzündetes Nierengewebe ist unter anderem von der Produktion von lokalen proinflammatorischen Zytokinen abhängig. Solche chemoattraktiven Botenstoffe sind zum Beispiel MIP-2 (Macrophage inflammatory protein-2) und MCP-1 (Macrophage chemoattractand protein-1) (Wenzel, U. et al. 1997). Um zu überprüfen, ob die verminderte Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in die Transplantate der uPAR-/- Gruppe aus einer verminderten Produktion dieser Chemokine stammt, wurde die mRNA-Expression von MIP-2 und MCP-1 in uPAR-defizienten Transplantaten gemessen und mit der Expression in der WT2-Kontrollgruppe verglichen. Wie erwartet war die Produktion dieser proinflammatorischen Chemokine in der WT2-Kontrollgruppe stark hoch reguliert.
Doch überraschenderweise fanden sich in der uPAR-/- Gruppe ähnlich hohe Werte der lokalen MIP-2 und MCP-1 Produktion wie in der WT2-Gruppe (Abb. 3.2.7.2). Die Produktion von MIP-2 (A) erreichte nach 24h ein Maximum und fiel im Verlauf wieder ab. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den WT2- und uPAR-/- Transplantaten. Die Expression von MCP-1 (B) war in beiden Gruppen nach 24h leicht und nach 6 Tagen deutlich erhöht. Erstaunlicherweise waren die Werte in den uPAR-/- Transplantaten sogar signifikant höher als in den WT2-Transplantaten.
Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass die gestörte Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in uPAR-defiziente Nierentransplantate nicht über einen Unterschied der exprimierten Menge der chemoattraktiven Botenstoffe MIP-2 und MCP-1 vermittelt wird.
Abb. 3.2.7.2 zeigt die mRNA-Expression von MIP-2- und MCP-1-mRNA nach allogener NTx in uPAR-/- und WT2-Transplantaten.
A) zeigt die Expression von MIP-2 vor NTx, 24 Stunden und 6 Tage nach NTx.
Die maximale Expression fand 24 Stunden nach der Transplantation statt. Es lag kein signifikanter Unterschied zwischen den WT2-Transplantaten und den uPAR-/- Transplantaten vor.
B) zeigt die Expression von MCP-1 vor NTx, 24 Stunden und 6 Tagen nach NTx.
Es fand sich ein Maximum in beiden Gruppen nach 6 Tagen. Die MCP-1 Expression war in der uPAR-/- Gruppe sogar noch höher als in der WT2- Kontrollgruppe.
B
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03
Kontrolle 24h d6
WT uPAR-/-
rel. MCP-1/b-Aktin mRNA Expression
**
**
A
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 0,045
Kontrolle 24h d6
WT uPAR-/-
rel. MIP-2/b-Aktin mRNA Expression
