Inflammatorische Zellinfiltrate nach allogener Nierentransplantation bei uPAR-Defizienz

Die Infiltration des Transplantates mit Empfängerleukozyten ist ein Kennzeichen der Transplantatabstoßung (El-Sawy, T. et al. 2005;Tinckam, K. J. et al. 2005). Um die Zusammensetzung der infiltrierenden Zellen zu analysieren, wurden immunhistochemische Färbungen auf verschieden Leukozytensubpopulationen angefertigt. Zuerst wurden die Nierenpräparate der WT2-Gruppe und der uPAR-/- Gruppe mit Antikörpern gegen neutrophile Granulozyten (Gr-1) und anschließend gegen Monozyten und Makrophagen (F4/80) angefärbt (Abb. 3.2.7.1). Hierbei fanden sich deutliche Unterschiede, was die Infiltration von WT2-Nieren und uPAR-/- Nierentransplantaten sechs Tage nach allogener Nierentransplantation betrifft. So zeigte sich eine erniedrigte Anzahl von infiltrierenden neutrophilen Granulozyten im tubulo-interstitiellen Bereich von uPAR-defizienten Transplantaten, im Vergleich zu der WT2-Kontrollgruppe (B). Die akute Transplantatabstoßung wird weiterhin auch durch Monozyten und Makrophagen gesteuert. Ihre Anzahl war, im Gegensatz zur WT2-Gruppe, bei der uPAR-/- Gruppe im tubulo-interstitiellen Bereich deutlich reduziert (D).

Abb. 3.2.7.1 zeigt die Einwanderung von neutrophilen Granulozyten (Gr-1) und Monozyten/Makrophagen (F4/80) 6 Tage nach allogener NTx.

A) zeigt die immunhistochemische Färbung von neutrophilen Granulozyten in WT2-Transplantaten. Es imponierten vor allem peritubulär eingewanderte Granulozyten.

B) zeigt die immunhistochemische Färbung von neutrophilen Granulozyten in uPAR-/- Transplantaten. Im Tubulointerstitium zeigten sich weniger infiltrierte Granulozyten als in den WT2-Transplantaten.

C) zeigt die immunhistochemische Färbung von Monozyten und Makrophagen in einem WT2-Nierentransplantat. Im Tubulointerstitium war eine Vielzahl von dichten Ansammlungen dieser infiltrierenden Zellen zu sehen.

D) zeigt die immunhistochemische Färbung von Monozyten und Makrophagen in einem uPAR-/- Transplantat. uPAR-Defizienz führte zu einer wesentlich geringeren Infiltration mit Monozyten und Makrophagen.

Zur weiteren Differenzierung der inflammatorischen Zellen erfolgten weitere Untersuchungen. Es wurden Färbungen mit T-Lymphozyten CD4- und

CD8-WT uPAR-/-

F4/80 pos.

Zellen

A B

C D

GR-1 pos.

Zellen

spezifischen Antikörpern und Antikörpern gegen dendritische Zellen (CD11c) durchgeführt. Hierbei fanden sich jedoch keinerlei Unterschiede zwischen den WT2- und uPAR-/- Transplantaten (Daten hier nicht gezeigt).

Dieses Ergebnis unterstrich die Rolle von lokal in der Niere produziertem uPAR bei der Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in das Nierengewebe.

Die Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in entzündetes Nierengewebe ist unter anderem von der Produktion von lokalen proinflammatorischen Zytokinen abhängig. Solche chemoattraktiven Botenstoffe sind zum Beispiel MIP-2 (Macrophage inflammatory protein-2) und MCP-1 (Macrophage chemoattractand protein-1) (Wenzel, U. et al. 1997). Um zu überprüfen, ob die verminderte Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in die Transplantate der uPAR-/- Gruppe aus einer verminderten Produktion dieser Chemokine stammt, wurde die mRNA-Expression von MIP-2 und MCP-1 in uPAR-defizienten Transplantaten gemessen und mit der Expression in der WT2-Kontrollgruppe verglichen. Wie erwartet war die Produktion dieser proinflammatorischen Chemokine in der WT2-Kontrollgruppe stark hoch reguliert.

Doch überraschenderweise fanden sich in der uPAR-/- Gruppe ähnlich hohe Werte der lokalen MIP-2 und MCP-1 Produktion wie in der WT2-Gruppe (Abb. 3.2.7.2). Die Produktion von MIP-2 (A) erreichte nach 24h ein Maximum und fiel im Verlauf wieder ab. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den WT2- und uPAR-/- Transplantaten. Die Expression von MCP-1 (B) war in beiden Gruppen nach 24h leicht und nach 6 Tagen deutlich erhöht. Erstaunlicherweise waren die Werte in den uPAR-/- Transplantaten sogar signifikant höher als in den WT2-Transplantaten.

Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass die gestörte Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in uPAR-defiziente Nierentransplantate nicht über einen Unterschied der exprimierten Menge der chemoattraktiven Botenstoffe MIP-2 und MCP-1 vermittelt wird.

Abb. 3.2.7.2 zeigt die mRNA-Expression von MIP-2- und MCP-1-mRNA nach allogener NTx in uPAR-/- und WT2-Transplantaten.

A) zeigt die Expression von MIP-2 vor NTx, 24 Stunden und 6 Tage nach NTx.

Die maximale Expression fand 24 Stunden nach der Transplantation statt. Es lag kein signifikanter Unterschied zwischen den WT2-Transplantaten und den uPAR-/- Transplantaten vor.

B) zeigt die Expression von MCP-1 vor NTx, 24 Stunden und 6 Tagen nach NTx.

Es fand sich ein Maximum in beiden Gruppen nach 6 Tagen. Die MCP-1 Expression war in der uPAR-/- Gruppe sogar noch höher als in der WT2-Kontrollgruppe.

uPAR-/-rel. MCP-1/b-Aktin mRNA Expression

**

uPAR-/-rel. MIP-2/b-Aktin mRNA Expression

Neben den Chemokinen spielt die Interaktion von Adhäsionsmolekülen auf aktivierten Endothelzellen und den Leukozyten im Intravasalraum eine wichtige Rolle bei der Einwanderung von Entzündungszellen. Um zu überprüfen, ob in diesem Schritt der Leukozyteneinwanderung ein Unterschied zwischen uPAR-/- Transplantaten und ihrer WT2-Kontrollgruppe bestand, wurde die Expression von Adhäsionsmolekülen gemessen. In der qPCR wurde in den beiden Gruppen die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin gemessen. Dabei fand sich kein Unterschied zwischen den Gruppen (Daten hier nicht dargestellt). Ein weiteres wichtiges Adhäsionsmolekül ist ICAM-1 (intracellular-adhesions-molecule-1). Die Expression von ICAM-1 wurde immunhistochemisch untersucht. Im Gegensatz zu E-Selektin fand sich bei der Expression von ICAM-1 bei der Gruppe der uPAR-defizienten Transplantate eine signifikant niedrigere Hochregulation nach NTx, verglichen mit der WT2-Kontrollgruppe (Abb. 3.2.7.3). Die basale Expression von ICAM-1 war in beiden Gruppen ähnlich.

Diese Ergebnisse sprachen dafür, dass die verminderte Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in uPAR-defiziente Transplantate durch eine verminderte Hochregulation von ICAM-1 verursacht sein könnte.

Abb. 3.2.7.3 zeigt die Expression von ICAM-1 nach allogener NTx in uPAR-/- und WT2-Transplantaten 24h nach Transplantation.

A) zeigt die ICAM-1 Expression in einer WT2-Niere, B) in einem uPAR-/- Transplantat vor der Transplantation. Es war eine geringe basale Expression von ICAM-1 in WT2- und uPAR-/- Nieren zu erkennen.

C) zeigt die immunhistochemische Färbung von einem WT2-Transplantat 24h nach allogener NTx. In den Glomeruli war eine starke Hochregulation von ICAM-1 zu sehen.

D) zeigt die immunhistochemische Färbung eines uPAR-/- Transplantates 24h nach allogener NTx. In den Glomeruli der uPAR-defizienten Nieren fand keine Hochregulation von ICAM-1 statt.

Vor NTx

WT uPAR-/-

24h

A B

C D

4 Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass renal exprimiertem uPAR eine bedeutende Rolle für die Pathogenese der hypoxie-induzierten akuten Abstoßungsreaktion nach allogener Nierentransplantation und des IR-Schadens zukommt. Die Expression von uPA spielte hierfür eine untergeordnete Rolle. Die uPAR-Defizienz des Transplantates führte zu einer deutlich verminderten Generierung von ROS und einer verminderten Apoptose nach allogener Nierentransplantation. Aus der Resistenz des uPAR-/- Transplantates gegenüber oxidativem Stress und hypoxie-induzierter Apoptose resultierte eine bessere Transplantatfunktion und ein deutlich verlängertes Transplantatüberleben. Weiterhin zeigte sich in den Blutgefäßen von uPAR-/- Nierentransplantaten eine inadäquat niedrige Expression von Adhäsionsmolekülen und nachfolgend eine verringerte Infiltration mit neutrophile Granulozyten, aber auch eine reduzierte Anzahl von infiltrierenden Monozyten und Makrophagen. Diese Versuche belegen eine wichtige kausale Rolle des renalen uPAR-Systems bei der Ausbildung des akuten Nierenversagens im Rahmen des IR-Schadens und der akuten Nierentransplantatabstoßung.