Untersuchungen zur molekulargenetischen Rassendifferenzierung bei Canis familiaris

Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

dem Tierärztlichen Institut der Georg-August-Universität Göttingen

Untersuchungen zur

molekulargenetischen Rassendifferenzierung bei Canis familiaris

I N AU G U R AL-D ISSE RT AT IO N zurErlangung des Grades einer Do kto rin der Vet er inär med iz in

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche HochschuleHannover

Vorgelegt von Inger Völkel

ausHeilbronn

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Tosso Leeb

Prof. Dr. Dr. Bertram Brenig

1. Gutachter: Prof. Dr. Tosso Leeb

2. Gutachter: Prof. Dr. Bernd Schierwater

Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2005

M einer F a m ilie

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 11

2 Literaturübersicht 12

2.1 Der Rassebegriff 12

2.1.1 Hunderassen im Wandel der Zeiten 12

2.1.2 Modelle zur Systematik der Hunderassen 17

2.2 Molekulargenetische Grundlagen 19

2.2.1 Mikrosatelliten 19

2.2.2 Mitochondriale DNA 23

2.2.2.1 Die Grundstruktur der caninen mtDNA 23

2.2.2.2 Nomenklatur und Aufbau der d-loop 25

2.2.3 Populationsgenetik 26

2.3 Anwendungsbereiche für Mikrosatelliten und mtDNA 28

2.3.1 Abstammungskontrolle 28

2.3.2 Forensische Fragestellungen 30

2.3.3 Populationsgenetische Studien 32

2.3.3.1 Speziesabgrenzung und Phylogenie 32

2.3.3.2 Conservation genetics und Hybrid-Diagnostik 33

2.3.3.3 Rassendiskriminierung 35

2.3.3.4 „tracing back”- Erforschung der Matrilinien 36

3 Material und Methoden 38

3.1 Erhebung von Referenzdaten 38

3.1.1 Tiermaterial 38

3.1.1.1 Untersuchte Rassen 38

3.1.1.2 Stichprobenwahl 38

3.1.1.3 Probenentnahme 40

3.1.2 Molekulargenetische Methoden und Arbeitsprotokolle 40

3.1.2.1 DNA-Isolierung aus Blut 40

3.1.2.2 DNA-Isolierung aus Haaren 41

3.1.2.3 Photometrische DNA-Quantifizierung 42

3.1.2.4 Genotypisierung 43

3.1.2.4.1 Polymerase-Ketten-Reaktion 43

3.1.2.4.2 Kapillarelektrophorese 45

3.1.2.5 Sequenzierung der mtDNA 46

3.1.2.5.1 PCR-Ansatz 46

3.1.2.5.2 Automatische Sequenzierung 47

3.1.3 Mikrosatelliten-Analyse 48

3.1.3.1 Auswertung der Mikrosatelliten-Profile 48

3.1.3.2 Statistische Auswertungen 48

3.1.3.2.1 Genetische Diversität innerhalb der Rassen 48 3.1.3.2.2 Rassendivergenz und Populationsdifferenzierung 49

3.1.3.2.2.1 F-Statistik und G-Statistik 49

3.1.3.2.2.2 Private Allele und genetische Differenzierung 51 3.1.3.2.2.3 Genetische Distanzen und phylogenetische Bäume 51

3.1.3.2.2.4 Hauptfaktorenanalyse (PCA) 52

3.1.3.2.3 Assignmentverfahren 52

3.1.4 mtDNA-Sequenzierung 53

3.1.4.1 Datenauswertung und Alignment 53

3.1.4.2 Charakterisierung der Haplotypen 54

3.1.4.3 Relative Haplotypenhäufigkeit (xi) 54

3.2 Anwendungsbezogene Verfahren 54

3.2.1 Testhunde 54

3.2.2 Gruppierung der Testhunde in Proben-Pools 55

3.2.3 Genotypisierung und Haplotypenidentifizierung 56

3.2.4 Strategien zur Rassenidentifizierung 56

3.2.4.1 Reinrassige Hunde 56

3.2.4.2 Mischlinge 56

4 Ergebnisse 57

4.1 Basisdaten der Referenzpopulationen 57

4.1.1 DNA-Isolierung 57

4.1.2 Genotypisierung 57

4.1.3 Genetische Diversität 58

4.1.3.1 Anzahl der Allele 58

4.1.3.2 Allelfrequenzen 59

4.1.3.3 HO und HE 64

4.1.3.4 Ausschlusswahrscheinlichkeit PE 66

4.1.3.5 Polymorphism information content (PIC) 67

4.1.3.6 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWG) 69

4.1.4 Genetische Divergenz und Populationsdifferenzierung 70

4.1.4.1 F-Statistik 70

4.1.4.2 G-Statistik 71

4.1.4.3 Private Allele 72

4.1.4.4 Differenzierung auf Allel- und Genotypenbasis 74

4.1.4.5 Distanzmaße und phylogenetische Bäume 74

4.1.4.6 Hauptfaktorenanalyse 77

4.1.5 Rassenzuordnung („Breed assignment“) 80

4.1.5.1 GeneClass 80

4.1.5.2 Structure 84

4.1.6 mtDNA-Sequenzierung 87

4.1.6.1 Sequenzvariationen 87

4.1.7 Haplotypendiversität 88

4.2 Evaluierung der Testverfahren 91

4.2.1 Zuordnung reinrassiger Hunde 91

4.2.1.1 Analyse anhand von Allelfrequenzen und Genotypentabellen 91 4.2.1.2 Ausschlussverfahren in Kombination mit Structure 91

4.2.1.3 Auswertung der mtDNA-Haplotypen 92

4.2.1.4 Rassenzuordnungsversuche mittels GeneClass 94

4.2.1.5 Zuordnungserfolg bei Kombination der Verfahren 94 4.2.2 Untersuchung der Mischlinge „Nicki“ und „Sammy“ 95 4.2.2.1 Bestimmung der Hybridisierungsrichtung 95

4.2.2.2 Genetische Intermediärstellung 96

4.2.3 „Momo“ und „Baska“ – Hybride oder reinrassig? 96

5 Diskussion 98

5.1 Diversität 98

5.2 Divergenz 104

5.3 Assignment-Methoden 107

5.3.1 GeneClass 107

5.3.2 Structure 109

5.4 Bewertung der verwendeten Methoden 110

5.4.1 Manuelle Auswertung auf Mikrosatelliten-Basis 110

5.4.2 Nutzung des Programms Structure 113

5.4.3 mtDNA-Haplotypenermittlung 113

5.4.4 GeneClass – Direktmethode und Simulation 114

5.4.5 Kumulative Methodik 115

5.4.6 Hybrid-Klassifizierung 116

5.4.7 Bewertung und Ausblick 117

6 Zusammenfassung 119

7 Summary 121

8 Literaturverzeichnis 123

9 Anhang 135

9.1 Hunderassen 135

9.2 Tabellen 141

9.3 Verwendete Hilfs- und Arbeitsmittel 151

Abkürzungen

der verwendeten Hunderassen

AlM Alaskan Malamute BC Border Collie

Box Boxer

Dob Dobermann

DSh Deutscher Schäferhund GR Golden Retriever

Hov Hovawart

IRS Irish Red Setter LR Labrador Retriever Rht Rauhhaarteckel Row Rottweiler SHy Sibirian Husky

WHT West Highland White Terrier YT Yorkshire Terrier

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1 Einleitung

Als das am frühesten domestizierte Haustier wurde der Hund durch seine jahrtausendelange Bindung an den Menschen entscheidend nach dessen Bedürfnissen geformt. Die enorme Phä- notypenvielfalt von Canis familiaris impliziert ausgeprägte innerartliche Divergenz; dessen ungeachtet gestalteten sich bisherige Versuche, Rasseneinteilungen auf molekulargenetischer Grundlage vorzunehmen, problematisch. Eine Erklärung dafür liegt in den gemeinsamen Wurzeln vieler Rassen, historischem Genfluss sowie der relativ kurzen Zeitspanne geschlos- sener Genpools, aus denen sich unsere modernen Rassehunde entwickelt haben.

Die Entwicklung praxisrelevanter Verfahren zur Abgrenzbarkeit einzelner Hunderassen ge- geneinander („Breed assignment“) stellt die Grundlage der vorliegenden Arbeit dar. Die Si- cherheit, mit der sich ein Individuum seiner Ursprungspopulation (Ausgangsrasse) zuordnen lässt, erlaubt konkrete Aussagen über deren Grad an genetischer Differenziertheit. Eine Ras- senidentifizierung auf DNA-Basis eröffnet neue Strategien im Zuchtmanagement der Haus- und Nutztiere und dient der Erhaltung gefährdeter Rassen durch Ausschluss von Individuen gemischter Abstammung. Obwohl beim Hund zweifellos die Absicherung der „Reinrassig- keit“ im Mittelpunkt des Züchterinteresses stehen dürfte, bieten sich ebenfalls wertvolle Mög- lichkeiten für die Klärung forensischer Fragestellungen. Auch die eindeutige Klassifizierung verbotener und unerwünschter Mischlinge (Kampfhunde und Rennsport) rückt damit in greif- bare Nähe.

Eine Kombination polymorpher Mikrosatelliten mit modernen Cluster-Verfahren ermöglichte bereits in begrenztem Umfang eine grobe Einteilung in Rassengruppen sowie die Differenzie- rung einzelner Hunderassen. Vorausgehende Studien ließen die mtDNA für rasserelevante Fragestellungen ungeeignet erscheinen. Ihr statistischer Nutzen für die Rassenidentifikation wurde jedoch bisher keiner genauen Analyse unterzogen. Diese Arbeit soll die Frage klären, mit welchem Erfolg die Kombination verschiedener Methoden der Mikrosatellitenauswertung unter Einbeziehung mitochondrialer Datensätze eine Differenzierung zwischen 14 ausgewähl- ten Rassen sowie die Abgrenzung fremder Rassen erlaubt.

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2 Literaturübersicht

2.1 Der Rassebegriff

2.1.1 Hunderassen im Wandel der Zeiten

Kaum ein anderes domestiziertes Tier weist heute eine derartige Rassenvielfalt auf wie der Hund. Solange Hunde dem Menschen überwiegend als Nutztiere (Jagd-, Hütehunde) dienten, konnten Abweichungen vom Grundplan des „hetzjagenden Caniden“ nur insoweit toleriert werden, als Varianten von Skelett, Muskulatur, Haut, Haaren und Organen die geforderte Leistung nicht beeinträchtigen durften. Eine bereits zu Beginn der Rassen-Entstehung ange- legte, große genetische Variabilität führte später jedoch zu Veränderungen der Größe, Schä- delformen und Haarstrukturen in Dimensionen, die fast über die Grenzen einer Art hinausge- hen (RÄBER 1995;PENNISI 2002).

LINNÉ hatte bereits 1735 eine Definition der Art geliefert und damit jene Individuen zusam- mengefasst, die einander in der Mehrzahl ihrer morphologischen Eigenschaften ähneln.

CUVIER erweiterte 1829 den Artbegriff mit der Feststellung, eine Art sei eine natürliche Fort- pflanzungsgemeinschaft. Damit entstand im Gegensatz zum statischen der dynamische Art- begriff. Mit Beginn der modernen Hundezucht zu Anfang des 19. Jahrhunderts wurde die Ein- führung neuer Begriffe notwendig. In diesem Zusammenhang hatte KANT bereits 1775 er- kannt, dass eine Aufteilung von Arten in Unterarten¹ und Varietäten sinnvoll wäre.

Eine wichtige Voraussetzung für die Entstehung einer divergenten Hundepopulation stellte der Übergang der menschlichen Lebensweise vom Jäger- und Sammlertum der Nomaden zu einer sesshaften, agrokulturell geprägten Gesellschaft dar (neolithische Transition). Spätes- tens im Mesolithikum (10.000-4.000 v.Chr.) hatte der Mensch begonnen, Paarungen zwischen

„Hunden“ und Wölfen zu unterbinden (RÄBER 1995). Es ist zu vermuten, dass durch Bevor- zugung besonders zutraulicher Tiere eine erste primitive Zuchtauslese erfolgte. Die mit dem Sesshaftwerden des Menschen einhergehenden Veränderungen schufen ein erweitertes Auf- gabenfeld für den Hund und machten neue Methoden der selektiven Zuchtauslese erforder-

1 Beim Haustier werden Arten in Rassen unterteilt.

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lich. Diese brachten letztendlich Tiere hervor, deren Phänotyp erstmals sichtbar von dem des Wolfes abwich (VILA et al.1997).²

Es folgte die Entwicklung erster „Natur-“ bzw. „Landrassen“. Damit werden jene Hundetypen bezeichnet, die sich unter den herrschenden klimatischen Bedingungen sowie dem erwarteten Leistungsanspruch des Menschen durchzusetzen vermochten. So entstanden beispielsweise in den Wüsten- und Steppengebieten Asiens und Afrikas rein auf Sicht jagende, windhundartige Hetzhunde. In den stark bewaldeten Gegenden Europas dagegen setzten sich bei der Jagd vermehrt solche Hunde durch, die eine Spur ausdauernd mit der Nase verfolgen konnten.

Schädelfunde aus dem Neolithikum (4000-1700 v.Chr.) weisen darauf hin, dass es bereits kräftige Hunde einheitlichen Typs, aber mit regional abweichender Körpergröße gab (RÄBER

1995). Eine weitere Unterteilung dieser lokalen neolithischen Varianten in Rassen ist jedoch nicht möglich, da eine derartige Differenzierung zwar auch auf Grundlage zahlreicher mor- phologischer Merkmale, jedoch nicht ausschließlich aufgrund von Knochenfunden möglich ist.

Die neolithischen Hundetypen müssen darüber hinaus schon über die Fähigkeit verfügt haben, zwischen Haustieren, die als tabu galten, und jagdbarem Wild zu unterscheiden. Neben dem Verlust des Fluchtverhaltens bei Gefahr und fehlendem Aggressionsverhalten trotz Beute- Konkurrenz stellt dies eine der Grundvoraussetzungen zur Abgrenzung der ersten primitiven Rassen vom Wolf dar. In Ägypten sind Abbildungen von Jagdszenen mit Hunden schon aus der Zeit 4200-2800 v.Chr. überliefert; entsprechende neolithische Felszeichnungen wurden in Algerien, Spanien und auch in Schweden gefunden (RÄBER 1995).

Zur Selektion nach rein praktischer Verwendung für den Menschen gesellte sich bald eine gezielte Zucht auf phänotypische Besonderheiten. Bereits aus dem alten Rom sind rein der Gesellschaft dienende Hunde bekannt. Die ersten historisch zuverlässigen Belege für die E- xistenz des ausschließlich in menschlicher Obhut lebensfähigen mexikanischen Nackthundes lassen sich auf die Zeit 250 v.Chr.-450 n.Chr. datieren (VILA et al. 1999a).³

2 Abbildungen mit Darstellungen verschiedener Hundetypen (ähnlich dem Greyhound und Schäferhund) datieren bereits aus der Zeit 5000 v.Chr. (ZAJC et al. 1997).

3 Abbildungen phänotypisch ähnlicher Hunde auf Töpferwaren der Colima-Kultur; Hundeskelette, die die rasse- typischen morphologischen Defekte aufweisen, wurden in alten Grabstätten Westmexicos entdeckt, die aus der Zeit 750 v.Chr.-100 n.Chr. datiert wurden.

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XENOPHON (430-354) dokumentierte schon im Altertum eine grobe Aufteilung in Jagd-, Hüte- und Wachhunde. Eine primitive Rasseneinteilung der Jagdhunde nach Gebrauchszweck wird bereits ab dem 5. Jahrhundert überliefert.⁴

Die ersten Züchter, die von „Rassen“ sprachen, waren die mittelalterlichen Jäger. „Reinras- sig“ war ihrer Vorstellung nach ein Hund, der die Spur möglichst rein, d.h. problemlos hielt.

Je besser die Nasenleistung, desto „reiner“ war folglich auch der Hund; das Aussehen war zweitrangig. „Reine“ Hunde kamen somit vermehrt zur Fortpflanzung. Anschließende Inzucht führte dazu, dass sich im Laufe der Zeit neben der Gebrauchstüchtigkeit auch die körperliche Konstitution solcher Tiere durchzusetzen vermochte. Die Entstehung voneinander abgrenzba- rer Rassen wurde zusätzlich durch den damals weit verbreiteten Irrglauben gefördert, gute Leistung sei mit bestimmten körperlichen Merkmalen gekoppelt (z.B. lange Hängeohren mit guter Nasenleistung). So entstand hinter den Burgmauern der Adeligen in räumlicher Tren- nung eine gelenkte Jagdhundezucht, bei der die Vermischung mit Bauernhunden möglichst vermieden wurde (RÄBER 1995). Im ausgehenden Mittelalter bzw. in der frühen Neuzeit war die Rassenunterscheidung schon weit fortgeschritten. Während im „Book of St. Alban“

(1486) Windhund, Bastard, Mastiff, Leithund, Wachtelhund, Spürhund, Kennetys, Erdhund, Fleischerhund, Hofhund sowie Hunde mit geringeltem Schwanz, spitzohrige Hunde und klei- ne Damenhunde aufgelistet werden, erwähnt Conrad GESNER 1563 in seinem „Thierbuch“

eine Aufteilung in Windhund, Laufhund, Bluthund, Spürhund, Leithund, Vorstehhund und Erdhund; ebenfalls genannt werden Windspiel, Spaniel, Wasserhund, Vogel- und Wachtel- hund.

Bis ins 18. Jahrhundert prägte Frankreich die Jagdhundezucht und nahm entscheidenden Ein- fluss auf die Entwicklung zahlreicher Rassen. Nach dem Niedergang des Adels in der franzö- sischen Revolution übernahm England die Führung in der Zucht dieser Gebrauchshunde. Von dort ausgehend verbreitete sich seit Beginn des 19. Jahrhunderts der Gedanke, Hunde – ähn- lich wie edle Pferde – stammbuchmäßig „rein“ zu züchten. Bis zu dieser Zeit existierten nur spärliche Aufzeichnungen über verschiedene Rassen von Hüte-, Treib-, Bauern- und Wach-

4 Zitiert nach RÄBER (1995): Einteilung der Jagdhunde in leithunt, triphunt, spurihunt, winthunt und hapuhunt (Lex Bajuvariorum, 7. Jahrhundert).

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hunden, da sie als Gebrauchshunde der „niederen Stände“ (Hirten, Bauern, Handwerker) kaum Beachtung fanden.

Auf das äußere Erscheinungsbild solcher Gebrauchshunde wird allenfalls im Hinblick auf den Verwendungszweck eingegangen. Über Wert und Eigenarten bestimmter Hunderassen liegen dagegen bruchstückhafte Informationen vor. Mehr Aufschluss über das Aussehen der damali- gen Hunderassen geben hingegen zeitgenössische Abbildungen.⁵

Fortschreitende Industrialisierung und die Entstehung städtischer Ballungsgebiete im 19.

Jahrhundert gingen mit tief greifenden Veränderungen des Transportwesens und der Land- wirtschaft einher. Dies hatte den Niedergang einzelner Nutzhunde-Rassen zur Folge, deren ursprünglicher Zweck nun verloren ging. Während einige Rassen völlig verschwanden, wur- den andere in neuen Aufgabenbereichen eingesetzt. Gleichzeitig entstanden jedoch auch wei- tere, den veränderten Ansprüchen des Menschen angepasste Rassen aus den Resten sowie der Mischung der bereits vorhandenen. Der Gebrauchszweck vieler Rassen trat nun zugunsten des äußeren Erscheinungsbildes in den Hintergrund, und es folgte eine Entwicklung zum „Luxus- tier“.⁶ Gleichzeitig führte eine immer stärkere bewusste Umsetzung der DARWINSCHEN Evo- lutionstheorie sowie der MENDELSCHEN Vererbungsregeln zur Verwirklichung neuer Zucht- vorstellungen. Mit der Gründung der ersten Rassehundevereine ab 1878 sowie den ersten Rassestandards und Hundeausstellungen wurden schließlich die Weichen für die „moderne Rassehundezucht“ gestellt.

Bis heute ist die Problematik der Abgrenzbarkeit der Rassen voneinander noch nicht sinnvoll gelöst. HERRE (1961) postuliert in seiner heute allgemein anerkannten Rassedefinition, dass jene Gruppen innerhalb einer Spezies als Rasse anzusehen sind, die relativ einheitliche physi- sche (bzw. phänotypische) Eigenschaften aufweisen, welche sich unter vom Menschen kon- trollierten Bedingungen⁷ entwickelt haben. Weiterhin bezeichnet HERRE Rassen als Kollek- tiveinheiten, deren Besonderheiten nur durch statistische Methoden wiedergegeben werden können. Eine besondere Betonung legt er auf den großen Spielraum hinsichtlich der Umgren-

5 Bildliche Darstellungen von Bauernhunden (RÄBER 1995): Paulus Potter (1651) „Herders met hun vee“; J. J.

Biedermann (1763-1830) „Bauernhof bei Kirchberg“; S. Freudenberger (1745-1801) „Murtentor in Bern“; B.

Adam (1869) „Hundefamilie mit altem Gaul“.

6 Als Beispiele können Yorkshire, Pudel, Dalmatiner und Collie genannt werden.

7 Durch die Rassebarriere bzw. bewußte sexuelle Isolation.

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zung und Auswahl von Merkmalen und nennt als Ursache hierfür „subjektives menschliches Ermessen“.⁸

Aus der Geschichte der Hundezucht lassen sich zahlreiche Beispiele für die Auswirkungen dieses „subjektiven menschlichen Ermessens“ anführen. So weisen die sechs weißen, lang- haarigen Hirtenhundrassen Ungarischer Kuvacz, Slowakischer Tschuwatsch, Polnischer Owczarek Podhalenski, Südrussischer Owtcharka, Türkischer Akbash und der Maremmen- hund phänotypisch manchmal so große Übereinstimmungen auf, dass eine Zuordnung zu der jeweiligen Rasse oft nur noch durch das Stammbuch möglich ist.⁹ Bei den Belgischen Grif- fons dagegen kommt es vor, dass im selben Wurf rote rauhhaarige Brüssler, schwarz-rote rauhhaarige Belgier und schwarze kurzhaarige Brabanter fallen können – alle gelten jeweils als reinrassig.

Einige Rassen wurden historisch gesehen nur durch eine Person definiert. Beispielsweise er- folgte 1908 die Umdeklaration eines kurzhaarigen Berner Sennenhundes zum Großen Schweizer Sennenhund durch den Richter Prof. A. Heim, der damit eine neue Rasse „er- schuf“. Als weiteres Beispiel sei hier die Züchtung der Rasse Hovawart genannt, bei der unter Verwendung zahlreicher Rassen und Mischlinge phänotypisch der „alte Germanenhund“ wie- derauferstand (RÄBER 1995), der jedoch in der Vergangenheit nur als Urtyp des alten Bauern- hundes existiert hatte (s. Kap. 9.1).

Angelehnt an die Definition von HERRE bezeichnet RÄBER (1995) zusammenfassend eine Hunderasse als eine Gruppe der Untergattung Haushund, die durch menschliche Zuchtauslese speziell auf ein bestimmtes Zuchtziel¹⁰ hin über mehrere Generationen gezüchtet wird. Am Ende dieses Prozesses stehen phänotypisch veränderte Tiere, die die gewünschten Eigen- schaften mit Sicherheit weitervererben.

8 Über die Entstehung neuer Rassen schreibt RÄBER (1995) unter Bezugnahme auf Kynologen des 19. Jahrhun- derts: „aus dem Konglomerat der vorhandenen, kaum jemals rein gezüchteten Hundetypen begannen Züchter [...] mit der Zucht von Rassehunden. Man suchte sich aus den verschiedenen Schlägen das heraus, was den ei- genen Vorstellungen über eine Rasse entsprach und begann dann unter Anwendung engster Inzucht zu selekti- onieren“ (Bd. 1, S. 412).

9 Kommentar nach HERRE: „es ist züchterisch unerwünscht, weitgehend übereinstimmenden Erbbestand, der weitgehend sich gleichende Merkmale prägt, als verschiedene Rassen zu unterscheiden“, denn die Aufsplitte- rung solcher Tiere schafft eine unerwünscht schmale Zuchtbasis, die den Fortbestand der einzelnen Rassen be- droht.

10 Färbung, Fellzeichnung, Haartyp, Größe, Leistung, psych. Eigenschaften etc.

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Hunderassen stellen folglich keine statischen, sondern dynamische Kollektiveinheiten dar, die sich im Laufe nur weniger Generationen sehr stark verändern können. Besonders betroffen von wechselnden Schönheitsidealen sind dabei Nutzungstypen, deren ursprünglicher Zweck verloren gegangen ist. Die Entfernung vom ursprünglichen Ideal ist bei einigen Rassen bereits derart fortgeschritten, dass der einstige Standard und das heutige Rassebild nicht mehr de- ckungsgleich sind.¹¹

2.1.2 Modelle zur Systematik der Hunderassen

Mittlerweile sind weltweit über 400 verschiedene Hunderassen beschrieben. Studien über die Abstammung oder mögliche genetische Verwandtschaft einzelner Rassen können jedoch oft keine klaren Ergebnisse liefern. Dies ist auf einen Mangel eindeutiger archäologischer Funde und historischer Dokumente zurückzuführen, ohne die die zahlreichen Entwicklungsverzwei- gungen der Unterart Canis familiaris seit ihrer Entstehung nicht eindeutig zu rekonstruieren sind.¹²

Tabelle 1: Überblick über die Rasseneinteilung gemäß der FCI

Gruppe Integrierte Hunderassen Sektionen

FCI-Gruppe 01 Hüte- und Treibhunde 2

FCI-Gruppe 02 Pinscher, Schnauzer, Molosser, Schweizer Sennenhunde 3

FCI-Gruppe 03 Terrier 4

FCI-Gruppe 04 Dachshunde 0

FCI-Gruppe 05 Spitze und Hunde vom Urtyp 8

FCI-Gruppe 06 Lauf- und Schweißhunde, verwandte Rassen 3

FCI-Gruppe 07 Vorstehhunde 2

FCI-Gruppe 08 Apportierhunde, Stöberhunde, Wasserhunde 3

FCI-Gruppe 09 Gesellschafts- und Begleithunde 11

FCI-Gruppe 10 Windhunde 3

11 Ein Beispiel hierfür ist der Zwergschnauzer, bei dem sich seit der Mitte des 20. Jahrhunderts eine neue Varian- te mit starken Abweichungen in Statur und Haarkleid herausgebildet hat, während die ursprüngliche Form daneben weiter existiert (RÄBER 1995).

12 „Die vorhandenen Aufzeichnungen, die aus der Zeit von vor Mitte des letzten Jahrhunderts stammen, sind so spärlich, lückenhaft und ungenau, dass jemand fast alles Gewünschte beweisen könnte, was die (Zucht-) Ge- schichte einzelner Rassen angeht.“ (PETERS 1969).

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Klassische Modelle der Einteilung, wie sie beispielsweise die FCI (Fédération Cynologique Internationale)¹³ oder der American Kennel Club verwenden, basieren auf den Kriterien Ver- wendungszweck, gemeinsamer geographischer Ursprung, ähnliche Morphologie sowie offen- sichtliche Verwandtschaft aufgrund bekannter Zuchtgeschichte. Tabelle 1 gibt Auskunft über die Einteilung der Hunderassen nach den Richtlinien der FCI sowie die Anzahl von Sektionen innerhalb der Gruppen.

In jüngster Zeit wurde der Versuch unternommen, die lückenhafte Phylogenie der Hunderas- sen durch quantitative Untersuchung morphologischer und charakterlicher Eigenschaften zu schließen. Diese Studie (JORDANA et al. 1999) basierte auf der Theorie, dass der heutige Haushund mehreren Urhund-Typen entstammt, die jeweils auf verschiedene Subspezies von Canis lupus zurückgehen.¹⁴ Während aufgrund morphologischer Daten eine signifikante Trennung zwischen den Abkömmlingen der C. l. arabs-Gruppe (mit Ausnahme der Hütehun- de) und den Nachfahren von C. l. chanco sowie C. l. lyacon erkennbar wurde, lieferte die A- nalyse typischer Verhaltensweisen keine eindeutigen Ergebnisse. Dies wurde auf den starken Einfluss sowohl natürlicher als auch künstlicher Selektion durch den Menschen zurückge- führt.

Als verlässlicheres Hilfsmittel zur Rekonstruktion der Verwandtschaft zwischen einzelnen Rassen hat sich dagegen die Analyse biochemischer Polymorphismen an strukturell beteilig- ten Genorten bewährt (TANABE et al. 1991; JORDANA et al. 1992; LACHMANN 1993; ERDOGAN

2004). Aufgrund eines vergleichsweise niedrigeren Grads an Polymorphie ist diese Methode jedoch dem folgenden Verfahren unterlegen.

Seit einigen Jahren werden vermehrt Mikrosatellitenmarker zur Klärung phylogenetischer Beziehungen zwischen Hunderassen eingesetzt (MORERA et al. 1999; ZAJC & SAMPSON 1999;

13 Der FCI als internationalem Dachverband unterliegt die Vereinheitlichung von Zucht-, Ausstellungswesen und Rassestandards in allen ihr angeschlossenen Ländern.

14 Gemäß dieser Theorie gilt der chinesische Wolf C. l. chanco als Ahne der frühen chinesischen und mongoli- schen Rassen. Eskimohunde und Spitze vom Urtyp werden über C. f. palustris auf die nordischen Wölfe zu- rückgeführt und der arabische Wolf C. l. arabs gilt als Vorläufer von vier Urhundtypen, aus denen die meisten europäischen Rassen entstanden sind: C. f. metris-optimae (Hütehunde), C. f. inostranzewi (Molosser), C. f.

intermedius (Bracken) und C. f. leineri (Harrier).

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KOSKINEN & BREDBACKA 2000). Hierbei wurden jedoch zu Beginn nur einzelne, zum Teil lokal dominierende Hunderassen berücksichtigt.

Eine umfassendere Studie (PARKER et al. 2004) ermöglichte per Mikrosatelliten-Analyse eine klare Aufspaltung von 85 Hunderassen in vier große Gruppen, die im Folgenden weiter spezi- fiziert werden. Die Ergebnisse bestätigten teilweise die klassische Einteilung der Rassen nach Verwendungszweck, historisch belegter Zuchtgeschichte und äußerem Erscheinungsbild. Sie enthüllten jedoch auch völlig neue Aspekte genetischer Verwandtschaft. Zur phylogenetisch ältesten Hundegruppe, die mit dem Grauwolf enge Verwandtschaft zeigt, zählen nach PARKER

et al. (2004) bekannte „archetypische“ Rassen wie die nordischen Schlittenhunde, verschie- dene alte Rassen ostasiatischen Ursprungs sowie der afrikanische Basenji und die asiatischen Windhundrassen Afghane und Saluki. Die Mehrheit der modernen Rassen scheint ihren Ur- sprung jedoch zeitgleich in einem gemeinsamen europäischen Grundstock zu haben. Aus die- sem abgeleitet, wurden in einer zweiten großen Gruppe Hunde mit Mastiff-ähnlichem Phäno- typus zusammengefasst. Die übereinstimmende Morphologie spiegelt die Abstammung von einem gemeinsamen Ahnen wider. Die Zugehörigkeit verschiedener Hütehund-Typen zur dritten Gruppe zeugt von erblichem Hüteverhalten, das entweder auf gemeinsam geteilte Ah- nen oder ähnliche Selektionsmechanismen zurückgeht. Die vierte Gruppe wird von Hunden dominiert, die auf unterschiedliche Weise bei der Jagd eingesetzt werden. Ein ständiges Durchmischen dieser Rassen im Laufe der letzten Jahrhunderte zur Erzielung von „Jagdspezi- alisten“ ist zuchtgeschichtlich hinreichend dokumentiert und machte eine weitere Auftren- nung mittels der in dieser Studie gewählten Methode unmöglich.¹⁵

2.2 Molekulargenetische Grundlagen

2.2.1 Mikrosatelliten

Jeder Organismus ist durch sein unverwechselbares Genom eindeutig charakterisiert. Die Va- riabilität der DNA führt dazu, dass natürlicherweise nur eineiige Zwillinge bzw. Mehrlinge identische Genome aufweisen können.

15 Eine interessante Beobachtung stellt in diesem Zusammenhang die Tatsache dar, dass in die älteste phylogene- tische Gruppe bei PARKER et al. (2004) sämtliche Hunderassen fielen, die nach JORDANA et al. (1999) den Nachfahren von C. l. lyacon und C. l. chanco zugeordnet werden. In den Gruppen zwei bis vier nach PARKER

et al. (2004) finden sich dagegen ausschließlich Angehörige der von C. l. arabs abstammenden Hundetypen wieder.

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In der Regel wirken sich Mutationen in den codierenden Abschnitten der DNA negativ auf einen Organismus aus. Da die Wahrung der Stabilität und Funktionalität lebenswichtiger Genprodukte (Proteine) den limitierenden Faktor für das Auftreten möglicher Mutationen in informativen Bereichen darstellt, manifestieren sich diese mit höherer Wahrscheinlichkeit in nichtcodierenden DNA-Abschnitten. Hier sind folglich auch die meisten der bisher bekannten Mikrosatelliten-Marker lokalisiert. Mikrosatelliten (MS), die nach WEBER & WONG (1993) auch als „short tandem repeat“-Marker (STRs) bezeichnet werden, stellen repetitive DNA- Sequenzen dar, die zufällig und in großer Zahl über das ganze Genom aller bisher untersuch- ten Organismen verteilt sind. Sie sind aus kurzen Wiederholungseinheiten (repeats) aufge- baut, die auf 1-5 Nukleotiden basieren (ZAJC et al. 1997) und durchschnittlich 10-50fach wie- derholt werden (JOUQUAND et al. 2000). Je nach Anzahl der Basenpaare wird das Grundmotiv als Di-, Tri-, Tetra- oder Pentanukleotid bezeichnet.

Die MS zeichnen sich durch hohe Verteilungsdichte im Genom aus, was sie für Genomkartie- rungen und Kopplungs-Analysen besonders attraktiv macht.¹⁶ Aus diesem Grund sind mitt- lerweile für sämtliche wichtigen Haus- und Nutztierarten zahlreiche Mikrosatelliten-Marker und Loci (Genorte) bekannt. Die hohe Variabilität der MS ist auf die unterschiedliche Zahl der Wiederholungseinheiten zurückzuführen, die sich in unterschiedlichen Fragmentlängen ausdrückt (ASHLEY & DOW 1994). Die möglichen Varianten eines MS sind deckungsgleich mit der Menge seiner Allele. In der Regel sind Mikrosatelliten hochpolymorph, d.h. es lassen sich in definierten Populationen für jeden Genort mehrere Allele bestimmen. Im Mittel wer- den pro Locus beim Säugetier etwa acht verschiedene Allele gefunden. Das repetitive Muster dieses Markersystems begünstigt Mutationen und ist somit an der Ausprägung des starken Polymorphismus ursächlich beteiligt.

Über den genauen Mechanismus sowie die Ursachen der Mutationen war man in der For- schung lange Zeit geteilter Meinung (SCHLÖTTERER & TAUTZ 1992; RICHARDS &

SUTHERLAND 1994), mittlerweile konnte sich jedoch die Theorie des „slipped-strand mispai- ring“ durchsetzen: Als Hauptmechanismus, der zu den verschiedenen Längenvarianten führt, werden hierbei Fehlpaarungen durch Strangverschiebung während der DNA-Replikation an-

16 Das Grundmotiv CA ist beim Säugetier durchschnittlich alle 30kb vorhanden (JOUQUAND et al. 2000), wäh- rend die Repeateinheit GAAA statistisch gesehen alle 100-200bp (FRANCISCO et al. 1996) zu finden ist.

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gesehen, die zur Bildung neuer Stränge mit vom Original abweichender Fragmentlänge füh- ren. Gemäß der Theorie der schrittweisen Mutation („stepwise mutation model“, SMM) – nach OHTA & KIMURA (1973) bzw. KIMURA & OHTA (1978) – gehen neue Allele aus dem Verlust oder Erwerb von 1-2 Wiederholungseinheiten hervor (SUNDQVIST et al. 2001;

VALDES et al. 1993). Neuere Studien führten zu der Erkenntnis, dass die Mutationsrichtung eines Mikrosatelliten von seiner Länge und damit von seinem Alter abhängig zu sein scheint (XU et al. 2000). Von ähnlichen Ergebnissen wurde bei ELLEGREN (2000), FRANCISCO et al.

(1996) sowie TAKEZAKI & NEI (1996) berichtet.

Beobachtete Mutationsraten bei MS überschreiten häufig den Bereich 10^-4 pro Locus und Ge- neration (WEBER & WONG 1993; FRANCISCO et al. 1996; IRION et al. 2003). Die Mutationsra- te für die Verkürzung eines MS-Markers steigt exponentiell zu seiner Länge (BROHEDE et al.

2002), wohingegen die Mutationsrate für die Verlängerung variablenunabhängig ist. Da hohe Mutationsraten besonders bei populationsgenetischen Studien Ergebnisse verzerren können und die korrekte statistische Auswertung – bedingt durch konvergente und divergente Mutati- onsrichtungen – komplexere Berechnungen erfordert, sollten hierfür stets möglichst „stabile“

Marker gewählt werden (IRION et al. 2003).

Findet an einem Locus eine Punktmutation in den Primerbindungsstellen der flankierenden Sequenzbereiche statt, wird das entsprechende Allel dieses Locus entweder mit verminderter Effizienz oder überhaupt nicht (Nullallel) amplifiziert (PEMBERTON et al. 1995). Das Vorlie- gen eines Nullallels führt dazu, dass ein heterozygotes Tier als vermeintlich homozygot er- scheint. Während dies auf Individuen-Ebene bei Abstammungskontrollen zu falsch negativen Ergebnissen führen kann (SCHWEND 2001), kommt es auf Populationsebene zu einer Erhö- hung des Homozygoten-Anteils und zu stärkeren Abweichungen im Hardy-Weinberg- Gleichgewicht (HWG), falls das Nullallel in statistisch relevanter Frequenz vorliegt (WILTON

et al. 1999).

Die Mutationen innerhalb der repetitiven Sequenz machen eine Einteilung der MS in mehrere Klassen erforderlich (EICHMANN et al. 2004). Zu unterscheiden ist hierbei zwischen einfachen Markern bestehend aus einem simplen, vollständig wiederholten Motiv, z.B. (ATGA)_n und zusammengesetzten Markern, bei denen noch ein weiteres Wiederholungsmotiv hinzukom- men kann, z.B. (GATA)_n(GTTA)_n. Die dritte Klasse wird von den komplexen und hypervari-

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ablen Markern gebildet; hier liegen verschiedene und zum Teil unvollständige Repeatmotive vor, sowie Insertionen unterschiedlicher Länge und „Poly-A-Stretches“, z.B.

(GAAA)nGAAGAAG(GAA)n. Eine ähnliche, geringfügig abweichende Einteilung wurde von OSTRANDER et al. (1993) vorgeschlagen und von FREDHOLM & WINTERO (1995) bestä- tigt.

Mittels spezifischer Primer, die an die flankierenden Sequenzabschnitte des jeweiligen STR binden, lassen sich dessen Längenpolymorphismen mit Hilfe der PCR direkt amplifizieren.

Durch hochauflösende Elektrophorese-Techniken können anschließend die gewonnenen DNA-Fragmente gemäß ihrer unterschiedlichen Länge aufgetrennt und dargestellt werden.

Eine geschickte Auswahl ermöglicht die Verwendung mehrerer spezifischer Primerpaare im selben PCR-Ansatz (Multiplex-PCR) und damit die gleichzeitige Amplifikation der zugehöri- gen MS-Marker. Weiterhin ermöglichen fluoreszenzmarkierte Primer in der PCR eine Analy- se der DNA-Fragmente mittels Laserlicht-Detektion. Dadurch ist eine Automatisierung der MS-Auswertung und eine genauere Interpretation der Ergebnisse möglich.

Die Mikrosatelliten-Analyse (Genotypisierung) stellt folglich eine relativ einfach umzuset- zende molekulargenetische Untersuchungsmethode dar. Darüber hinaus sind bereits geringe Mengen von Blut, Haarwurzeln, Mundschleimhautzellen oder sonstigem Gewebe für eine erfolgreiche DNA-Isolation und Amplifikation ausreichend. Diese Gründe führten dazu, dass im Laufe der letzten zehn Jahre MS-Marker die zuvor üblichen Blutgruppen- und biochemi- schen Marker aus den meisten Anwendungsbereichen verdrängt haben. Während sie bei- spielsweise für die Bereiche Genom-Kartierung, Kopplungs-Analysen, Abstammungskontrol- le sowie bei Identitätsüberprüfungen in der Forensik routinemäßig bereits als Mittel der Wahl gelten, gewinnen sie für die Populationsgenetik, insbesondere bei phylogenetischen Studien und in Untersuchungen zur Beurteilung der genetischen Integrität gefährdeter Arten und Va- rietäten (conservation genetics) zunehmend an Bedeutung (RANDI & LUCCHINI 2002; VILA et al. 2003a; VILA et al. 2003b).

Zahlreiche Studien – z.B. PAETKAU et al. (1995) beim Bären; BEAUMONT et al. (2001) und ECKERT (2003) bei Feliden; HANSLIK et al. (2000), MACHUGH et al. (1998), KIM et al. (2002) und METTA et al. (2004) beim Rind; ACHMANN et al. (2004), BJORNSTAD & ROED 2001 sowie

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CANON et al. (2000) fürs Pferd; ARANGUREN-MENDEZ et al. (2001) bei Eseln; MARTINEZ et al. (2000) beim Schwein und DIEZ-TASCON et al. (2000) für das Schaf – belegen darüber hin- aus die hervorragende Eignung der MS für die Ermittlung verwandtschaftlicher Beziehungen zwischen einzelnen Rassen, Varietäten oder fragmentierten Wildpopulationen und zur Be- stimmung der genetischen Diversität innerhalb einer bestimmten Rasse.

2.2.2 Mitochondriale DNA

2.2.2.1 Die Grundstruktur der caninen mtDNA

Seit Beginn der 80er Jahre ist die mitochondriale DNA (mtDNA) immer mehr in den Brenn- punkt molekulargenetischer Forschung gerückt.

Abhängig vom Gewebetyp kommen Mitochondrien bis zu mehreren Hundert pro Zelle vor.

Sie zeichnen sich dabei – obwohl auf komplexe Weise in vitale zelluläre Funktionen einge- bunden – bereits entwicklungsgeschichtlich (Endosymbionten-Theorie)¹⁷ durch einen hohen Grad an Unabhängigkeit vom Zellkern (Nukleus) aus.

Die mitochondriale DNA stellt ebenso wie das Kern-Genom eine vollkommen autonome ge- netische Einheit dar, hat jedoch im Vergleich zu diesem eine überschaubare Größe (16-17,5kb beim Säugetier). Das mitochondriale Genom liegt haploid und in Ringform vor, durchläuft ungeschlechtliche, vom Zellzyklus unabhängige Vermehrung (Mitose) und wird – mit weni- gen Ausnahmen (GYLLENSTEN et al. 1991) – rein maternal, ohne Rekombination, weiterver- erbt. Als erstes mitochondriales Säugergenom wurde 1981 das des Menschen vollständig cha- rakterisiert (ANDERSON et al. 1981).

Durch die zehnfach höhere Mutationsrate (BROWN et al. 1979) im Vergleich zum Kern- Genom entwickelt sich die mtDNA überdurchschnittlich schnell weiter (ROY et al. 1994).

Dies muss im Zusammenhang mit biochemischen Prozessen der Atmungskette gesehen wer- den, bei denen eine hohe Konzentration freier Sauerstoffradikale im Mitochondrium entsteht.

Die Entstehung von Mutationen wird dadurch begünstigt. Eine vermehrte Anhäufung von Nukleotidsubstitutionen wird darüber hinaus durch reduzierte Replikationstreue der Polyme-

17 Die Endosymbiontenhypothese postuliert, dass frühe Eukaryoten weder Mitochondrien noch Chloroplasten besaßen. Durch Zunahme des atmosphärischen Sauerstoffgehalts entwickelten sich unabhängig davon „bakte- rienähnliche“ Organismen mit der enzymatischen Ausstattung zur Energiegewinnung aus O2. Der Atmungs- prozess stellte aufgrund gesteigerter und effizienterer Energiegewinnung einen erheblichen evolutionären Se- lektionsvorteil dar. Man vermutet, dass eukaryotische Zellen diese Organismen „einfingen“ und lernten, mit ihnen in Symbiose zu leben (KNIPPERS 1997).

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rase sowie unzureichende DNA-Reparaturmechanismen aufgrund struktureller Besonder- heiten der mtDNA verursacht. Obwohl beim Menschen eine Reihe mitochondrialer Erb- krankheiten bekannt ist, betreffen Mutationen in der Regel die 3. Position eines Codons und bleiben deshalb in den meisten Fällen ohne schädliche Auswirkung auf den Organismus (KNIPPERS 1997).

Die erwähnte hohe Mutationsrate ließ die mtDNA für eine Vielzahl an Fragestellungen geeig- net erscheinen. Daher ist mittlerweile für fast alle Haustiere und viele Wildtiere die mito- chondriale DNA bezüglich Größe, Genbestandteilen sowie genomischer Organisation voll- ständig charakterisiert. In allen Säugergenomen weist die mtDNA eine konservierte Anord- nung der Gene sowie eine straffe Struktur und hohe Kompaktheit bezüglich ihrer genetischen Information auf (ANDERSON et al. 1981).

KIM et al. (1998) stellten erstmals die Sequenz des kompletten caninen mitochondrialen Ge- noms vor. Die codierenden Bauelemente (Gene für 13 Enzyme der Atmungskette, 22 tRNAs und 2 rRNAs) unterschieden sich in Anzahl, Organisation und Richtung offener Leserahmen nicht von anderen untersuchten Säugerspezies.

Die Nukleotidposition 1 wird gemäß nomenklatorischer Konventionen dem 5’-Ende des Gens für tRNA-Phenylalanin zugeordnet. Den Abschluss des codierenden Teils bildet das 3’-Ende der tRNA-Prolin; daran anschließend befindet sich die nicht-codierende Kontrollregion (control region), oft auch als displacement-loop (d-loop) bezeichnet. Die Gesamtlänge des caninen mitochondrialen Genoms beläuft sich auf 16728bp, dies stellt jedoch aufgrund des Vorkommens einer variablen Anzahl repetitiver Motive (HOELZEL et al. 1994; TSUDA et al.

1997; FRIDEZ et al. 1999; SAVOLAINEN et al. 2000) in der d-loop nur eine ungefähre Größen- angabe dar.

Wie bei allen anderen Säugetieren liegen alle proteincodierenden Gene außer NADH6 auf dem H-Strang¹⁸, so dass der L-Strang den sinngebenden Leserahmen liefert. Als Besonderheit des mitochondrialen Genoms bei Canis familiaris wurde eine CTAGA-Duplikation zwischen der Cytochrom-C-Oxidase Untereinheit II und dem tRNA-Lysin lokalisiert, die in dieser

18Abgeleitet aus unterschiedlichen Auftriebsdichten im CsCl-Gleichgewichstgradienten, durch die eine Unter- scheidung in schweren (H, heavy) und leichten (L, light) Strang möglich ist (KNIPPERS 1997).

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Form bei anderen Säugetieren bisher nicht gefunden wurde und somit als spezifischer caniner Marker gelten kann.

2.2.2.2 Nomenklatur und Aufbau der d-loop

Die Aufgabe der displacement-loop liegt in der Regulation und Initiation mitochondrialer Replikation.¹⁹ Im Bereich der d-loop liegt ein dreifacher DNA-Strang vor (ca. 700bp beim Menschen), der den ursprünglichen L- und H-Strang verdrängt. Die d-loop besteht aus einem variablen Anteil, einem eher konservierten Bereich und einem Einschub repetitiver Sequen- zen.

Obwohl die d-loop des Hundes in jüngster Vergangenheit in zunehmendem Maße zu For- schungszwecken herangezogen wurde, gibt es für einige Teilbereiche noch immer keine in- ternational verbindliche, einheitliche Nomenklatur. Dies erschwert die Vergleichbarkeit un- terschiedlicher Quellenangaben teilweise erheblich.

Übereinstimmend bei allen Autoren ist jedoch der Beginn der d-loop bei bp 15459 (in direk- tem Anschluss an das 3’-Ende der tRNA-Prolin), ihr Abschluss am 5’-Ende der tRNA- Phenylalanin sowie das Vorhandensein eines repetitiven, 10bp langen Grundmotivs. Weiter- hin wird autorenübergreifend eine hypervariable Region beschrieben, deren exakte Position jedoch sehr unterschiedlich definiert wird. Sie erstreckt sich bei TSUDA et al. (1997) von Posi- tion 1 bis ca. 672 der d-loop und beinhaltet dabei sowohl einen Bereich, den FRIDEZ et al.

(1999) als „central conserved region“ bezeichnen, als auch einen Abschnitt, der von OKUMURA et al. (1996) bereits als CSB1 (conserved sequence block 1) eingeordnet wird.

OKUMURA et al. (1996) dagegen verstehen unter „hypervariabel“ ein ca. 70bp langes Frag- ment sowie zwei kleinere Fragmente, die sowohl am Anfang als auch am Ende der d-loop liegen. In jüngster Zeit wird der Begriff „hypervariable region“ jedoch für einen Teilbereich in der Nähe der tRNA-Prolin verwendet, der ca. 250bp umfasst und von einigen Autoren auch HV1 genannt wird (SAVOLAINEN et al. 1997; SAVOLAINEN et al. 2000; FRIDEZ et al. 1999).

Unterschiede bestehen auch in der Nomenklatur des konservierten Bereiches. Während viele Autoren (OKUMURA et al.1996; KIM et al. 1998; SAVOLAINEN et al. 2000) von der Existenz

19 Startpunkt dafür ist der Origin OH, an dem die H-Strang-Synthese der mtDNA beginnt. OH liegt beim Hund in CSB1.

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dreier getrennter konservierter Blöcke ausgehen, wird von TSUDA et al. (1997) dieser Ab- schnitt allgemein als „conserved region“ zusammengefasst; FRIDEZ et al. (1999) nehmen da- gegen keine spezielle Benennung vor.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht der d-loop. Da der Name displacement-loop automatisch einen hohen Grad an Variabilität impliziert, wird im Folgenden die Bezeichnung

„hypervariabel“ nur für die als HV1 bezeichnete Region übernommen. Konservierte Bereiche werden durch die Verwendung des Begriffs CSB gekennzeichnet. Alle nicht speziell benann- ten Bereiche zeichnen sich durch eine moderate Variabilität aus.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der d-loop, bestehend aus den „conserved sequence blocks“

(CSB), der hypervariablen Region sowie einem repetitiven Abschnitt (tandem repeats). Nicht näher be- zeichnete Teile zeigen nur geringe Variabilität.

2.2.3 Populationsgenetik

Die Populationsgenetik beschäftigt sich mit den genetischen Grundprinzipien (z.B.

MENDELSCHE Regeln) sowie deren Auswirkungen auf Populationen. Unter dem Begriff „Po- pulation“ wird dabei eine definierte Paarungs-/Fortpflanzungsgemeinschaft zwischen Tieren, Menschen oder Pflanzen zusammengefasst. Diese kann auf natürliche Weise zustande kom- men oder experimentell gebildet werden.

Die Populationsgenetik ermittelt und beurteilt genetische Varianten, die innerhalb oder zwi- schen Populationen auftreten. Genetische Variation drückt sich dabei innerhalb der Populati- onen durch das Vorhandensein verschiedener Allele an unterschiedlichen Loci aus und spie- gelt sich in den Allelfrequenzen wider. Diese stellen das Verhältnis aller definierten Allele zueinander in einer Population dar. Anhand der Allelfrequenzen werden anschließend die genetischen Beziehungen zwischen den Populationen untersucht. Verschiedene Faktoren der

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Evolution beeinflussen dabei in unterschiedlich starkem Maß die Unterschiede zwischen Po- pulationen.

Die zufällige genetische Drift (random drift) kann in Populationen zum Verlust einiger Allele sowie einer Verschiebung der Frequenzen erhalten gebliebener Allele führen. Das Vorliegen von massiven „bottlenecks“²⁰ bzw. „founder effects“²¹ verstärkt den Einfluss dieses populati- onsgenetischen Faktors erheblich.²² Genetische Unterschiede zwischen Populationen, die geographisch oder reproduktiv voneinander isoliert sind, werden auf diese Weise immer grö- ßer, je länger die Trennung besteht (ALTET et al. 2001; SEDDON & ELLEGREN 2002; VILA et al. 2003a; SUNDQVIST et al. 2001).

Mutationen, die in jeder Population unabhängig voneinander und spontan auftreten, tragen erheblich zur genetischen Differenzierung bei. Aufgrund relativ geringer Mutationsraten kommen diese jedoch erst nach längerer Divergenzzeit der Populationen zur Geltung und sind damit überwiegend auf Speziesebene von größerer Bedeutung (KLUKOWSKA et al. 2003;

FREDHOLM & WINTERO 1995). Mitbestimmend für den tatsächlichen Einfluss von Mutationen auf die Fortentwicklung einer Rasse ist jedoch – neben der Mutationsrate – die effektive Po- pulationsgröße (IRION et al. 2003).

Die bei Rassen häufige züchterische Selektion führt zur bevorzugten Weitervererbung be- stimmter Allele und hat dadurch variierende Allelfrequenzen in nach verschiedenen Schwer- punkten selektierten Populationen zur Folge. Eine zufällige Selektion in die gleiche Richtung mit Bevorzugung derselben Allele kann jedoch die wahre genetische Beziehung verfälschen.

Deshalb ist selektionsneutralen Markern, wie etwa den MS, in der Populationsgenetik der Vorzug zu geben.

Das Ausmaß an Migration (Austausch von Individuen) zwischen verschiedenen Populationen hat ebenfalls einen entscheidenden Einfluss auf die Entstehung genetischer Unterschiede.²³ Der kontinuierliche Genfluss, bei dem Allele zwischen Populationen ausgetauscht werden, führt zu einer Verringerung der genetischen Differenzierung. Je mehr Ähnlichkeit die Al-

20 Zäsur einer Population bedingt durch massiven Rückgang der effektiven Populationsgröße.

21 (Wieder-)Aufbau einer Population mit einer geringen Anzahl von Gründerindividuen., oft im Zusammenhang mit genetischen bottlenecks.

22 Bottlenecks und founder effects sind in der Geschichte zahlreicher Hunderassen dokumentiert (z.B. Mittelpin- scher, Leonberger).

23 Der Austausch von Individuen stellte in der Hundezucht vor Errichten der „Rasse-Barriere“ eine gängige Me- thode dar, um Inzuchteffekte zu reduzieren und neue Eigenschaften herauszuzüchten (RÄBER 1995).

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lelfrequenzen untersuchter Populationen aufweisen, desto mehr Austausch hat zwischen ihnen stattgefunden (HARTL &CLARK 1997).

2.3 Anwendungsbereiche für Mikrosatelliten und mtDNA

2.3.1 Abstammungskontrolle

Aufgrund des rein maternalen Vererbungsmodus ist die mtDNA nicht für routinemäßige Ab- stammungskontrollen geeignet, da sie im Zweifelsfall nur Auskunft über die Identität des Muttertiers bzw. über die mütterliche Linie geben kann. Bei Säugetieren stellt sich allerdings primär die Frage nach dem Vater, da die Mutter fast immer bekannt ist. Dennoch ist die mtDNA für Aussagen über die Vorfahren-Matrilinien durchaus von Nutzen. So wurden durch Analysen kompletter Populationen mit vollständig bekannten Pedigrees mit Hilfe der d-loop fehlerhafte Eintragungen in Zuchtbüchern aufgedeckt (LÜPKE 2004).

Im Gegensatz dazu werden autosomale Mikrosatelliten-Marker kodominant gemäß den Men- delschen Regeln vererbt (STALLINGS et al. 1991; FRANCISCO et al. 1996) und sind somit her- vorragend zur Klärung der Abstammung geeignet.

Das Grundprinzip der Abstammungskontrolle mittels Mikrosatelliten besteht darin, an einer größeren Anzahl polymorpher Loci die anteiligen Allele der Eltern auch bei den Nachkom- men zu ermitteln. Für die Ermittlung des Zucht- und Handelswertes ist die gesicherte Zuord- nung von Eltern und Nachkommen eine Grundvoraussetzung. In den letzten Jahren erwies sich der Anteil falsch dokumentierter Abstammungen im Nutztiersektor teilweise als erheb- lich: Bei Rindern, Schafen und Schweinen wurden in verschiedenen Studien bis zu 20%

falsch eingetragene Ahnenangaben ermittelt (Schwend 2001). Bei Hunden liegen bis jetzt noch keine veröffentlichten Daten über das Ausmaß falscher Abstammungseintragungen vor, da die routinemäßige Genotypisierung von Eltern und Welpen erst seit wenigen Jahren und nur von einzelnen Verbänden gefordert wird. Die Ursachen für falsche Abstammungsdaten beim Rassehund sind vielfältig und reichen von „Deckunfällen“, Mehrfachbedeckung mit Superfecundatio (FREDHOLM & WINTERO 1996) bis hin zu ökonomisch motivierten Falschan- gaben über die Elterntiere. Der hohe Anteil falsch dokumentierter Abstammungen in Streit- und Zweifelsfällen macht deutlich, dass eine unabhängige Überprüfung der in Zuchtbüchern und -registern eingetragenen Stammdaten unverzichtbar ist.

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Zur Abstammungsüberprüfung findet das Ausschlussverfahren Anwendung: Werden beim Nachkommen Allele gefunden, die weder von der Mutter stammen noch beim potentiellen Vatertier vorhanden sind, kann der jeweilige Rüde als biologischer Erzeuger ausgeschlossen werden. Die Quote, mit der ein falsch angegebener Vater auch als falsch klassifiziert werden kann, bezeichnet man als Ausschlusswahrscheinlichkeit PE (JAMIESON & TAYLOR 1997). Der PE-Wert ist abhängig von Anzahl und Polymorphie der verwendeten Marker-Loci, aber auch von der Rasse des jeweiligen Probanden. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass die modernen Rassehunde durch inzucht- und selektionsbedingte genetische Drift insgesamt er- heblich an genetischer Variabilität verloren haben. Dies betrifft sowohl die Anzahl der Allele als auch die Heterozygotie-Rate (DENISE et al. 2004; ALTET et al. 2001; IRION et al. 2003;

ZAJC et al. 1997; SUTTON et al. 1998; KOSKINEN & BREDBACKA 2000; FREDHOLM &

WINTERO 1995) und kommt bei den einzelnen Loci verschieden stark zur Geltung. Je nach Rasse können deshalb unterschiedlich viele Marker nötig sein, um eine Ausschlusswahr- scheinlichkeit von über 99% zu erreichen. So waren beispielsweise in einer Untersuchung von ZAJC & SAMPSON (1999) die fünf polymorphsten Marker eines vorgegebenen Sets ausrei- chend, um bei reinrassigen Deutschen Schäferhunden und bei Labrador Retrievern eine PE von 99% zu erreichen, während beim stärker ingezüchteten Greyhound dafür sechs Loci des gleichen Sets benötigt wurden. Um bei allen der insgesamt 108 untersuchten Rassen eine mindestens 99%ige Ausschlusswahrscheinlichkeit zu erzielen, war nach DENISE et al. (2004) der Einsatz von 10-15 STR-Markern nötig.

In Streitfällen, bei denen die Herkunft eines Tieres vollständig in Frage gestellt werden muss bzw. ein Teil der potentiellen Eltern nicht zum Testen verfügbar ist, muss auf eine andere statistische Methode zurückgegriffen werden. Dabei werden aus den Ausschlusswahrschein- lichkeiten der jeweiligen Marker und ihrer Allelverteilung in einer größeren Referenzpopula- tion derselben Rasse mütterliche bzw. väterliche Indizes berechnet (FREDHOLM & WINTERO

1996). Diese geben Auskunft über die direkte Wahrscheinlichkeit der biologischen Eltern- schaft. Als Grundlage hierfür dienen populationsgenetische Studien, bei denen die Stichprobe vom Umfang so zu wählen ist, dass sowohl rassetypische Allelprofile als auch seltene Allele zum Vorschein kommen können (SUTTON et al. 1998).

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Zahlreiche Studien auf der Basis populationsgenetischer Daten dienten dazu, die Eignung verschiedener spezieller MS-Marker für die Abstammungskontrolle reinrassiger Hunde mit teilweise hohem Verwandschaftsgrad zu verifizieren (ZAJC et al. 1997; ZAJC & SAMPSON

1999; SUTTON et al. 1998; KOSKINEN & BREDBACKA 1999; ICHIKAWA et al. 2001; ALTET et al. 2001). Wiederholt wurde hierbei die Beobachtung gemacht, dass einzelne Rassehundpopu- lationen im Vergleich zu einem Misch-Pool verschiedener Rassen nur eine eingeschränkte genetische Bandbreite bezüglich der Allelzahl besaßen.

2.3.2 Forensische Fragestellungen

Die stetig ansteigende Zahl von Hunden und Katzen in unserer Gesellschaft hat zur Folge, dass auch an Tatorten Tierhaare vermehrt nachweisbar und damit zu wichtigem Spurenmate- rial geworden sind (EICHMANN et al. 2004).

Die Erfolgsquote von DNA-Typisierungen aus Haaren ist direkt abhängig von der Qualität des Ausgangsmaterials. Biologisches Spurenmaterial kann von verschiedenen Individuen stammen und muss deshalb jeweils getrennt untersucht werden (PADAR et al. 2001; PADAR et al. 2002). Oft enthalten jedoch einzelne Deckhaare und Haarschäfte allenfalls geringe Men- gen meist degradierter Kern-DNA und die Mikrosatellitenanalyse verläuft demzufolge nur in den seltensten Fällen erfolgreich. Die Beweiskraft von Tierhaaren hängt jedoch davon ab, wie gut ein Untersucher sie mit einer bestimmten Quelle in Verbindung bringen kann. Die im Haarschaft enthaltene mitochondriale DNA spielt aus diesem Grund in der Forensik eine wichtige Rolle: Die haploide Form sowie das Vorliegen in einer Kopienzahl von 10³ bis 10⁴ pro Zelle erleichtert die Amplifikation und Sequenzierung. Der maternale Vererbungsmodus ermöglicht Aussagen über mütterliche Linien, und hohe Mutationsraten im hypervariablen Bereich erlauben die Identifikation einzelner Individuen.

Zur Analyse der Variabilität mitochondrialer DNA und ihrer Einsatzmöglichkeiten in der Fo- rensik untersuchte SAVOLAINEN et al. (1997) die hypervariable Region bei 102 Hunden aus insgesamt 52 Rassen (s. Kap. 5.1.). Dabei wurden insgesamt 19 Varianten, die sich an 23 Po- sitionen²⁴ unterschieden, identifiziert. Die drei häufigsten Varianten schlossen 51% der unter- suchten Individuen ein, die sechs häufigsten Haplotypen 75% der Population. Die discrimina-

24 21 Transitionen, 1 Transition/Transversion, 1 Insertion.

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tion power²⁵ der caninen hypervariablen Region betrug 0,88 im Vergleich zu 0,97 beim Men- schen. Eine einzelne Nukleotidposition erwies sich dabei als besonders variabel und ist als hot spot mit einer Ausschlusswahrscheinlichkeit von 58% einsetzbar.

Eine generelle Korrelation zwischen einzelnen Rassen und Sequenzvarianten war nicht er- sichtlich, obwohl eine deutliche Überrepräsentation einzelner Haplotypen in bestimmten Ras- sen beobachtet werden konnte. Zur sicheren Verwendung der d-loop für forensische Zwecke ist folglich die Erstellung von Sequenzdatenbanken nötig, um Angaben zur statistischen Wahrscheinlichkeit der jeweiligen Variante in unterschiedlichen Rassen zu erhalten.

Zum Identitätsvergleich von Spuren-DNA mit potentiellen Tätertieren bei Routineproben ist jedoch die Mikrosatelliten-Analyse die klassische Methode, da die darauf basierenden Tests einfach durchzuführen und auszuwerten sind. Die Defizite dieser Methode bei der Analyse qualitativ und quantitativ minderwertiger DNA-Proben (siehe oben) machten die Entwicklung effizienter DNA-Extraktionsmethoden (PFEIFFER et al. 2004) sowie eine systematische Klas- sifizierung der Mikrosatelliten nötig. Einfache und zusammengesetzte Marker sind als Mittel der Wahl für die Forensik-Routine anzusehen. Sie sind problemlos zu typisieren und zeichnen sich durch kurze Fragmente aus. Diese Eigenschaft ist für die Analyse degradierter DNA be- sonders wichtig. Komplexe und hypervariable Marker dagegen erweisen sich bei speziellen Fragestellungen aufgrund ihrer großen Variabilität als nützlicher. Sie beinhalten oft Allele mit großen Fragmentlängen und sind daher nur für die Analyse von DNA-Proben hoher Qualität geeignet (EICHMANN et al. 2004).

Ähnlich wie bei der Abstammungskontrolle handelt es sich bei der forensischen Identitäts- überprüfung mehrerer in Frage kommender Tiere um ein Ausschlussverfahren, das um so aussagekräftiger wird, je höher der Grad an Polymorphie und die Anzahl der verwendeten Marker sind. Zur Berechnung der „Trefferwahrscheinlichkeit“ (probability of match identity) bei bestimmten Fragestellungen müssen jedoch auch hier umfangreiche populationsgenetische Studien bezüglich der Allelverteilung in einer Referenzpopulation zu Grunde gelegt werden (PADAR et al. 2002).²⁶ Das Fehlen einer international anerkannten standardisierten Laborme- thode sowie einer einheitlichen Auswertungs-Nomenklatur bei der Typisierung caniner DNA-

25 Dies entspricht der exclusion power bei der MS-Analyse.

26 Berechnet wird hier die Wahrscheinlichkeit, mit der ein zufällig gewähltes, nicht verwandtes Tier die gleiche Genotypenkombination aufweist.

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Proben schränkt jedoch bisher – nicht nur in der Forensik – die Vergleichbarkeit verschiede- ner Studien erheblich ein.

2.3.3 Populationsgenetische Studien

2.3.3.1 Speziesabgrenzung und Phylogenie

Aufgrund ihrer hohen Mutationsrate erwies sich die mtDNA als wertvolles Hilfsmittel zur Klärung phylogenetischer Beziehungen zwischen eng verwandten Spezies (Canidae) und ist darüber hinaus hervorragend zur Artabgrenzung geeignet. Während dafür anfangs die codie- renden Bereiche der mtDNA verwendet wurden (WAYNE et al. 1991; DRAGOO & HONEYCUTT

1997), wird mittlerweile die Verwendung der d-loop bei populationsgenetischen Analysen auf Speziesebene bevorzugt.

Bei einer Untersuchung der linken Domäne der d-loop unterschieden sich Wolf und Hund maximal durch 12 Substitutionen, während Hund und Coyote Divergenzen von mindesten 20 Substitutionen aufwiesen (VILA et al. 1997). Im Vergleich dazu lag die Divergenz zwischen Rotwolf und Coyote bei 4-34 Substitutionen und wies auf die nahe Verwandtschaft beider Arten hin (s. Kap. 2.3.3.2). Wichtig für die Speziesabgrenzung mittels d-loop ist jedoch weni- ger der Grad quantitativer Divergenz als das Vorhandensein „fixierter“ Substitutionen inner- halb der Arten. Die Existenz speziesspezifischer Indels²⁷ ist bei Grauwolf, Rotwolf und Coyo- te nachgewiesen und kann für die eindeutige Artzuordnung einzelner Individuen sowie zur Hybrid-Detektion genutzt werden (ADAMS et al. 2003a; ADAMS et al. 2003b; VILA et al.

1999b).

Ein weiterer wichtiger Anwendungsbereich der Populationsgenetik besteht in der genetischen Charakterisierung und Differenzierung nahe verwandter Spezies mittels Mikrosatellitenanaly- se. In verschiedenen populationsgenetischen Studien über die Canidae kamen mehrere Auto- ren zu dem Ergebnis, dass die genetische Divergenz zwischen Mitgliedern dieser Familie in begrenztem Maße auf dem Vorhandensein einzigartiger (privater) Allele bei den einzelnen Spezies (DOLF et al. 2000) bzw. Subpopulationen (SUNDQVIST et al. 2001) beruht. Hauptsäch- lich variieren eng verwandte Arten jedoch bezüglich absoluter Verteilung und genutztem

27 Deletionen und Insertionen.

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Fragmentlängenbereich (Range) der Allele und weisen stark differierende Allelfrequenzen auf (WALL et al. 1993; ROY et al. 1994; FREDHOLM & WINTERO 1995; RANDI & LUCCHINI 2002;

KLUKOWSKA et al. 2003).

Dieselbe Beobachtung konnte auch auf einer tiefer liegenden Ebene der Populationshierarchie – bei der genetischen Charakterisierung verschiedener Hunde-Rassen (FREDHOLM &

WINTERO 1996; ZAJC et al. 1997; ALTET et al. 2001; KOSKINEN & BREDBACKA 2000) – ge- macht werden. Private Allele spielten in diesem Falle nur noch eine untergeordnete Rolle (MORERA et al. 1999).

2.3.3.2 Conservation genetics und Hybrid-Diagnostik

Die MS-Analyse einzelner Spezies und Rassen erlaubt derzeitig nicht nur die Klärung von Verwandtschaftsverhältnissen (IRION et al. 2003; KOSKINEN & BREDBACKA 2000; PARKER et al. 2004) mittels genetischer Distanzen einschließlich der Erstellung phylogenetischer Bäume, sondern hat sich auch als nützliches Hilfsmittel auf dem Gebiet der Erhaltungsbiologie (con- servation genetics) erwiesen. Der veränderte Bedarf des Menschen hatte in den letzten Jahr- zehnten einen bedrohlichen Rückgang „alter“ Nutztierrassen – teils bis zur vollständigen Aus- löschung – zur Folge. Für deren Erhaltung ist die Kenntnis der noch vorhandenen genetischen Variabilität innerhalb der Restpopulation unverzichtbar (SCHWEND 2001).

Der massive Eingriff des Menschen in die Kulturlandschaft hat bei vielen Wildtierarten welt- weit zu drastischer Dezimierung der Populationen sowie zu starker Verinselung (Fragmenta- tion) der letzten Habitate geführt. Die geringe Populationsdichte, kombiniert mit fehlender Zugangsmöglichkeit zu anderen Fortpflanzungsgemeinschaften, hat zur Folge, dass die Cani- den auch koexistente,²⁸ verwandte Spezies bei der Partnerwahl akzeptieren. Die enge Ver- wandtschaft zwischen den Caniden-Spezies resultiert im Vorkommen fertiler Hybride. Ob- wohl zwischen einigen Spezies reproduktive Barrieren (Unterschiede im Verhalten und der Reproduktions-Physiologie) die Entstehung und erfolgreiche Aufzucht von Hybridnachkom- men meistens verhindern, gibt es doch zahlreiche Beispiele für eine erfolgreiche Rückkreu- zung (Introgression) fertiler Hybride in ihre Ursprungspopulationen (RANDI & LUCCHINI

2002; LEHMAN et al. 1991; GOTTELLI et al. 1994; ADAMS et al. 2003a; VILA et al. 2003a).

Solange die Hybridisierung nur in einem schmalen Randbereich zweier Populationen bzw.

28 Zur gleichen Zeit und im gleichen Verbreitungsgebiet vorkommend.