klinisch* sonstige† Ausstellungen sonstige†
DNA TOTAL
DSh 37 - - - 6 43
BC 9 - 5 - 6 20
Dob 9 - 5 - 1 15
Row 12 1 17 - - 30
Box 17 1 2 - - 20
Hov 11 1 10 - - 22
WHT 20 - 3 - - 23
YT 15 1 - - 4 20
Rht 26 - 14 - 1 41
AlM 2 13 6 2 - 23
SHy 10 11 1 2 3 27
IRS 3 - - - 27 30
GR 23 - 15 - 4 42
LR 15 1 15 - - 31
*klinisch = Blutproben aus dem Göttinger Einzugsgebiet
†sonstige= Hunde-Ausstellungen, Körung, Hunderennen, Privateinsendungen
Bei sämtlichen Proben, die bei Ausstellungen und Körungen gesammelt wurden oder aus pri-vaten Einsendungen stammten, lagen vollständige Pedigree-Daten zum jeweiligen Tier vor.34 Zwecks Klärung der Reinrassigkeit wurde bei den Blutproben klinischer Herkunft auf die Besitzerangaben in der Patienten-Kartei zurückgegriffen. Um eine Doppelbeprobung einzel-ner Tiere zu vermeiden, wurden dabei genaue Aufzeichnungen über Entnahmedatum, Tier- und Besitzername gemacht. Bei den DNA-Proben aus dem institutseigenen Archiv wurden die Angaben auf dem ursprünglichen Einsendeformular überprüft, um die Verwendung eng verwandter Tiere zu verhindern.
Während die meisten der klinischen Proben von Tieren gewonnen wurden, die aus dem Ein-zugsgebiet der Stadt Göttingen und damit vermutlich überwiegend von lokalen
34 Obligate Angaben: vollständiger Zwingername, Zuchtbuch-Nr., Elterntiere und Zuchtgebiet.
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gern in Südniedersachsen, Nordhessen und Thüringen abstammen, konnten mit den übrigen Probanden Tiere aus der gesamten Bundesrepublik sowie anderen europäischen Ländern und den USA erfasst werden (s. Anhang, Tabelle 30).
Als minimale Stichprobengröße wurden 20 Tiere pro Rasse festgelegt. Um einen möglichst repräsentativen Rasse-Querschnitt zu erhalten, wurden auch seltenere, dem jeweiligen Stan-dard entsprechende Farbschläge mitberücksichtigt. Beim Rht wurden alle Größenvarianten (Standard-, Zwerg- und Kaninchenteckel) in die Untersuchung miteinbezogen. Insgesamt fand keine Trennung nach Arbeits- und Show-Linien statt.
3.1.1.3 Probenentnahme
Bei Verwendung von Blut als Ausgangsmaterial wurde ca. 1ml pro Tier entnommen und di-rekt in beschriftete sterile Röhrchen mit EDTA zur Gerinnungshemmung verbracht. An-schließend wurde das Blut bis zur Isolierung der DNA bei -20°C eingefroren. Zur Vermei-dung von Kontaminationen bei der Beprobung von mehreren Tieren hintereinander wurde zwischendurch eine gründliche Reinigung und Desinfektion der Hände vorgenommen sowie ausschließlich steriles Einwegmaterial verwendet.
Haarproben wurden mittels steriler Pinzette und mit Einmalhandschuhen einschließlich der Wurzeln von Hals-, Rücken- und Flankenpartie ausgezupft (10-30 Haare). Um Kontaminatio-nen zu vermeiden, wurden die entnommeKontaminatio-nen Haare sofort in eiKontaminatio-nen beschrifteten Briefum-schlag überführt und dieser verschlossen. Desweiteren wurde die verwendete Pinzette nach jeder Benutzung mit Zellstoff grob gereinigt und danach einige Minuten in 96%igem Ethanol eingelegt.
3.1.2 Molekulargenetische Methoden und Arbeitsprotokolle
3.1.2.1 DNA-Isolierung aus Blut
Unter Verwendung des Qiamp DNA Blood Mini Kits (Qiagen) wurde die DNA aus den EDTA-Blutproben nach folgendem Protokoll isoliert:
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1. gründliches Vortexen der aufgetauten Blutproben
2. 100µ l nicht geronnenes Vollblut in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorff-Tube) überpipettieren
3. nacheinander +100µ l HPLC, +200µ l AL-Puffer (Qiagen), +30µ l Protease (Qiagen) 4. den Ansatz 30sec schütteln/vortexen, danach kurz abzentrifugieren
5. Inkubation im Wasserbad bei 65°C für mind. 15-20min
6. +200µ l Ethanol 96%, 30sec schütteln/vortexen, danach kurz abzentrifugieren 7. den flüssigen Inhalt des Gefäßes auf eine Qiagen-Säule überführen
8. Zentrifugation bei 6000rpm für 4min
9. Eluat verwerfen, neues Auffanggefäß montieren 10. + 500µl AW1-Puffer (Qiagen)
11. Zentrifugation 6000rpm für 2min
12. Eluat verwerfen, neues Auffanggefäß montieren 13. +500µ l AW2-Puffer (Qiagen)
14. Zentrifugation bei 6000rpm für 2min
15. Eluat verwerfen, Montage der Säule auf ein Reaktionsgefäß 16. 100µ l AE-Puffer35 (Qiagen) auf die Säule pipettieren 17. Inkubation bei Raumtemperatur für 1min
18. Zentrifugation bei 14000rpm für 2min 19. Einfrieren des Eluats bei -20°C
3.1.2.2 DNA-Isolierung aus Haaren
Mit in 96%igem Ethanol steril gemachtem Besteck von ca. 30 Haaren die Wurzeln abschnei-den und in ein Eppendorff-Reaktionsgefäß überführen; +200µ l HPLC, +200µ l AL-Puffer (Qiagen), +30µ l Protease (Qiagen); weiteres Protokoll: siehe oben im Text
Zur Überprüfung der Eignung eines in der Forensik bevorzugt eingesetzten Extraktions-Puffers wurden die auf Ausstellungen gewonnenen Haare alternativ folgender Isolationsme-thode unterzogen (Qiagen, modifiziert):
35 AE-Puffer vorher auf 65°C vorwärmen.
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Herstellung des TCA-Puffers:
• 0,121g Tris
• 0,584g NaCl
• 2,000g SDS
• 0,601g DTT
• 0,011g CaCl2
Danach mit Aqua Bi-Dest auf 100ml auffüllen und auf pH 8,0 einstellen.
Protokoll nach Qiagen, modifiziert:
• Haare komplett oder die Wurzeln mit ca. 1,5cm Haarschaft in ein Reaktionsgefäß überführen36
• nacheinander +200µ l TCA-Puffer (max. 14 Tage alt); + 35µ l Proteinase K
• den Ansatz 30sec schütteln/vortexen, danach kurz abzentrifugieren
• Inkubation im Wasserbad bei 55°C für mind. 2h, im Abstand von 30min vortexen und kurz abzentrifugieren
• +200µ l AL-Puffer; +200µ l Ethanol 96%, 30sec schütteln/vortexen, danach kurz ab-zentrifugieren (14000rpm)
• den flüssigen Inhalt auf eine Qiagen-Säule überführen weiteres Protokoll: s. Kap. 3.1.2.1
3.1.2.3 Photometrische DNA-Quantifizierung
Zur ungefähren Abschätzung des DNA-Gehaltes der isolierten Proben wurden stichprobenar-tige Konzentrationsmessungen mittels Photometer durchgeführt. Verwendet wurde hierfür das Modell Gene Quant Pro. Um den Verbrauch an DNA-Extrakt möglichst gering zu halten, wurde eine Messküvette (Pathlength 5 mm) aus Spectrosil eingesetzt, die DNA im Verhältnis
36 Nach jeder Probenvorbereitung Handschuhe wechseln und Besteck gründlich desinfizieren.
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1:1 mit HPLC-Wasser verdünnt und am Photometer der Verdünnungsfaktor 2 eingestellt. Die Messung wurde nach folgendem Protokoll vorgenommen:
• Kalibrierung des Gerätes mit HPLC-Wasser
• Mischen von 5µ l HPLC-Wasser mit 5µ l DNA zur Vorbereitung
• Überpipettieren der Probe in die Messküvette (Füllvolumen 10µ l)
• Zur Vermeidung verfälschter Ergebnisse, Kontrolle der Küvette auf Luftblasen mittels Lupe
• Konzentrationsmessung der DNA
• Absaugen der Probe, zweimaliges Spülen der Küvette mit HPLC-Wasser
3.1.2.4 Genotypisierung
3.1.2.4.1 Polymerase-Ketten-Reaktion
Die PCR dient als molekulargenetisches Verfahren zur Vervielfältigung (Amplifikation) spe-zifischer DNA-Abschnitte. Dabei bedient man sich in vitro natürlicher Replikations- und Re-paraturmechanismen der DNA. Der zu amplifizierende Bereich wird durch die Auswahl der jeweiligen Primerpaare determiniert. Die Bedingungen der PCR sind abhängig von den Pri-mersequenzen, die bei einer bestimmten Optimaltemperatur am besten „annealen“ und damit maximale Ausbeute erreichen. Um Arbeits- und Kostenaufwand zu minimieren, werden be-vorzugt mehrere Primerpaare in einer PCR kombiniert (multiplex). Die Temperatur-Bedingungen sollten dabei so gewählt werden, dass alle Amplifikate ausreichend und in an-nähernd gleicher Menge vorliegen. Für die folgenden Untersuchungen stand ein 10fach-Multiplex-Set zur Verfügung, das in der routinemäßigen caninen Abstammungskontrolle be-reits seit mehreren Jahre Anwendung findet: StockMarks for Dogs, Canine Genotyping Kit (Applied Biosystems).
Tabelle 3 bietet einen Überblick zu den wichtigsten Eigenschaften der im Marker-Set enthal-tenen Mikrosatelliten. In der sich anschließenden Tabelle 4 sind die Sequenzen der eingesetz-ten Primerpaare für die Multiplex-PCR aufgeführt. Der fwd-Primer ist dabei jeweils mit dem dazugehörenden Farbstoff versehen (Label).
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Tabelle 3: Im Kit StockMarks for Dogs enthaltene Marker einschließlich Basis-Eigenschaften, Allel-Länge und Farbmarkierung
Tabelle 4: Primersequenzen für die im Multiplex-Set enthaltenen Marker
Marker FWD (+Label) REV
Der Reaktionsansatz für die Multiplex-PCR ist in Tabelle 5 dargestellt. Die PCR erfolgte an-schließend in einem auf 95°C vorgeheizten Hybaid OmnE-Cycler bei folgendem
37 PEZ-Marker sind im US Patent 05874217 dokumentiert (HALVERSON et al.1995), die FHC-Marker gehen auf das Fred Hutchinson Center (FRANCISCO et al. 1996) zurück.