Vergleichende Tumorgenetik: Der Hund (Canis familiaris) als Modelltier für die humane Tumorgenese

Vergleichende Tumorgenetik:

Der Hund (Canis familiaris) als Modelltier für

die humane Tumorgenese

Dissertation

Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften -Dr. rer. nat. –

Dem Promotionsausschuss Dr. rer. nat

im Fachbereich Biologie / Chemie der Universität Bremen

vorgelegt von Susanne Winkler

1. Gutachter: Prof. Dr. J. Bullerdiek 2. Gutachter: Prof. Dr. I. Nolte

sen der vorliegenden Dissertation „Vergleichende Tumorgenetik: Der Hund (Canis

familiaris) als Modelltier für die humane Tumorgenese“ folgende drei Aussagen

zu-treffen:

1. Ich habe die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt.

2. Ich habe keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel be-nutzt

3. Ich habe die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht.

Bremen, 2007

Not failure, but low aim, is crime.

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...VII

1. EINLEITUNG ... 1

2. MATERIAL UND METHODEN... 7

2.1. Primärzellkultur von Adhäsionskulturen... 7

2.2. Primärzellkultur von Suspensionskulturen ... 7

2.2.1. Zellkultur von Knochenmarkaspiraten ... 7

2.2.2. Zellkultur von Lymphozyten ... 7

2.3. Kultivierung von Zelllinien ... 8

2.4. Kryokonservierung von Zellkulturen ... 8

2.4.1. Einfrieren lebender Zellen ... 8

2.4.2. Auftauen gefrorener Zellen... 8

2.5. Zytogenetische Methoden ... 9

2.5.1. Chromosomen-Präparation von Adhäsionskulturen... 9

2.5.2. Chromosomenpräparation von Suspensionskulturen... 9

2.5.3. GTG-Färbung ... 9

2.5.4. Karyotypanalyse ... 10

2.6. Molekular-zytogenetische Methoden... 10

2.6.1. DNA-Isolierung aus caninem Vollblut ... 10

2.6.2. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)... 11

2.6.2.1. Markierung der Sonden DNA durch Nick-Translation ... 11

2.6.2.2. Herstellung von ultraschall-behandelter Hunde DNA (sdDNA) ... 11

2.6.2.3. Hybridisierung ... 11

2.6.2.4. Auswertung... 12

2.6.3. Erzeugung Adeno-assoziierter Viren... 12

2.6.4. Proliferationsassays mit Adeno-assoziierten Viren und CT 1258 ... 12

2.7. Erstellen der Gewebebank... 13

2.7.1. Entnahme von Gewebeproben... 13

2.7.2. Lagerung der Gewebeproben... 14

2.7.3. Katalogisieren der Gewebeproben... 14

2.8. Molekulargenetische Methoden ... 14

2.8.1. RNA-Isolierung aus Gewebe... 14

2.8.2. RNA-Isolierung aus der Zell-Linie CT 1258... 15

2.8.3. DNase Verdau... 15

2.8.5. Amplifikation von DNA-Fragmenten durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 16

2.8.6. Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Fragmente... 16

2.8.7. Real-Time PCR (Quantitativ) ... 17

3. ERGEBNISSE... 18

3.1. Zytogenetische Ergebnisse... 18

3.1.1. Cytogenetic investigations in four canine lymphomas ... 18

3.1.2. Establishment of a cell line derived from a canine prostate carcinoma with a highly rearranged karyotype ... 18

3.1.3. Polysomy 13 in a canine prostate carcinoma underlining its significance in the development of prostate cancer ... 19

3.2. Molekular-zytogenetische Ergebnisse ... 19

3.2.1. Molecular characterization and mapping of the canine KRAB zinc finger gene ZNF331... 20

3.2.2. The protein kinase B, gamma (AKT3) gene maps to canine chromosome 7 ... 21

3.2.3. Molecular characterization and mapping of the canine cyclin D1 (CCND1) gene.... 21

3.2.4. The canine NRAS gene maps to CFA 17 ... 22

3.2.5. The canine KRAS2 gene maps to chromosome 22 ... 22

3.2.6. Cloning and characterization of the canine receptor for advanced glycation end products.... 23

3.3. Erstellen der Gewebebank... 23

3.4. Molekulargenetische Ergebnisse... 24

3.4.1. Absence of ras-gene hot-spot mutations in canine fibrosarcomas and melanomas... 24

3.4.2. RAS gene hot-spot mutations in canine neoplasias. ... 25

3.4.3. Expression pattern of the HMGB1 gene in sarcomas of the dog. ... 25

3.4.4. The canine HMGA1. ... 26

3.4.5. "Best friends" sharing the HMGA1 gene: comparison of the human and canine HMGA1 to orthologous other species... 27

3.4.6. HMGA2 Expression in a Canine Model of Prostate Cancer ... 28

3.4.7. Inhibitory effect of antisense HMGA AAV-mediated delivery suppresses cell proliferation in canine carcinoma cell line ... 28

4. DISKUSSION... 30

5. ZUSAMMENFASSUNG ... 40

6. SUMMARY... 42

8. DANKSAGUNG ... 61 9. PUBLIKATIONSÜBERSICHT... 63

Abkürzungsverzeichnis

µ Mikro- (10-6)

Abb. Abbildung

AGE Advanced glycation endproducts

AK Antikörper

AKT3 Protein Kinase B, gamma Gen

ALL akute lymphatische Leukämie

AML akute myeloische Leukämie

AP2 Poly(A)-Adapter-Primer AS Aminosäure as antisense bp, kb Basenpaare, kilobasenpaare °C Grad Celsius CCND1 Cyclin D1 Gen

cDNA copy DNA

CDS coding Sequence

CFA Canis Familiaris

CML chronische myeloische Leukämie

Da Dalton

dNTP desoxynukleosid-5’-triphosphat

dH2O bidestilliertes Wasser

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA / DNase Desoxiribonukleinsäure / Desoxiribonuklease

ds doppelsträngig

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ER estrogen receptor

EST expressed sequence tag, cDNA Fragment

et al. et altera

FAB-Klassifikation French-American-British-Klassifikation

FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung

FKS fetales Kälberserum

g Erdbeschleunigung

GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase

GC- Guanin- bzw. Cytosin

GTG G-Bänderung mit Trypsin und Giemsa

HCl Salzsäure

HMG High mobility Group

HMGA1/HMGA2 High mobility Group A1/A2 Gen

HSA Homo sapiens

ISCN An International System for Human Cytogenetic

Nomenclature

k kilo (103)

KCl Kaliumchlorid

kDa Kilo Dalton

KM Knochenmark

KRAS2 v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral Onkogene

homolog

LB Luria-Bertani

LHCGR luteinizing hormone/choriogonadotropin

LTR Long Terminal Repeat

Lsg Lösung

m milli (10-3)

M Molar

MAP Mitogen activated protein

min Minute

MgCl2 Magnesiumchlorid

M-MLV Moloney murine leukemia virus

mRNA messenger-RNA

NCBI National Center for Biotechnology Information

NFDM non fat dried milk

NRAS Neuroblastoma RAS viral (v-ras) Oncogene

homolog

ORF open reading frame

OT Objektträger

PBS phosphate buffered saline

PCR polymerase chain reaction

rAAV rekombinante Adeno-assoziierte Viren

RAGE receptor for advanced glycation end products

RNA Ribonukleinsäure

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

sdDNA sonicated Dog-DNA

ssDNA salmon-sperm-DNA

sec Sekunde

SSC sodium-saline Citrat

T4 Bakteriophage T4

TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

Taq Polymerase Thermus aquaticus DNA Polymerase

TE Tris-EDTA

U Unit

UTR Untranslatierte Region

UV Ultraviolett

V Volt

vg virus genome titer

Vol Volumen

1. Einleitung

Für die Erforschung der genetischen Grundlagen von Krebserkrankungen werden schon seit geraumer Zeit Tiermodelle verwendet. Allerdings wurde dabei bisher zum großen Teil auf Nagetiermodelle zurückgegriffen, bei denen die Tumoren unter Sup-pression des Immunsystems induziert oder transplantiert wurden. Erst in den letzten Jahren ist der Hund als Modelltier in den Mittelpunkt des Interesses gerückt. Hund und Mensch teilen den gleichen Lebensraum, haben eine ähnliche Ernährung und sind somit in der Regel den gleichen Lebensbedingungen ausgesetzt. Umwelteinflüs-se, die unter Umständen kanzerogen wirken können, betreffen daher beide Spezies in ähnlicher Weise (Vail and MacEwen, 2000). Im Falle einer Erkrankung steht dem Tier bzw. seinem Halter die moderne Tiermedizin auf hohem Niveau zur Verfügung, bei der die Behandlung und der Krankheitsverlauf von spezialisierten Tierärzten zu-meist lückenlos dokumentiert werden (Ostrander et al., 2000). Die Bereitschaft der Tierhalter, an Studien teilzunehmen und dem Tier die bestmögliche Behandlung zu-kommen zu lassen, ist in den meisten Fällen sehr hoch. Verschiedene Untersuchun-gen haben gezeigt, dass der Hund etwa doppelt so häufig an Krebs erkrankt wie der Mensch, wobei einige Krebsarten eine höhere Inzidenz aufweisen als andere (Withrow and MacEwen, 1989; Nolte and Nolte, 2000; Vail and MacEwen, 2000; Withrow and MacEwen, 2001). Die überwiegende Zahl der Tumoren des Hundes ent-steht spontan, d.h. die Tumoren müssen – im Gegensatz zu den häufig verwendeten Nagetiermodellen – nicht künstlich induziert oder transplantiert werden (Mayr et al., 1991a; Bartnitzke et al., 1992a; Bartnitzke et al., 1992b; Mayr et al., 1992b; Mayr et al., 1993; Nolte et al., 1993; Hahn et al., 1994; Reimann et al., 1996b; Reimann et al., 1999b; Thomas et al., 2003; Meyer et al., 2004a; Murua Escobar et al., 2004a). Sie zeigen in vielen Fällen eine ähnliche Biologie und Histopathologie wie Tumorerkran-kungen beim Menschen, bedingt durch die kürzere Lebensspanne des Hundes entwi-ckeln sie sich jedoch in weitaus kürzerer Zeit. Für die Forschung ist dieser Umstand insofern von Vorteil, als er die Beobachtung der Tumorentwicklung und der Wirksam-keit der gewählten Therapie vereinfacht (Withrow and MacEwen, 1989; MacEwen, 1990; Hahn et al., 1994). Man geht davon aus, dass eine randomisierte klinische Stu-die für ein neues Medikament am Hundemodell in ca. 1 – 3 Jahren abgeschlossen sein kann, während eine vergleichbare Studie am Menschen etwa 5 – 15 Jahre in Anspruch nimmt (Hansen and Khanna, 2004). Dabei erlauben die Anatomie und die Physiologie des Hundes eine größere Übertragbarkeit der gewonnenen Erkenntnisse

auf den Menschen als dies zwischen Nagern und Menschen der Fall ist (Kirkness et al., 2003). Die Anatomie von Hunden zeigt gegenüber der Anatomie von Nagetieren deutliche Vorteile im Hinblick auf die Evaluierung verschiedener therapeutischer Me-thoden und deren Übertragbarkeit auf den Menschen. Diese MeMe-thoden beinhalten z. B. Operationstechniken, Chemotherapie, Bestrahlung, Hyperthermie aber auch Gen-therapie. So dienten z.B. Hunde mit Osteosarkomen als Modell für die Entwicklung neuer Operationstechniken, die heute in der Versorgung kindlicher und adulter Kno-chentumoren eingesetzt werden (Withrow et al., 1993; Hansen and Khanna, 2004). Das canine Osteosarkom zeigt viele Gemeinsamkeiten mit dem menschlichen kindli-chen Osteosarkom bezüglich z.B. der Histologie des Primärtumors, Mikrometastasie-rung und Ansprechen auf Chemotherapeutika wie Cisplatin und Anthracycline. Ande-re canine TumoAnde-rerkrankungen, die große Ähnlichkeiten bezüglich der Tumorbiologie zu ihrem menschlichen Pendant aufweisen sind z.B. das canine Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), welches ein gutes Modell für das humane NHL und andere spontan auftretende Neoplasien des lymphatischen Systems darstellt, sowie das canine Pros-tatakarzinom (Hansen and Khanna, 2004). Hunde sind neben dem Menschen die einzigen Säugetiere, bei denen das Prostatakarzinom spontan auftritt. In beiden Spe-zies handelt es sich um eine invasive Erkrankung mit einer Neigung zur Metastasie-rung in Knochen oder Lunge durch das Blut oder das lymphatische System. Dabei sind vorrangig ältere Individuen betroffen, mit einem durchschnittlichen Erkrankungs-alter von 10 Jahren bei Hunden und 71 Jahren beim Menschen (MacEwen, 1990; Switonski et al., 1996; Boutemmine et al., 2002; Bertz et al., 2004). Die Verwendung des Hundemodells erlaubt Biopsien von betroffenem und nicht betroffenem Gewebe sowie die wiederholte Untersuchung von Körperflüssigkeiten wie Serum, Blut und U-rin. Dabei werden Studien, die letztlich auch dem behandelten Tier zu Gute kommen, besser von der Öffentlichkeit akzeptiert als Studien an eigens gezüchteten Labortie-ren (Hansen and Khanna, 2004). Die gesammelten Proben von betroffenen TieLabortie-ren ermöglichen schließlich eine Vielzahl verschiedener Studien wie z.B. Untersuchungen zur Molekulargenetik und Molekularbiologie der Erkrankungen.

Sowohl die Tumoren des Hundes als auch des Menschen weisen verschiedene chromosomale Aberrationen auf, die in die Tumorgenese involviert sind. Im Men-schen sind eine Vielzahl verschiedener numerischer Aberrationen, wie Tri- und Mo-nosomien (Anastasi et al., 1992; Bullerdiek et al., 1993; Banerjee et al., 1997;

Mitel-man et al., 1997; Czepulkowski et al., 2002), aber auch chromosomale Rearrangie-rungen (Collins et al., 1987; Ashar et al., 1995; Petit et al., 1996; Dal Cin et al., 1998; Tallini and Dal Cin, 1999; Ligon and Morton, 2000; Lemke et al., 2001) bekannt. Der im Vergleich zum Menschen äußerst komplexe Karyotyp des Hundes macht zytoge-netische Untersuchungen an caninen Tumoren ungleich schwerer. Der Hund besitzt 76 akrozentrische Autosomen, die sich in der Größe nur gering unterscheiden, sowie metazentrische X- und Y-Chromosomen. Bedingt durch diesen komplexen Karyotyp kam es erst spät zur Erstellung einer einheitlichen Nomenklatur für canine Chromo-somen (Selden et al., 1975; Manolache et al., 1976; Stone et al., 1991; Graphodatsky et al., 1995; Reimann et al., 1996a; Breen et al., 1999a). Im Vergleich zu der Situation beim Menschen, sind Berichte über chromosomale Veränderungen im Hund immer noch rar. Dennoch fielen verschiedene, numerische und strukturelle, chromosomale Aberrationen auf, die als Ursache für verschiedene Krankheitsbilder beim Menschen schon seit geraumer Zeit bekannt sind. Darunter befinden sich Mono- oder Trisomien der X-Chromosomen, zentrische Fusionen und reziproke Translokationen, wobei letz-tere jedoch einen sehr geringen Anteil darstellen (Switonski et al., 2004). In caninen Neoplasien finden sich überwiegend Trisomien, welche als dritte Kopie eines Chro-mosoms oder als Isochromosomen auftreten können (Bartnitzke et al., 1992b; Nolte et al., 1993; Mayr et al., 1994; Reimann et al., 1996b; Reimann et al., 1998), aber auch verschiedene strukturelle Veränderungen wie Translokationen (Mayr et al., 1990a; Hahn et al., 1994) derivative Chromosomen (Reimann et al., 1999b) oder zentrische Fusionen (Mayr et al., 1991b; Horsting et al., 1999) wurden häufiger beo-bachtet. Monosomien caniner Chromosomen werden hier eher selten beschrieben (Mayr et al., 1991a). In einer Studie, in der 270 canine Tumoren verschiedenen histo-logischen Ursprungs untersucht wurden, konnten in 23% der Fälle klonale zytogeneti-sche Veränderungen sowohl in benignen, als auch in malignen Tumoren gefunden werden. Beide Gruppen zeigten einer höhere Inzidenz für klonale Veränderungen bei den mesenchymalen Tumoren, wie Sarkome und Lipome, als bei den epithelialen Tumoren. Diese Erkenntnis ist vergleichbar zu den Verhältnissen beim Menschen (Reimann et al., 1999a).

Durch die Verwendung von Painting-Sonden (reciprocal Zoo-FISH) konnte gezeigt werden, dass die caninen Chromosomen in weiten Abschnitten Homologien zu den Chromosomen des Menschen aufweisen, so dass verschiedene Abschnitte der

cani-nen Chromosomen bestimmten Regiocani-nen der menschlichen Chromosomen zugeord-net werden konnten (Breen et al., 1999b; Yang et al., 1999). Ähnlich wie beim Men-schen ist auch für den Hund zwiMen-schenzeitlich die Genomsequenz bekannt (McPherson et al., 2001b; Venter et al., 2001; Lindblad-Toh et al., 2005). Den Nach-weis einzelner Gene, die Homologien zwischen beiden Spezies aufNach-weisen liefert die sog. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH). Im Gegensatz zu den Painting-Sonden, welche relativ große Bereiche (bis zu 2000 kb) überspannen können, wer-den für das Mapping bestimmter Gene relativ kleine, genspezifische Sonwer-den (100 – 300 kb) verwendet. Im Jahr 2001 waren bereits etwa 1246 Gene (McPherson et al., 2001a) und im März 2006 bereits etwa 11000 Gene im menschlichen Genom lokali-siert (NCBI, 2006). Mit Hilfe des sog. physikalischen Mappings war es bis 2004 ge-lungen, ca. 70 verschiedene (krankheitsrelevanter) Gene im Genom des Hundes zu lokalisieren (Switonski et al., 2004), darunter zum Beispiel das hypocretin (orexin) receptor 2 Gene (Hcrtr2), welches im Zusammenhang mit caniner Narkolepsie steht, auf dem Chromosom 12 des Hundes (Lin et al., 1999), das canine Her2 /neu

(ERBB2) auf Chromosom 1q13.1 des Hundes (Murua Escobar et al., 2001) sowie die

caninen High mobility Group Proteine HMGA1 und HMGB1 auf den Chromosomen 23 bzw. 25 des Hundes (Becker et al., 2003; Murua Escobar et al., 2003).

Viele dieser Gene wie z.B. die Mitglieder der HMG-Proteinfamilie sind evolutionär hochkonserviert. So weist z.B. das canine HMGB1 für das vollständige Gen eine Se-quenzhomologie von 90,8% zum Menschen auf. Betrachtet man nur die codierenden Sequenzen, so ist diese Homologie noch höher und beträgt 95,4 %. Das daraus re-sultierende Protein ist zu 100% identisch zu seinem menschlichen Gegenstück (Murua Escobar et al., 2003). Die HMGB1 Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Organisation der Chromatinstruktur (Wolffe, 1994). Mit ihren DNA-Bindungsdomänen, den sog. HMG-Boxen binden sie mit hoher Affinität sequenzunspezifisch an die kleine Furche doppelsträngiger DNA, was zu einer Aufbiegung in Richtung der großen Fur-che führt. Diese partielle Biegung der DNA beeinflusst die Bindung von Transkripti-onsfaktoren, indem deren Bindungsaffinität herauf- oder herabgesetzt wird (Bustin and Reeves, 1996).

Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit waren die Untersuchungen caniner HMGA Pro-teine. Die evolutionär ebenfalls hochkonservierten HMGA Proteine werden von zwei verschiedenen Genen, die als HMGA1 und HMGA2 bezeichnet werden, codiert. Da-bei verfügt HMGA1 über zwei Splicevarianten, die wiederum als HMGA1a und

HMGA1b bezeichnet werden. Alle drei Proteine stellen wichtige architektonische Transkriptionsfaktoren dar. Die HMGA Proteine verfügen über drei DNA-bindende Domänen, die sog. AT-Hooks, mit denen sie an AT-reiche Sequenzen in der kleinen Furche der DNA-Doppelhelix binden und bedeutende Funktionen in der Gen-Regulation und Chromatin-Organisation übernehmen: Es wird angenommen, dass HMGA Proteine in chromosomale Rearrangierungen in verschiedenen Tumoren in-volviert sind und die Bildung von Multi-Protein-Komplexen, den sog. Enhanceosomen in Promoterregionen fördern und dadurch das Expressionsmuster einer Vielzahl von Genen, sowohl in positiver, als auch in negativer Weise beeinflussen (Friedmann et al., 1993; Schoenmakers et al., 1995; Reeves, 2000; Reeves et al., 2001).

Für den Menschen ist eine Vielzahl maligner Neoplasien bekannt, deren Entstehung mit der Überexpression von HMG-Genen assoziiert zu sein scheint (Chiappetta et al., 1995; Fedele et al., 1996; Rogalla et al., 1997; Xiang et al., 1997; Tallini and Dal Cin, 1999; Abe et al., 2000; Fedele et al., 2001; Flohr et al., 2001; Brezniceanu et al., 2003; Czyz et al., 2004; Miyazawa et al., 2004; Takaha et al., 2004; Ishiguro et al., 2005; Sarhadi et al., 2006). Die Überexpression von HMGA Proteinen ist charakteris-tisch für eine Vielzahl maligner Tumoren, was auf eine Verbindung zwischen einem hohen Titer des Proteins und der neoplastischen Veränderung hinweist (Tamimi et al., 1993; Chiappetta et al., 1995; Fedele et al., 1996; Bandiera et al., 1998; Chiappet-ta et al., 1998; Abe et al., 1999; Abe et al., 2000; Czyz et al., 2004). Insbesondere in menschlichen Prostatakarzinomen ist die Überexpression von HMGA Proteinen mit dem Auftreten eines hochmalignen Phänotyps assoziiert, daher wird die HMGA-Expression in (Prostata-)Tumoren als molekularer Marker diskutiert (Tamimi et al., 1993; Scala et al., 2000; Takaha et al., 2002). Diese Vermutung wird durch die Be-funde von Scala et al. unterstützt, die im Jahr 2000 nachweisen konnten, dass eine Antisense Therapie mit Hilfe adenoviraler Vektoren in Nacktmäusen mit induzierten HMGA2 positiven Tumoren zu einer deutlichen Verkleinerung der Tumoren führte, ohne dabei die gesunden Zellen zu beeinflussen.

Die vorliegende Arbeit gliedert sich im Wesentlichen in fünf Abschnitte: Zunächst wurden verschiedene canine Neoplasien zytogenetisch untersucht und auf das Vor-handensein wiederkehrender chromosomaler Aberrationen, wie sie vom Menschen bereits bekannt sind, untersucht. Anschließend erfolgte die molekular-zytogenetische Lokalisation verschiedener tumorrelevanter Gene im caninen Genom

(FISH-Mapping). Für die weitere molekulargenetische Untersuchung einzelner tumorrele-vanter Gene wurde zunächst eine Gewebebank für canine Tumoren und Normalge-webe aufgebaut. Verschiedene Proben aus dieser GeNormalge-webebank, sowie Zellen aus einer im Rahmen der vorliegenden Arbeit neu etablierten, spontan immortalisierten Zell-Linie wurden anschließend auf die Expression von HMGA Proteinen untersucht. Zusätzlich wurde die Zell-Linie für die Entwicklung von Modellen zur Gentherapie mit Hilfe von Adeno-assoziierten Viren verwendet.

2. Material und Methoden

2.1. Primärzellkultur von Adhäsionskulturen

Gewebeproben verschiedener Tumoren zur zytogenetischen Untersuchung wurden entweder in der Tierärztlichen Hochschule Hannover oder an der Medizinischen Hochschule Hannover entnommen und in 13 ml-Röhrchen mit Hanks-Lösung (200 IU/ml Penicillin, 200µg/ml Streptomycin) an das Zentrum für Humangenetik geschickt. Jede Probe wurde mit Hilfe einer Pinzette und einer Pinzettenschere zerkleinert und mit 4 ml 0,35% Collagenase (200 U/ml, Serva) versetzt. Die Suspension mit den ver-einzelten Tumorzellen wurde in ein bis drei 50 ml-Zellkulturflaschen mit jeweils 5 ml Medium 199 (Earle’s Salze, 20% fötales Kälberserum, 2% Antibiotika) bei 37°C, 5% CO2 und 95%iger Luftfeuchte inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die Anheftung der Zellen im Phasenkontrastmikroskop (Zeiss) kontrolliert. Bei angewachsenen Zellen wurde zweimal pro Woche ein Mediumwechsel durchgeführt. Die Subkultivierung dicht gewachsener Zellschichten erfolgte durch Inkubation mit 1 ml Trypsin/EDTA -Lösung (Biochrom) bei 37°C und Verteilen der Zellen auf zwei bis drei neue mit Me-dium 199 gefüllte 50 ml-Zellkulturflaschen. Das Zellwachstum wurde im Phasenkon-trastmikroskop überprüft, bei hohem Mitoseindex wurden von verschieden Passagen der Kultur Chromosomen präpariert.

2.2. Primärzellkultur von Suspensionskulturen

2.2.1. Zellkultur von Knochenmarkaspiraten

Knochenmarkaspirate wurden in der Tierärztlichen Hochschule Hannover entnom-men, mit 1 ml Heparin (Roche) versetzt und an das Zentrum für Humangenetik ge-schickt. Jeweils ca. 1 ml des Aspirates wurden semisteril in 50 ml-Zellkulturflaschen gegeben, die zuvor mit je 10 ml Chromosomenmedium A (Biochrom), RPMI 1640-(Gibco), und McCoy-Medium (Biochrom) versehen worden waren. Die Zellkulturfla-schen wurden für 48 Stunden im Wärmeschrank bei 37°C inkubiert. Nach 48 Stunden wurden Metaphase-Chromosomen präpariert.

2.2.2. Zellkultur von Lymphozyten

Für die Durchführung der FISH-Untersuchungen wurden Präparate aus caninen Lym-phozyten hergestellt. Hierzu wurde in der Tierärztlichen Hochschule Hannover von

gesunden Hunden 10 ml venöses Blut in 1 ml Heparin (Roche) aufgenommen und zugeschickt. Jeweils 1 ml dieses Vollblutes wurden für 4 Tage in 10 ml Chromoso-menmedium B (Biochrom) bei 37°C semisteril kultiviert und anschließend Metaphase-Chromosomen präpariert.

2.3. Kultivierung von Zelllinien

Für die Erzeugung Adeno-Assoziierter Viren für die Gentherapie mit Hilfe des AAV-Helper-Free Sytems (Stratagene) wurden die Zelllinien „AAV-293“ und „HT 1080“ nach Herstellerangaben im „Instruction Manual“ kultiviert.

2.4. Kryokonservierung von Zellkulturen

2.4.1. Einfrieren lebender Zellen

Von den Primärzellkulturen sowie von den Zelllinien erfolgte in verschiedenen Passa-gen eine Kryokonservierung. Hierzu wurden Zellen in dicht gewachsenen Monolayern trypsiniert, in ca. 2 ml eiskaltem Medium-DMSO-Gemisch (10% DMSO, Janssen) aufgenommen, in ein Kryo-Röhrchen überführt und auf Eis gelagert. Das schrittweise Einfrieren der Zellen erfolgte durch ein Einfriergerät für biologisches Material. Das Gerät verfügt über eine programmierbare Einheit und einen daran gekoppelten CTE-Messfühler, welcher die aktuelle Temperatur misst. Das Programm (0,7°C/min bis – 12°C und 1°C/min bis –120°C) wurde gestartet, nach Ablauf wurden die Kryo-Röhrchen in flüssigem Stickstoff gelagert.

2.4.2. Auftauen gefrorener Zellen

Das Auftauen gefrorener Zellen erfolgte durch Entnahme des Röhrchens aus dem Stickstoff und Inkubation bei 37°C im Wasserbad. Die aufgetaute Zellsuspension wurde mit 8 ml Medium gewaschen und in eine mit Medium gefüllte Kulturflasche ü-berführt. Die Kultivierung erfolgte unter den in Kapitel 2.1. genannten Bedingungen. Nach 24 Stunden wurde ein Mediumwechsel durchgeführt.

2.5. Zytogenetische Methoden

2.5.1. Chromosomen-Präparation von Adhäsionskulturen

In dicht bewachsene Kulturflaschen mit einem hohen Mitose-Index wurden 60 µl Col-cemid (0,1µg/ml, Biochrom) gegeben und weitere 90 bis 120 min inkubiert. Das Me-dium/Colcemid-Gemisch wurde abgesogen, die Zellen mit ca. 5 ml PBS gewaschen und trypsiniert. Die abgelösten Zellen mit den darin enthaltenen Metaphasen wurden anschließend mit 5 ml, hypotoner Medium 199-Lösung (1:6, Medium 199:Aqua bi-dest) für 25 min bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Die so freigelegten Zellkerne wurden mit einem 3:1 Methanol/Eisessig-Gemisch fixiert und anschließend über Nacht bei -20°C gelagert. Diese Suspension wurde auf 4°C gekühlte, in dH2O gewäs-serte Objektträger getropft. Die so entstandenen Präparate mit Metaphase-Chromosomen wurden für mindestens sechs Tage bei 37°C getrocknet.

2.5.2. Chromosomenpräparation von Suspensionskulturen

Nach Ablauf der jeweiligen Kultivierungszeiten wurden in die Suspensionskulturen jeweils 100 µl Colcemid (0,1µg/ml, Biochrom) gegeben und für weitere zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die hypotone Behandlung erfolgte mit 37°C warmer 1/15 M KCl für 15 (Knochenmark) bzw. 20 min (Lymphozyten). Nach der Fixierung mit Metha-nol/Eisessig erfolgte die Lagerung über Nacht bei –20°C. Am nächsten Tag erfolgte die in Kapitel 2.5.1 beschriebene Herstellung der Chromsomen-Präparate.

2.5.3. GTG-Färbung

Zur Erstellung von Karyogrammen wurde an den auf die Objektträger aufgebrachten und getrockneten Metaphase-Chromosomen eine GTG-Banding (modifiziert nach Seabright, 1971) durchgeführt. Hierzu wurden 15 mg Trypsin-Trockensubstanz (Dif-co) in 50 ml auf 37°C vorgewärmten Sörensen-Puffer (pH 6,8) für mind. 6 min gelöst. In diese Lösung wurden die Präparate für 6 sec eingetaucht, anschließend in einer 2%igen Giemsa-Lösung (Merck) für 10 min gefärbt. Nach dreimaligem Spülen in dH20 wurden die Präparate luftgetrocknet. Für eine dauerhafte Lagerung wurden die Prä-parate mit Entellan (Merck) eingedeckt.

Für den Einsatz der Präparate in der FISH wurde die GTG-Banding weiter modifiziert. Um ein zu starkes Angreifen der Metaphase-Chromosomen zu verhindern, wurden

die chromosomalen Proteine lediglich mit 1,2 mg Trypsin-Trockensubstanz in Sören-sen-Puffer für nur 6 sec verdaut und anschließend für 7 min in einer 1%igen Giemsa-Lösung gefärbt. Für die Karyotypanalyse geeignete Metaphase-Chromosomen wur-den aufgenommen (siehe Kapitel 2.5.4), die Objektträger mit einer 70%igen Ethanol-Lösung für 15 min bei RT auf dem Schüttler entfärbt und anschließend luftgetrocknet.

2.5.4. Karyotypanalyse

Es wurden Karyotypanalysen für canine Tumoren und Knochenmarksaspirate durch-geführt, indem geeignete GTG-gefärbte Metaphase-Chromosomen an einem Durch-lichtmikroskop mit Hilfe einer digitalen Aufsatz-Kamera (Neuberger) und der PSI-Software (Perceptive Scientific Instruments) „MacKType, Version 5.5.1“ aufgenom-men wurden. Die Karyogramme wurden am Computer nach der Noaufgenom-menklatur von Reimann et al. (1996a) erstellt. Für jedes Chromosomen-Mapping wurden zehn gut gespreitete Metaphasen wie oben aufgenommen und bearbeitet. Gegebenenfalls wurden von den Chromosomen dieser Metaphasen ebenfalls Karyogramme nach der oben genannten Nomenklatur erstellt.

2.6. Molekular-zytogenetische Methoden

2.6.1. DNA-Isolierung aus caninem Vollblut

Aus ca. 10 ml Vollblut wurde gesamt genomische Hunde DNA isoliert. Die Isolierung erfolgte mit Hilfe des DNA-Isolation Kits der Firma Puregene wie folgt: Lyse der E-rythrozyten durch Zugabe des dreifachen Volumen RBC-Lysis Solution und Inkubati-on für 10 min bei +4°C. ZentrifugatiInkubati-on für 10 min bei 2000 xg und 4°C, Resuspendie-ren der Lymphozyten, Zugabe der Cell lysis Solution und Inkubation über Nacht bei 4°C. Am nächsten Tag erfolgte die Zugabe der Protein Precipitation-Solution und er-neute Zentrifugation für 10 min bei 2000 xg sowie die Fällung der DNA durch Zugabe von Isopropanol (Roth) zum Überstand und erneute Zentrifugation für 10 min bei 2000xg. Das DNA-Pellet wurde mit Ethanol (Riedel del Haen) gewaschen anschlie-ßend getrocknet und in 50 µl DNA Hydration Solution aufgenommen.

2.6.2. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

FISH Experimente wurden zum chromosomalen Mapping verschiedener, PCR ge-screenter BAC-Klone durchgeführt. Als Präparate dienten dabei Objektträger mit fi-xierten Metaphase-Chromosomen caniner Lymphozyten (siehe Kapitel 2.5.2)

2.6.2.1. Markierung der Sonden DNA durch Nick-Translation

Die Sonden bestanden aus der isolierten DNA verschiedener BAC-Klone, die zu menschlichen Genen homologe Sequenzen enthielten. In diese DNA wurden mittels Nick-Translation Digoxigenin markierte Nukleotide (DIG-11-UTPs) eingefügt. Das La-belling wurde nach dem Protokoll des Herstellers „Dig-Nick-Translation-Mix for in situ probes“ (Roche Diagnostics) durchgeführt. Die Lösung wurde mit 19 µl TE-Puffer verdünnt und bis zur Verwendung bei +4°C gelagert.

2.6.2.2. Herstellung von ultraschall-behandelter Hunde DNA (sdDNA)

Die in Kapitel 2.6.1 isolierte DNA wurde 3 mal für 45 sec mit Ultraschall behandelt. Die Länge der so entstandenen DNA-Fragmente wurde mit Hilfe einer Gelelektropho-rese überprüft, erfahrungsgemäß liefern Fragmentlängen von ca. 100 –300 bp die besten Ergebnisse.

2.6.2.3. Hybridisierung

Die vorbereiteten Präparate wurden bei Bedarf mit Pepsin-Lösung (Merck) verdaut, in 2xSSC gewaschen, in einer –20°C kalten, aufsteigenden Ethanolreihe (70%, 80%, 90%, 100%) dehydriert und anschließend getrocknet. Die Präparate wurden zur De-naturierung der Chromosomen in einer 70°C heißen 70% Formamid/ 2xSSC-Lösung inkubiert, anschließend in eiskaltem 2 x SSC gewaschen, abermals entwässert und getrocknet. Für den Hybridisierungsmix wurden pro OT 8µl markierte Sonden-DNA mit 4 µl ssDNA (Sigma), 1µg sd-DNA, 25µl Formamid (Fluka), 10 µl Dextransulfat (Oncor), 2,5µl 20 x SSC und 2,5 µl SSPE vermischt, denaturiert und prähybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 37°C. Für die Posthybridisierung wurden die Präparate in 42°C warmer 50% Formamid/ 2 x SSC-Lösung für 15 min, 42°C warmen 2 x SSC-Lösung für 8 und in 1 x PBS gewaschen. Die Präinkubation erfolgte mit jeweils 100 µl 5% NFDM/ 4 x SSC für 10 min bei 37°C. Zur Färbung der Sonden-DNA wurden die OTs mit 100 µl Anti-Dig-Lösung für 20 min inkubiert, nicht gebunde-ne Anti-Dig-Lösung wurde durch dreimaliges Spülen mit 1 x PBS wieder

abgewa-schen. Die Präparate wurden getrocknet und durch Auftragen von Antifade-Solution gegengefärbt. Die Auswertung erfolgte an Mikroskop und Computer.

2.6.2.4. Auswertung

Die Auswertung der FISH-Versuche erfolgte an den zuvor ausgesuchten Metaphasen (siehe Kapitel 2.5.3) an einem UV- Durchlichtmikroskop mit Hilfe einer digitalen Auf-satz-Kamera (Neuberger) und der PSI-Software (Perceptive Scientific Instruments) „MacProbe, Version 4.0“.

2.6.3. Erzeugung Adeno-assoziierter Viren

Zur Erzeugung von Adeno-assoziierten Viren, welche das gewünschte Gen als Insert tragen, wurden die kultivierten AAV-293 Zellen mit den drei Plasmiden pHelper, pAAV RC und pAAV MCS nach Anleitung im „AAV Helper-Free System instruction manual“ (Stratagene) transfiziert. Es wurden verschiedenartige Viren erzeugt, indem das ge-wünschte Gen in sense (Lac Z) oder antisense Richtung (HMGA1 und HMGA2) in das pAAV MCS Plasmid kloniert wurde. Zusätzlich wurden Viren ohne Insert erzeugt, welche in späteren Untersuchungen als Negativkontrollen dienen sollten. Eine Nega-tivkontrolle für die Virusproduktion wurde durchgeführt, indem mindestens eines der drei Plasmide durch Puffer ersetzt wurde. Die Virusernte wurde nach 72 Stunden e-benfalls nach dem „AAV Helper-Free System instruction manual“ (Stratagene) durch-geführt. Der so gewonnene primäre Virusstock wurde zunächst bei 37°C einem DNA-se I (Sigma) Verdau unterzogen und anschließend nach Herstellerangaben im „Vira-Kit AAV-Instruction Booklet for Purification „Vira-Kit (Virapur)“ aufgereinigt. Abschließend wurde der Virustiter mit Hilfe einer universellen Real-Time PCR für Adeno-assoziierte Viren bestimmt.

2.6.4. Proliferationsassays mit Adeno-assoziierten Viren und CT

1258

Der Effekt von Adeno-assoziierten Viren, welche HMGA1 und HMGA2 in Antisense Orientierung tragen, auf HMGA überexprimierende Zellen wurde mit Hilfe der spontan immortalisierten Zell-Linie CT1258 überprüft. Hierzu wurden CT1258 Zellen in einer Dichte von 2.500 Zellen in 96-well Platten mit 100 µl 20% Medium 199 ausgesät und

abgesogen und durch 50µl L-199 Medium (Earle’s Salze, 2% fötales Kälberserum, 2% Antibiotika) ersetzt. Die Zellen wurden in unterschiedliche Gruppen geteilt: 1. Zu-gabe von 50 vg/Zelle rAAV as-HMGA (25/25 vg/Zelle rAAV-asHMGA1a/rAAV-asHMGA2), 2. Zugabe von 50 vg/Zelle rAAV-LacZ und 3. keine Zugabe von Viren. Die Gruppen 2 und 3 dienten als Kontrollen. Um Kreuzkontaminationen zu vermei-den, wurden alle Experimente auf separaten Platten durchgeführt. Während der fol-genden 90 min. Inkubation bei 37°C wurden die Platten alle 30 min. vorsichtig ge-schwenkt, anschließend wurden jeweils 50 µl H-199 Medium (Earle’s Salze, 18% fö-tales Kälberserum, 2% Antibiotika) in die Wells gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 60 Stunden bei 37°C, 5% CO2 und 95%iger Luftfeuchte, erfolgte die Zugabe von BrdU in die Wells und eine weitere Inkubation von 12 Stunden unter gleichen Bedin-gungen. Die weitere Behandlung des Assays erfolgte nach Herstellerangaben der „General Assay Procedure, Cell Proliferation ELISA BrdU (colorimetric)“(Roche). Die Messung der Absorption wurde im Multidetection Microplate Reader „Synergy“ (Bio-tek) bei einer Wellenlänge von 370 nm durchgeführt.

2.7. Erstellen der Gewebebank

2.7.1. Entnahme von Gewebeproben

Die canine Gewebebank soll als Grundlage weitgehender molekularbiologischer Un-tersuchungen dienen. Die Gewebesammlung wurde in Kooperation mit der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover entwickelt und aufgebaut. Die Entnahme von Gewebeproben erfolgte während der chirurgischen Versorgung der Tiere oder direkt nach deren Euthanasie unter sterilen OP-Bedingungen. Gewe-beproben von Tumoren und Normalgeweben wurden mit sterilen Instrumenten zer-kleinert um mehrere Proben in geeigneter Größe herzustellen. Diese wurden in sterile Kryogefäße mit Schraubgewinde gegeben und mit der Angabe der hausinternen Kli-niknummer des jeweiligen Patienten und des Inhalts des Röhrchens beschriftet. Die Gefäße wurden dicht verschlossen und schnellstmöglich in flüssigen Stickstoff über-führt um das Gewebe Schock zu gefrieren. Von allen Geweben wurde eine Probe zur histopathologischen Untersuchung in Formalin eingelegt. Zusätzlich zu den Gewebe-proben wurden den jeweiligen Hunden routinemäßig verschiedene Blut- (EDTA-Vollblut, Heparin-Plasma, EDTA-Plasma, Serum) und Urinproben entnommen und nach analoger Beschriftung ebenfalls tiefgefroren.

2.7.2. Lagerung der Gewebeproben

Die weitere Lagerung der schockgefrorenen Gewebeproben erfolgte bei –80°C. Die Kryogefäße wurden dazu aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und schnellstmög-lich in Polypropylenboxen mit 10 x 10 Raster überführt, welche wiederum in Metall-racks einsortiert und in einem –80°C Gefrierschrank gelagert wurden. Das 10 x 10 Raster und die Nummerierung der Boxen ermöglichte die Zuordnung einer bestimm-ten Probe zu einem bestimmbestimm-ten Lagerort, um die Wiederauffindbarkeit der Proben zu gewährleisten.

2.7.3. Katalogisieren der Gewebeproben

Es wurde eine Datenbank unter Verwendung des Programms Microsoft Access pro-grammiert. In diese Datenbank wurden die Patientendaten des jeweiligen Tieres, also Namen des Besitzers und die hausinterne Kliniknummer, Angaben über Rasse, Alter und Geschlecht des Tieres sowie über Art der Erkrankung und den histopathologi-schen Befund eingegeben. Zusätzlich erfolgte eine Verknüpfung dieser Daten mit den Daten über die Art und den Lagerort der dem Hund zugehörigen Proben.

2.8. Molekulargenetische Methoden

2.8.1. RNA-Isolierung aus Gewebe

Zur Lyse der Zellen wurden ca. 500 mg Gewebe mit 3,75 ml Trizol LS (Gibco BRL) versetzt. Das Gewebe wurde mit einem Skalpell möglichst fein zerkleinert, der Ansatz in ein steriles Sarstedt-Röhrchen überführt und 5 min bei RT inkubiert. Zur Fällung der Proteine wurden 750 µl Chloroform (Fluka) zugegeben, alles für 15 sec. gut ge-mischt und der Ansatz für 2-3 min bei RT inkubiert. Die Suspension wurde für 15 min bei 4500 xg und 4°C zentrifugiert, der wässrige, RNA-haltige Überstand in ein neues Röhrchen überführt und mit 1 Vol. 70% Ethanol vermischt. Dieser Ansatz wurde voll-ständig auf eine RNeasy midi Säule (Qiagen, Hilden) aufgetragen. Die weiteren Schritte erfolgten nach Herstellerangaben im „RNeasy midi/maxi Protocol for the Iso-lation of total RNA from animal tissue“ (Qiagen, Hilden). Nach der Aufreinigung wurde die enthaltene RNA-Menge im Photometer bei 260 nm quantifiziert.

2.8.2. RNA-Isolierung aus der Zell-Linie CT 1258

Zur Vorbereitung wurde der Zellrasen jeder Flasche mit 5 ml PBS gewaschen und durch Zugabe von 500µl Trypsin/EDTA-Lösung (Biochrom) vom Boden abgelöst. Es folgte eine Zentrifugation für 5 min bei 400 xg und 4°C. Der Überstand wurde verwor-fen und das Pellet durch Zugabe von 1 ml PBS, Resuspendieren und erneute Zentri-fugation für 5 min bei 4500 xg und 4°C gewaschen. Das Zellpellet wurde in 350 µl RLT-Puffer (Qiagen, Hilden) aufgenommen, mit Hilfe des QIAshredder (Qiagen, Hil-den) homogenisiert und mit 1 Vol. 70% Ethanol versetzt. Das Lysat wurde vollständig auf eine RNeasy mini Säule gegeben und die RNA nach Herstellerangaben im „RNeasy mini Protocol for the Isolation of total RNA from animal cells“ (Qiagen, Hil-den) isoliert. Nach der Aufreinigung wurde die enthaltene RNA-Menge im Photometer bei 260 nm quantifiziert.

2.8.3. DNase Verdau

Um eine Kontamination der isolierten RNA mit DNA auszuschließen, wurde vor der Verwendung der RNA für die cDNA-Synthese (siehe Kapitel 2.8.4) ein DNase I – Verdau durchgeführt. Jeweils 5 µg der isolierten RNA (siehe Kapitel 2.8.1 und 2.8.2) wurden auf ein Reaktionsvolumen von 87,5 µl gebracht, und mit 10µl RDD-Puffer (Qiagen, Hilden) und 2,5 µl DNase I stock solution (Qiagen, Hilden) für 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz mit Hilfe des „RNeasy miniprotocol for Cleanup“ (Qiagen, Hilden) nach Angabe des Herstellers aufgereinigt. Der DNase I Verdau sowie der RNeasy mini clean-up wurden wiederholt und die enthaltene RNA-Menge im Photometer bei 260 nm quantifiziert.

2.8.4. cDNA-Synthese

Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit Hilfe von 200 U M-MLV reverser Transkrip-tase (Invitrogen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Im Einzelnen: Mischen von 250 ng der DNase I verdauten RNA in einem Volumen von 10µl mit 1 µl AP2 Primer AAGGATCCGTCGACATC(17)T (50µM) und 1 µl dNTP-Mix (10mM) und Inkubation für 5 min bei 65°C. Zugabe von 4 µl 5 x 1st Strand Buffer, 2 µl DTT (0,1M) 1µl RNase Out und 1 µl M-MLV Reverser Transkriptase (200U/µl) und Inkubation für 50 min bei 37°C. Abbruch der enzymatischen Reaktion durch Inkubation bei 70°C für 15 min.

2.8.5. Amplifikation von DNA-Fragmenten durch

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zur Etablierung der HMGA2-spezifischen PCR wurden zunächst die ersten bzw. letz-ten 25 Basen der gewählletz-ten Sequenzen als upper bzw. lower Primer eingesetzt. Als Basis für das Reaktionsschema dienten das „Basic PCR Protokoll“ der Firma Invitro-gen und das Protokoll „Taq DNA Polymerase and Q-Solution“ der Firma QiaInvitro-gen. Als Template diente die zuvor hergestellte cDNA. Als Template für die positiv-Kontrolle diente HMGA1- bzw. HMGA2-Plasmid-DNA. Der Reaktionsansatz wurde wie folgt pipettiert: Aqua bidest 12,75 µl 10 x PCR-Puffer 2,50 µl dNTP-Mix je 10 mM 0,50 µl MgCl2 50 mM 0,75 µl Q-Solution 5,00 µl Upper Primer 10 mM 1,25 µl Lower Primer 10 mM 1,25 µl cDNA (70 ng/µl) 0,50 µl

Taq DNA Polmerase 5U/µl 0,50 µl

Gesamtvolumen 25,0 µl

Die Amplifikation erfolgte nach einer initialen Denaturierung für 5 min bei 95°C in 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec. 94°C, Annealing für 45 sec. bei 61°C, Elongation für 45 sec. bei 72°C). Sie endete mit einer finalen Elongation für 10 min bei 72°C.

2.8.6. Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Fragmente

Für die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden 1,5% Aga-rosegele (Promega) mit 1 x TAE-Puffer gekocht. Für die Detektion der DNA wurden in das noch flüssige Gel 1,5 µl Ethidumbromid-Lösung (Oncor) pro 100 ml Gel pipettiert. DNA-Marker und –Proben wurden jeweils mit 6xGelbeladungspuffer im Verhältnis 5:1 vermischt, in die Geltaschen pipettiert und für 1 h bei 120 Volt in 1xTAE-Puffer aufge-trennt. Der Nachweis der aufgetrennten DNA erfolgte im UV-Durchlicht bei 254 nm und wurde mit dem Programm ArgusX1 fotografiert.

2.8.7. Real-Time PCR (Quantitativ)

Für die HMGA2-spezifische Real-Time PCR wurde zunächst wieder eine cDNA-Synthese durchgeführt (siehe Kapitel 2.8.4), allerdings wurde statt des AP2-Primers der genspezifische Reverse-Primer eingesetzt. Zusätzlich wurden eine cDNA-Synthese an einem synthetischen Oligonukleotid, dem sog. Standard, mit definierter Menge an Transkripten pro 10µl unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Die eigentliche Real-Time PCR erfolgte im Taq-Man nach folgendem Schema:

Aqua bidest 7,25 µl

2x TaqMan Universal PCR Master Mix 12,50 µl

Upper Primer (10 µM) 1,50 µl

Lower Primer (10 µM) 1,50 µl

Sonde (20µM) 0,25 µl

cDNA (12,5ng/µl) 2,00 µl

Gesamtvolumen 25,0 µl

Die Amplifikation erfolgte nach einer initialen Denaturierung für 10 min bei 95°C in 50 Zyklen (Denaturierung für 15 sec. 95°C, Annealing für 60 sec. bei 60°C).

3. Ergebnisse

3.1. Zytogenetische Ergebnisse

Ein Teilaspekt der vorliegenden Arbeit war die zytogenetische Untersuchung ver-schiedener caniner Neoplasien. Der Hund zeigt einen komplexen Karyotyp mit 76 akrozentrischen Chromosomen, die in ihrer Länge nur wenig variieren und zwei me-tazentrischen Geschlechtschromosomen, X und Y.

3.1.1. Cytogenetic investigations in four canine lymphomas

Aus 30 verschiedenen Knochenmarkaspiraten konnten erfolgreich Chromosomen präpariert werden. Die zytogenetische Analyse von durchschnittlich 10 Metaphasen pro Fall zeigte in vier Fällen klonale Aberrationen. Der erste Patient, ein fünfjähriger männlicher Münsterländer (KM15) zeigte ein derivatives Chromosom 13. Während der zweite Patient, ein sechsjähriger männlicher Münsterländer eine klonale Trisomie 8 aufwies. Der dritte Patient, ein vierjähriger männlicher Deutscher Schäferhund zeig-te wiederum eine klonale Trisomie 13 mit zusätzlichen Trisomien der Chromosomen 20, 30 und 37 sowie einer nicht klonalen Tetrasomie 9. Während der vierte Patient, ein vierjähriger, weiblicher Berner Sennenhund eine einfache Trisomie 2 zeigte. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit humanen hämatopoetischen Erkrankungen zeigt bemerkenswerte Übereinstimmungen zwischen beiden Spezies. Berücksichtigt man die von Yang et al. gefundenen Homologien zwischen menschlichen und caninen Chromosomen, scheinen in beiden Spezies vergleichbare Regionen von den chro-mosomalen Aberrationen betroffen zu sein.

Nicht nur das canine Non-Hodgkin-Lymphom, sondern insbesondere auch das canine Prostatakarzinom zeige große Ähnlichkeiten bezüglich der Tumorbiologie zu ihrem jeweiligen menschlichen Pendant, daher wurden im folgenden insbesondere canine Prostata-Karzinome zytogenetisch untersucht.

3.1.2. Establishment of a cell line derived from a canine prostate

carcinoma with a highly rearranged karyotype

II. Winkler S et al., J Hered. 2005

Canine Prostatakarzinome zeigen viele Übereinstimmungen zu ihrem menschlichen Gegenstück, wie zum Beispiel durchschnittliches Erkrankungsalter und

Metastasie-rungsverhalten. Zytogenetische Untersuchungen an humanen Prostatakarzinomen zeigten eine Reihe von chromosomalen Aberrationen. Zur Überprüfung, ob sich auch in caninen Tumoren vergleichbare zytogenetische Aberrationen finden lassen, wurde ein Prostatatumor eines 10-jährigen Briards zytogenetisch untersucht. Die Kultivie-rung von Zellen des Tumors mit der Nummer CT 1258 resultierte in gut wachsenden Zellen mit einer hohen Mitoserate. Zum Zeitpunkt der Publikation befanden sich die Zellen in der 55. Passage der Zellkultur, was auf eine spontane Immortalisierung der Zellen hinweist. Die zytogenetische Untersuchung der Zellen ergab einen annähernd tetraploiden Karyotyp mit vielen zentrischen Fusionen und den daraus resultierenden zweiarmigen Markerchromosomen. Die Chromosomenanzahl reichte von 81 bis 131. Der stark rearrangierte Karyotyp machte eine genaue Identifikation aller Chromoso-men unmöglich, jedoch konnten zentrische Fusionen der ChromosoChromoso-men vier und fünf in ca. der Hälfte aller untersuchten Metaphasen und zentrische Fusionen der Chro-mosomen eins und fünf sowie ein Markerchromosom, bestehend aus Material der Chromosomen eins und zwei in allen untersuchten Metaphasen gezeigt werden.

3.1.3. Polysomy 13 in a canine prostate carcinoma underlining its

significance in the development of prostate cancer

III. Winkler S et al., Cancer Genet Cytogenet. 2006

Zur weiteren Überprüfung ob sich in caninen Prostatakarzinomen ähnliche Chromo-somenaberrationen wie in menschlichen Tumoren der Prostata zeigen, wurde ein Tumoraspirat eines caninen Prostatakarzinoms zytogenetisch untersucht. Die Zellkul-tur dieses Tumoraspirates resultierte in gut wachsenden Zellen mit einer mittleren Mitoserate. Die zytogenetische Untersuchung der Zellen ergab das Vorhandensein eines Fusionschromosoms 13 in unterschiedlichen Anzahlen zusätzlich zu einem normalen caninen Chromosom 13, woraus eine Polysomie resultiert. Die Chromoso-menanzahl reichte von 72 bis 78, wobei die Mehrzahl der Metaphasen 78 Chromo-somen zeigte. Keine der Metaphasen hatte mehr als 78 ChromoChromo-somen. Fusionen der Chromosomen 13 wurden in allen Metaphasen beobachtet, dabei traten die Fusions-chromosomen in unterschiedlicher Anzahl auf.

3.2. Molekular-zytogenetische Ergebnisse

Das Auftreten bestimmter, wiederkehrender chromosomaler Veränderungen in cani-nen Tumoren lässt vermuten, dass wichtige, Tumor-assoziierte Gene in diese

Aberra-tionen involviert sind. Daher bestand ein weiterer Teilaspekt der vorliegenden Arbeit aus der Lokalisation verschiedener Tumor-relevanter Gene im caninen Genom. Auf-grund des bereits erwähnten komplexen caninen Karyotyps gibt es nur wenige Arbei-ten, die sich mit dem FISH-Mapping also der direkten Lokalisation von Genen auf dem Genom des Hundes befassen. Mit Hilfe der von Reimann et al. (1996) erstellten Nomenklatur, welche die eindeutige Zuordnung von caninen Chromosomenpaaren ermöglicht, war es in der vorliegenden Arbeit möglich, mit Hilfe des FISH-Mappings verschiedene canine Gene im Karyotyp des Hundes zu lokalisieren.

3.2.1. Molecular characterization and mapping of the canine KRAB

zinc finger gene ZNF331

IV. Meiboom M et al., Anim Genet. 2004

Das KRAB Zinkfinger-Gen ZNF331 ist in humanen Schilddrüsenadenomen häufig in chromosomale Aberrationen involviert, daher wurde es als Kandidatengen für die Entwicklung dieser Tumoren beschrieben. Für die Charakterisierung des ZNF331 Gens des Hundes wurde eine canine cDNA Library mit Primern für das humane ZNF

331 Homolog gescreent. Eine 5’ Race PCR mit spezifischen Primern an der cDNA

führte zu einem vollständigen cDNA Klon. Aus den ermittelten Daten wurde die mRNA Sequenz für das canine ZNF 331 erstellt. Demnach besteht das Gen, inklusive ORF, aus 2148 bp und zeigt in der kodierenden Sequenz eine Homologie von 85,3% zwischen Hund und Mensch. Northern Blot Analysen an mRNA verschiedener cani-ner Gewebeproben zeigten eine nur schwache Expression des Gens.

Anhand der gewonnenen Sequenzinformationen wurde eine Primerpaar generiert, mit dem ein 300 bp großes Fragment aus der Spacerregion des ZNF331 Gens amplifi-ziert und durch Sequenzanalyse verifiamplifi-ziert wurde. Mit diesem Fragment wurde ein caniner BAC/PAC Filter auf positive Klone gescreent. Der verifizierte Klon wurde in die FISH eingesetzt. Das FISH-Mapping zeigte eine Lokalisation des caninen ZNF331 auf CFA1q33.

Ein weiterer Ansatzpunkt für die Untersuchung der Tumorenstehung sind (Cyclin ab-hängige) Kinasen, die eine wichtige Rolle in der Regulation des Zellzyklus spielen. Daher wurden im Folgenden sowohl die intrazelluläre Proteinkinase AKT3 als auch das regulatorisch wirksame Cyclin D1 (CCND1) im Genom des Hundes lokalisiert.

3.2.2. The protein kinase B, gamma (AKT3) gene maps to canine

chromosome 7

V. Murua Escobar H et al., Anim Genet. 2004

Die Proteinkinase B, gamma (AKT3) ist eine intrazelluläre Proteinkinase, die unter anderem die Überlebensdauer der Zelle reguliert. Sie reguliert die Funktion vieler zel-lulärer Prozesse, zu denen sowohl die Apoptose, aber auch die Proliferation gehören (Masure et al., 1999; Nicholson and Anderson, 2002). Für die Herstellung einer FISH-Sonde für das canine AKT3 Gen wurde der entsprechende Bereich gesamt genomi-scher DNA eines zweijährigen golden Retrievers mittels PCR amplifiziert. Dazu wur-den Primer verwendet, die einen Teil des Exon 13 umfassen und welche zu 80,3 % identisch mit menschlicher AKT3 mRNA sind. Aus dieser PCR resultierte eine PCR Fragment von 303 bp, welches durch Sequenzanalyse verifiziert wurde. Mit Hilfe die-ser Primer wurde eine canine BAC Library auf positive Klone gescreent. Das mit den verifizierten Klonen durchgeführte FISH-Mapping ergab ein Lokalisation des caninen

AKT3 Gens auf CFA 7.

3.2.3. Molecular characterization and mapping of the canine cyclin

D1 (CCND1) gene

VI. Meyer B et al., Anim Genet. 2004

Die Deregulierung der Cyclin D1 Synthese erlaubt das fortschreiten des Zellzyklus in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren und könnte somit zur Entstehung von Tu-moren beitragen. Zur Charakterisierung des caninen Cyclin D1-Gens und des dazu-gehörigen Proteins wurde cDNA aus einem caninen Osteosarkom mit Primern, spezi-fisch für den humanen ORF des CCND1-Gens, gescreent. Das resultierende PCR-Produkt wurde anschließend kloniert und sequenziert und der vollständige ORF mit Hilfe von zwei zusätzlichen Primern amplifiziert. Die Sequenzanalyse ergab ein 1246 bp langes cDNA Fragment, welches für den caninen ORF eine 90,4% Sequenz Über-einstimmung zu seinem menschlichen Homolog zeigte. Das daraus resultierende ca-nine Protein besteht aus 295 Aminosäuren und zeigt eine Ähnlichkeit von 93,3% zwi-schen beiden Spezies. Anhand der menschlichen Sequenzdaten wurde ein weiteres Primerpaar hergestellt, mit dem eine canine BAC Library auf positive Klone gescreent wurde. Der hieraus resultierende positive Klon wurde in die FISH eingesetzt. Das FISH-Mapping ergab eine Lokalisation des caninen CCND1-Gens auf CFA 17.

Des Weiteren spielen auch die RAS Gene eine wichtige Rolle in der menschlichen Tumorentwicklung Die Bindung von Wachstumsfaktoren aktiviert die RAS Proteine und initiiert so die Zellteilung. Mutationen in den RAS Genen führen zur andauernden Aktivierung von Signalwegen, welche die Zellteilung anregen und schließlich zur un-kontrollierten Zellteilung führen (Park, 1995). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Mitglieder der RAS Proteinfamilie, NRAS und KRAS, im caninen Genom lokalisiert.

3.2.4. The canine NRAS gene maps to CFA 17

Für die Lokalisation des caninen NRAS-Gens wurden anhand der caninen mRNA Sequenz Datenbank PCR-Primer hergestellt. Die PCR wurde an caninem Blut etab-liert, das resultierende PCR-Fragment wurde durch Sequenzanalyse verifiziert. Mit den gleichen Primern wurde die canine BAC Library auf positive Klone gescreent. Der verifizierte, positive Klon wurde für das FISH-Mapping verwendet, welches eine Loka-lisation des caninen NRAS auf CFA 17 ergab.

3.2.5. The canine KRAS2 gene maps to chromosome 22

Um das KRAS Homolog im caninen Genom zu lokalisieren, wurde zunächst an cani-ner gesamt genomischer DNA ein Primerpaar gecani-neriert, dass einen Teil des Exons 2 umfasst. Das daraus resultierende PCR-Produkt wurde zur Verifizierung kloniert und sequenziert. Das etablierte Primerpaar wurde verwendet um die canine BAC Library auf positive Klone zu screenen. Der verifizierte Klon wurde in die FISH eingesetzt, welche eine Lokalisation von KRAS2 auf dem caninen Chromosom 22 ergab.

Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf den Untersuchungen der caninen HMG-Proteine. Ein Rezeptor für HMGB1, ein Mitglied der HMG-Proteinfamilie ist RAGE (receptor for advanced glycation end products) ein Transmembranrezeptor aus der Immunglobulinfamilie, an den extrazelluläres HMGB1 als Ligand binden kann. Diese Bindung führt zur Aktivierung verschiedener Signalkaskaden, welche wiederum Einfluss auf das Wachstum und die Beweglichkeit von Zellen nehmen. Im Rahmen der Charakterisierung des caninen RAGE wurde das Gen im Genom des Hundes lo-kalisiert.

3.2.6. Cloning and characterization of the canine receptor for

ad-vanced glycation end products

IX. Murua Escobar H et al., Gene. 2006

Zur Charakterisierung des caninen RAGE-Gens und des dazugehörigen Proteins wurde cDNA aus caninem Lungengewebe mit Primern, spezifisch für die humane cDNA des RAGE-Gens, gescreent. Das resultierende PCR-Produkt wurde anschlie-ßend kloniert und sequenziert. Das vollständige Gen wurde mit Hilfe zweier weiterer Primerpaare amplifiziert und umfasst 2835 bp. Die vollständige canine RAGE cDNA besteht aus 11 Exons die insgesamt 1384 Basenpaare umfassen. Die Exongröße schwankt zwischen 27 und 254 bp. Alles in allem besteht die cDNA aus einem 5’ UTR von 18 bp, einem cds von 1215 bp, und einem 3’ UTR von 151 bp. Die Sequenzho-mologie zwischen Hund und Mensch beträgt insgesamt 80,9% und variiert für die verschiedenen Exons zwischen 73,9% (Exon 11) und 86,7% (Exon 2). Das abgeleite-te canine Proabgeleite-tein weist für die extrazelluläre Domäne eine Übereinstimmung von 78,2%, für die Transmembran Domäne eine Übereinstimmung von 78,9% und für die cytosolische Domäne eine Übereinstimmung von 72,7% mit dem menschlichen Prote-in auf, was eProte-iner Homologie von Prote-insgesamt 77,6% zwischen beiden Spezies ent-spricht.

Die Expression des caninen RAGE-Gens wurde in verschiedenen Geweben mittels Northern Blot und Hybridisierung mit einer 32P markierten RAGE cDNA Sonde unter-sucht. Bis auf das Lungengewebe zeigte keine der untersuchten Gewebeproben die spezifische Bande von 1,4 kb. Diese Ergebnisse decken sich mit denen für die RAGE-Expression in humanen Geweben. Für die Lokalisation des Gens im caninen Genom wurde eine genomische DNA Sonde hergestellt und für das Screening des caninen RPCI 81 BAC/PAC Filters eingesetzt. Der verifizierte positive Klon wurde in die FISH eingesetzt. Das FISH-Mapping ergab die Lokalisation des caninen RAGE auf CFA 12.

3.3. Erstellen der Gewebebank

Molekulargenetische Untersuchungen z.B. zur Genexpression erfordern adäquate Gewebeproben. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit damit begonnen, eine Gewebebank für canine und feline Tumoren und Normalgewebe zu erstellen. Dazu wurden 8408 Proben von Hunden und Katzen verschiedener Rassen-zugehörigkeiten genommen und katalogisiert. Dabei entfallen 4286 Proben auf

Tumo-ren und 4122 auf Normalgewebe. Zusätzlich wurden zu den meisten Tumorgeweben auch verschiedene Blutproben genommen, eingefroren und katalogisiert, so dass die gesamte Gewebebank aus über 10.000 Proben bestand. Der Ausbau der Gewebe-bank erfolgte über den Rahmen der vorliegenden Arbeit hinaus. Die GewebeGewebe-bank umfasste im Frühjahr 2007 21.100 Proben, der überwiegende Anteil (67,9%) besteht dabei aus Tumorproben. Die Proben aus dieser Gewebebank stellten die Grundlage dar, für eine Vielzahl molekulargenetischer Untersuchungen. Daher werden die Er-gebnisse dieser Untersuchungen im Kapitel 3.4. dargestellt.

3.4. Molekulargenetische Ergebnisse

Das Ziel, den Hund als Modell für die Krebsentstehung beim Menschen zu nutzen, um sowohl die Diagnose als auch die Therapie in beiden Spezies zu verbessern und damit die Lebenserwartung zu erhöhen, kann nur durch ein Verständnis der moleku-laren Grundlagen und Wirkweise der untersuchten Gene erreicht werden. In der vor-liegenden Arbeit wurden daher verschiedene tumorrelevante Gene molekulargene-tisch untersucht.

3.4.1. Absence of ras-gene hot-spot mutations in canine

fibrosar-comas and melanomas.

X. Murua Escobar H et al., Anticancer Res. 2004

Für die Untersuchung auf hot-spot Mutationen in RAS Genen wurden 13 canine Fibrosarkome, 11 canine Melanome und 2 feline Fibrosarkome aus der caninen Ge-webebank verwendet. Unter den untersuchten Rassen befanden sich Mischlinge so-wie reinrassige Tiere so-wie Irish Terrier, Fox Terrier, Schnauzer, Kuvasz, Briard, Deut-scher Schäferhund, Rottweiler, Beagle und Pudel. Die DNA wurde isoliert und mit spezifischen Primern für die Exons 1 und 2 von KRAS und NRAS amplifiziert und se-quenziert. Vier der sechsundzwanzig untersuchten Gewebeproben zeigten Nukleotid-Veränderungen in den caninen Exons. Keine dieser Nukleotid-Veränderungen lag in den RAS hot-spot Codons 12, 13 und 61. Ein canines Fibrosarkom zeigte drei Veränderungen:

KRAS Exon 1 Codon 23 (CTA → TTA, keine Aminosäureveränderung), Exon 2,

Co-don 53 (TTG → TAG, Leu → Stopp coCo-don) und NRAS Exon 1, CoCo-don 10, GGA → GAA, Gly → Glu). Zwei andere Fibrosarkome (Kuvasz und Pudel) zeigen jeweils ei-nen Nukleotidaustausch in KRAS, Exon 2, welche die Codons 48 (GGA → GAA, Gly

→ Glu) und 70 (CAG → CTG, Gln → Leu) betreffen. In einer Probe eines Melanoms aus einem Mischling wurde ein Nukleotidaustausch in NRAS Exon 1 Codon 22 (CAG → CTG, Gln → Leu) gefunden. Die Untersuchung des NRAS Exon 2 zeigte keine Nukleotid-Veränderungen innerhalb der caninen Sequenzen.

3.4.2. RAS gene hot-spot mutations in canine neoplasias.

Für den Vergleich mit bereits vorliegenden Daten aus anderen Studien wurden 13 canine Fibrosarkome und 11 canine Melanome aus der caninen Gewebebank auf Punktmutationen in den Ras-Gen Hot-Spot Mutationen untersucht. Dieser Vergleich ergab, dass K-Ras und N-Ras Mutationen in den Hot-Spot Loci offenbar nur sehr sel-ten in caninen Fibrosarkomen und Melanomen vorkommen. Von den insgesamt un-tersuchten 31 caninen Fibrosarkomen und 17 caninen Melanomen waren nur zwei Melanomproben von einer Mutation im Exon 61 des N-Ras Gens betroffen. Für das K-Ras Gen wurden keinerlei Mutationen in den Hot-Spot Codons der untersuchten Proben gefunden. Um einen aussagekräftigen Vergleich der Daten dieser caninen Tumorentitäten mit den vorliegenden Forschungsergebnissen von z. B. Menschen und Mäusen vornehmen zu können bedarf es jedoch der Untersuchung größerer An-zahlen an caninen Tumorproben.

3.4.3. Expression pattern of the HMGB1 gene in sarcomas of the

dog.

XII. Meyer B et al., Anticancer Res. 2004

Für die Expressionsanalyse von HMGB1 in caninen Sarkomen wurden 5 Osteosar-kome, ein Fibrosarkom und ein Leiomyosarkom aus der caninen Gewebebank ver-wendet. RNA wurde isoliert und einerseits für die Synthese von cDNA, andererseits für die mRNA Isolierung zum Einsatz in einem Northern Blot verwendet. Der Northern Blot zeigte zwei HMGB1 mRNA Transkripte von 1,4 und 2,4 kb, die vergleichbar zu denen in menschlichen und verschiedenen caninen Geweben sind. Die Intensität der Signale wurde zusammengefasst und mit der Intensität der GAPDH-Bande der glei-chen Proben vergliglei-chen. Die untersuchten Proben caniner Tumoren zeigten starke Unterschiede in der Stärke der Expression von HMGB1. Die Werte, welche als Quo-tient zwischen HMGB1 und GAPDH ermittelt wurden, variierten zwischen 0,52 und

1.31 für Osteosarkome, während das Fibrosarkom und das Leiomyosarkom Werte von 0,52 und 1,31 zeigten. Um diese Ergebnisse zu verifizieren wurde eine semi-quantitative Duplex-PCR mit HMGB1 und GAPDH durchgeführt. Die Werte für die caninen Osteosarkom-Proben variierten zwischen 0,72 und 1,28, während das Fibro-sarkom und das LeiomyoFibro-sarkom Werte von 0,73 bzw. 0,42 aufwiesen. Die statisti-sche Analyse zeigte einen signifikanten Zusammenhang zwistatisti-schen dem HMGB1 Ex-pressionslevel, welcher mittels Northern Blot ermittelt wurde und dem Level aus der etablierten RT-PCR.

3.4.4. The canine HMGA1.

XIII. Murua Escobar H et al., Gene. 2004

Für die Charakterisierung des caninen HMGA1 wurde Hodengewebe von verschie-denen Hunderassen aus der caninen Gewebebank verwendet. Darunter befanden sich u. a. Bullterrier, Dackel, Dobermann, Münsterländer und Yorkshire Terrier. Aus der gewonnenen RNA wurde mit Hilfe der 3’ Race PCR cDNA synthetisiert. Anhand der humanen cDNA-Sequenz wurden Primer hergestellt, mit deren Hilfe das canine

HMGA1 synthetisiert und sequenziert wurde. Das vollständige canine HMGA1

um-fasst sechs Exons und codiert für zwei Spleißvarianten, HMGA1a mit 1836 Basen-paaren und HMGA1b mit 1803 BasenBasen-paaren, welche den humanen Transkripten ent-sprechen. Diese Spleißvarianten zeigen die bekannte 33 bp Deletion in HMGA1b, welche zwischen verschiedenen Spezies, wie Mensch, Maus, Hamster und Ratte stark konserviert ist. Die Homologie für beide Spleißvarianten zu ihren menschlichen Gegenstücken liegt bei 80,6%. Dabei zeigen der 5’UTR, CDS und 3’ UTR unter-schiedliche Homologien von 95,6%, 95,1% und 74,7%. Die abgeleiteten Proteinse-quenzen ergeben für HMGA1a ein 107 Aminosäuren großes Protein mit einem ge-schätzten Gewicht von 11674,97 Da, während HMGA1b 96 Aminosäuren und Ge-wicht von geschätzten 10677,85 Da aufweist. Die Homologie zwischen caninen und humanen Proteinen beträgt 100%, inklusive der drei „AT-Hooks“ und der carboxy-terminalen Domäne. Der Vergleich der Spleißvarianten zwischen den verschiedenen Rassen ergab nur einen einzigen Aminosäureaustausch der ersten Base des Codons 64 in der Gewebeprobe eines Dackels (A → G, Thr → Ala). Dieser Austausch fehlt im korrespondierenden HMGA1a-Transkript des zweiten Allels des gleichen Tieres, was auf einen Heterozygotie schließen lässt. Für die Expressionsanalyse des caninen

sion mittels Northern Blot überprüft. Bis auf die gesamt RNA des Nierengewebes zeigten alle Proben ein schwaches Signal, welches einer Größe von ca. 1,8 kb ent-spricht. Dies lässt auf eine geringe Expression des Gens in diesen Geweben schlie-ßen.

3.4.5. "Best friends" sharing the HMGA1 gene: comparison of the

human and canine HMGA1 to orthologous other species.

XIV: Murua Escobar H et al., J Hered. 2005

Die Charakterisierung der caninen HMGA-Gene ermöglicht neue Strategien für expe-rimentelle und therapeutische Ansätze. Daher wurden unter Verwendung von Proben aus der neu etablierten Gewebebank die caninen HMGA1a und HMGA1b Transkripte charakterisiert, die Proteine hergeleitet und ihr Potenzial als Ziel für therapeutische Ansätze eingeschätzt. Der Sequenzvergleich ergab eine 100% Homologie zwischen dem caninen und dem menschlichen Protein, trotzdem unterscheidet sich die Anzahl der gefundenen cDNAs: Für den Menschen sind sieben verschiedene cDNA-Transkripte bekannt, von denen die Splicevarianten 1 und 2 am häufigsten vorkom-men. Die charakterisierten caninen Varianten zeigen die gleiche Zusammensetzung wie diese. Canine Entsprechungen zu den menschlichen Varianten der Splicevarian-ten 3 bis 7 konnSplicevarian-ten mittels PCR nicht nachgewiesen werden. Der Vergleich der hu-manen cDNA mit den bekannten Transkripten anderer Spezies zeigte, dass der Hund die einzige Spezies ist, die im Bezug auf Exon-Struktur und Verteilung Übereinstim-mungen zu den häufig gefundenen Transkripten des Menschen zeigt. Die Homologie der CDS des caninen HMGA1 zu der anderer Spezies variiert zwischen 72% (Huhn) und 95,7% (Pferd, Schwein). Der Homologie-Vergleich der abgeleiteten Proteine liegt zwischen 67,7% (Huhn) und 100% (Mensch). Die Proteine aller Spezies zeigten ei-nen hohen Konservierungsgrad in ihrer funktionellen DNA-bindenden Domäne, den sog. AT-Hooks. Alle untersuchten Spezies haben gemeinsam, dass die CDS aus vier Exons besteht. Die beschriebenen Proteine aller untersuchten Spezies bestehen aus 107 bzw. 96 Aminosäuren für HMGA1a und HMGA1b. Alle Spezies zeigen die für das HMGA1b Protein typische Deletion von 33 bp, die in dem Fehlen von 11 Aminosäu-ren in der Splicevariante resultiert.

Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf der molekulargenetischen Untersu-chung der HMGA2 Expression in caninen Prostata-Geweben. Hierfür wurden im Fol-genden wiederum Proben aus der caninen Gewebebank verwendet

3.4.6. HMGA2 Expression in a Canine Model of Prostate Cancer

Zur Bestimmung der tatsächlichen Transkriptmengen in caninen Prostata-Geweben wurden quantitative Real Time PCR Untersuchungen durchgeführt. Diese ergaben deutlich unterschiedliche Mengen an HMGA2 Transkripten in den untersuchten ge-samt-RNAs in Abhängigkeit vom jeweiligen Patho-Histologischen Befund. So zeigten die untersuchten Normalgewebe, Hyperplasien und Zysten deutlich geringere Men-gen an HMGA2 Transkripten als Karzinome. Alle sechs Karzinome zeigten Transkriptmengen über einem Wert von 23086 Transkripten pro 250 ng gesamt RNA. Alle gutartigen Gewebe blieben unter diesem Wert, dabei zeigten die Normalgewebe einen maximalen Wert von 1433 Transkripten pro 250 ng gesamt RNA. Die statisti-sche Analyse zeigte, dass es sich bei den ermittelten Werten nicht um Zufallsergeb-nisse handelt (p < 0,001), somit kann der HMGA2 mRNA Level zur Unterscheidung zwischen malignen und benignen Geweben verwendet werden. Bei der Karzinom-Probe mit dem höchsten gemessenen HMGA2 Transkriptlevel handelt es sich um das korrespondierende Gewebe zu der bereits zuvor etablierten caninen Prostatakarzi-nom Zell-Linie (Siehe Kapitel 3.1.2).

Weiterführende Untersuchungen sollten klären, ob eine antisense Strategie mit Hilfe von adenoviralen Vektoren einen Einfluss auf die Proliferation der im Rahmen der zytogenetischen Untersuchungen neu etablierten, spontan immortalisierten Zell-Linie ausübt.

3.4.7. Inhibitory effect of antisense HMGA AAV-mediated delivery

suppresses cell proliferation in canine carcinoma cell line

Für die Herstellung Adeno-assoziierter Viren, welche das gewünschte Gen als Insert tragen, wurde zunächst die codierende Sequenz des caninen HMGA2 charakterisiert. Mit Hilfe dieser Sequenzdaten wurden rekombinante Adeno-assoziierte Viren (rAAV) hergestellt, die HMGA1 und HMGA2 in antisense bzw. LacZ in sense Orientierung enthielten. Zusätzlich hergestellte rAAVs ohne Insert dienten als Negativkontrolle. Der Effekt, den diese Adeno-assoziierten Viren auf die HMGA überexprimierenden Zellen ausüben, wurde mit Hilfe der spontan immortalisierten Zell-Linie CT1258 überprüft. Demnach induzieren Viruspartikel, die HMGA1 und HMGA2 in antisense Orientierung tragen, mit hoher statistischer Signifikanz eine Inhibition der Proliferation von Zellen

des caninen Prostata-Karzinoms in vitro. Im Vergleich dazu wird das Wachstum der Tumorzellen durch Viren, welche LacZ in sense Orientierung tragen (Kontrolle) nicht signifikant beeinflusst.