Tierärztliche Hochschule Hannover
Friedrich-Loeffler-Institut
Institut für Nutztiergenetik (Mariensee)
Charakterisierung der Interaktion porciner Spermien mit uterinen Epithelzellen und der hiermit verbundenen Genexpression hinsichtlich der Modulation einer
erfolgreichen Insemination
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Sonja Lucie Sophie Junge-Krämer Diepholz
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. D. Rath,
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. D. Rath
2. Gutachter: Prof. habil. Dr. phil. nat. S. Steinlechner
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2012
Die vorliegenden Arbeit wurde durch die Dr. Dr. h.c. Karl Eibl Stiftung, die Firma IMV- Technologies und die Gesellschaft der Freunde des Johann Heinrich von Thünen Institutes (vTI) gefördert.
Ein Beitrag aus dem virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen.
Für meinen Mann
Mut ist nicht die Abwesenheit von Angst, sondern vielmehr die Einschätzung,
dass es wichtigere Dinge gibt als die eigene Angst.
Die Furchtsamen nehmen an, daß es die fehlende Angst ist, die es den Mutigen erlaubt, zu handeln,
während die Ängstlichen nichts tun.
Aber Handeln ist leicht, wenn man keine Angst hat.
Etwas nicht tun, wenn man Angst hat, ist ebenfalls leicht.
Etwas trotz seiner Angst zu tun, ist mutig.
Ambrose Hollingworth Redmoon
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 9
2 Literatur ...11
2.1 Immunologische Aspekte der Reproduktion ... 11
2.1.1 Generelle Aspekte der Reproduktionsimmunologie ... 11
2.1.2 Uterine Immunantwort nach Insemination beim Schwein ... 15
2.1.3 Spermienselektionsmechanismen und Spermienbindung im weiblichen Genitaltrakt ... 19
2.2 Morphologie und Funktion des Uterus ... 21
2.2.1 Topographie und makroskopischer Aufbau des Uterus beim Schwein . 21 2.2.2 Histologischer Aufbau des Uterus ... 21
2.3 Zusammensetzung des Inseminates ... 23
2.3.1 Spermien ... 23
2.3.2 Seminalplasma ... 24
2.3.3 Spermadhäsine ... 27
2.3.4 Kapazitation ... 28
2.3.5 Akrosomreaktion ... 30
2.4 In dieser Arbeit näher betrachtete, immunologisch relevante, Gene ... 32
2.4.1 CD163 ... 32
2.4.2 PPAR-alpha ... 33
3 Material und Methoden ...36
3.1 Synchronisation der Versuchstiere ... 37
3.2 Gewinnung der verwendeten Ejakulate ... 37
3.2.1 Gewinnung von Frischsperma ... 37
3.2.2 Gewinnung von Nebenhodenschwanzsperma ... 38
3.3 Spermauntersuchung- und Aufbereitung ... 38
3.3.1 Computerassistierte Spermaanalyse (CASA) ... 38
3.3.2 Morphologische, spermatologische Untersuchung der
Besamungsportion ... 40
3.3.3 Erstellung der Besamungsportionen ... 40
3.4 Probengewinnung... 41
3.5 RNA-Präparation ... 43
3.5.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren (Nanodrop) ... 43
3.5.2 RNA Bioanalyser Untersuchung ... 44
3.6 Reverse Transkription ... 45
3.7 Semiquantitative Real-Time-PCR ... 46
3.8 Primerdesign ... 47
3.9 Gelelektrophorese ... 48
3.10 Mikroarray und Chipdesign ... 50
3.11 Gewinnung von Uterusspülflüssigkeit ... 50
3.12 Bestimmung der Anzahl von Spermien und Immunzellen in der Uterusspülflüssigkeit ... 51
3.13 Probenentnahme, Fixierung und Vorbereitung der Gewebeproben zur Färbung ... 52
3.14 Immunhistologische Nachweise an Kryostatschnitten ... 52
3.15 Histologische Färbungen und bakteriologische Untersuchungen der Uteri . 53 3.16 Western-Blotting-Analyse ... 53
3.17 Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung ... 55
3.18 Statistische Auswertung ... 55
3.19 Verbrauchsmaterialien und Reaktionskits ... 57
3.19.1 Puffer und Lösungen ... 58
4 Ergebnisse ...62
4.1 Reproduktionsbiologische Manipulationen ... 62
4.1.1 Empfängertiere ... 62
4.1.2 Quantitative und qualitative Bestimmung der Ejakulate ... 63
4.2 Uterusspülung ... 63
4.2.1 Leukozyten- und Spermienzahl im Uterus nach künstlicher Besamung in
Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Besamungsportion ... 63
4.2.2 Leukozyten- und Spermienzahl im Uterus nach künstlicher Besamung in Abhängigkeit von der Zeit ... 67
4.3 Transkriptom-Analysen ... 70
4.3.1 RNA-Mikroarray-Analysen ... 70
4.3.2 Semiquantitative Real-Time-PCR ... 77
4.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen ... 77
5 Diskussion ...84
5.1 Diskussion zu Hypothese 1 ... 87
5.2 Diskussion zu Hypothese 2 ... 90
5.3 Diskussion zu Hypothese 3 ... 92
5.4 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick ... 95
6 Zusammenfassung ...96
7 Summary ...100
8 Anhang ...103
8.1 Verzeichnis der im Mikroarray geprüften Gene ... 103
8.2 Abkürzungen der untersuchten Besamungsportionen in den Mikroarrayuntersuchungen / Boxplotgrafiken ... 132
8.3 Regulierte Gene als Boxplotgrafik, 1. Mikroarray ... 133
8.4 Regulierte Gene als Boxplotgrafik, 2. Mikroarray ... 162
8.5 Tabellenverzeichnis ... 180
8.6 Abbildungsverzeichnis ... 181
8.7 Abkürzungsverzeichnis ... 183
9 Literaturverzeichnis ...186
10 Danksagung ...198
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1 Einleitung
Das Hausschwein (Sus scrofa f. domestica) ist in den westlichen Industrienationen einer der wichtigsten Lieferanten von hochwertigem tierischen Protein und Fett für die menschliche Ernährung. Sowohl in der konventionellen als auch in der biologisch-dynamischen Schweinezucht wird für die Ferkelerzeugung heute zum größten Teil die künstlicher Besamung verwendet, welche die hygienischen Risiken der natürlichen Fortpflanzung bei gleichzeitiger Steigerung des genetischen Fortschrittes minimiert. Die zunehmende Bedeutung der künstlichen Besamung beim Hausschwein hat in den letzten 20 Jahren zu einer Optimierung des Besamungsmanagements mit einer annähernd 90%igen Fertilitätsrate geführt.
Allerdings müssen hierfür Besamungsportionen mit mindestens 1x109 Spermien eingesetzt werden, was die Anzahl der Besamungsdosen, die aus einem Eberejakulat gewonnen werden können, deutlich reduziert (Ciereszko et al., 2000).
Dieser Umstand limitiert auch die Etablierung neuer biotechnologischer Verfahren in der Schweinereproduktion, wie z.B. die Tiefgefrierkonservierung (Westendorf et al.
1975) oder geschlechtsspezifische Sortierung von Spermien anhand der Geschlechtschromosomen mittels Durchflusszytometrie. Für eine erfolgreiche Besamung mit einer reduzierten Spermienzahl je Besamungsportion ist es bis heute notwendig auf Techniken wie die tief intrauterine Besamung (5x106 Spermien je Uterushorn) oder eine laparoskopische Besamung in den Eileiter zurück zu greifen (Johnson, 1999, Krüger, 2000).
Kürzlich publizierte Ergebnisse (Taylor et al., 2008, Matthijs et al., 2000) geben Hinweise darauf, dass es bei Sauen nach der Besamung zu einem Verbleib von Spermien im Uterus kommt. Des weiteren kann eine immunologische Reaktionen des Uterus beobachtet werden, die durch den Inseminationsvorgang, Komponenten der Besamungsportion oder die Spermien selbst stimuliert werden und sich zum Beispiel durch eine verstärkte Infiltration von Leukozyten in das Uteruslumen äußert (Matthijs et al., 2003, Rozeboom et al., 1998, Rozeboom et al., 1999). Sowohl die uterine Spermienretention als auch die immunologische Reaktion können Erklärungsansätze für den massiven Spermienbedarf einer erfolgreichen
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Insemination beim Schwein sein. Die molekularen Steuerungsmechanismen dieser Prozesse sind allerdings bisher nicht bekannt.
Ziel der Arbeit ist es daher, durch ein besseres Verständnis der Vorgänge im porcinen Uterus direkt nach Besamung neue Wege für die Optimierung des Besamungsmanagements beim Schwein aufzuzeigen. Dazu wurden auf Grundlage der aktuellen Literatur folgende Hypothesen aufgestellt:
Die Retention von Spermien im Uterus wird durch deren Bindung an das uterine Epithelzellgewebe bedingt.
Die Spermien-Epithelzellbindung im Uterus wird durch Seminalplasma moduliert.
Die Bindung von Spermien an uterine Epithelzellen beeinflusst die Genexpression im Uterus und hat dadurch Auswirkungen auf spätere Ereignisse wie Implantation und Embryonalentwicklung.
Zur Untersuchung genannter Hypothesen wurden im Rahmen dieser Arbeit Besamungsversuche mit unterschiedlich formulierten Besamungsportionen durchgeführt. Hierbei sollte zum einen ermittelt werden, wie sich der Verbleib von Spermien im periovulatorischen Uterus gestaltet. Des weiteren sollten diese Experimente die Regulation der Leukozyteninfiltration in Abhängigkeit von einzelnen Komponenten der Besamungsportion untersuchen. Zur Ermittlung der Effekte einzelner Ejakulatkomponenten, die für die Regulationen auf molekularer Ebene verantwortlich sind, wurde die Genexpression immunologisch relevanter Gene im Uterusepithel mittels RNA-Mikroarrays untersucht und durch Real-Time-PCR- Analysen sowie immunhistochemische Untersuchungen ergänzt.
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2 Literatur
2.1 Immunologische Aspekte der Reproduktion
2.1.1 Generelle Aspekte der Reproduktionsimmunologie
Durch die Ejakulation gelangen Spermien als körperfremde Zellen sowie auch körperfremde Proteine in den weiblichen Organismus und induzieren eine Immunantwort im Reproduktionstrakt. Die Regulation dieser natürlichen Abwehrreaktion ermöglicht die Manifestation einer Trächtigkeit bei gleichzeitiger Eliminierung defekter Spermien und Ejakulatbestandteile. Die molekularen Mechanismen und Signaltransduktionswege dieser Prozesse werden bis heute nur im Ansatz verstanden.
Seit Mitte der 90er Jahre wird Gravidität als ein Th2-Phänomen angesehen (Lin et al., 1993), wobei Th2-Zellen IL-4 und IL-5 als wesentliche Faktoren für IgE- Produktion, Eosinophile und allergische Entzündungsvorgänge angesehen werden.
Diese Hypothese beruht auf der Beobachtung einer Infektion trächtiger Mäuse mit dem Leishmania major Erreger, wobei diese Mäuse die Infektion durch eine Th1- Immunantwort erfolgreich bekämpfte, jedoch die Trächtigkeit mit einem Abort endete.
Eine Th2-Immunantwort der infizierten Tiere sorgte dagegen für eine Persistenz der L. major-Infektion und eine erfolgreiche Trächtigkeit der Tiere (Krishnan et al., 1996a, Krishnan et al., 1996b). Besonders Spontanabort und Präeklampsie scheinen zwei Komplikationen der Schwangerschaft im humanen Bereich zu sein, für welche eine Th1-Dominanz charakteristisch scheint (Hill et al., 1995).
Als schwangerschafts-protektives Zytokin gilt TGF-ß2, weil es immunsupprimierende Eigenschaften besitzt (Clark et al., 1997, Clark et al., 1999). Neuere Daten wiederlegen die traditionelle These, dass die Th1-Zytokine generell schwangerschaftsgefährdend sind (Chaouat et al., 2002). Wichtig ist jedoch, dass viele Schwangerschaftskomplikationen mit einem Überwiegen der Th1-Zytokine in Zusammenhang stehen. In aktuellen Untersuchungen gilt besonders Interleukin 12 (IL12) als wichtigster Mediator der Interferon-y-Sekretion in der Th1-Immunantwort
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(Fantuzzi et al., 1999, Seder et al., 1993). Antigenpräsentierende Zellen (APZ) sind die Hauptquellen von IL-12, wobei ihre Produktion abhängig und auch unabhängig von T-Zellen sein kann. In der Dezidua trächtiger Mäuse korreliert die Transkription von IL-12 mRNA mit der Expression von IFN-y (Haddad et al., 1997), dem eine zwiespältige Rolle in der Gravidität zugeschrieben wird. Auf der einen Seite können natürliche Killerzellen (NK-Zellen) IFN-y absondern, wodurch eine Stimulierung von Makrophagen erfolgt, die als eine Quelle der embryotoxischen Nitric-Oxidase gesehen werden (Haddad et al., 1997). Andererseits kann die Expression einen positiven Einfluss auf den immunologischen Status der Mutter, spätere Schwangerschaften und auf die Prädisposition allergischer Abwehrmechanismen in der frühen Entwicklung der Nachkommen haben (Breckler et al., 2008).
Maternale und paternale Anteile prägen das genetische Material der befruchteten Eizelle. Während bestimmter Entwicklungsabschnitte wird das embryonale Genom aktiviert und bewirkt hierbei eine Proteinsynthese, welche sich von der bis zu diesem Zeitpunkt codierenden maternalen mRNA unterscheidet. Der sich entwickelnde Embryo bildet somit eine antigene Komponente, die sich vom Immunsystem der Mutter unterscheidet und zu einer Abstoßungsreaktion führen müsste.
Untersuchungen hierzu vertreten die Hypothese, dass in der Frühgravidität die Zona pellucida eine physikalische Schutzbarriere bildet und somit den Konzeptus vor der Zerstörung durch entsprechende Antikörper oder auch zytotoxische T-Lymphozyten schützt (Gil et al., 2001, Warner et al., 1988). Auf der anderen Seite produziert der Embryo verschiedene Faktoren, die eine Aktivierung zytotoxischer Zellen unterbinden und weiterhin eine Veränderung des Leukozytenphänotyps bewirken. So findet im Falle der Gravidität eine Verschiebung von Th-1-Zellen zu Th-2-Zellen statt (Lin et al., 1993). Bedingt durch diesen Shift wird am feto-maternalen Interaktionspunkt die Produktion unterschiedlichster Wachstumsfaktoren und auch positiv induzierender Zytokine wie etwa IL-4, IL-5 und IL-10 angeregt, die somit ein Überleben und auch das Wachstum des Embryos ermöglichen (Emond et al., 1998, Fortin et al., 1997). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der trächtige Uterus eine Sonderstellung hinsichtlich der Immunantwort spielt und bedingt durch diese Sonderstellung ein Überleben und Wachstum des Embryos ermöglicht.
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Im Rahmen von Immunantworten kann zwischen erworbenen und angeborenen bzw.
adaptiven und nichtadaptiven Immunantworten unterschieden werden. Die angeborenen, nicht adaptiven Immunantworten benötigen im Vorfeld keinen Kontakt mit einem Antigen und führen unmittelbar, in einem Zeitraum von bis zu 4 Stunden, zu einer Immunantwort. Makrophagen, dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten und auch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) spielen hierbei als Effektorzellen eine ausschlaggebende Rolle. Die erworbene adaptive Immunantwort entwickelt sich innerhalb mehrerer Tage und benötigt hierbei einen vorangegangenen Antigenkontakt. Wichtige Zellen dieser Immunantwort sind T- und B-Lymphozyten sowie antigenpräsentierende Zellen wie zum Beispiel Makrophagen und dendritische Zellen (Engelhardt et al., 1997, Janeway, 1995). Wodurch die roten Blutkörperchen eine homogene Population bilden. Im Gegensatz hierzu finden sich viele unterschiedliche Typen von weißen Blutkörperchen. Differenziert nach ihrem Erscheinungsbild werden sie in die drei Gruppen die Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten eingeteilt. Die Granulozyten enthalten einen großen Anteil an Lysosomen und Sekretionsvesikeln (auch als Granula bezeichnet). Sie werden anhand ihrer Morphologie und dem unterschiedlichen Anfärbeverhalten ihrer Zellorganellen in drei weitere Untergruppen gegliedert. Ihr unterschiedliches Anfärbeverhalten spiegelt auch die Differenzen in Chemie und Funktion wieder.
Neutrophile Granulozyten, die wegen ihres gelappten Zellkerns auch polymorphkernige Granulozyten oder Leukozyten genannt werden, gehören zur größten Gruppe der Granulozytenpopulation. Sie phagozytieren und zerstören eingedrungene Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und gehören zum nichtadaptiven Immunsystem. Basophile Granulozyten scheiden zum Großteil Histamin aus und wirken bei der Bekämpfung von Entzündungs- und allergischen Reaktionen mit. Eosinophile Granulozyten sind an der Kompensation von parasitären Erkrankungen und der Modulierung allergischer Entzündungsprozesse beteiligt.
Verlassen Monozyten den allgemeinen Blutstrom, reifen sie heran und werden zu Makrophagen. Zusammen mit den neutrophilen Granulozyten bilden sie die phagozytierenden Zellen im Organismus (Tabelle 1). Sie enthalten beide spezialisierte Lysosomen, welche mit neugebildeten Phagosomen verschmelzen. In
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diesen Phagosomen werden eingeschlossene Mikroorganismen durch unterschiedliche Mechanismen und einer Mischung aus lysosomalen Hydrolasen unschädlich gemacht. Makrophagen sind im Vergleich zu den Neutrophilen jedoch sehr viel größer und langlebiger. In unterschiedlichen Geweben sind die Makrophagen dafür verantwortlich, dass alte, tote und beschädigte Zellen erkannt und beseitigt werden. Als einzige sind Makrophagen auch in der Lage, große Mikroorganismen wie etwa Protozoen zu phagozytieren. Monozyten sind weiterhin auch die Ausgangszellen für dendritische Zellen. Ihre überwiegende Tätigkeit ist jedoch nicht die Phagozytose, sondern sie haben sich darauf spezialisiert, den Lymphozyten fremde Antigene zu präsentieren und somit eine Immunantwort herbeizuführen. Lymphozyten unterteilen sich in zwei Untergruppen, welche beide an einer Immunreaktion beteiligt sind: die B- und die T-Lymphozyten (Tabelle 1). Die B- Lymphozyten produzieren Antikörper, die T-Lymphozyten steuern die Aktivität anderer weißer Blutkörperchen und zerstören virusinfizierte Zellen. Des Weiteren gibt es Lymphozyten-ähnliche Zellen, die als natürliche Killerzellen (NK-Zellen) bezeichnet werden (Alberts et al., 2004).
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Tabelle 1: Hauptfunktionen der weißen Blutkörperchen
Zelltyp Hauptfunktion des Zelltyps
Weiße Blutkörperchen (Leukozyten) Granulozyten
Neutrophile (polymorphkernige Leukozyten) Phagozytieren und zerstören eingedrungene Bakterien
Eosinophile Zerstören größere Parasiten und
modulieren allergische Entzündungs- prozesse
Basophile Setzen bei bestimmten Immunreaktionen
Histamin frei
Monozyten Werden zu Makrophagen der Gewebe,
phagozytieren und verdauen
Mikroorganismen, Fremdkörper und alte und geschädigte Zellen
Lymphozyten
B-Zellen Bilden Antikörper
T-Zellen Töten virusinfizierte Zellen und steuern
Aktivität anderer Leukozyten
Natürliche Killerzellen Töten virusinfizierten Zellen und einige Arten von Tumorzellen
2.1.2 Uterine Immunantwort nach Insemination beim Schwein
Der Uterus ist nicht nur, aber vor allem während der Insemination antigenen Substanzen ausgesetzt. Ein immunologisches System ist hierbei ein wichtiger Schutz vor Infektionen. Die Präsenz von Leukozyten im Uterus zeigt dabei eine zyklusabhängige Modifikation (Bischof et al., 1994b, Kaeoket et al., 2002a). Die endokrinologisch gesteuerte Veränderung wird vor allem vom Östrogen und Progesteron reguliert (Rigby, 1967, Kunavongkrit and Malmgren, 1983). Des Weiteren konnte bei Jungsauen zyklusabhängige Anfälligkeit nach intrauteriner Applikation von Bakterien nachgewiesen werden (de Winter et al., 1994). Hierbei zeigten alle im Interöstrus mit Escheria coli infizierten Tiere eine Endometritis mit
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vaginalem Ausfluss, wobei jedoch ein im Östrus befindliches infiziertes Tier nur einen geringgradigen vaginalen Ausfluss zeigte. In allen Zyklusstadien des porcinen Uterus finden sich im Oberflächenepithel, im Stroma und auch im Drüsenepithel des Endometriums Lymphozyten (Bischof et al., 1994a, Kaeoket et al., 2002b). Bischof stellte 1994 fest, dass neutrophile Granulozyten im präpuberalen Uterus zusammen mit T-Lymphozyten und Makrophagen die häufigste Zellpopulationen sind. Hierbei schrieb er diesen Zellen eine wichtige Rolle in der interaktiven, zyklischen zellulären Veränderung sowohl in der Struktur als auch der Funktion des Endometriums zu.
Weiterhin stellte er eine lokale zelluläre Immunantwort bedingt durch diese Leukozytenpopulationen fest (Bischof et al., 1994a). Bei geschlechtsreifen Sauen nach Insemination ist im Proöstrus und Östrus ein starker Influx neutrophiler Granulozyten zu beobachten. Subepithelial sowie um Blutgefäße herum ist hierbei eine Ansammlung dieser Zellen zu finden. Im Oberflächenepithel sind sie nur vereinzelt vorhanden (Bischof et al., 1994a, Bischof et al., 1994b, Engelhardt et al., 1997, Kaeoket et al., 2002a, Kaeoket et al., 2003b).
Beim Schwein ist nach Einbringen des Ejakulates ein schneller Einstrom neutrophiler Granulozyten in das Lumen und das Endometrium des Uterus nachweisbar (Lovell and Getty, 1968, Pursel et al., 1978, Rozeboom et al., 1998, Rozeboom et al., 1999).
Zwar ist in vitro eine Hemmung der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten durch Seminalplasma beschrieben worden, doch kann die uterin auftretende Immunantwort auch durch Seminalplasma hervorgerufen werden (Bischof et al., 1994b, Rozeboom et al., 1999, Rozeboom et al., 2001b, Rozeboom et al., 2001a). Auch konnte nach Insemination mit Seminalplasma eine verstärkte Makrophageninfiltration gezeigt werden (Hadjisavas et al., 1994). Als häufigste Subpopulation finden sich im porcinen Endometrium Lymphozyten nach Insemination bzw.
Seminalplasmaapplikation (Kaeoket et al., 2003c, Kaeoket et al., 2003a, Bischof et al., 1994b). Im Endometrium besamter Sauen konnten bis zu 11 Tage nach Insemination erhöhte Werte für CD2 CD4 und CD8 positive Zellen im Vergleich zu östrischen und unbesamten Tieren gefunden werden (Kaeoket et al., 2003b). Im Gegensatz hierzu wurden bei Untersuchungen nach dem Natursprung bei Jungsauen im Vergleich zu unbesamten Tieren für diese Zellen ein niedrigerer Wert
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an Tag zwei und vier nach dem Östrus gefunden (Bischof et al., 1994b, Bischof et al., 1994a). Weiterhin wurden im Oberflächen- und Drüsenepithel des Endometrium eine höhere Anzahl an CD8 und CD4 positiven Zellen gefunden, während im oberflächlichen und auch tiefen Stroma des Epithels ein umgekehrtes Verhältnis dieser Zellpopulationen gefunden wurde (Kaeoket et al., 2003b, Kaeoket et al., 2003a). Ein Einfluss auf Mastzellen im Endometrium konnten bedingt durch die Insemination nicht nachgewiesen werden (Kaeoket et al., 2003b). Studien konnten weiterhin zeigen, dass Seminalplasmabestandteile mit dem Endometrium interagieren und somit eine Veränderung des Leukozyteninflux und der Zytokinexpression bewirken, wodurch ein Einfluss auf die Aufrechterhaltung der Gravidität, die Präimplantation und Embryonalentwicklung bestehen. Hiermit bietet sich eine molekulare Erklärung für die veränderten, erhöhte Wurfgrößen bei Schweinen an (O'Leary et al., 2004). Studien belegen eine entzündliche Veränderung der Reproduktionsorgane aller bisher untersuchten Säugetiere, wenn sie Seminalplasma ausgesetzt wurden. Den größten Einblick in die hierbei ablaufenden molekularen und zellulären Reaktionen erbrachten Studien an Nagern, wobei Seminalplasma nicht nur als Transport- und Nährmedium für Spermien anzusehen ist, sondern auch als Kommunikationsmittel zwischen weiblichen Genitaltrakt und Spermien dient, und eine Schlüsselrolle in der Konditionierung des weiblichen Reproduktionstraktes gegenüber einer Trächtigkeit darstellt. Bei Nagern ist Seminalplasma für den positiven Trächtigkeitsverlauf durch die Aktivierung entzündlicher und immunologischer Veränderungen im weiblichen Genitaltrakt verantwortlich. Hierdurch ergibt sich weiterhin eine positive Wirkung auf die Embryonalentwicklung und Implantation (Robertson, 2007). Beim Schwein ist bekannt, dass erst 15-30 Minuten nach der Besamung die ersten Spermatozoen im Eileiter nachgewiesen werden können. Mehrere Stunden dauert es jedoch noch bis im kaudalen Isthmus befruchtungskompetente Spermien auszumachen sind (Hunter, 1981). Sowohl für Scheiden- als auch Uterusbesamer stellt der kaudale Isthmus des Eileiters ein funktionelles Spermienreservoir dar (Boyle et al., 1987). Innerhalb dieses Reservoirs werden die Spermien an unterschiedlichen Lokalisationen gespeichert.
(Smith and Yanagimachi, 1991). Ein Anteil dieser Spermienpopulation findet sich
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unbeweglich gebunden in einer viskösen Masse im zentralen Lumen des Eileiters.
Ein weiterer Teil ist am Boden der Epithelschleimhautfalten gebunden (Mburu et al., 1997). Veränderungen ähnlich eines Alterungsprozesses konnten an den Spermien beobachtet werden, die sich im Eileiterlumen befanden. Als Schutz vor dem Zilientransport bildet sich in den Schleimhautfalten des Eileiters ein zusätzliches Reservoir aus Spermien (Blandau and Gaddum-Rosse, 1974). Unterschiedliche Studien gehen davon aus, dass eine Voraussetzung für das Überleben und auch die Kapazitation der Spermien ein enger Kontakt zwischen dem apikalen Anteil des Spermienkopfes und dem Epithel des Ovidukts ist. Kohlenhydrat-Proteinbindungen sind hierbei vermutlich für die Vermittlung des Kontaktes zwischen den somatischen Oviduktzellen und den männlichen Gameten zuständig (Smith and Yanagimachi, 1991, Suarez, 2001, Hunter, 1995), da mehreren Forschergruppen der Nachweis einer Kohlenhydratbeteiligung an der Spermien-Oviduktepithelzell-Bindung gelang (Lefebvre and Suarez, 1996, Dobrinski et al., 1996, Petrunkina et al., 2001). Hierbei werden von Oviduktepithelzellen Oligosaccharide exprimiert, die über spezifische Proteine die Kohlenhydrate binden oder Lektin-ähnliche Moleküle der Spermien identifizieren (Suarez, 1998, Suarez et al., 1997).
Unterschiedlicher Untersuchungen folgend können dem kaudalen Isthmus somit folgende, für die Befruchtung wichtige Funktionen zugeordnet werden:
Selektion intakter und zur Befruchtung fähiger Spermien
Aufrechterhaltung der Spermienvitalität bis zum Zeitpunkt der Ovulation
Eine Verhinderung der Polyspermie, durch Begrenzung der Spermienanzahl am Ort der Befruchtung durch gezielte Lösung der Spermatozoen
Regulation in Hinsicht auf Hyperaktivität und Kapazitation der Spermien
Nicht nur die Bindung der Spermien am kaudalen Isthmus ist ein zentraler Mechanismus, sondern auch physikalische Vorgänge wie die Spermienfixierung innerhalb ödematöser Isthmusfalten verhindern den Spermienaufstieg in der präovulatorischen Zyklusphase (Hunter and Nichol, 1986). Im Östrus kommt es zu einer starken Schwellung der Falten des Oviduktepithels, wodurch sich das Lumen verengt und die ankommenden Spermien automatisch Kontakt zu den
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Oviduktepithelzellen und ihren Rezeptoren erhalten. Bekannt ist, dass gebundene Spermien, welche schon präovulatorisch freigesetzt wurden, zum Zeitpunkt der Ovulation nicht mehr befruchtungsfähig sind (Hunter, 1995). Dies wird durch einen Verlust der nur begrenzten Energiereserven der Spermien bewirkt. Bei Eberspermien ist bekannt, dass diese Reserven maximal für 24 Stunden ausreichend sind, wobei eine Ovulation auch mehr als 24 Stunden nach der Insemination auftreten kann.
Schon kapazitierte Spermien in der Besamungsportion sind aufgrund ihrer Veränderungen an der Plasmamembran dann in einer Phase der metabolischen Erschöpfung (Hunter, 1995).
2.1.3 Spermienselektionsmechanismen und Spermienbindung im weiblichen Genitaltrakt
Hinsichtlich des Begriffs Spermienselektion muss zunächst zwischen solchen Säugetierspezies unterschieden werden, die vaginal das Sperma absetzen und jenen die ihr Sperma direkt in den Uterus absetzen. Bekannt ist, das bei den Vaginalbesamern wie z. B. dem Rind, die Cervix eine Hauptbarriere für den Spermientransport darstellt (Mitchell et al., 1985). Ein retrograder Fluss des Cervixschleims bei Rind beseitigt hier einen Anteil der zentral in den Cervixkanal eingebrachten Spermien (Mullins and Saacke, 1989). Eine Selektion morphologisch und aber auch funktionell veränderter Spermien erfolgt bei Primaten und Wiederkäuern u. a. durch den Cervixschleim (Barros et al., 1984, Mitchell et al., 1985, Katz et al., 1989). Einigen Spezies wird in der Interaktion zwischen Cervixschleim und Spermien eine zentrale Rolle bei der Spermienkapazitation eingeräumt (Katz et al., 1989). Beim Wiederkäuer dient die Cervix auch als Spermienreservoir (Katz et al., 1989). Die utero-tubale Verbindung und der Eileiteristhmus dienen bei intrauteriner Samenablage nicht nur als Spermienreservoir, sondern auch als Selektionsbereich. Tiefgefrorene und wieder aufgetaute sowie tote Spermien verbleiben in diesem Bereich nur für eine kurze Zeitspanne im Vergleich zu frischen, lebenden Spermien (Pursel et al., 1978, Einarsson and Viring, 1973, Blandau and Gaddum-Rosse, 1974). Polson und Krzanowski (Polson et al., 1974) beobachtete bei Mäusen eine Selektion morphologisch veränderter Spermien durch die utero-tubale Verbindung. Eine
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massive Reduktion der Spermienmenge erfolgt zwischen dem Ablageort und der Eileiterampulle. Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass nur ein geringer Anteil der inseminierten Spermien aus dem Eileiter zurückgewonnen werden kann und an der Befruchtung beteiligt ist (Rigby, 1966, First et al., 1968, Overstreet and Cooper, 1978). Unterschiedliche Angaben werden über den Zeitraum gemacht, in dem der weitaus größte Anteil der Spermien und des Seminalplasmas aus dem Uterus wieder eliminiert werden. Eine einheitliche Aussage wird dadurch erschwert, dass die Untersuchungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt werden. Unter anderem wurde beschrieben, dass bereits nach 15 Minuten nur noch die Hälfte der eingebrachten Spermien im Uterus zu finden ist (First et al., 1968). Andere Arbeiten beschreiben, dass zwei Stunden nach Bedeckung bzw. Besamung ein großer Anteil der Spermien und des Seminalplasmas schon wieder aus dem Uterus eliminiert wurde (Rigby, 1966). Nach Viring und Kollegen trat die Verringerung der Spermienzahl im Uterus erst 12 Stunden nach der Besamung ein (Einarsson and Viring, 1973, Viring, 1980, Viring and Einarsson, 1980). Der schnelle Verlust von Spermien und Seminalplasma aus dem Uterus ergibt sich zum Teil durch den Rückfluss durch den Cervixkanal (Einarsson and Viring, 1973, Viring and Einarsson, 1980, Pursel et al., 1978, Steverink et al., 1998), wobei ein Rückfluss von bis zu 70%
des inseminierten Volumens und annähernd 25% der inseminierten Spermien innerhalb von zwei Stunden nach Besamung bei Sauen festgestellt wurde. Unter anderem sind für diesen Rückfluss Uteruskontraktionen in peristaltischen Wellen verantwortlich (Langendijk et al., 2005). Ein weiterer Einfluss der Reduktion der Spermatozoenzahl ergibt sich durch eine lokale Phagozytose, welche bei Sauen nach 8 Stunden, bei Jungsauen schon 2 Stunden nach der Insemination beobachtet wurde. Erste Phagozytoseprozesse wurden schon 30 Minuten nach Besamung durch die Einwanderung phagozytierender polymorphkerniger Leukozyten in das Uteruslumen beschrieben. (Pursel et al., 1978, Lovell and Getty, 1968). Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass der Rückfluss und die Phagozytose der Spermatozoen durch die extrem schnelle Reduktion der Spermien innerhalb der ersten vier Stunden nach der Insemination beeinflusst wird (Matthijs et al., 2003, Matthijs et al., 2000). Beim Schaf konnten Spermienverluste bei der Passage der
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Spermien durch die Eileiter in die angrenzende Peritonealhöhle nachgewiesen werden (Mattner, 1968). Dieses beobachtete Phänomen wird ebenfalls ausgiebig beim Schwein diskutiert. Hierbei stützen sich die Diskussionen auf Ergebnisse, wonach schon 2 Stunden nach der natürlichen sowie auch der artifiziellen Besamung hohe Spermienzahlen aus dem proximalen Eileiterhälften zurückgewonnen werden konnten (Viring, 1980, Einarsson and Viring, 1973).
2.2 Morphologie und Funktion des Uterus
2.2.1 Topographie und makroskopischer Aufbau des Uterus beim Schwein Der Uterus beim Schwein wird in die Abschnitte Gebärmutterhals (Cervix uteri), Uteruskörper (Corpus uteri) und die paarig vorliegenden Uterushörner (Corni uteri) des Uterus bicornis unterschieden. Neben dem Spermientransport ist der Uterus auch an der Implantation und Plazentation beteiligt und sorgt weiterhin für die Versorgung und Entwicklung des Embryos bzw. des Fötus (Nusshag, 1968). Am Ende der Gravidität ist der Uterus durch Kontraktion für die Austreibung der Frucht verantwortlich. Im Vergleich zum Menschen fehlt bei Schweinen der Bereich der Portio vaginalis cervicis, ein in die Vagina reichender Anteil der Cervix uteri. Um einen Verschluss gegenüber der Vagina zu erreichen, liegen daher beim Schwein im Lumen des Gebärmutterhalses (Cervix uteri) spezielle Gewebekissen (Pulvini cervicis) vor, die ähnlich einem Reißverschluss ineinander greifen.
2.2.2 Histologischer Aufbau des Uterus
Die Uterusschleimhaut (Endometrium, Tunica mucosa) bildet beim Schwein und auch anderen Säugetieren unterschiedlich hohe Falten, die verstreichbar sind, und im Bereich des Corpus uteri besonders hoch vorliegen können. Die Tunica mucosa liegt der Uterusmuskulatur (Tunica muscularis) an, wobei der äußere Anteil der Uterusmuskulatur in das Mesometrium einzieht. Hier bildet sie die Serosamuskulatur, die an den Bewegungen des Aufhängeapparates des Uterus beteiligt ist. Als äußere Abgrenzung wird der Uterus vom Perimetrium, einem Überzug des Bauchfells umschlossen, der dem Mesometrium entstammt.
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Die das Uteruslumen auskleidende Schleimhautschicht unterliegt starken zyklusabhängigen hypertrophen und hyperplasmatischen Veränderungen. Das einschichtige iso- bis hochprismatische Oberflächenepithel kann während des Zyklus zwei- bis mehrreihig werden (Nusshag, 1968, Kaeoket et al., 2002a).
Auf das Oberflächenepithel folgt vom Lumen her gesehen die Lamina propria mucosae, welche vor allem die Uterusdrüsen und zellreiches, aber faserarmes Stroma endometrialis umfasst. In dieser Gewebeschicht finden sich besonders häufig im subepithelialen Bereich zahlreiche Immunzellen, wie z. B. Lymphozyten.
Das Myometrium, die Tunica muscularis, wird aus einer inneren, zirkulär verlaufenden Schicht, dem Stratum circulare, und einer äußeren, longitudinal verlaufenden Schicht, dem Stratum longitudinale, gebildet. Beide Muskelschichten bilden zusammen ein Spiralsystem, welches die Uterusausdehnung während der Gravidität ermöglicht und auch für das anschließende Zusammenziehen post partum verantwortlich ist. Das Stratum circulare setzt sich nach kaudal in die Muskulatur der Tuba uterina fort, während es nach kranial in die Muskulatur der Cervix übergeht.
Anteile aus dem Stratum longitudinale bilden nach kranial die Scheidenmuskulatur und verstärken mit die Theca subserosa. Ein bei anderen Haussäugetieren (Pferd, Hund, Katze) zwischen den beiden Muskelschichten vorliegendes Stratum vasculare ist beim Schwein nicht vorhanden (Nusshag, 1968). Das Perimetrium bildet die äußere Begrenzung des Uterus und besteht aus einem einschichtigen Plattenepithel, dem Mesothel, und einer lockeren Bindegewebsschicht. In dieser bindegewebigen Schicht verlaufen Blut- und auch Lymphgefäße sowie Nervenfasern des Sympathikus und Parasympathikus. Ein kompliziertes Faltungssystem befindet sich im Bereich der Schleimhaut der Cervix uteri. Dieses besteht aus Längs- und Querfalten, die als Primär- Sekundär- und auch Tertiärfalten bezeichnet werden. Sie dienen dem Verschließen und Öffnen des Uterus. Die einschichtigen, hochprismatischen Cervixepithelzellen bilden als zusätzlichen Verschluss der Cervix einen zähen Schleimpfropf (Nusshag, 1968, Kaeoket et al., 2002a).
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2.3 Zusammensetzung des Inseminates
2.3.1 Spermien
Eberspermatozoen entsprechen in ihrem Aufbau den Spermatozoen anderer Nutztiertierarten. Das Spermium wird in einen Kopf, Hals und Schwanz unterteilt, wobei sich der Spermienschwanz wiederum in ein Mittel-, Haupt- und Endstück gliedert (Setchell, 1974, Evans and Setchell, 1978). Die Gesamtlänge eines Spermiums beträgt zwischen 50 bis 70μm.
Abbildung 1: Schem atische Darstellung eines Säugersperm ium s: Angepasst nach Rüsse and Sinowatz (1998 aus: http://edoc.hu -berlin.de/dissertationen/kurz-anke-2005- 02-02/HTML/im age001.gif )
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Der Spermienkopf beinhaltet den Zellkern, in welchem die Desoxyribonukleinsäure als Träger der genetischen Information in Form sehr stark kondensierten Chromatins vorliegt (Monesi et al., 1978). Eine innere und äußere Kernmembran umgeben den Zellkern in seiner ovalen bis rechteckigen, seitlich abgeflachten Form. Die Kopfkappe, das Akrosom, bedeckt 2/3 des Kopfes. Dieses Akrosom wird aus den Vesikeln des Golgikomplexes gebildet. Es enthält hydrolytische Enzyme wie z. B.
Akrosin und Hyaluronidase, die bei der Interaktion des Spermiums mit der Eizelle freigesetzt werden und die Penetration des Spermiums in die Oozyte ermöglichen.
Das Halsstück fungiert als bewegliche Verbindung zwischen Spermienkopf und Spermienschwanz. Die Basalplatte, welche zwischen der Implantationsgrube des Kerns und dem proximalen Zentriol liegt, bildet die Kontaktstelle. Dieser Bereich wird vielfach auch als Gelenkkopf bezeichnet und ist eine Prädilektionsstelle für die Trennung des Spermienschwanzes vom Kopf während des Penetrationsprozesses.
Der Spermienschwanz wird in ein Mittel- Haupt und Endstück unterteilt und entspringt als Achsenfaden am proximalen Zentriol des Spermienhalses. Eine für Geißeln typische radialsymetrische Struktur, bestehend aus neun Doppelmikrotubuli und weiteren neun Außenfibrillen, findet sich am Achsfaden. Die Energieversorgung wird im Spermium im Mittelstück von Mitochondrien bereitgestellt, die in einer einlagigen, spiralförmigen Schicht vorliegen. Das Hauptstück bildet den längsten Teil des Spermienschwanzes, wobei die Dicke der Außenfibrillen nach distal abnimmt. In diesem Bereich findet sich die sogenannte Ringfaserscheide, die aus einer Schicht fibrillärer Proteine besteht. Das Endstück befindet sich am Ende der Ringfaserscheide, wobei weder Mantelfasern noch eine Faserscheide vorhanden sind und in dessen Verlauf der Achsenfaden frei von Plasmalem umgeben wird. Alle Bereiche eines Spermiums werden von einer Plasmamembran umgeben, deren Zusammensetzung der Lipide der Funktion der einzelnen Spermienareale entspricht (Setchell, 1974, Evans and Setchell, 1978, Hinton et al., 1979).
2.3.2 Seminalplasma
Schon im Nebenhoden erwerben Säugetierspermatozoen die Fähigkeit eine Eizelle zu befruchten, direkt nach der Ejakulation geht die Eigenschaft aber zunächst
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verloren, da sich Bestandteile des Seminalplasma während der Ejakulation wie eine Art Schutzhülle um die Spermatozoen legen, und die Spermien vor Schädigungen, Umwelteinflüssen und frühzeitiger Kapazitation schützen (Shivaji et al., 2009). Das Seminalplasma bildet den flüssigen, spermienfreien Anteil des Ejakulates, das in den verschiedenen akzessorischen Organen des männlichen Genitaltraktes gebildet wird.
Im Allgemeinen wird der Hauptanteil des Seminalplasmas durch die akzessorischen Drüsen (Ampulle, Samenblasendrüse, Prostata und Bulbourethraldrüse) sezerniert, wobei einzelne Volumen und die Zusammensetzung speziesabhängig sind. Im Seminalplasma finden sich unterschiedliche Komponenten, wie freie Aminosäuren, Monosaccharide, Lipide, Polyamide, Prostaglandine, Steroidhormone und Proteine als niedermolekulare Substanzen (Mann and Lutwak-Mann, 1982, von Rad, 2002), sowie eine unterschiedliche Anzahl Ionen (Na+, Cl-, K+, Mg2+, und Ca2+) (Hafez, 1976, Hafez, 1973, Hofny et al., 2010). Um das saure Milieu im weiblichen Genitaltrakt zu neutralisieren, liegt der pH-Wert des Seminalplasmas im Bereich zwischen 7,2 und 7,8 (Setchell, 1974). Das Seminalplasma dient dem Transport, dem Schutz und der Ernährung der Spermien (Smith et al., 1988). Verschiedene Studien belegen weiterhin, dass Seminalplasma einen Einfluss auf die endometrialen Epithelzellen und somit auf eine immunologische Reaktion des weiblichen Genitaltraktes hat. Das Seminalplasma der Maus hat eine hohe Konzentration an TGF-ß, welches die Ausschüttung weiterer pro-inflammatorischer Zytokine in vivo und in vitro stimuliert (Tremellen et al., 1998). Studien belegen heute die Wichtigkeit der Zytokine für die Etablierung einer Gravidität, sowie des Kontaktes des Endometriums mit den Spermien und dem Seminalplasma. Vor allem in der humanen Anwendung der IVF- und ICSI- Methode sind diese Mechanismen von hoher Bedeutung. Durch den hierbei fehlenden physiologischen Kontakt zwischen dem rezeptiven Endometrium und dem Ejakulat ließe sich gegebenenfalls die geringe Implantationsrate intakter Embryonen nach IVF und ICSI erklären. Die Beeinflussung der endometrialen Funktion nach Kontakt mit Spermien und Seminalplasma und einer hieraus resultierenden verbesserten Implantationsrate ist bisher nur in Ansätzen untersucht.
Einzelne Studien jedoch stützen die Hypothese derartiger Mechanismen (Bellinge et al., 1986, Coulam and Stern, 1995). So ist bekannt, dass das Seminalplasma des
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Eberejakulates mit dem Reproduktionstrakt der inseminierten Sau interagiert und die Befruchtungschance positiv beeinflusst. Hierbei werden dem Seminalplasma regulierende Funktionen zugeschrieben, welche die essentiellen Befruchtungsschritte, wie etwa Freisetzung der Oozyten, den Spermientransport im weiblichen Reproduktionstrakt und die Spermienkapazitation, zeitlich optimieren (Waberski et al., 1997, Waberski et al., 1999). Weitere Studien bestätigten die Wirkung des Seminalplasmas auf die T- und B-Zellproliferation, die Phagozytoseaktivität von polymorphkernige Granulozyten (PMN) und Makrophagen sowie die Unterdrückung der Aktivität von natürlichen Killerzellen (Thaler, 1989).
Weitere Funktionen werden heute diskutiert, zumal die Charakterisierung der Seminalplasmaproteine weit fortgeschritten ist. Dabei haben Proteine der drei dominanten Eiweiße der FnII Typ-Familie, CRISP-Proteine und Spermadhäsine II entscheidenden Einfluss.
2.3.2.1 FnII Typ-Proteine
Hierbei handelt es sich um eine Gruppe homologer Proteine, die heparin- und gelatinebindende Domänen enthalten, die allgemein auch als Fibronectin Typ II Domänen bezeichnet werden. Die FnII-Proteine des Rindes (Bovine Seminal Plasma Proteins; BSP-1, -2, -3 und BSP30) sind in ihren Funktionen besonders gut untersucht (Manjunath and Sairam, 1987). Ihre Synthese findet in der Samenblase statt, sodass sie erst bei der Ejakulation mit der Spermienmembran in Kontakt kommen. Die BSPs binden über Interaktion von Phospolipiden fest an die Membran, werden nicht von der Membran abgelöst und wirken durch eine Heparinbindung als positive Regulatoren der Kapazitation.
2.3.2.2 CRISP-Proteine (Cystein-Rich Secretory Proteins)
Die Mitglieder dieser Proteinfamilie zeichnen sich durch 16 hochgradig konservierte Zystein-Reste aus und bilden dabei eine kompakte Domäne am C-terminalen Ende (Eberspaecher et al., 1995). Erstmals wurde ein Protein dieser Familie bei der Ratte nachgewiesen und in Folge als DE/AEG-Protein (acidic epidymal glycoprotein) beschrieben (Cameo and Blaquier, 1976). Aus dem Nebenhodenkörper der Maus wurde das homologe Protein CRISP-1 isoliert. Bei Equiden zeigt das HSP-3 eine
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sehr starke Sequenzhomologie zu CRISP-1, und wird somit gleichfalls der CRISP- Familie zu geordnet. Bei den Pferden gehören die CRISP-Proteine, anders als bei Maus und Ratte, zu den dominierenden Proteinen des Seminalplasmas (Schambony et al., 1998). Ihre Synthetisierung geschieht im Nebenhoden und der Ampulle, wobei sie fest an die postakrosomale Membran und das Mittelstück des Spermienschwanzes binden.
Eine direkte Beteiligung an der Gameteninteraktion durch die DE/AEG-Proteine wurde bei der Ratte nachgewiesen. Hierbei inhibiert das DE-Protein konzentrationsabhängig die Gametenfusion, nicht jedoch die Gamentenbindung (Rochwerger et al., 1992). Beim Pferd konnte eine Korrelation zwischen der Fertilitätsrate und der Anzahl der auf der Spermienmembran gebundenen Proteine nachgewiesen werden (Schambony et al., 1998).
2.3.3 Spermadhäsine
Spermadhäsine gehören einer Proteinfamilien an, deren Moleküle eine Masse von 12-15kDa besitzen. Spermadhäsine sind spermienoberflächenassoziierte Eiweiße, die der Kapazitation und der Gametenerkennung dienen (Calvete et al., 1993, Rodriguez-Martinez et al., 2010). Die Primärstruktur wird dabei von 111-113 Aminosäuren und einer homologen Anordnung von zwei Disulfidbrücken zwischen jeweils benachbarten Cysteinresten gebildet (Einspanier et al., 1994). Es wurde nachgewiesen, dass Spermadhäsine von ihrer Struktur zu einer Familie von ontogenetisch regulierenden Proteinen gehören, welche durch die sogenannte CUB- Domäne charakterisiert werden (Bork and Beckmann, 1993).
Spermadhäsine besitzen die Fähigkeit, spezifisch an Kohlenhydrate zu binden, wobei sie mit den bisher bekannten Lektinen keinerlei Gemeinsamkeiten zeigen.
Deshalb werden sie mittlerweile als eine neue Gruppe von Lektinen bezeichnet.
Bisher identifizierte porcine Spermadhäsine sind:
AWN-1, AWN2, AQN-1, AQN-3, PSP-1, PSP-2
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Spermadhäsine verfügen über verschiedenste Möglichkeiten biochemische Prozesse zu modulieren. Sie sind in der Lage, über die Kohlenhydratbindungsmöglichkeit hinaus, Glycoaminoglycane, Phospholipide und Serinproteinaseinhibitoren zu binden (Calvete et al., 1994). Sie sind bestrebt, sulfatierte Glukosaminoglykane und Heparin zu bilden und wirken somit regulativ auf Kapazitationsfaktoren (Calvete et al., 1994).
Eine sehr wichtige Rolle der Spermadhäsine besteht in der Bindung der Gameten, welche über die apikale Region des Spermienkopfes vermittelt wird, in dem die Spermadhäsine lokalisiert sind (Calvete et al., 1993, Dostalova et al., 1994). Weitere Studien gehen davon aus, dass die Spermadhäsine PSP I und II die Aktivierung von PMN´s und somit einen proinflammatorischen Prozess beeinflussen. In ihrer Hypothese gehen sie davon aus, dass es durch PSP I und II zu einer Vermittlung von Entzündungsprozessen nach der Besamung kommt, wobei die nach einer Besamung einströmende erste Spermienfraktion im Eileiteristhmus ein Reservoir bildet und frei von PSP I und II ist. Ein Einstrom von PMNs in das Lumen folgt nicht. Die physiologische Bedeutung von PSP I und II im Uterus und der immunologischen Reaktion nach Besamung wird diskutiert. So scheint die Balance zwischen der Rekrutierung von Mastzellen und Neutrophilen als Reaktion auf entzündliche Reize moduliert durch PSP I und II einen erheblichen Einfluss auf die biochemischen Details der durch Makrophagen induzierten Entzündungsreaktion und deren Regulation auf die Existenz von Mastzellen zu haben (Assreuy et al., 2002, Assreuy et al., 2003). Das Spermadhäsin AWN bildet in seinem Syntheseort eine Ausnahme zu den anderen Spermadhäsinen, denn es wird nicht erst in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen gebildet, sondern bereits in den Tubuli recti und im Rete testis des Hodens (Ekhlasi-Hundrieser et al., 2002).
2.3.4 Kapazitation
Eine Reihe von endogenen Aktivierungsvorgängen im weiblichen Genital, die Voraussetzung für die Akrosomreaktion des Spermiums, die Penetration der Zona pellucida und Befruchtung der Eizelle sind, werden als Kapazitation bezeichnet.
Dieses Phänomen ist seit den fünfziger Jahren des letzten Jahrhunderts bekannt (Chang, 1951, Austin, 1951, Austin, 1952). Erste Schritte der Kapazitation, deren
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molekulare Grundlagen weitestgehend noch unbekannt sind, beginnen vermutlich schon auf dem Weg der Spermien in den Eileiter, dem Hauptort der Kapazitation. Bei Schwein und Pferd werden die Spermien direkt in den Uterus abgesetzt, und im kaudalen Isthmus des Eileiters bis zur Befruchtung gespeichert (Miller and Hunter, 1986).
Zu Beginn der Kapazitation wird die schützende Hülle aus Proteinen über der Spermienmembran entfernt. Hiermit werden die Spermadhäsine, die als Dekapazitationsfaktoren wirken, partiell entfernt. Hiernach entsteht eine Umstrukturierung der Membran durch Entfernung von Cholesterin (Breitbart, 2003).
Bei intakten Spermien befinden sich Membranproteine über den gesamten Spermienkopf verteilt und sparen hierbei nur den rostralen Bereich aus. Hier besteht eine Diffusionsbarriere, die eine Proteinwanderung in diesem Bereich verhindert. Die Umorganisation der Spermienoberfläche bewirkt nun, dass diese Barriere aufgehoben wird und Proteine in diesen Bereich einwandern können. Sie bilden Aggregate in der periakromosomalen Region und bilden formen proteinfreie Regionen (Breitbart, 2003). Bei der Akrosomreaktion sind diese Bereiche durch ihre fluiden und fusiogenen Eigenschaften prädestiniert für die Fusion zwischen Plasmamembran und äußerer akrosomaler Membran. Andere Transmembranproteine des Eberspermienkopfes zeigen ein ähnliches Verteilungsmuster (Aguas and da Silva, 1989). Anschließend an diese Neuverteilung der Membranproteine, folgt ein Lokalisationswechsel von Lipiden aus der apikalen Kopfregion in das Äquatorialsegment, wodurch eine Destabilisierung der apikalen Region eintritt (Revah et al., 2000) und einen zweiphasigen Influx von Kalziumionen bewirkt. Die erste Phase hierbei wird durch den Kapazitationsprozess selbst ausgelöst, während die zweite Phase über die Aktvierung eines spannungsabhängigen Kalziumkanals reguliert wird. Die hiermit verbundene Erhöhung der interzellulären Ca2+-Konzentration löst die Exozytose des Akrosoms bei der Akrosomreaktion aus (Fraser, 1995). Der Kapazitationsprozess kann durch Heparin stimuliert werden, wobei dieser Effekt durch heparinbindende Proteine (FnII- Proteine) auf der Spermienoberfläche vermittelt wird (Miller and Hunter, 1986, Thomas et al., 1994). Aus den vielfältigen Veränderungen während des
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Kapazitationsprozesses resultiert eine hyperaktive Bewegung der Spermien, die für die Loslösung der Spermien von den Oviduktepithelzellen und dem folgenden Transport zum Ort der Befruchtung notwendig ist (Lefebvre and Suarez, 1996, Raychoudhury and Suarez, 1991).
2.3.5 Akrosomreaktion
Die Akrosomreaktion wird durch die erste Bindung der Spermatozoen an die Oozyte induziert. Hierbei werden akrosomale Enzyme aktiviert und freigesetzt, welche im weiteren Verlauf für die Penetration der Zona pellucida essentiell sind. Im Laufe der Akrosomreaktion fusioniert die äußere akrosomale Membran mit der darüber liegenden Plasmamembran. Hierdurch bilden sich Kanäle im Akrosom für die Freisetzung lytischer Enzyme, die eine partielle Hydrolyse der Zona pellucida bewirken und es den Spermatozoen ermöglichen, die extrazelluläre Membran zu penetrieren. Diese Penetration ist Voraussetzung für die Fusion mit der Vitellinmembran in der Oozyte. Als zentrales Ergebnis der Akrosomreaktion ist die Exozytose des Spermienakrosoms, die durch einen massiven Einstrom extrazellulärer Kalziumionen entsteht, zu sehen (Fraser, 1995). Untersuchungen in diesem Bereich haben gezeigt, dass durch die Zugabe von Bikarbonat eine interzelluläre Kalziumaufnahme erleichtert werden kann (Roldan and Harrison, 1993). Bedingt durch den intrazellulären Kalziumspiegelanstieg erhöht sich der intrazelluläre pH-Wert, wodurch die Ladung an der Spermienoberfläche vermindert wird und es zu einer Destabilisierung der Plasmamembran der Spermatozoen kommt. Die gesamte Akrosomreaktion versteht sich als ein exozytotischer Prozess, bei dem die außen vorliegende akrosomale Membran des Spermiums mit der darüber liegenden Plasmamebran fusioniert, wobei durch die Bildung unzähliger Pseudovesikel eine Durchlöcherung und somit eine Art Fenestrierung der Akrosommembran entsteht. Hierdurch können im weiteren Verlauf hydrolytische Enzyme freigesetzt werden (Breitbart, 2003). Dieser Prozess der Fusion wird durch den Kontakt des Spermiums mit dem ZP3-Glykoprotein der Zona pellucida ausgelöst. Die hierbei vorliegenden Rezeptoren sowie der Ablauf des molekularen Prozesses der Membranverschmelzung sind bis heute noch nicht komplett analysiert und verstanden (Gupta et al., 2007, Wassarman et al., 2004). Bekannt ist
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bereits, dass die Akrosomreaktionen durch einen Einstrom von Kalzium ausgelöst wird. Untersuchungen der letzten Jahre gehen jedoch davon aus, dass diesem Einstrom von Kalzium ein Chloridausstrom voran geht, welcher die Membran des Spermiums depolarisiert und so den Kalziumeinstrom moduliert oder gar auslöst (Roldan et al., 1994, Shi and Roldan, 1995). Neueste Studien konnten jedoch partiell erkennen, dass die akrosomale Exozytose anscheinend eine spezielle Art der Kalzium-regulierten Exozytose ist, wobei diese durch mindestens drei vorliegende, zeitlich hinter einander geschaltete und aktivierte Arten von Kalzium-Kanälen ausgelöst wird (Florman et al., 2008, Darszon et al., 2005). Untersuchungen von Ackermann (Ackermann, 2008) sehen das Protein MUPPS als ein im frühen Prozess der akrosomalen Exozytose beteiligtes Protein an, welches in den Ablauf vor dem zweiten Ausstrom des Kalziums aus dem Akrosom involviert ist. Hierbei bildet es zusammen mit der Kalzium/Calmodulin Kinase II einen funktionellen Komplex, der die Phosphorylierung einer Signalkomponente der Signalkaskade ohne einen exogenen Reiz unterbindet. Erst eine Stimulation der Kaskade über das Zona pellucida Protein 3 (ZP3) oder ein schneller Kalziumeinstrom verschiebt die Kaskade vom MUPP1-Komplex und der Phosphorylierungspartner desphosphoryliert wodurch die Blockierung der Reaktion aufgehoben wird. Es entsteht eine akrosomale Exozytose und damit einher geht die Freisetzung der hydrolytisch wirksamen Enzyme aus dem Akrosom. Frühere Studien im humanen Bereich untersuchten des Weiteren eine durch Progesteron induzierbare Akrosomreaktion (De Jonge et al., 1993a, De Jonge et al., 1993b, Zaneveld et al., 1993, Brucker et al., 1994).
Humanmedizinische Studien haben dabei festgestellt, dass die Zona pellucida eine rezeptorvermittelte Spermienbindung eingeht und somit die Akrosomreaktion auslöst (Liu et al., 1992). Als wichtigster physiologischer Vermittler der Akrosomreaktion in vivo wird auch hier das ZP3 gesehen, wobei eine zusätzliche Rolle in vivo dem Progesteron zuerkannt wird (van Duin et al., 1994, Buddhikot et al., 1999, Harrison et al., 2000). Progesteron wird im humanen weiblichen Genitaltrakt von Granulosazellen produziert und in der hierbei vorliegenden Follikelflüssigkeit mit einer Konzentration von ca. 10 μg/ml ausgewiesen (De Jonge et al., 1993a).
Verschiedene Studien sehen hierbei Progesteron, nicht nur wie schon erwähnt als
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Aktivator der Akrosomreaktion, sondern auch als aktive Komponente der Follikelflüssigkeit (Oehninger et al., 1994a, Oehninger et al., 1994b, Sueldo et al., 1993, Allgegeyer, 2005).
2.4 In dieser Arbeit näher betrachtete, immunologisch relevante, Gene
Besonders für die Fragestellung dieser Arbeit interessante Gene sind schon im Vorfeld auf ihre modulierenden Aspekte hinsichtlich inflammatorischer Prozesse untersucht worden und werden im Anschluss gelistet.
2.4.1 CD163
Bei CD163 handelt es sich um ein 130k Da großes Transmembranprotein mit einem 25-30 kDa großen Anteil an N-glykosidisch gebundenen Mannose-reichen Zuckerresten. Es wurde erstmals 1993 unter dem Namen M130 beschrieben (Law et al., 1993). CD163 gehört zur Superfamilie der cysteinreichen Scavengerrezeptoren (SRCR, engl.: scavenger receptor cysteine rich), welche durch das Vorkommen einer oder auch mehrerer hochkonservierter zysteinreichen Proteindomänen charakterisiet wird. Diese Proteindomänen bestehen aus 100-110 Aminosäureresten und wurden 1990 erstmals von Freemann beim Makrophagen Scavengerrezeptor Typ 1 beschrieben (Freeman et al., 1990, Resnick et al., 1994). In der extrazellulären Domäne von CD163 finden sich 9 SRCR-Domänen, die zwischen der sechsten und siebten Domäne eine 31 Aminosäurenlange Zwischensequenz beinhaltet. Die Transmembrandomäne umfasst eine Länge von 24 Aminosäuren. Die intrazelluläre Domäne liegt in einer Größe von 49 und 89 Aminosäuren vor, mit Hilfe der RT-PCR konnten hierbei vier alternativ gesplicede mRNA-Varianten nachgewiesen werden (Law et al., 1993). Kristiansen konnte 2001 zeigen, dass CD163 Hämoglobin/
Haptoglobin-Komplexe bindet und so deren Endozytose bewirkt (Kristiansen et al., 2001). Hierbei wird durch Hämolyse freigesetztes Hämoglobin nach Bindung an das Serumprotein Haptoglobin effektiv aus dem Blutkreislauf entfernt. Das durch Hämolyse freigesetzte Hämoglobin verfügt wegen der eisenhaltigen Häm-Gruppe über oxydative und toxische Eigenschaften. Die beschriebenen Eigenschaften von
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CD163-positiven Makrophagen legen die Vermutung nahe, dass das Protein inflammatorische Vorgänge moduliert oder an ihnen beteiligt ist. Möglich ist, dass CD163 die Adhäsion von RM3/1-positiven, antiinflammatorischen Monozyten und die LPS- bzw. Zytokin-aktivierenden Endothelzellen verstärkt (Wenzel et al., 1996, Hauptmann et al., 1994). Beobachtungen, dass die Bindung monoklonaler Antikörper an CD163 auf entsprechenden Makrophagen zu einer Ca2+- und Inositoltriphosphat- abhängigen Aktivierung der Makrophagen und der Sekretion der proinflammatorische wirkenden Zytokine IL-1ß, IL 6 und GM-CSF führt, sprechen gegen eine Beteiligung an antiinflammatorischen Prozessen (Droste et al., 1999, Van den Heuvel et al., 1999). Das freigesetzte und auch lösliche CD163 könnte als Mediator bei entzündlichen Prozessen eine Rolle spielen.
2.4.2 PPAR-alpha
Bei den Peroxisomproliferator-aktivierenden Rezeptoren (PPAR´s) handelt es sich um eine Familie intrazellulärer Liganden aktivierter Transkriptionsfaktoren. Zur Zeit sind 3 Subtypen PPAR-alpha, PPAR-beta (NUC-1 oder unter der Bezeichnung PPAR-delta geführt) und PPAR-gamma bekannt (Dreyer et al., 1992, Issemann and Green, 1990). Die PPAR´s gehören zu der Überfamilie der Steroidhormon- Rezeptoren. Die ligandenaktivierenden PPARs bilden mit ihrem „retinoid X receptor (RXR)“ einen heterodimeren Komplex aus (Abbildung 2) und somit einen breiteren Bindungspartner für unterschiedliche nukleäre Hormonrezeptoren wie unter anderem Schilddrüsenhormon- oder auch Vitamin D-Rezeptoren (Mangelsdorf et al., 1995).
Diese sind in der Protorregion des Zielgenes lokalisiert. RXR ist in den Isoformen RXR-alpha, RXR-beta und gamma bekannt und wird durch die 9-cis-Retinionsäure aktiviert (Kliewer et al., 1992).
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Abbildung 2: Der Mechanism us der Regulierung der Genexpression - Kom plex PPAR / RXR (Kiec-W ilk et al, 2005.) (PPAR-Peroxisomproliferator -aktivierte Rezeptoren RXR - Retinoid X-Rezeptor-, 9-cis RA - 9-cis Retinsäure, PPRE - Peroxisom proliferator response elem ent)
Jeder der bekannten 3 Subtypen wird von einem eigenen Gen kodiert und lässt sich auch durch eine ganz unterschiedliche Gewebeverteilung charakterisieren (Auboeuf et al., 1997). PPAR-alpha wird dabei in Geweben wie Leber, Niere, Skelett- und Herzmuskulatur exprimiert (Wahli et al., 1995, Peters et al., 1997), wo es zentrale Prozesse im Lipidstoffwechsel generiert. Von PPAR-beta ist bekannt, dass es ubiquitär vorkommt, seine Funktion ist aber bislang noch nicht genau geklärt. Im Fettgewebe sowie im Interstitium lässt sich PPAR-gamma nachweisen (Mansen et al., 1996). Von PPAR-gamma ist bekannt, dass es eine wichtige Rolle in der Regulation der Adipogenese spielt. Weiterhin kontrolliert es in Adipozyten unter
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anderem die Expression der Lipoproteinlipase. Die Aktivierung von PPAR-alpha in Monozyten/ Makrophagen führt zu einer Reduktion der prokoagulatorischen Aktivität.
Aktiviertes PPAR-gamma inhibiert die Sekretion entzündungshemmender Zytokine und von PPAR-alpha ist bekannt, dass es bei knock-out Mäusen zu einer verlängerten Immunantwort auf Entzündungsreize führt (Devchand et al., 1999, Su et al., 1999). Bedingt durch die von den PPARs bekannten sehr zahlreichen Mechanismen kann von einer Schlüsselrolle in der Regulation von Entzündungsreaktionen ausgegangen werden. Hierbei sind heute schon eine Hemmung der Transkription von COX-2 sowie eine Hemmung und Stimulation von TNF-alpha bekannt (Kersten et al., 2000).
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3 Material und Methoden
Als Empfängertiere für die artifizielle Insemination wurden geschlechtsreife Jungsauen, Hybriden der Rasse Deutsches Landschwein und Pietrain, im Alter von 6 bis 9 Monaten und einem Gewicht 90 bis 130 kg ausgewählt, wie sie auch standardmäßig in der Ferkelproduktion eingesetzt werden. Um in vergleichenden Analysen Gruppengrößen von 3 empfängnisbereiten Sauen je Besamungsportion/
Untersuchungsgruppe zum selben Zeitpunkt künstlich befruchten zu können, wurde eine hormonelle Synchronisation durchgeführt. Die tierexperimentellen Arbeiten wurden in zwei Versuchsabschnitten in den Monaten September 2009 bis Januar 2010 im Institut für Nutztiergenetik des FriedrichLoeffler-Institut (FLI) in Mariensee und in den Monaten Januar bis Mai 2011 im Leibnitz Institut für Nutztierbiologie in Dummerstorf durchgeführt. In Versuchsabschnitt I wurden 49 präpuberale institutseigene Jungsauen, Hybriden der deutschen Landrasse und Pietrain, im Alter zwischen 5 und 6 Monaten hormonell stimuliert und mit sechs unterschiedlichen Besamungsdosen (Negativkontrolle ohne Besamung, PBS, Seminalplasma, PBS + Spermien, Nebenhodenschwanzsperma, Seminalplasma + Spermien ) inseminiert.
Zwei Stunden später erfolgte die Schlachtung, wobei Gewebeproben für die anschließenden molekularbiologischen Untersuchungen gewonnen wurden. Die für den Versuchsabschnitt I verwendeten Tiere wurden im Institut für Nutztiergenetik, des FLI unter Standardbedingungen für diese Altersgruppe gehalten. Für die zweimalige Fütterung pro Tag stand eine institutseigene Futtermischung zur Verfügung. Wasser bekamen die Tiere ad libitum. Alle tierexperimentellen Arbeiten wurden durch den Tierschutzdienst des Niedersächsischen Landesamts für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt, überwacht und in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz 2002 durchgeführt.
Für den Versuchsabschnitt II wurden 72 hormonell stimulierte zyklische Jungsauen, der deutschen Landrasse im Alter von 8 und 9 Monaten mit drei unterschiedlichen Inseminationsdosen (Negativkontrolle ohne Besamung, PBS, Seminalplasma + Spermien) besamt und zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten (15 Minuten, 2
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Stunden, 6 Stunden und zum Zeitpunkt der Ovulation) chirurgisch zur Probengewinnung, der Reproduktionstrakt entfernt. Diese Tiere verblieben im Anschluss an den Versuchstag im Institut in Dummerstorf. Die für diesen Versuchsabschnitt verwendeten Tiere wurden unter den dortigen Standardbedingungen gehalten. Alle tierexperimentellen Arbeiten für den Versuchsabschnitt II wurden durch den Tierschutzdienst des Landesamts für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V) genehmigt, überwacht und in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz 2002 durchgeführt.
3.1 Synchronisation der Versuchstiere
Für die Superovulation in Versuchsabschnitt I erhielten die Sauen 1200 Internationale Einheiten (I.E.) PMSG (Firma Biomol GmbH, Hamburg Deutschland), intramuskulär (i.m.). 72 Stunden später wurde die Ovulation durch Gabe von 500 I.E.
Ovogest (Firma Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) i.m. ausgelöst. 24 Stunden danach wurden die Sauen einmalig durch künstliche Besamung belegt. Die in Versuchsabschnitt II benötigte Superovulation wurde erzielt, indem die Sauen 850 I.E: eCG (Pregmagon, Firma ReboPharm, Bocholt, Deutschland) i.m. erhielten. 80 Stunden später wurde durch 50 μg GnRH (Gonavet, Firma Vexy-Pharma GmbH, Schwarzenborn, Deutschland) die Ovulation ausgelöst und die Sauen einmalig, wiederum durch künstliche Besamung, belegt. Die Auslösung des Duldungseffektes erfolgte in beiden Versuchsabschnitten mittels Stütz- und Reitprobe vor der Besamung.
3.2 Gewinnung der verwendeten Ejakulate
3.2.1 Gewinnung von Frischsperma
Für die zwei Versuchsabschnitte wurden Ejakulate klinisch gesunder, institutseigener Eber mit geprüfter Fertilität verwendet. Alle Eber wurden während der gesamten Zeit der Versuchsabschnitte I und II regelmäßig abgesamt, wodurch eine weitgehend gleichbleibende Spermienqualität gewährleistet werden konnte. Die Tiere wurden jeweils am Morgen des Versuchstages mit Hilfe eines Phantoms durch die
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Handmethode abgesamt. Die spermienarme und spermienreiche Fraktion des Ejakulates wurde dabei getrennt in zwei Isoliergefäßen mit innenliegendem Plastikbeutel (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) aufgefangen. Durch olfaktorische Kontrolle wurde eine Urinkontamination des Ejakulates ausgeschlossen. Die spermienreiche Fraktion des Ejakulates wurde nach Gewinnung mit auf 36° C vorgewärmter 1 x PBS-Lösung (PBS-Gebrauchslösung) verdünnt. Im Anschluss an die Gewinnung des Ejakulates wurden die Isoliergefäße in einer Styroportransportkiste verpackt und zur weiteren Verwendung in das Labor transportiert.
3.2.2 Gewinnung von Nebenhodenschwanzsperma
Zur Gewinnung von Nebenhodenschwanzsperma wurde ein institutseigener Eber getötet und die Hoden freipräpariert. Die Nebenhoden wurden abgesetzt und im Labor der Kanal des Nebenhodenschwanzes mit auf 37° C vorgewärmter 1 x PBS- Lösung gespült. Die ausgespülten Spermien wurden 10 Minuten bei 37° C zur Aktivierung des Stoffwechsels kultiviert. Ein Aliquot der Probe wurde hinsichtlich Motilität, Dichte und Anteil morphologischer Abweichungen bestimmt.
3.3 Spermauntersuchung- und Aufbereitung
Jedes Ejakulat wurde hinsichtlich Volumen, Farbe, Konsistenz, Geruch, Motilität und Dichte der Spermien sowie Anteil der morphologisch abweichenden Spermatozoen untersucht. Eine erste Einschätzung der Motilität der Spermien wurde durch subjektive Schätzung im Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch (+38° C) bei 160- facher Vergrößerung durchgeführt. Die Dichtebestimmung des Ejakulates wurde mit Hilfe der Zählkammer „Thoma-neu“ im Doppelansatz durchgeführt.
3.3.1 Computerassistierte Spermaanalyse (CASA)
Die Messung der Motilität wurde als Doppelmessung mit dem computerassistierten Sperma Analysesystem (CASA; IVOS Version 12; Hamilton Thorne Biosciences, Beverly, USA) durchgeführt. Es wurden 10 µl Probe in eine Makler-Kammer (SEFI Medical Instruments, Haifa, Israel) pipettiert. Auf insgesamt 10 Feldern wurden
