Archiv "Mammakarzinom: Prognostisch wichtige Rezeptorbestimmungen" (26.11.1986)

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DEUTSCHES ÄRZTEBLATT

Aktuelle Medizin

Zur Fortbildung

Mammakarzinom:

Prognostisch wichtige Rezeptorbestimmungen

Wolfgang Remmele

Mit der Isolierung von monoklonalen Antikörpern gegen das Östrogenrezeptor(ER)-Protein in Mammakar- zinomgewebe wurden die Voraussetzungen dafür ge- schaffen, ER in den Tumorzellen direkt immunhisto- chemisch nachzuweisen. Inzwischen hat sich die mit ER-ICA bezeichnete Nachweismethode weltweit be- währt. Von Vorteil ist, daß bei diesem Verfahren nur eine niedrige Menge an Tumorgewebe benötigt wird.

Aus dem Institut für Pathologie (Chefärzte:

Professor Dr. med. Wolfgang Remmele, Professor Dr. med. Ulrich Bettendorf) der Dr.-Horst-Schmidt-Kliniken,

Klinikum der Landeshauptstadt Wiesbaden, Akademisches Lehrkrankenhaus der

Johannes-Gutenberg-Universität Mainz

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or gut vier Jahren, in der in dieser Zeitschrift veröffentlichten Übersichtsarbeit „Bestimmung der Steroidrezeptoren im Mamma- karzinom — Methoden und Emp- fehlungen für die Praxis" (2), muß- te der Schluß gezogen werden, daß es zu diesem Zeitpunkt noch kein zuverlässiges morphologi- sches Verfahren für die Steroidre- zeptorbestimmung in Mammakar- zinomen gab. Die von Lee (1978) mitgeteilte fluoreszenzmikrosko- pische Methode konnte nicht als Äquivalent des biochemischen Rezeptor-Assay (Dextran-Coated Charcoal Assay = DCC) gelten.

Inzwischen konnte an über 400 Mammakarzinomen, die verglei- chend mit dem DCC und der von Lee beschriebenen Methode un- tersucht wurden, diese ablehnen- de Stellungnahme zweifelsfrei un- termauert werden (3). Mit dem Verfahren von Lee werden statt des spezifischen Östrogen-Rezep- tors (ER), der auch als „Typ-I-Bin- dungsstelle" für Östrogen be- zeichnet wird, unspezifische Bin- dungsstellen („Typ II und III") er- faßt. Das noch immer hier und dort verwendete Lee-Verfahren sollte definitiv ad acta gelegt werden.

Seit etwa zwei Jahren besteht die Möglichkeit, Östrogenrezeptoren im Gewebe mittels monoklonaler Antikörper nachzuweisen. Im Ge- gensatz zum DCC wird dabei nicht die Bindungskapazität der in einem Gewebshomogenat (Zytosol) vorhandenen Östrogen-Rezepto- ren für radioaktiv markiertes Östradiol bestimmt, sondern das ER-Protein wird unmittelbar in den Tumorzellen (im Schnittpräparat) sichtbar gemacht. Die von zahlrei- chen Arbeitsgruppen seit 1984 er- hobenen Befunde sind durchweg positiv. Damit ist eine Neubewer- tung der biochemischen und mor- phologischen Methoden zum ER- Nachweis erforderlich geworden.

Die Tabellen 1 a und 1 b geben eine Übersicht über die bisher ge- bräuchlichen und die neuen Me- thoden. Klinikern und Pathologen soll damit erläutert werden, unter welchen Umständen die einzelnen Methoden angezeigt sind, welche Voraussetzungen erfüllt sein müs- sen, um sie sinnvoll anwenden zu können, in welcher Form sie ein- ander ergänzen und wo ihre jewei- ligen Vorzüge und Nachteile liegen. Auf die methodischen Grund- lagen und Techniken der Verfah-

ren kann an dieser Stelle nicht im einzelnen eingegangen werden.

ER-ICA (Estrogen Receptor- ImmunoCytochemical Assay) Das Verfahren beruht auf dem direkten Nachweis des Rezeptor- Proteins mittels monoklonaler An- tikörper. Es ist dem Erprobungs- stadium entwachsen und kann in jedem Institut für Pathologie, das über ausreichende Erfahrung im immunhistologischen Arbeitsbe- reich verfügt, routinemäßig angewandt werden. Dafür steht ein Kit der Firma Abbott Laboratories (deutsche Niederlassung: Wiesba- den-Delkenheim) zur Verfügung.

Das Färbeprodukt wird durch die subjektive Bewertung der Färbe- intensität (Staining Intensity = SI) und des Prozentsatzes der positiven Zellen (PP) beurteilt, aus beiden Parametern wird ein „Immun- Reaktiver Score" errechnet, der die Reaktionsstärke ausdrückt. Da es bisher noch keine einheitliche Berechnungsweise gibt, soll von einer im Mai dieses Jahres auf der Pathologentagung in Heidelberg ad hoc gegründeten Arbeitsgrup- Ausgabe A 83. Jahrgang Heft 48 vom 26. November 1986 (39) 3359

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Rezeptorbestimmung im Mammakarzinomgewebe

pe von Pathologen und Gynäkolo- gen versucht werden, den Score zu vereinheitlichen (siehe hierzu die Kurzmitteilung, Seite 3362).

Vorteile des ER-ICA

Der ER-ICA hat folgende wesent- lichen Vorteile gegenüber dem DCC: Er kann auch an kleinen Ge- websmengen unterhalb der für den DCC erforderlichen 0,3 bis 0,5 Gramm Tumorgewebe ausgeführt werden. Er wird durch einen un- terschiedlichen Zell- und Stro- magehalt des Tumorgewebes nicht negativ beeinflußt, er ist auch unabhängig vom Ausmaß etwa vorhandener Tumornekrosen.

Schließlich spielen wegen der direkten Bestimmung des ER-Pro- teins die im Zytosol vorhandenen Östrogene und Antiöstrogene keine störende Rolle.

Nachteile des ER-ICA

Nachteilig ist, daß es bislang kei- nen ergänzenden immunhistoche- mischen Nachweis der Progeste- ron-Rezeptoren gibt. Nach dem derzeitigen Entwicklungsstand (1) ist jedoch damit zu rechnen, daß diese Lücke kurzfristig geschlos- sen wird.

Bisher ist nicht überzeugend nachgewiesen, daß der ER-ICA auch am Paraffinschnitt erfolgen kann; zuverlässige Befunde sind einstweilen nur am Kryostatschnitt zu erwarten.

Der ER-ICA mit dem Kit der Abbott Laboratories erfaßt das nukleäre Rezeptorprotein. Ein weiterer monoklonaler Assay (ER-D5 Amer- sham Buchler) führt hingegen zur Reaktion mit zytoplasmatischen Rezeptoren. Diese sind offenbar nicht mit dem spezifischen ER

identisch (1). Wir verwenden daher nur die Abbott-Methode. Be- züglich der Konsequenzen, die sich aus der Erfassung nukleärer Rezeptoren für die bisherigen Mo- dellvorstellungen über die Östro- genrezeptoren ergeben, wird auf die ausführliche Publikation zu diesem Thema verwiesen (3).

Die Ergebnisse des ER-ICA und des DCC stimmen auch qualitativ nicht immer überein. In der Regel handelt es sich dabei um die Kom- bination ER-ICA +/DCC 0. Sie er- klärt sich gewöhnlich aus den er- wähnten Besonderheiten der Ge- websstruktur (wenig Epithel, Ne- krosen). Wir geben daher bei dis- krepantem Ausfall der beiden Me- thoden dem Ergebnis des ER-ICA den Vorzug.

Beim DCC wird gewöhnlich bei 10 bis 20 fmol/mg Zytosol-Protein die Grenze zwischen ER-positiven

Tabelle 1 a: Derzeit verfügbare Methoden zur Bestimmung von Rezeptoren in Mammakarzinomgewebe

Methodische Grundlagen Erforderliches Gewebsmaterial Erforderliche Tumormenge Direkter Nachweis des

nukleären ER-Proteins mittels monoklonaler An- tikörper

Gefrierschnitt (Kryostatschnitt)

= Kombination mit Schnell- schnittuntersuchung

Fixiertes Gewebe bzw. Paraffin- schnitte nach dem derzeitigen Wissensstand ungeeignet Paraffinschnitt

ER-ICA

LRA

Auch unterhalb der für den DCC erforderlichen Menge (0,3-0,5 g), also möglich:

bei sehr kleinen Karzinomen, Stanzzylindern aus Tumorge- webe (einschl. Metastasen) Unabhängig von Tumorgrö- ße, also auch unter der für den DCC erforderlichen Men- ge (0,3-0,5 g)

Nachweis von PNA-Re- zeptor (hormoninduzier- tes Glykoprotein) = funk- tioneller Differenzierungs- grad der Tumorzellen DCC

ER-EIA

Nachweis der Bindungs- kapazität für 3 H-markiertes Östradiol an die ER von Tumorhomogenaten (Zytosol)

Nachweis von ER in Zyto- sol mittels monoklonaler Antikörper und Meerret- tichperoxidase

Frischmaterial

= Kombination mit Schnell- schnittuntersuchung: Transport zum Pathologen eisgekühlt (Zeitgrenze etwa 30 Minuten nach Gewebsentnahme), dort sofortiges Einfrieren in Trocken- eis oder Tiefkühltruhe bis zur biochemischen Untersuchung Frischmaterial

(wie bei DCC)

Mindestens 0,3-0,5 g Tumor- gewebe

0,05 g nach Angaben von Ab- bott Laboratories

3360 (40) Heft 48 vom 26. November 1986 83. Jahrgang Ausgabe A

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Kriterien der Befund- auswertung

Anwendungsbereich Erfolgsquote einer endokri- nen Therapie

Tabelle 1 b: Prognostische Aussagekraft der derzeit verfügbaren Methoden zur Bestimmung von Rezeptoren in Mammakarzinomgewebe

1. Färbeintensität (Staining Intensity) = SI 2. Prozentsatz positiver Zellen = PP

Berechnung eines „Im- munReaktiven Score"

(IRS) aus SI und PP, Art der Berechnung noch un- einheitlich (siehe Kurzmit- teilung, Seite 3362) Fluoreszenzmikroskopi- sche Bestimmung des Färbeergebnisses mit subjektiver Graduierung von 0 (< 10% positive Zel- len) über + (10-30%), ++

(31-60%) bis +++ (über 60%)

1. Langfristig Ersatz für DCC, zur Zeit noch Ergänzung des DCC durch direkten ER-Nach- weis

2. Ersatz für DCC bei zu geringer Menge an Tumorgewebe

1. Ergänzung des DCC und ER- ICA (Ansprechen der Tumorzel- len auf hormonelle Stimulation) 2. Ersatz für DCC und ER-ICA an fixiertem Gewebe (Paraffin- schnitt)

Noch keine größeren Fallstu- dien. Wahrscheinlich vergleichbar DCC (Korrelation ER-ICA/DCC)

LRA + 64,1%

LRA — 12,5%

ER-ICA

LRA

fmol/mg Zytosol-Protein.

Grenze negative/positive Fälle gewöhnlich bei 10-20 fmol/mg gezogen Photometrische Bestim- mung des enzymatischen Reaktionsproduktes

Zur Zeit noch Standardmetho- de, zumal immunhistochemi- sche PgR-Bestimmung noch nicht möglich

Möglicher Ersatz für DCC (gute Korrelation ER-EIA/DCC; einfa- chere Methode als DCC ohne Verwendung radioaktiv markier- ten Östradiols)

ER + 60-70%

ER — 7-15%

ER + /PgR + 75%

ER +/ PgR — 28%

Noch keine verläßlichen An- gaben an einem größeren Untersuchungsgut (wahrscheinlich vergleichbar DCC und ER-ICA)

DCC

ER-EIA

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und ER-negativen Fällen gezogen.

Ob und — wenn ja — wo es einen vergleichbaren Grenzwert auch bei der Methode des ER-ICA gibt, konnte bisher noch nicht geklärt werden. Wir vertreten einstweilen die Meinung, daß auch bei nur we- nigen ER-ICA-positiven Zellen (Im- munReaktiver Score von 1 und 2) ein endokriner Behandlungsver- such nicht von vornherein als aussichtslos angesehen werden sollte.

LRA/PNA (Lectin Receptor Assay mit PeaNut Agglutinin)

Diese Methode, auf die wir schon 1982 aufmerksam gemacht hatten, ist weder mit dem DCC noch mit dem ER-ICA vergleichbar. Dabei

wird die Bindung des Erdnuß-Ag- glutinins an den Kohlenhydratan- teil (Disaccharid ß-D-GaI 1-3 Gal- Nac) eines Glykoproteins im Mam- masekret bestimmt. Das von Klein und seiner Arbeitsgruppe entwik- kelte Verfahren zeigt also das funktionelle Verhalten der Karzi- nomzellen unter einem hormonel- len Stimulus an, das heißt es er- laubt Rückschlüsse auf den funk- tionellen Differenzierungsgrad der Zellen.

Daraus erklärt sich auch, daß die Ergebnisse des LRA/PNA trotz unterschiedlicher theoretischer Grundlagen statistisch mit denen des DCC korrelieren (3) und daß die therapeutisch-prognostischen Folgerungen etwa denjenigen beim DCC entsprechen.

Vorteile des LRA/PNA

Die Vorteile des LRA/PNA liegen also darin, daß der Test eine zu- sätzliche Information zum funktio- nellen Differenzierungsgrad der Tumorzellen liefert und daß er — ein ganz entscheidender Vorzug — auch am formalinfixierten Gewebe nach Paraffineinbettung vorgenommen werden kann. Ebenso wie der ER-ICA ist er von der Ge- websmenge unabhängig.

Nachteil des LRA/PNA

Der einzige wesentliche Nachteil der Methode ist der, daß sie nicht den ER direkt erfaßt. Die prognostische Aussage ist jedoch ähnlich gut wie beim DCC (Tabelle 1 b).

Ausgabe A 83. Jahrgang Heft 48 vom 26. November 1986 (43) 3361

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Der LRA/PNA erfordert eine noch größere persönliche Erfahrung des Untersuchers als der ER-ICA, die nur dann gegeben ist, wenn die Methode ständig angewandt wird. Da der Pathologe heute in al- ler Regel Mammatumoren im Na- tivzustand zur Schnellschnittun- tersuchung erhält, kommt die al- ternative LRA/PNA-Untersuchung nur gelegentlich in Frage. Der LRA sollte daher auf spezialisierte Insti- tute konzentriert werden, um er- stens die Kosten zu senken und zweitens eine optimale Befund- auswertung zu sichern. Aus diesem Grunde führen auch wir den LRA nicht am eigenen Institut aus;

die Untersuchungen werden von Herrn Professor Klein (Pathologi- sches Institut der Universität Frei- burg) vorgenommen.

DCC (Dextran-Coated Charcoal Assay)

Zu dieser Methode, die derzeitig noch die Standardmethode zum Nachweis von ER und PgR darstellt, sind keine neuerlichen Hin- weise erforderlich. Das technische Vorgehen bei der Kooperation zwischen Operateur, Pathologe und Rezeptorlabor wurde 1982 von uns ausführlich dargestellt (2).

Weitere Hinweise sind der Tabelle 1 b zu entnehmen.

ER-EIA (Estrogen Receptor Enzyme-linked lmmuno-Assay) Mit dieser ebenfalls von Abbott La- boratories vertriebenen Methode könnte dem DCC insofern eine weitere Konkurrenz entstehen, als dabei —mittels monoklonaler Antikör- per — mit einem relativ einfachen photometrischen Verfahren direkt der ER-Gehalt von Zytosolen bestimmt wird. Es stellt sich die grundsätzliche Frage, ob der ER- EIA gegenüber dem ER-ICA, der die unmittelbare Beurteilung des ER- Gehaltes der Tumorzellkerne er- laubt, entscheidende Vorteile bein- haltet, zumal sich hinsichtlich von Stromagehalt und Tumornekrosen des Karzinomgewebes ähnliche

Probleme ergeben wie beim DCC.

Demnach dürfte sich der ER-ICA in der Praxis gegenüber dem ER-EIA durchsetzen.

Schlußfolgerungen

Mit dem ER-ICA wurde eine Me- thode entwickelt, die eine wertvol- le Bereicherung der Rezeptordia- gnostik beim Mammakarzinom darstellt. Auf Sicht ist zu erwarten, daß die bisherige Standardmetho- de, der biochemische DCC, durch den ER-ICA ersetzt wird, vor allem dann, wenn neben dem ER-ICA auch ein PgR-ICA verfügbar sein wird. Neben dem ER-ICA ist der LRA/PNA die zweite wichtige mor- phologische Methode, die es er- laubt, Rückschlüsse auf das thera- peutische Ansprechen eines Mam- makarzinoms gegenüber endokri- nen Therapiemaßnahmen zu zie- hen. Der LRA/PNA hat damit so- wohl als Alternative zum ER-ICA beziehungsweise zum DCC wie

7wei Sitzungen mehrerer Ar- Lbeitsgruppen von Pathologen und Gynäkologen (Heidelberg 24.

Mai 1986, Mainz 10. Oktober 1986), die sich seit längerer Zeit mit dem ER-ICA beschäftigen, haben zu dem folgenden Ergebnis geführt:

(j) Es wird empfohlen, zur einheitlichen Formulierung des ER-ICA- Befundes einen ImmunReaktiven Score (IRS) zu verwenden, der als Mindestvoraussetzung die Färbe- intensität (Staining lntensity = SI)

auch als Ergänzung dieser beiden Methoden einen festen Platz in der Diagnostik des Mammakarzinoms.

Literatur

(1) Heubner, A.: Diskussionsbemerkung;

Herbsttagung Dtsch. Ges. Pathol., Mainz (1985) — (2) Remmele, W.; Heicke, B.; Heine, M. Frank, K.; Keogh, H.J.; Schmitt, A.: Bestim- mung der Steroidrezeptoren in Mammakarzi- nomen. Methodik und Empfehlungen für die Praxis. Dtsch. Arztebl. 79, Heft 4 (1982) 35-40 — (3) Remmele, W.; Hildebrand, U.; Hienz, H. A.;

Klein, P.-J.; Vierbuchen, M.; Behnken, L. J.;

Heicke, B.; Scheidt, E.: Comparative histolog- ical, histochemical, immunohistochemical and biochemical studies an estrogen receptors, lectin receptors, and Barr bodies in human breast cancer. Virchows Arch. A. Pathol. Anat.

409 (1986) 127-147.

Anschrift des Verfassers:

Professor Dr. med.

Wolfgang Remmele Institut für Pathologie Dr.-Horst-Schmidt-Kliniken Klinikum der

Landeshauptstadt Wiesbaden Ludwig-Erhard-Straße 100 6200 Wiesbaden

und den Prozentsatz der positiven Zellen (PP) berücksichtigt.

SI und PP werden in Gruppen un- terteilt (siehe Tabelle 1): SI und PP werden geschätzt. Für die Bewer- tung der SI ist der vorherrschende SI-Grad maßgebend. Der SI- und KURZMITTEILUNG

Immunhistochemischer Nachweis von Östrogenrezeptoren (ER-ICA)

im Mammakarzinomgewebe:

Vorschlag zur einheitlichen Formulierung des Untersuchungsbefundes

3362 (44) Heft 48 vom 26. November 1986 83. Jahrgang Ausgabe A