Vergleichende Untersuchungen zu flüchtigen Aromastoffen beim Braten von Rinder- und Schweineleber
sowie
von gebratener Gänse- und Gänsestopfleber
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Rebekka Wilhelm Braunschweig
Hannover 2015
ii
Wissenschaftliche Betreuung : Prof. Dr. Waldemar Ternes
Institut für Lebensmittel und Chemische Analytik
1. Gutachter: Prof. Dr. Waldemar Ternes 2. Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Nowak
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2015
Die Arbeit wurde finanziell von der Fritz-Ahrberg-Stiftung, Hannover gefördert.
iii
Meiner Familie
iv Veröffentlichte Auszüge dieser Arbeit:
Wilhelm, R. u. W.Ternes (2011):
Identifizierung flüchtiger Aromastoffe aus gebratener Leber.
Fleischwirtschaft 9, S. 131-135 Wilhelm, R. u. W. Ternes (2012):
Identification of volatiles from fried liver.
Fleischwirtschaft International 27, S.66-69 zur Veröffentlichung vorbereitet:
Wilhelm, R. u. W. Ternes (2015):
Flüchtige Aromastoffe aus gebratener Gänseleber und Gänsestopfleber.
Fleischwirtschaft
v
1 Einleitung ... 1
2 Schrifttum ... 4
2.1 Aufbau und Physiologie der Leber ... 4
2.2 Physiologie zur Aromawahrnehmung ... 6
2.3 Entstehung von Aromastoffen ... 8
2.3.1 Maillard-Reaktion ... 9
2.3.2 Strecker-Reaktion ... 10
2.3.3 Lipidautoxidation ... 11
2.4 Leberzusammensetzung und Aromastoffe ... 13
2.4.1 Rinderleber und Schweineleber ... 13
2.4.1.1 Zusammensetzung ... 13
2.4.1.2 Aromastoffe aus Rinder- und Schweineleber ... 14
2.4.1.3 Aromastoffe und Erzeugnisse aus Rinder- und Schweineleber ... 17
2.4.2 Gänseleber und Gänsestopfleber ... 18
2.4.2.1 Zusammensetzung ... 18
2.4.2.2 Aromastoffe und Erzeugnisse aus Gänseleber ... 20
2.5 Analytik ... 21
2.5.1 Aromastoff-Analytik ... 21
2.5.2 Atomabsorptionsspektrometrie ... 22
3 Material und Methoden ... 23
3.1 Arbeits- und Untersuchungsmaterial ... 23
3.1.1 Untersuchungsmaterial ... 23
3.2 Apparative Anordnung ... 24
3.2.1 Analyseeinheiten ... 24
3.2.1.1 Solid Phase Microextraction Faser (SPME) ... 24
3.2.1.2 Tenax® TA 60/80 ... 24
3.2.1.3 Kondensat ... 24
3.2.2 Aufbau ... 25
vi
3.4 GC/MS-Analyse ... 30
3.4.1 Aroma-Fraktionen ... 30
3.4.1.1 Solid Phase Microextraction Faser (SPME) ... 30
3.4.1.2 Tenax® TA 60/80 Rinder- und Schweineleber ... 30
3.4.1.3 Tenax® TA 60/80 Gans- und Gänsestopfleber ... 30
3.4.1.4 Kondensat ... 31
3.4.2 GC/MS-Systeme ... 32
3.4.2.1 Hewlett-Packard-System ... 33
3.4.2.2 Varian-Finnigan-System ... 35
3.4.3 Sniffing-Analyse ... 36
3.4.3.1 Aufbau ... 36
3.4.3.2 Methode ... 37
3.4.3.3 Durchführung ... 37
3.5 Auswertung ... 38
3.5.1 Qualifizierung der Aromastoffe ... 38
3.5.2 Quantifizierung ... 39
3.5.3 Statistik ... 39
3.6 Schwermetallanalyse mit Hilfe der Graphitrohr-Atomabsorptionspektometrie ... 40
3.6.1 Apparatur ... 40
3.6.2 Methode ... 40
3.6.3 Durchführung ... 40
4 Ergebnisse ... 42
4.1 Betrachtung der Aromaprofile von Rinder- und Schweineleber ... 44
4.1.1 Verbindungsklassen der Chromatogramme von Rinder- und Schweinelebern .. 52
4.2 Betrachtung der Aromaprofile von Gänseleber ... 58
4.2.1 Verbindungsklassen der Chromatogramme von Gänse- und Gänsestopflebern . 62 4.3 Betrachtung der Aromaprofile von Rinder- und Schweineleber im Vergleich zu Gänse- und Gänsestopfleber ... 67
vii
5.1 Methodik ... 78
5.2 Rinder- und Schweineleberaroma ... 83
5.2.1 Verbindungsklassen der Aromastoffe bei Rinder- und Schweineleber ... 86
5.3 Gänseleber- und Gänsestopfleberaroma ... 96
5.3.1 Verbindungsklassen der Aromastoffe bei Gänse- und Gänsestopfleber ... 98
5.4 Zusammenfassende Betrachtung der Aromaprofile von Rinder- und Schweineleber; Gänse- und Gänsestopfleber ... 108
5.5 Erörterung der Sniffing-Analyse ... 111
5.6 Einordnung der Schwermetallanalyse ... 112
6 Zusammenfassung ... 114
7 Summary ... 116
8 Literaturverzeichnis ... 118
9 Anhang ... 125
9.1 Chromatogramme von SPME- und Kondensat-Proben ... 125
9.2 Verlaufsprotokoll/ Analyseschema ... 132
9.3 Berechnungen zur Statistik ... 133
10 Verzeichnisse ... 135
10.1 Chemikalienverzeichnis ... 135
10.2 Verzeichniss der Retentionsindices ... 137
10.2.1 Errechnete lineare Retentionsindices (RIC) der Stoffe aus den ... 137
Rinder- und Schweineleberchromatogrammen ... 137
10.2.2 Errechnete lineare Retentionsindices (RIC) der Stoffe aus den ... 138
Gänse- und Gänsestopfleberchromatogrammen ... 138
10.3 Abbildungsverzeichnis ... 139
10.4 Tabellenverzeichnis ... 141
10.5 Abkürzungsverzeichnis ... 142
11 Glossar ... 143
Danksagung ... 147
viii
1
1 Einleitung
Durch den schnellen Fortschritt in Wirtschaft und Technik ist in den europäischen Ländern die Lebensmittelauswahl übergroß, und Nahrungsmittel sind immer reichlich vorhanden. Die Auswahl aus aller Welt ist varietätenreich, um so mehr ist es aus ökonomischer und ökologischer Sicht von Bedeutung, auf Lebensmittel aus der Region aufmerksam zu machen.
Gleichzeitig steht die gesunde Ernährung mit Geschmack und Bekömmlichkeit im Vordergrund. Leber als Innerei ist fettarm, protein-, vitamin- und mineralstoffreich. Sie ist durch derzeit geringe Nachfrage sehr preiswert, erfreut sich jedoch unterschiedlicher Akzeptanz auf Grund des so häufig empfundenen mehligen Geschmacks und des Rufs, schwermetallbelastet zu sein. Dass dieser Ruf kritisch zu betrachten ist, zeigt ein Blick in die Literatur:
Das Bundesgesundheitsamt gab die Empfehlungen für den Verzehr von Rinder- und Schweinenieren heraus (PHILIPPEIT und SCHWARTAU 1991). Die gemessenen Cadmium- rückstände der Nieren von Rindern und Schweinen überstiegen den Richtwert von 0,5 mg/ kg Frischware (PHILIPPEIT u. SCHWARTAU 1991). Die Rückstände von Cadmium und Blei in Rinder- und Schweineleber dagegen überschritten im Mittel den Richtwert von 0,3 mg/ kg Frischware nicht (PHILIPPEIT u. SCHWARTAU 1991). Weiterhin zeigt eine Veröffentlichung des Bundesinstituts für Risikobewertung (BFR 2010) zu Höchstgehalt- bzw.
Richtwertüberschreitungen zwischen 1995 und 2008, dass es bei Schweine- bzw. Rinderleber 1997 bzw. 1998 eine Überschreitung von 0,3 % gab (siehe Abb. 1). 2001 überstiegt die Kalbsleber mit 0,5 % den Richtwert, während die Rückstände bei Rinder-, Schweine- und Kalbsnieren häufiger den Grenzwert überschritten (siehe Abb. 1) (BFR 2010).
Abbildung 1: Belegte Überschreitun (BFR 2010)
In der Aromaforschung lassen flüchtigen aromaaktiven Verb Erkenntnis über diese Inhaltssto Geschmack und Aroma von Le Glossar) werden menschliche berücksichtigt, hierüber können im Gesamtaroma getroffen w Schlüsselfunktion sowohl im Geruchsschwellenwert (siehe G Substanz hat mehr Einfluss auf großer Bestandteil ohne oder m Mit diesem Wissen kann die vorliegenden Arbeit werden gestellt. Es gilt das Aromapro Wahrnehmung des Nahrungs Altersstufen innerhalb von Rin Grund des zarteren Geschma Gegenstück mit Leber ungestop
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0
2
reitungen der Höchstgehalte bzw. Richtwerte für Blei un
en sich durch Gaschromatographie und Massen Verbindungen eines Lebensmittels beim Brate altsstoffe und ihre Entstehung trägt zu einem fundi
on Lebensmitteln bei. Durch den Einsatz eines „S chliche Sinneseindrücke im Bereich des Gen önnen detaillierte Aussagen über den Stellenwert ffen werden. So werden flüchtige Stoffe det positiven als auch im negativen Sinne besitz iehe Glossar) von Bedeutung. Eine kleine Menge auf das Geruchs- und Geschmackserlebnis als der mit nur kaum geruchlicher Intensität.
n die Akzeptanz eines Lebensmittels verändert erstmalig Brataromata verschiedener Leber maprofil zu erfassen, um somit einen Ansatzp hrungsmittels Leber zu schaffen. Es werden on Rinder- und Schweineleber verglichen. Die K schmacks als Delikatesse; ebenso die Gänsest gestopfter Tiere im Brataroma untersucht und vergl
Blei und Cadmium
assenspektroskopie die Braten ermitteln. Die fundierten Wissen über nes „Sniff-Ports“ (siehe s Genusses zusätzlich nwert einer Verbindung detektiert, die eine besitzen. Dabei ist der Menge stark riechender als ein mengenmäßig ändert werden. In der Lebersorten gegenüber satzpunkt zur positiven erden unterschiedliche Die Kalbsleber gilt auf änsestopfleber, die als
verglichen wird.
Blei (%) Cadmium (%)
3
Hierbei soll angemerkt werden, dass der Vergleich mit der Gänsestopfleber nur aus wissenschaftlicher Sicht unternommen wird. Es soll in keiner Weise Werbung für die Art der Herstellung oder auch des Genusses der Stopfleber vorgenommen werden. Es wird hier betont, dass in Deutschland eine solche Fettleberherstellung durch das Tierschutzgesetz verboten ist (§ 3 Ziff 9). Es kommt bei der Herstellung, wie oben bereits beschrieben, zur Produktion einer krankhaften Fettleber (Steatosis hepatis) der Gänse, die, wenn nicht mit der Schlachtung, auch zum Tod des Tieres führt.
Sorge um die toxische Komponente bei der Innerei Leber findet Berücksichtigung in Tests zur Schwermetallbelastung für Blei und Cadmium. Es werden bei allen Leberproben Blei- und Cadmiumgehalte per Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt.
4
2 Schrifttum
2.1 Aufbau und Physiologie der Leber
Die Leber ist das Hauptstoffwechselorgan des Körpers. Die Architektur der Leber ist entsprechend ihrer Stoffwechselvorgänge angepasst. Sie ist mit einer Kapsel, der Tunica fibrosa umgeben und mit Peritoneum, dem Bauchfell überzogen. Über die Pfortader aus dem Magen-Darm-Trakt kommend, als auch über die Leberarterie gelangt Blut in die Leber. Diese Gefäße verzweigen sich zu Arteriae und Venae interlobulares und bilden zusammen mit dem Gallengang die Glisson`sche Trias (siehe Glossar). Die anatomische Mikrostruktur der Leber ist in Läppchen (Lobuli hepatici) angeordnet, diese entstehen aus Abzweigungen der Tunica fibrosa. Das einzelne Leberläppchen besteht aus radiär angeordneten Lebersinosoiden. Die Zellen der Sinosoiden sind Hepatocyten, Endothel-, Ito-, PiT- und Kupffer-Zellen (Abb. 2).
Die Funktionen der einzelen Zelltypen sind unterschiedlich. Betrachtet man den Fluß des Blutes und damit die Stoffwechselleistung der Leber, so läßt sich ihre Struktur leicht erklären.
Die Endothelzellen bilden eine einschichtige Endothelwand, die den Sinusraum vom Dissé- Raum (siehe Glossar) trennt. Die Kupfferzellen sind mit 50 % an der Gesamtendothelwand beteiligt. Sie sind als stationäre Makrophagen anzusehen und haben immunologische Funktion. Sie filtern und phagozytieren (siehe Glossar) Antigen aus dem Pfortaderblut (SALLMANN u. FUHRMANN 2000).
Im Dissé-Raum befinden sich die PiT-Zellen. Als große granuläre Lymphozyten erfüllen sie ebenfalls immunologische Aufgaben und bilden Schutz gegen Viren und einwandernde Tumore (SALLMANN u. FUHRMANN 2000). Die Ito-Zellen sind ebenfalls im Dissé-Raum lokalisiert. Sie sind als modifizierte Adipozyten anzusehen, sie speichern Fett und damit den größten Teil des Vitamin A des Körpers (SALLMANN u. FUHRMANN 2000).
Bis zu 70 % des Leberparenchyms (siehe Glossar) bilden die Hepatozyten, die für die Hauptstoffwechselleistung verantwortlich sind. An der periportalen Seite (siehe Glossar) des Lebersinus finden auf Grund des sauerstoffreichen Blutes vermehrt die Gluconeogenese, Glycogensynthese, der Citratzyklus, die Fettsäureoxidation, Ketogenese und die Harnstoff-, Cholesterin- und Gallensäuresynthese statt, während perivenös (siehe Glossar) die vom Sauerstoff unabhängigeren Stoffwechselvorgänge stattfinden: Glycolyse, Phase-II-Reaktion
5
der Biotransformation, Lipogenese, Glycogen- und Glutaminsynthese (SALLMANN u.
FUHRMANN 2000).
Die in der Blutbahn aus den Chylomikronen freigesetzten Fettsäuren werden durch Bindung an Albumin von der Leber aufgenommen. In der Leber werden diese verwendet und VLDL- Lipoproteine (siehe Glossar) gebildet. Diese dienen zum Transport von wasserunlöslichen Substanzen aus der Leber und dem Blut (HERMANNS 1999). Unter normalen Umständen ist in den Hepatozyten kein Fett histologisch nachzuweisen. Zu einer Anreicherung von Triglyceriden kommt es jedoch, wenn der Abtransport durch die VLDL-Lipoproteine geringer als die Zufuhr von Fettsäuren ist (HERMANNS 1999). Dies kann eine Folge von zu fett- bzw.
kohlenhydratreicher Nahrung sein. Ausgenutzt wird diese Einlagerung von Fettsäuren in die Leber bei der Mästung von Geflügel, um beispielsweise Gänsestopfleber herzustellen (siehe Kap. 2.4.2.1).
Abbildung 2: Aufbau eines Lebersinus (schematisch)
6
2.2 Physiologie zur Aromawahrnehmung
Beim Essen wird das Aroma der zubereiteten Speise genossen. Dieser „Genuss“ entsteht durch die Gesamtheit der Sinneseindrücke wie Geruch, Geschmack und Textur des Gerichtes in der Mundhöhle. Die Schleimhaut der Mundhöhle enthält die Sinnesrezeptoren für das Temperatur- und Tastempfinden. Die Geschmackspapillen und -knospen, über die die Geschmacksqualität weitergegeben wird, befinden sich auf der Zunge. Die übrige Zungenfläche wird von kleinen Fadenpapillen (siehe Glossar) bedeckt, die taktile Funktion (siehe Glossar) besitzen.
Die Riechsinneszellen haben ihren Sitz in der olfaktorischen Region (siehe Glossar) der Conchen (siehe Glossar) in der Nasenhöhle. Von dort werden die Geruchsempfindungen direkt in den Bulbus olfactorius (siehe Glossar) weitergegeben (HATT 2010).
Die Geschmacksqualitäten beschränken sich auf vier Eindrücke: bitter, sauer, süß, salzig.
Desweiteren werden weitere Geschmackseindrücke für umami (siehe Glossar), metallisch und alkalisch diskutiert. Die sekundären Sinnesrezeptoren auf der Zunge reagieren auf die nicht flüchtigen Verbindungen aus der Nahrung, jeder einzelne auf eine oder mehrere Geschmacksqualitäten mit unterschiedlicher Empfindlichkeit. So ergeben sich unterschiedliche Geschmacksprofile für jede Zelle, die Gesamterregung aller Zellen ergibt die empfundene Geschmacksqualitiät (HATT 2010). GRÜNDER (2010) spricht von einem Qualitätswechsel der Geschmackszellen, als Beispiel nennt er NaCl, das in geringer Konzentration (10 mM) noch süßlich schmeckt und bei hoher Konzentration (100 mM) rein salzig. Die nervale Weiterleitung zum Hirnstamm erfolgt über die N. fascialis, N. glossopharyngeus und N. vagus, von dort entsteht eine weitere Verschaltung über den ventralen Thalamus (siehe Glossar) zum primären Geschmackskortex, der bewussten Geschmackswahrnehmung. Von dort ziehen weitere Afferenzen zum orbifrontalen Kortex, wichtig für die kognitive Wahrnehmung, und andere Fasern aus dem Hirnstamm zum Hypothalamus und dem limbischen System, wichtig für die emotionale Information (GRÜNDER 2010). Dieser Zusammenschluss aller Informationen ergibt den Gesamteindruck eines Geschmacks. Er dient zur Kontrolle der Nahrung auf gesundheitsschädliche Stoffe und unterliegt emotionaler Bewertung (GRÜNDER 2010).
7
Zur Bildung des Aromas sind die geruchsaktiven, leicht flüchtigen Verbindungen von größerer Bedeutung. Die qualitativ unterscheidbaren Reize beim menschlichen Geruchssinn sind um das mindestens 2500fache größer als beim menschlichen Geschmack.
10.000 Duftklassen kann der menschliche Organismus unterscheiden, die über primäre Sinneszellen vermittelt werden. Die nervale Leitung erfolgt direkt in den Bulbus olfactorius und von dort über den Tractus olfactorius (siehe Glossar) in das Riechhirn. Von dort gehen Bahnen zum limbischen System und zum Hypothalamus (emotionale Komponente); über den Thalamus weitere Bahnen zum orbifrontalen Kortex (kognitive Komponente) (GRÜNDER 2010).
In Bezug auf die Nahrungsaufnahme geben die Duftstoffe Aufschluss über die Bekömmlichkeit eines Gerichtes. Diese Wahrnehmung wird im Zusammenhang mit der Sniffing-Analyse genutzt (siehe Kap. 3.4.3, 4.4, 5.5). Die Duftstoffe entstehen beim Kauprozess und gelangen retronasal in die Conchen. Sie sind, wie die Geschmacksstoffe, emotional gekoppelt und haben für den Genuss eine große Bedeutung. Im weiteren biologisch-physiologischen Sinne haben sie Einfluss auf das soziale Leben (HATT 2010).
Der Zusammenschluss aller Informationen aus Geschmack und Geruch ergibt einen Gesamteindruck eines Aromas. Durch die emotionale und kognitive Komponente im Gehirn kann der Geschmack subjektiv beeinflusst werden.
8
2.3 Entstehung von Aromastoffen
Die Aromastoffe entsprechen den Geruchsstoffen. Es sind chemische Verbindungen, die aus den Einzelkomponenten der Lebensmittel hervorgehen. Diese so genannten Aromapre- cursoren (siehe Glossar) haben selbst kaum oder nur wenig aromatische Eigenschaften, sind jedoch bei der Zubereitung Reaktant. Es entstehen hierbei die leicht flüchtigen Substanzen, die das Aroma bilden. Im Bereich von Fleisch sind die Aromavorläufer bereits ausführlich erforscht. Zu ihnen zählen Aminosäuren, Peptide, Zucker, Thiaminverbindungen, Nucleotidmetaboliten und Lipide (MOTTRAM 1991).
Im Zusammenhang mit Innereien, wie der Leber, konnten bisher keine wissenschaftlichen Publikationen gefunden werden. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass die gleichen chemischen Reaktionen zu den Aromastoffen führen. Hierbei ist zu bemerken, dass Innereien einem schnellen Verderb und nicht, wie es bei Muskelfleisch vorkommt, einer Reifung unterliegen.
„Off-flavour“ entsteht, wenn ein unerwünschter Geschmack oder Geruch bei der Zubereitung der Speise auftaucht. Verbindungen, die eine Schlüsselfunktion im Aroma besitzen und dieses charakterisieren werden „character impact compounds“ genannt (BELITZ et al. 2007).
Wichtige Reaktionswege, die zu der Entstehung der leicht flüchtigen und damit aromaaktiven Substanzen führen, werden hier im Weiteren beschrieben. Viele der entstandenen Aromastoffe aus den hier gebratenen Lebern können mit Hilfe der nun folgenden Reaktionswege erklärt werden (siehe Kap.4, 5).
9 2.3.1 Maillard-Reaktion
Die nichtenzymatische Bräunungsreaktion wurde erstmals von Maillard 1912 beschrieben.
Sie führt in ersten Schritten über die Bildung von Iminen aus reduzierendem Zucker und Aminosäuren (bzw. Peptiden, Proteinen oder Aminen) zur Aminoketose, nach dem Entdecker, Amadori-Verbindung genannt. Durch die geringe Stabilität des Amadoriprodukts kommt es über Enolisierung und Aminosäurerestabspaltung zu Desoxysonen (siehe Abb. 3).
Diese sind als α-Dicarbonylverbindung reaktiv und liefern so viele geruchlich aktive Folgeprodukte.
3-Desoxysonen führen unter Wasserabspaltung und Ringschluss zu primären Zuckerabbauprodukten, wie beispielsweise Furfural (Pentose), 5-Methylfurfural (Hexose) (Abb. 3, A). Die 1-Desoxysonen führen über Ringschluss und Wasserabspaltung zu Furanonen und Pyranonen (Abb. 3, B). Alternativ entstehen durch Spaltung der Kohlenstoffkette α-Dicarbonylverbindungen aus den 1-Desoxysonen, die als Reaktant im Streckerabbau (siehe Glossar) fungieren.
Abbildung 3: Die Reaktion des Amadori-Produkts in der Maillard-Reaktion zu aromaaktiven Verbindungen (MOTTRAM 1991, Abb. Lammers 2006)
2 5
5 2 3
A
1,2-Enolisation C C
N H R OH CHOH CHOH H
- H2O C C
N R
OH C H CHOH H
+ H2O - RNH2 C
C O C H CHOH
H O
H
- H2O C C O C H C H
H O
3-Desoxyoson
Pentosen: R = H Hexosen: R = CH2OH
O C
R
H O
C C C H
OH N
OH R H H
CHOH 2,3-Enolisation Amadori-Produkt
C C CHOH CHOH H
O N
R H H
- RNH2
C C C
OH H
CHOH H
O
C C C
O
CHOH H
O H H
1-Desoxyoson
O
HO O
R
Fragmentation Pentosen: R = H Hexosen: R = CH3
α-Dicarbonyl- verbindungen B
C C C
O
R H
O H H
10 2.3.2 Strecker-Reaktion
Weiterführend kommt es mit den aus der Maillardreaktion entstandenen α-Dicarbonyl- verbindung und Aminosäuren zum sogenannten Streckerabbau. Durch die oxidative Desaminierung und Decaboxylierung von α-Aminosäuren mit den α-Dicarbonylverbindungen entstehen Aldehyde und α-Aminoketone, aromaaktive Verbindungen (siehe Abb. 4).
Abbildung 4: Reaktion des Streckerabbaus mit Bildung der aromaaktiven Verbindungen (BELITZ et al. 2007, Abb. Lammers 2006))
R1
C C NH2
O O H
H
+ C
C O
O R2
R3 α-Aminosäure Dicarbonyl
- H2O
- CO2
C C N
HO R2
R3 CH
R1
C C N
O R2
R3 CH2
R1
+ H2O
CH C H2N
O
R2
R3
+ R C H O
α-Aminoketon Aldehyd
C C O
R2
R3
R C C
N
O O
H
H
S CH3
z. B. Methional:
R =
z. B. Phenylacetaldehyd:
R =
+
- 2 H2O CH C
NH2
O
R5
R4
CH C
N R2
R3
CH C R5 N
R4
[O]
N N R4
R5
R2
R3
Pyrazin
11 2.3.3 Lipidautoxidation
Die Lipidautoxidation verläuft in komplex ineinander greifende Reaktionen und führt zu flüchtigen und nicht-flüchtigen Substanzen. Zum weiteren Studium wurden Modelle entwickelt und erforscht, um die Elementarschritte benennen zu können. Abhängig ist die Autoxidation von der Fettsäurezusammensetzung, der Konzentration und Wirksamkeit von Pro- und Antioxidantien, vom Sauerstoffpartialdruck, von der Oberfläche, der Lagerung und der Position der Doppelbindungen im Triacylglyceridmolekül. Der Prozess der Autoxidation wird als Radikalkettenreaktion beschrieben (BELITZ et al. 2007). Es bilden sich radikalische Zwischenstufen, die weiter in Wachstums-, Verzweigungs- und Abbruchreaktionen verlaufen (Abb. 5).
Start: Entstehung von Peroxy- (RO2·), Alkyl- (R·) oder Alkoxy (RO·)-Radikalen Kettenwachstum:
1) R· + O2 → RO2 · 2) RO2· + RH → ROOH + R·
3) RO· + RH → ROH + R·
Kettenverzweigung:
4) ROOH → RO· + ·OH
5) 2ROOH → RO2 + RO· + H2O
Kettenabbruch:
6) 2R· →
7) R· + RO2· → stabile Produkte 8) 2RO2· →
Abbildung 5: Prozess der Lipidautoxidation (BELITZ et al. 2007)
Die (siehe Abb. 5 unter 1) aus Alkylradikalen entstehenden Peroxyradikale werden in Gegenwart von Luft (siehe Abb. 5 unter 8) durch Kollision zum Abbruch geführt. Durch unimolekularen Zerfall (siehe Abb. 5 unter 4) beschleunigt sich die Peroxidation autokatalytisch. Diese Reaktion wird durch Hämverbindungen und Schwermetallionen
12
begünstigt, da diese prooxidativ wirken (GIROTTI 1985; MINOTTI u. AUST 1998). Die primär entstehenden Monohydroperoxide (siehe Abb. 5 unter 2) sind geruchs- und geschmacklos, aus ihnen entstehen sekundär flüchtige Verbindungen, die damit das Aroma beeinflussen.
Abbildung 6: Bildung von Sekundärprodukten aus der Lipidautoxidation (MOTTRAM 1991) Tabelle 1: Beispiele der Lipidautoxidation mit aromatischer Bedeutung
(BELITZ et al. 2007)
ursprüngl.
Fettsäure Sekundärprodukt Chemische
Klasse Aromaeindruck
Ölsäure Nonanal Alkanal frische Champignons
Linolsäure Hexanal Alkanal talgig, grünes Blatt
Linolensäure 2-(E)-Heptenal Alkenal fettig, Bittermandel
13
2.4 Leberzusammensetzung und Aromastoffe
2.4.1 Rinderleber und Schweineleber
2.4.1.1 Zusammensetzung
Die Grundbestandteile der Leber dienen als Aromavorläufer, die durch die Zubereitung über die oben beschriebenen Reaktionswege (siehe Kap. 2.3) zu dem Aroma der Speise führen.
Rinder- und Schweinelebern setzen sich zum größten Teil aus Wasser (ca. 70 %), zu 20 % aus Proteinen und zu 4,3 % aus Fetten zusammen. Der Glycogengehalt unterscheidet sich dagegen je nach Tierart. Die Rinderleber hat mit 5,3 % den höchsten Gehalt, gefolgt von der Kalbsleber mit 4,1 %, die Schweineleber hingegen enthält nur 1 % Glycogen (siehe Tab. 2).
Tabelle 2: Grundbestandteile von Schweine-, Rinder- und Kalbsleber (TERNES et al. 2008; SOUCI et al.
2008)
Gehalte in % Schweineleber Rinderleber Kalbsleber
Feuchte 72,00 70,30 71,00
Protein 21,00 19,50 19,00
Fett 4,90 3,90 4,00
Triacylglyceride 64,00
Phospholipide 83,00 36,00
Cholesterol 0,35 0,26 0,36
Glycogen 1,00 5,30 4,10
Die für die Lipidautoxidation wichtige Fettsäurezusammensetzung ist bei Rinder- und Schweineleber unterschiedlich, nur Ternes et al. (2008) veröffentlichten dazu Werte in der Literatur. Der Fettsäuregesamtgehalt der Cholesterylester von lyophilisierter Leber ist bei der Rinderleber mit 97 mg/ 100 g TS (entspricht 64 mg/ 100 g TS frischer Rinderleber) sehr hoch, wohin die Schweineleber nur 44 mg/ 100 g TS enthält (siehe Tab. 3). Den höchsten Anteil bei beiden Leberarten hat die Linolsäure (32-35 %). Für die Rinderleber können in absteigender Reihenfolge Arachidon-, Öl-, Palmitin-, Stearin-, Linolen- und Palmitoleinsäure genannt
14
werden. Letztere fehlt der Schweineleber ganz. Sie enthält im Unterschied zum Rind doppelt so viel Ölsäure (35,0 %). Die weitere absteigende Reihenfolge für die Schweineleber ist:
Palmitinsäure (14 %), Arachidon- und Stearinsäure mit jeweils 7 % und die Linolensäure mit 2 % (siehe Tab. 3).
Tabelle 3: Fettsäurezusammensetzung der Cholesterylester von lyophilisierter Schweine- und Rinderleber (in %) (TERNES et al. 2008)
Schweineleber Rinderleber
Palmitinsäure 14,0 11,5
Palmitoleinsäure - 5,3
Stearinsäure 7,0 9,5
Ölsäure 35,0 16,0
Linolsäure 35,0 32,9
Linolensäure 2,0 7,0
Arachidonsäure 7,0 17,7
Gesamtgehalt mg/100g TS 44,0 97,0
2.4.1.2 Aromastoffe aus Rinder- und Schweineleber
Aus gekochter Schweineleber ermittelten MUSSINAN und WALRADT (1974) 179 Aromastoffe mittels GC/MS-Analyse (siehe Glossar). Sie wählten Schweineleber, da sie typischer riecht und einen erheblich stärkeren Geruch als Kalb- oder Rinderleber hat (MUSSINAN u. WALRADT 1974). Die Fraktion der Pyrazine stellt den größten Anteil an flüchtigen Aromastoffen dar (41 %). 21 Mercapto-/ Methylthioaldehyde und Ketone hatten WERKHOFF et al. (1996) unter 120 weiteren Schwefelverbindungen in gekochter Rinderleber entdeckt. Sie konzentrierten sich auf schwefelhaltige Inhaltsstoffe als wichtige Charakteristika bei Fleischaromen und stellten die Analytik darauf ein.
Um die flüchtigen Aromastoffe, die für das „off-flavour“ der Schweineleber verantwortlich sind, zu beschreiben, untersuchten IM und KURATA (2003) über SDE (siehe Glossar) wasserdampfdestillierte Schweineleber. Sie beschrieben das „off-flavour“ von Leber als metallisch und fischig (IM et al. 2004). Die Relationen von fünf Verbindungen zueinander postulierten sie als Hauptgrund für den unangenehmen Geruch (siehe Tab. 4).
15
Tabelle 4: "Off-flavour" der Schweineleber nach IM et al. (2004)
Verbindung Geruchsbeschreibung
1-Octen-3-one Metallisch
Hexanol Metallisch
(E,E)-2,4-Heptadienal Fischig
(E)-2-Nonenal Pappig
(Z)-4-Decenal Pappig
Im Weiteren untersuchten sie ungesättigte Fettsäuren und den Zusammenhang des „off- flavours“ der Schweineleber mit den Oxidationsprodukten der Fettsäuren (IM et al. 2004). Sie wählten Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure und Schweineleber und versetzen diese einzeln mit Eisenchlorid zur Oxidation bei Raumtemperatur für 60 min. Die Analyse der entstandenen Aromastoffe erfolgte über HS-SPME, GC/MS als auch mit GC-O (siehe Glossar). Sie analysierten 25 flüchtige Aromastoffe und deren geruchliche Wahrnehmung (siehe Tab. 5). Sie identifizierten 1-Octen-3-on als Hauptbestandteil des metallischen „off- flavours“ von Schweineleber und erkannten, dass, je mehr Gerüche von fischig und metallisch zusammen kamen, desto mehr entstand das leberartige „off-flavour“.
16
Tabelle 5: Konzentration von Oxidationsprodukten aus Fettsäuren (mg/kg) und Schweineleber (mg/kg), IM et al. (2004)
Schweine- leber
Öl- säure
Linol- säure
Linolen- säure
Arachidon- säure
Geruchsbe- schreibung
1-Octen-3-one 1,8 - 0,2 - 3,2 metallisch
Hexanol 0,2 - - - - schwach
metallisch
(E,E)-2,4-Heptadienal - - - 5,1 - fischig
(E,Z)-2,4-Heptadienal - - - 6,0 - fischig
(Z)-4-Heptenal 0,7 - 3,5 - 4,0 fischig,
unangenehm
(E)-2-Nonenal 0,8 - 0,6 - 0,3 pappig
Hexanal 0,4 - 0,4 - 18,1 grün, grasig
1-Penten-3-ol - - - 0,7 - stechend
Heptanal - 0,3 - - - unangenehm
Octanal - 0,8 - - - Orangenschale
(E)-2-Octenal 1,5 - 2,4 - 6,4 talgig
1-Octen-3-ol 3,5 - 0,3 - 9,6 pilzig
Essigsäure 0,2 2,0 - - - nach Essig
(E,Z)-3,5-Octadien-2-on - - - 0,8 - fruchtig, fettig
Propionsäure - - - 0,3 - unangenehm
(E,E)-3,5-Octadien-2-on - - - 0,7 - fruchtig, fettig
(E,Z)-2,6-Nonadienal - - - 0,4 - Gurke
Octanol - 0,3 - - - ölig, nach Walnuss
(E,E)-2,4-Nonadienal - - - - 0,2 ölig, fettig
(E,Z)-2,4-Decadienal 0,3 - 0,2 - 3,5 fettig, ölig
Nonanol - 0,1 - - - ölig, nach Walnuss
(E,E)-2,4-Decadienal 0,3 - 0,8 - 1,4 fettig, ölig
(E,Z)-3,5,- Undecadien-2-on
- - - - 0,5 fettig, frittiert
Hexansäure 0,4 - 0,3 - 2,3 fettig
(E,E)-3,5-Undecadien-2-on - - - - 0,3 fettig, frittiert
17
2.4.1.3 Aromastoffe und Erzeugnisse aus Rinder- und Schweineleber
Von einer brennerigen Geschmacksnote wird bei Leberwurst und -konserven häufiger berichtet. Mehrere Untersuchungen sind in dieser Richtung durchgeführt worden. Nach REICHERT (1976) steigt der „brennerige Hocherhitzungsgeschmack“ mit zunehmenden Leberanteil in der Wurst. Ebenso postuliert er, dass die Produkte aus der Maillard-Reaktion ursächlich dafür sind. JAUD und FISCHER (1994) untersuchten Leberwurst und deren unerwünschte Geschmacksstoffe. Sie stellten fest, dass ein Zusammenhang zwischen dem Glycogengehalt von Schweineleber und der Schmackhaftigkeit der Leber beim Kochen besteht. Durch den postmortalen Glycogenabbau entsteht Glukose, je mehr Glukose die Leber enthält, desto schlechter der Geschmack der gekochten Leber (JAUD u. FISCHER 1994).
Einen positiven Effekt zur Reduzierung des „brennerige(n) Hocherhitzungsgeschmack(s) bei Leberwurstkonserven“ durch die Maillard-Reaktion konnten HILMES et al. (1998) durch Zugabe von N-Acetyl-L-cystein feststellen. Dabei wird die Maillard-Reaktion durch Blockieren der Kohlenhydrate über die Schwefelverbindung (N-Acetyl-L-cystein) gehemmt.
Durch pflanzliche Extrakte aus Salbei und Rosmarin gelangt es ESTÉVEZ et al. (2004), die antioxidative Wirkung in Schweineleberpastete zu verbessern. Es entstanden weniger Stoffe aus der Lipidautoxidation, die hier als verantwortliche Verbindungen für den negativen Geschmack angesprochen wurden.
Ein deutlicher Unterschied ist durch die unterschiedliche Fettsäurezusammensetzung der eingesetzten Schweinerassen („white pigs“ und „Iberian pigs“) und die daraus resultierenden Aromastoffe erkennbar. Die Pastete aus iberischen Schweinen enthält mehr Linolsäure und damit mehr positive Aromastoffe aus der Lipidoxidation (ESTÉVEZ et al. 2004).
Um neue Lockstoffe für Coyoten geht es LORENZ et al. (1983), als sie mittels Wasserdampfdestillation und Dietyletherextraktion aus Schafleber Extrakte gewannen und 108 Aromastoffe identifizierten.
18 2.4.2 Gänseleber und Gänsestopfleber
2.4.2.1 Zusammensetzung
Die Leber von gestopften Gänsen im Vergleich zu der Leber von nicht gestopften Hafermastgänsen differiert allein schon in Aussehen und Gewicht. Das vorliegende Gewicht der Gänsestopfleber beträgt zwischen 550 – 798 g, und die Farbe ist als porzellanfarben, fast weiß anzusehen. Die Leber der Hafermastgänse dagegen wiegt zwischen 50 und 55 g und ist dunkelrot, wie man es von frischer Leber gewohnt ist.
Untersuchungen, die die Fütterung der Gänse und damit die Auswirkung auf die Stopfleberproduktion beinhalteten, führten CAZEIL et al. (1999) durch. Sie verglichen die Fettsäuremuster von Hepatozytenmembranen und die Lipogenese in der Leber unterschiedlich gefütterter Gänse. Die gezielte übermäßige Fütterung (CAZEIL et al. 1999) ergabt, dass sich die Fettsäurezusammensetzungen der Membranen in Relation zur Fettsäureneubildung veränderten.
Ähnliche Gewichte und Fettsäurezusammensetzung der Stopflebern, wie in den Tabellen 7 und 8 aus dem Lebensmittellexikon (TERNES et al. 2008) angegeben, ergeben sich aus den Untersuchungen von SALICHON et al. (1994). Sie untersuchten die Mastzunahmen und die Zusammensetzung der Stopflebern der Rassen „Landes geese“, „carnard mulard“ und
„carnard de Barberie“ (siehe Glossar). Sie verwendeten die Methode nach Kjeldahl (siehe Glossar) zur Bestimmung der Proteine, während MOLETTE et al. (2001) das Verfahren der Nahinfrarotspektroskopie (siehe Glossar) verwendeten, um die chemische Zusammensetzung von Gänsestopfleber zu ermitteln. Sie verglichen dieses Verfahren mit anderen analytischen Methoden zur Bestimmung von Protein-, Fett-, Asche- und Trockensubstanzgehalt, sowie der Fettsäurezusammensetzung. Die Nahinfrarotspektroskopie kann nach MOLETTE et al. (2001) zur analytischen Untersuchung der Komposition von Lebensmittel mit hohem Fettgehalt, wie der Gänsestopfleber, verwendet werden.
ZHANG et al. (2012) untersuchten Fütterungen mit drei unterschiedlichen Fettzugaben (je 2%
Gänsefett, Soja- und Maisöl), um die Auswirkungen auf die Zusammensetzung der Gänsestopfleber zu verfolgen. Sie konnten damit eine Verbesserung bezüglich der Wirtschaftlichkeit sowie eine Gänsestopfleber mit mehr ungesättigten Fettsäuren postulieren.
19
Die Werte der ungesättigten Fettsäuren sind durch die Ernährung mit dem Sojaöl erhöht und die Zunahme des Lebergewichts effizienter.
Um wirtschaftlicher Leberpastete (hier „foie gras“ genannt) herzustellen, untersuchten ABU- SALEM und ARAB (2010) chemische, mikrobielle und sensorische Eigenschaften von Hühner- und Entenleberpasteten (siehe Tab. 6). Bei der sensorischen Untersuchung fanden sie keinen nennenswerten Unterschied zwischen den Pasteten aus ungestopfter Hühnerleber und den Pasteten aus gestopfter Leber von Hühnern beziehungsweise von Enten.
Tabelle 6: Zusammensetzung der unterschiedlichen Lebersorten in % von Feuchtmasse (ABU-SALEM u. ARAB 2010)
Hühnerleber, normal "foie gras" aus Hühnerleber "foie gras" aus Entenleber
Feuchte 66,8 27,8 28,6
Protein 24,6 10,1 9,4
Fett 6 58,2 56,8
Asche 1,4 0,8 0,9
Tabelle 7: Zusammensetzung von Gänseleber und ihre Lipidklassenzusammensetzung im Vergleich zu Gänsestopfleber (in %) (TERNES et al. 2008)
Gänseleber Gänsestopfleber
Feuchte 71,71 a 32,70 e
Protein 19,62 b 8,30 e
Fett 4,57 c 54,60 e
Triacylglyceride 37,8…26,0 e 92,2 (93,2) e
Phospholipide 67,1…58,0 e 3,5 (4,3…15,2) e
Cholesterol 6,9…4,2 e 3,2 (2,4) e
Asche 1,28 d 0,70 e
a b c d Bestimmung im Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik, Hannover
a, d nach §35 LMBG, b nach Kjeldahlverfahren, c Mikromethode nach Schulte , e Lebensmittellexikon
20
Tabelle 8: Fettsäurezusammensetzung roher Gänseleber und Gänsestopfleber (in %) (TERNES et al. 2008)
Gänseleber Gänsestopfleber
Myristinsäure 0,4 0,8
Palmitinsäure 30,3 25
Palmitoleinsäure 2,3 3,4
Stearinsäure 28,8 11,6
Ölsäure 28 58,5
Linolsäure 6,8 0,8
Linolensäure 0,4 -
Eicosensäure 0,4 -
Arachidonsäure 2,7 -
Gesamtfett 4,28 54,6
2.4.2.2 Aromastoffe und Erzeugnisse aus Gänseleber
Wie oben schon erwähnt, führten ABU-SALEM und ARAB (2010) sensorische Untersuchungen von Hühner- und Entenpastete durch. Es wurden Geschmack, Geruch, Aussehen, Farbe, Textur und allgemeine Akzeptanz getestet. Sie fanden, bis auf die farbliche Abweichung (elfenbeinfarbend für Enten- und gelb für Hühnerpastete), keinen geschmacklichen oder anderen Unterschied.
Es ist bis zum jetzigen Stand der Literatur keine Publikation zu Aromastoffen aus Gänselebern oder deren Produkten bekannt.
21
2.5 Analytik
2.5.1 Aromastoff-Analytik
In der Aroma-Analytik sollen möglichst viele der entstehenden Verbindungen detektierbar sein, um die Komplexität des Aromaprofils darstellen zu können. Es müssen verschiedene Verbindungsklassen in den unterschiedlichsten Konzentrationen der Analytik zugänglich gemacht werden, dafür werden instrumentelle und sensorische Untersuchungen durchgeführt.
Da die Menge der isolierten Stoffe in sehr kleinem Bereich liegt, stellt die Gaschromatographie eine gute und bereits häufig etablierte Methode zur Auftrennung der gesammelten Aromastoffe dar (SCHULTZ et al. 1977; MUSSINAN u. WALRADT 1974).
Zur Isolierung und Gewinnung der Aromastoffe werden unterschiedliche Verfahren in der Literatur beschrieben (PARLIMENT 1997). Zum einen gibt es die Möglichkeit der Destillation bei flüssigen Lebensmitteln, zum anderen können feste Lebensmittel extrahiert und dann destilliert werden (LORENZ et al. 1983). Die Verbindungen werden als Extrakte aufgefangen und analysiert.
Durch die Headspace-Analyse werden die flüchtigen Verbindungen aus der entstehenden Gasphase extrahiert. Bei der statischen Untersuchung wird ein Teil des Dampfes beziehungsweise der Gasphase abgenommen und direkt untersucht. Beim dynamischen Ablauf werden die Verbindungen mithilfe eines inerten Gases an ein Adsorbens („purge and trap“) (siehe Glossar) gesammelt und dann weiter zur Analytik aufbereitet (WAMPLER 1997). Als Adsorbens hat sich Tenax® in der Aromastoff-Analytik bewährt. Es gibt jedoch auch andere Verbindungen, die zum Auffangen der flüchtigen Stoffe geeignet sind (BARNES et al. 1981).
Eine Form, Aromastoffe ohne Lösungsmitteleinsatz zu erfassen, stellt die SPME (Solid-phase Micro Extraction) dar. Sie ist unabhängig von der Probenmatrix und ist mittlerweile weit etabliert (IM et al. 2003). Eine Kieselglasfaser, ummantelt mit einem dünnen Film einer stationären Phase, stellt den Kern des Probennehmers dar. Die entstehenden flüchtigen Verbindungen werden, ähnlich wie bei dynamischen Headspace Verfahren, an dem Absorbens gebunden und anschließend direkt analysiert.
22
Nicht jede flüchtige Verbindung hat den gleichen Anteil am Gesamtaroma. Der Aromawert ist abhängig von dem Verhältnis der Konzentration der flüchtigen Substanz im Lebensmittel zu seiner Geruchschwelle (BELITZ et al. 2007). Um den Einfluss eines Inhaltstoffes am Gesamtaroma bestimmen zu können, wird ein Sniff Port an den Gaschromatographen angeschlossen (BLANK 1996), so dass, nach dem Trennen der einzelnen Komponenten, eine sensorische Beurteilung durch die menschliche Nase möglich ist. Auf diesem Weg lassen sich die flüchtigen Verbindungen erforschen, die für den typischen Geruch („character impact compound“) verantwortlich sind (IM u. KURATA 2003).
Einen Überblick über die Methode der Gaschromatographie mit Olfaktometrie gibt VAN RUTH (2001). Sie beschreibt die genauen Möglichkeiten, den Betrag einer flüchtigen Verbindung in einer Mischung zu bestimmen. VAN RUTH et al. (2001) prüften die vier Methoden mit Testpersonen, um Rückschlüsse über die Qualität der Wahrnehmung und Differenzierungsfähigkeiten ziehen zu können.
2.5.2 Atomabsorptionsspektrometrie
Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit gilt nicht der Bestimmung der Schwermetalle Cadmium und Blei in den Leberproben, stellt jedoch eine wichtige Information zur Qualität derer dar (siehe Kap. 1). Die Höchstgehalte der Konzentrationen sind in der Verordnung (EG) Nr.
1881/2006 geregelt. Der Höchstgehalt (mg/ kg Frischgewicht) für Cadmium und Blei beträgt 0,5 mg/ kg. Die Messung der Schwermetallkonzentrationen kann nach unterschiedlichen Aufschlussmethoden vorgenommen werden (WELZ u. SPERLING 1999). In der Literatur findet man Nassveraschung (siehe Glossar) (TAHVONEN u. KUMPULAINEN 1994) und trockenen Aufschluss (siehe Glossar) (DOGANOC 1996). Zur Bestimmung der Schwermetallkonzentration wird eine reine Analysenlösung benötigt, die über ein Atomabsorbtionsspektrometer gemessen werden kann. Um die nötige Dissoziationsenergie zu zuführen, werden Flammen- (ADEI u. FORSON-ADABOH 2008) oder Graphitrohr-AAS (TAHVONEN u. KUMPULAINEN 1994) verwendet.
23
3 Material und Methoden
3.1 Arbeits- und Untersuchungsmaterial
3.1.1 Untersuchungsmaterial
Untersucht werden Rinder-, Schweine- und Gänseleber. Rinder- und Schweineleber werden in drei Altersklassen unterschieden: Jungtier, Masttier und adultes Tier.
Tabelle 9: Altersklassen von Rind und Schwein
Gewicht (in kg)/ Alter
Kalb 130 - 450 kg; max. 8 Monate alt
Mastrind 250 - 300 kg; ca. 20 Monate alt
Kuh ca. 240 kg; min. 24 Monate alt
Ferkel bis 25 kg Körpermasse
Mastschwein 50 - 120 kg Körpermasse
Sau min. 120 kg Körpermasse
Die Leber der Gänse wird unterschieden in Stopfleber und die Gänseleber von nicht gestopften Tieren. Als gängiges Verzehrgut wurde die Leber sowohl über den Einzelhandel als auch direkt vom Schlachthof bezogen. Rinder- und Schweineleber stammten von in Deutschland gezogenen Tieren, die Gänsestopfleber aus Frankreich und die Leber von den Hafermastgänsen aus Polen. Die frische Leber wurde direkt nach dem Kauf für den einzelnen Bratvorgang vorbereitet und portioniert. Bei den frischen Lebern von Rind und Schwein wurde die Leberkapsel (siehe Kap. 2.1) entfernt. Um eine ausreichende Menge an Aromastoffen während eines Versuchsdurchgangs zu gewinnen, wurde die Leber in Scheiben von ca. 2,5 cm Dicke geschnitten und in Portionen von ca. 1000 g abgewogen. Die Leber der ungestopften Gänse wurde im Ganzen in Portionen von ca. 1000 g abgewogen, eine einzelne Leber wies ein Gewicht von ca. 55 g auf.
Eine Ausnahme bildete die Stopfleber, deren Gesamtgewicht im Versuch durchschnittlich 694 g betrug. Der hohe Fettgehalt bedingte eine Anpassung in der Portionsgröße. Die Dicke der Scheiben betrugen ca. 1,5 cm und das Portionsgewicht ca. 300 g. Die Proben wurden bei -18 °C bis zum Gebrauch gelagert und vor Versuchsbeginn 24h bei +4 °C aufgetaut.
24
3.2 Apparative Anordnung
3.2.1 Analyseeinheiten
Die flüchtigen Aromastoffe wurden als drei Rohproben während des Bratprozesses aufgefangen. Die Auffangsubstrate werden hier im Einzelnen beschrieben (siehe auch Abb. 7 und Kap. 3.2.2.). Die Aufarbeitung der Auffangeinheiten zur Analyse findet sich im Kapitel 3.4.1 und die daraus resultierenden Ergebnisse werden im Kapitel 4 beschrieben:
3.2.1.1 Solid Phase Microextraction Faser (SPME)
Die SPME-Faser (Fa. SUPELCO, Bellefonte, USA) besteht aus einem Divinylbenzen/Carboxen Kern, der mit Polydimethylsiloxan (PDMS) im Verhältnis von 50/30 µm beschichtet ist. Die Faser hat eine Länge von 2 cm und wird in einem dafür vorgesehenen Halter mit integrierter Schutzhülle in die Apparatur eingeführt. Vor jeder Nutzung wird die Faser im Injection Port des Gaschromatographen thermisch gereinigt.
3.2.1.2 Tenax® TA 60/80
Tenax® TA 60/80 (Fa. SUPELCO, Bellefonte, USA) ist ein pulverförmiges Adsorbens, das mit 0,3 g in eine 6 mL Polypropylenkartusche zwischen zwei Polyethylenfritten mit 20 µm Porengröße eingewogen wird. Konditioniert wird das Adsorbens vor dem Bratvorgang mit 3 mL Diethylether, der unter Luftdruck durch das Pulver geleitet wird. Im Anschluss daran wird das Tenax® TA 60/80 durch einen von Aktivkohle gefilterten Luftstrom getrocknet und gemäß Abbildung 7 in die Apparatur eingefügt.
3.2.1.3 Kondensat
Der während des Bratvorgangs entstehende Wasserdampf kondensiert in den Dimrothkühlern.
Das Kondensat wird in einem sauberen, vorher mit Ether gespülten und getrockneten, 100 mL Rundkolben aufgefangen und die Aromastroffe mit Diethylether aus der wässrigen Phase extrahiert.
25 3.2.2 Aufbau
Um die während des Bratvorgangs entstehenden flüchtigen Aromastoffe zu gewinnen, wurde eine Apparatur eingesetzt, die ursprünglich von SPECHT (1993) entworfen und von Autoren wie BASTL (1999) und LAMMERS (2006) weiterentwickelt wurde. MANTEUFFEL (2008) fügte als eine weitere Analyseeinheit die SPME-Faser ein. Diese von Manteuffel modifizierte Apparatur wurde in dieser Arbeit verwendet (siehe Abb. 7).
Destillationsbrücke NS 29 Dimrothkühler NS 29 Überführungsstück (Glas) Kartusche
Tenax® Fritten
Glasdeckel, NW 200
Bratpfanne
Edelstahlstempel
Büchnertrichter mit Aktivkohlefilter
Teflondichtungsring Dimrothkühler NS 14
Rundkolben NS 29 Kondensat Vakuumcontroller
SPME-Halter
a b
Modifiziertes Reduzierstück NS 29-14 mit Öffnung für SPME-Halter
c
c
c
Abbildung 7: Gesamtaufbau der Bratapparatur (Abb. MANTEUFFEL 2008)
26
Die Apparatur besteht vornehmlich aus drei Abschnitten:
Der erste Teil besteht aus dem Freisetzen der flüchtigen Aromastoffe durch Braten der Leberproben (siehe Abb. 7, a). Hierfür wird eine über einen Teflonring und Flansch luftdicht verschlossene Teflonpfanne (Modell „Romana“; ø 20 cm, Firma Schulte Ufer, Sundern;
ergänzt durch einen Auflagering aus Edelstahl) mit Glasdeckel (Firma LAT, Garbsen) verwendet. Diese wird durch eine elektrische Kochplatte (Kalorik 5253, Firma LAT, Garbsen) im Durchschnitt auf ca. 130 °C erhitzt.
Hieran angeschlossen ist der Abschnitt des Wasserentzugs (siehe Abb. 7, b) in Form von zwei Dimrothkühlern, die zur Gewinnung des Kondensates und im Weiteren zur Anreicherung der flüchtigen Substanzen auf den Adsorbentien (siehe Abb. 7, c), der SPME-Faser und dem Tenax® führen.
Der konstante Luftstrom wird mit Hilfe einer Vakuumpumpe (Aquastop® II, Firma Van der Heijde, Dörentrup, Deutschland) erzeugt. Über einen Aktivkohlefilter wird die Luft durch eine der Öffnungen des Glasdeckels durch den Bratraum in die Kühler überführt, weiter an der SPME-Faser entlang geleitet und durch die mit Tenax® gefüllte Kartusche abgesaugt. Im Anschluss ist ein Vakuummeter (Vakuummeter 7221 Sekto, Firma Van der Heijden, Dörentrup, Deutschland) zur Kontrolle des konstanten Luftstroms in die Apparatur eingefügt.
Die Leberprobe wird an einem Edelstahlstempel mit Hilfe eines Edelstahlspießes befestigt (Abb. 8 u. 9).
27
3.3 Durchführung
3.3.1 Einstellung der Versuchsstandards
Zu den Versuchsstandards gehört eine gleiche Anfangstemperatur der Teflonpfanne auf ca.
130 °C und ein konstantes Vakuum bei 750 mbar. Bis zum Erreichen dieser Ausgangsparameter wird der Luftstrom nicht durch die gesamte Apparatur geleitet, sondern aus der verschlossenen Pfanne noch vor den Dimrothkühlern abgeführt. Abbildung 8 stellt den Weg des Luftstroms bis zur Einstellung der Ausgangsparameter dar. Die Auffangmethoden sind, wie oben beschrieben, vorbereitet und schon in die zusammengesetzte Apparatur eingefügt. Ebenso ist die Leberprobe bereits an der Unterseite des Edelstahlstempels mit Hilfe eines ausgeglühten Edelstahldrahtes befestigt (siehe auch Abb. 8).
zur Vakuumanzeige
Leberprobe Stempel
Lufteinlaß über Aktivkohlefilter
Abbildung 8: Luftstrom zur Einstellung der Ausgangsparameter (Abb. MANTEUFFEL 2008)
28 3.3.2 Gewinnung der Aromastoffe
Sind alle Parameter eingestellt, wurde das System zum Auffangen der Aromastoffe aus dem Braten umgestellt und verschlossen, das Vakuum wurde über die Dimrothkühler angeschlossen. Das Glasverbindungsstück wurde mit einem Glasstopfen luftdicht verschlossen (siehe Abb. 9).
Mittels eines Infrarotthermometers wurde die Anfangstemperatur für den Bratdurchgang abermals kontrolliert und im Anschluss daran durch den Lufteinlass 100 µL des Pyridinstandards (wässrige Lösung, 2,51 mg/ 100 µL; siehe auch Kap. 3.5.2) auf die heiße Pfanne aufgegeben. Nachdem die Standardlösung vollständig verdampft und über den Luftstrom aus dem Bratraum geleitet worden war, wurde die Leberprobe auf den Pfannenboden herabgesenkt. In diesem Moment begann die Zeitmessung (Abb. 10 Verlaufsprotokoll). Jede Leberseite (Rinder- und Schweineleber) wurde für drei Minuten der Hitze ausgesetzt (Stufe 2,5), protokolliert wurden zusätzlich die Pfannenbodentemperatur und
Leberprobe Stempel
Lufteinlaß über Aktivkohlefilter
zur Vakuumanzeige
Abbildung 9: Luftstrom während des Bratdurchgangs (Abb. MANTEUFFEL 2008)
29
die Kerntemperatur der fertig gebratenen Leber. Die Gänseleber wurde auf kleinerer Hitze (Stufe 1,5) jeweils für fünf Minuten gebraten, da es sich um dünnere Scheiben handelte.
Die 1000 g des Probenumfangs bestanden im Durchschnitt aus 5 Scheiben Leber, so dass zwischen den einzelnen Portionen die Apparatur geöffnet und der Pfannenboden gereinigt wurde. Dafür wurde das angelegte Vakuum abgestellt und das Verbindungsstück zwischen Teflonpfanne und Dimrothkühlern getrennt. Die Pfanne wurde mit heißem Wasser und Zellstoff von anhaftenden Leberstücken befreit, dann wurden die Versuchsstandards aufs Neue eingestellt (siehe oben) und das nächste Leberstück gebraten.
Nach Abschluss der Aromastoffgewinnung aus dem gesamten Probenumfang wurden alle Teile der Apparatur gründlich gereinigt und mit heißem Wasser nachgespült. Getrocknet wurden sämtliche Teile mit Hilfe von Heißluft.
Abbildung 10: Verlaufsprotokoll/ Analyseschema, siehe auch im Anhang 9.2
Verlaufsprotokoll
• Datum der Analyse
• Art der Leber
• Menge (g) und Stückzahl der Teilproben
• Eingewogene Tenaxmenge (g)
• Vorliegendes Vakuum (mbar)
• Menge des verwendeten Pyridin-Standards
• Zeitangabe der Bratdauer pro Leberseite
• Temperatur der Pfannenmitte
zu Beginn, bei Seitenwechsel und zum Ende des Bratens der Leberseite (°C)
• gewonnene Menge Kondensat (mL)
• Menge des eingesetzten α-Pinen-Standards
30
3.4 GC/MS-Analyse
3.4.1 Aroma-Fraktionen
Aus den Analyseeinheiten (siehe Kap. 3.2.1) wurden, wie hier beschrieben, die einzelnen Aromafraktionen gewonnen.
3.4.1.1 Solid Phase Microextraction Faser (SPME)
Die mit Aromastoffen beladene SPME-Faser wurde, ohne weitere Aufarbeitung und um Verunreinigungen aus der Luft zu vermeiden, unmittelbar nach Beendigung des Bratvorgangs zur Analyse in das GC/MS-System überführt.
3.4.1.2 Tenax® TA 60/80 Rinder- und Schweineleber
Die Aromastoffe im Tenax® TA 60/80 wurden mit 3 mL Diethylether eluiert und in einem Spitzkolben aufgefangen. Dieses Eluat wurde mit 50 µL des α-Pinenstandards (4,62 g/ L Dichlormethan) versetzt und im Anschluss mit einem kontinuierlichen Stickstoffstrom von 4 mL pro Minute auf eine Menge von etwa 200 µL konzentriert. Zur Analyse durch das GC/MS wurden 4 µL dieses Extraktes injiziert.
3.4.1.3 Tenax® TA 60/80 Gans- und Gänsestopfleber
Die Aromastoffe im Tenax® TA 60/80 wurden mit 3 mL Diethylether eluiert und in einem Spitzkolben aufgefangen. Dieses Eluat wurde mit 25 µL des α-Pinenstandards (4,62 g/ L Dichlormethan) versetzt und im Anschluss mit einem kontinuierlichen Stickstoffstrom von 4 mL pro Minute auf eine Menge von etwa 200 µL konzentriert. Zur Analyse durch das GC/MS wurden 2 µL dieses Extraktes injiziert. Es wurde das Varian-Finnigan-GC/MS- System verwendet (siehe Kap. 3.4.2), daher sind die Mengen anders als bei Rinder- und Schweineleber.
31 3.4.1.4 Kondensat
Die entstandene Menge des Kondensats aus dem Bratdurchgang wurde bestimmt, in einen Scheidetrichter überführt und mit etwa einem Drittel seiner Menge mit Diethylether ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde verworfen und die Etherphase mit den darin gelösten Aromastoffen in einem Spitzkolben aufgefangen. Dieses Eluat wurde, wie das des Tenax® TA 60/80, ebenfalls mit 50 µL α-Pinenstandard (4,62 g/ L Dichlormethan) versetzt (bei der Gans- und Gänsestopfleber mit 25 µL α-Pinenstandard (4,62 g/ L Dichlormethan), da das emfindlichere GC/MS-System verwendet wurde) und unter dem kontinuierlichen Stickstoffstrom von 4 mL/ min auf eine Menge von circa 200 µL konzentriert. Auch hier wurden im Weiteren 4 µL (bei der Gans- und Gänsestopfleber mit 2 µL) des Extraktes zur Analyse injiziert.
3.4.2 GC/MS-Systeme Die Analyse der wie oben Gaschromatographie mit Masse Hierbei kommt dem Gaschrom einzelnen Moleküle und dem M Moleküle zu ihrem spezifische spezifischen Massenfragmente, (m/z) in einem Massenspektr Aromastoffe identifiziert werde
Es wurden zwei GC/MS-System von Hewlett-Packard (siehe K Rinderlebern ein Varian-Finnig Ionisation genutzt (siehe Kap.
ebenfalls das Varian-Finnigan im Weiteren genauer beschriebe
Abbildung 11: Beispiel: Massenfr ((m/z) = Masse/La
32
oben beschriebenen Extrakte (siehe Kap. 3.4.
Massenspektrometrie-Kopplung.
chromatographen die Aufgabe der Auftrennung de dem Massenspektrometer die Elektronenstoßionisa ifischen Zerfall zu. Detektiert werden die Molekü
ente, dargestellt in Abhängigkeit ihres Masse/Lad ktrum (siehe Abb. 11). Anhand des Spektr werden.
Systeme verwendet: für die Rinder- und Schweine ehe Kap. 3.4.2.1) und zur Absicherung der letz Finnigan-System (siehe Kap. 3.4.2.2). Es wurde da Kap. 5.1). Für die Analyse der Gänse- und Gänse
igan-System mit elektrischer Ionisation angewend hrieben.
ssenfragmentierung des Moleküls Dodecan
sse/Ladungsverhältnis), EI (Elektronenstoßionisation)
. 3.4.1) erfolgte über ng des Extraktes in die ionisation der einzelnen oleküle mit Hilfe ihrer se/Ladungsverhältnisses Spektrums können die
hweineleber ein System r letzten Peaks in den dazu die Chemische Gänsestopfleber wurde ewendet. Diese werden
33 3.4.2.1 Hewlett-Packard-System Gaschromatographie
• Gerätetyp: HP 5890 Series II GC mit 7673 Autosampler (Fa. Agilent, Böblingen)
• Trennsäule: Kapillarsäule, DB-5, 30 m x 0,25 mm x 1,00 µm; Agilent Technologies, Santa Clara, USA
• Injektortyp: Splitless
• Injektionstemperatur: 220 °C/ 250 °C (methodenabhängig)
• Trägergas: Helium, Reinheitsgrad 4.6; Fa. Linde, München
• Säulenvordruck: 80 kPa
• Flussrate: 1,95 mL/ min (constant flow)
• Temperaturprogramm: 5 min. isotherm bei 40 °C, dann Temperaturanstieg bei einer Rate von 5 °C/ min mit einer Endtemperatur von 200 °C, die anschließend 20 min.
gehalten wird Massenspektrometrie
• Gerätetyp: HP 5989 A MS, Agilent Technologies , Santa Clara, USA
• Elektronenstoßionisation (EI)
• Ionenquellentemperatur: 200 °C
• Ionisationsenergie: 70 eV
• Quadrupoltemperatur: 150 °C
• Tuning: Standard Autotune
• Solvent Delay: methodenabhängig Steuerung
• PC Programm HP G3410 ChemStation, Version C 03.00
34 Methoden
• Zur Analyse der Aromastoffe der SPME-Fraktion wurde die Faser manuell in den Injektorport eingeführt; es erfolgte dabei ein sofortiges Auftragen der Aromastoffe über ein Inlet auf die Säule. Es wurde kein Solvent Delay (siehe Glossar) verwendet, die Messung wurde unmittelbar nach Aufgabe manuell gestartet.
• Für die Eluate aus dem Tenax® TA 60/80 und dem Kondensat wurde ein Solvent Delay verwendet, um das Lösungsmittel aus der Messung zu halten, dieser betrug 3,80 min. Die Aufgabe von 4 µL Probenmenge erfolgte bei beiden Aroma-Fraktionen über den Autosampler.
Im Weiteren wurde zur Analyse der letzten großen Peaks aus den Chromatogrammen von Rind und Schwein ein empfindlicheres Finnigan Massenspektrometer mit chemischer Ionisation (Varian-Finnigan-System) verwendet (siehe Kap. 5.1). Hierbei werden die einzelnen Moleküle des Aromastoffgemischs, die durch den Gaschromatograph aufgetrennt wurden, chemisch durch ein Reaktantgas (Methan) ionisiert. Die Moleküle fragmentieren bei der chemischen Ionisation im Unterschied zur Elektronenstoßionisation nicht so stark, dadurch ist ein deutlicher Molekülpeak darstellbar (siehe Abb. 17-19).
35 3.4.2.2 Varian-Finnigan-System
Gaschromatographie
• Gerätetyp: Varian 3400 GC; Fa. Varian, Sunnyvale, CA, USA mit Autosampler CTC A 200 S; Fa. Finnigan MAT, San Jose, CA, USA
• Trennsäule: Kapillarsäule, DB-5, 60 m x 0,25 mm x 1,00 µm; Agilent Technologies, Santa Clara, USA
• Injektortyp: ptv-Injektor mit inlet liner Varian 1078
• Injektionsvolumen: 2 µL
• Trägergas: Helium, Reinheitsgrad 5.0; Fa. Linde, München
• Säulendruck: 40 psi
• Temperaturprogramm: Starttemperatur 40 °C, Temperaturrate von 4 °C/ min mit einer Endtemperatur von 250 °C, dann isotherm für 10 min
Massenspektrometrie
• Gerätetyp: Finnigan MAT SSQ710 MS; Fa. Finnigan MAT, San Jose, CA, USA
• Chemische Ionisation (CI)
• Reaktantgas: Methan, Reinheitsgrad 4.5; Fa. Linde, München
• Elektrische Ionisation (EI) Ionisationsenergie: 70 eV
• Ionenquellentemperatur: 150 °C
• Solvent Delay: methodenabhängig Steuerung
• ICIS 8.3. Finnigan
