Monitoring von antithrombotischen Medikamenten bei der Katze

(1)

Tierärztliche Hochschule Hannover

Monitoring von antithrombotischen Medikamenten bei der Katze

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Maike Teuber

Köln

Hannover 2017

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Reinhard Mischke Klinik für Kleintiere

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Reinhard Mischke 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Karsten Feige

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2017

(3)

Meiner Oma

(4)

(5)

„Die Wahrheit über die Katze erfährt man von Mäusen.“

- Henry Ford -

(6)

Teile dieser Arbeit sind bei folgender Zeitschrift zur Veröffentlichung angenommen oder bereits veröffentlicht: Research in Veterinary Science

TEUBER, M, R. Mischke (2016):

Influence of a low dosage of clopidogrel on platelet function in cats as measured by the platelet function analyser PFA-100 and the multiplate analyser.

Res Vet Sci. 109:149–156.

Ergebnisse dieser Dissertation wurden zudem in Form von Posterpräsentationen auf folgender Fachtagung präsentiert: 24. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe „Innere Me- dizin und Klinische Labordiagnostik“ (InnLab 2016), 29.–30.01.2016, Berlin:

Referenzwerte für die Thrombingenerierung bei der Katze Maike Teuber, Andreas Tiede, Reinhard Mischke

Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei der Katze gemessen mit dem Mul- tiplate^®-Analyser und dem PFA-100^® unter dem Einfluss von Clopidogrel Maike Teuber, Reinhard Mischke

Die zugehörigen Abstracts wurden veröffentlicht in der Tierärztl Prax Ausg K Kleintiere Heimtiere P37 und P40.

(7)

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

2. Literaturübersicht 5

2.1 Clopidogrel: Klinischer Einsatz und dessen Monitoring bei Mensch und Tier

5 2.1.1 Pharmakologie und Anwendung beim Menschen 5

2.1.2 Indikationen und Anwendung beim Hund 6

2.1.3 Anwendung bei der Katze 8

2.1.4 Ausgewählte Methoden zur in vitro Bestimmung der Plättchenfunk- tion

10 2.1.4.1 Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100^® 10 2.1.4.2 Vollblut-Impedanz-Aggregometrie mit dem Multiplate^®-Analy-

ser

13 2.2 Thrombingenerierung und ihre Rolle bei der Überwachung von Faktor

Xa-Inhibitoren

16

2.2.1 Methode und Anwendung 16

2.2.2 Faktor Xa-Inhibitoren 20

2.2.3 Einfluss der Faktor Xa-Inhibitoren auf die Parameter der Thrombi- ngenerierung

23

3. Material, Tiere und Methoden 25

3.1 Material 25

3.1.1 Geräte und Bezugsquellen 25

3.1.2 Reagenzien und Bezugsquellen 26

3.1.3 Verbrauchsmaterialien und Bezugsquellen 28

3.1.4 Medikamente und Bezugsquellen 30

3.2 Tiere 30

3.3 Studiendesign 31

3.4 Versuchsdurchführung, Blutgewinnung und Probenbearbeitung 32

(8)

Inhaltsverzeichnis

3.4.1 Vorbereitung der Tiere 32

3.4.2 Blutentnahmen 32

3.4.3 Probenbehandlung 33

3.5 Labormethoden 34

3.5.1 Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100^® 34

3.5.2 Multiplate^®-Analyser 35

3.5.3 Thrombingenerierung 35

3.5.4 ROTEM (Thrombelastometrie) 36

3.5.5 Anti-Xa Aktivität 38

3.5.6 Prothrominzeit, aktivierte partielle Thromboplastinzeit 39

3.5.7 Hämatokrit 40

3.5.8 Statistische Auswertung 40

4. Manuskript I 42

4.1 Abstract 43

4.2 Introduction 43

4.3 Materials and Methods 45

4.3.1 Study design 45

4.3.2 Animals 46

4.3.3 Sample collection 47

4.3.4 PFA-100^® 47

4.3.5 Multiplate^® analyser 48

4.3.6 Statistical analysis 48

4.4 Results 49

4.4.1 Platelet function analyser reference values 49 4.4.2 Different concentrations of agonists tested with impedance ag-

gregometer

51 4.4.3 Impact of clopidogrel on platelet function tested with PFA-100^® 53 4.4.4 Impact of clopidogrel on platelet aggregation tested with Multi-

plate^® analyser

55

4.5 Discussion 59

(9)

Inhaltsverzeichnis

4.6 Conclusion 63

4.7 References 64

5. Manuskript II 69

5.1 Abstract 70

5.2 Introduction 70

5.3 Materials and Methods 73

5.3.1 Study design 73

5.3.2 Animals 74

5.3.3 Sample collection 74

5.3.4 Thrombin Generation Assay 75

5.3.5 Apixaban concentration (anti-Xa activity) 77 5.3.6 Prothrombin time and activated partial thromboplastine time 77

5.3.7 ROTEM (Thromboelastometry) 78

5.3.8 Haematocrit 79

5.3.9 Statistical analysis 79

5.4 Results 79

5.5 Discussion 88

5.6 Conclusion 92

5.7 References 92

6. Übergreifende Diskussion 99

7. Zusammenfassung 111

8. Summary 114

9. Literaturverzeichnis 117

10. Tabellarischer Anhang 142

(10)

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

° Grad

AA Arachidonsäure

ADP Adenosindiphosphat

ASS Acethylsalizylsäure

Anti-Xa Anti-Faktor Xa

aPTT aktivierte partielle Thromboplastinzeit

AUC area under the curve, Fläche unter der Kurve

bzw. beziehungsweise

C Celsius

ca. circa

CADP-Testkartusche Kollagen/Adenosindiphosphat Testkartusche

CAT Calibrated automated Thrombography

CEPI-Testkartusche Kollagen/Epinephrin Testkartusche

CFT Clot Formation Time, Gerinnselbildungszeit

CT Clotting Time, Gerinnungszeit (beim ROTEM®)

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EPI Epinephrin

ETP Endogenes Thrombinpotential

EXTEM Reagenz zur Aktivierung des extrinsischen Gerin- nungssystems

F Faktor, beispielsweise FXa

g Erdbeschleunigung (1 g = 9,81 m/s²)

GV Gesamtvolumen

INR International Normalized Ratio

INTEM Reagenz zur Aktivierung des intrinsischen Gerin- nungssystems

i.v. intravenös

k kastriert

K Gerinnselbildungszeit

(11)

kg Kilogramm

m männlich

Max Maximum

MCF Maximum Clot Firmness,Gerinnselfestigkeit

ML Maximum Lysis, Maximale Lyse

mg Milligramm

Min Minimum

min Minute

mol Mol

μg Mikrogramm

μl Mikroliter

μmol Mikromol

ml Milliliter

ML Maximum Lysis

mm Millimeter

Mon Monate

MW arithmetischer Mittelwert

n Anzahl

NaCl Natriumchlorid

nM, nmol Nanomol

Nr. Nummer

ng Nanogramm

o. M. ohne Messung

P P-Wert, Signifikanzniveau

PFA Plättchenunktionsanalyse

PL Phospholipide

pM, pmol Picomol

PPP plättchenarmes Plasma

PRP plättchenreiches Plasma

p.o. per os

PT Prothrombinzeit

(12)

® eingetragenes Warenzeichen

r Korrelationskoeffizient nach Pearson

ROTEM Rotationsthromboelastometrie

rs Korrelationskoeffizient nach Spearman

s Standardabweichung

sek Sekunde

Std Stunde

Tab. Tabelle

Tbl Tablette

TEG Thromboelastographie

TF Tissue Factor, Gewebethromboplastin

TG Thrombingenerierung

™ Trade Mark

u. a. unter anderem

VK Variationskoeffizient

w weiblich

vWF Von Willebrand Faktor

VZ Verschlusszeit

 Arithmetischer Mittelwert

z. B. zum Beispiel

(13)

Einleitung

- 1 - 1. Einleitung

Antithrombotische Medikamente sind von wesentlicher Bedeutung bei der Katze. Auf- grund der hohen Inzidenz an hypertrophen Kardiomyopathien kommt es bei der Katze häufig zu Thromboembolien in der Endaufzweigung der Aorta (Fuentes, 2012). Diese Erkrankung ist mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsrate assoziiert und ist häufig mit einer schlechten Prognose behaftet (Borgeat et al., 2013). Aus diesem Grund und aufgrund der oft mit einer Aortenthrombose assoziierten schweren Kardiomyopathie werden Katzen, die in der Praxis vorstellig werden, meist euthanasiert (Hogan et al., 2015). Neben Aortenthrombosen kommen bei der Katze auch pulmonale Thromboem- bolien (Pouchelon et al., 1997; Smith et al., 1998; Davidson et al., 2006), Pfort- aderthrombosen (Rogers et al., 2008) und arterielle Thrombosen (Smith et al., 1998;

Smith et al., 2003) vor.

Zur Prävention und Therapie von Thromboembolien bei der Katze kommen neben An- tikoagulantien auch Thrombozytenaggregationshemmer zum Einsatz (Falconer und Atwell, 2003). Zu den bei der Katze verwendeten Thrombozytenaggregationshem- mern zählen Azetylsalizylsäure (ASS) und Clopidogrel (Smith et al., 2003; Hogan et al., 2004), wobei Clopidogrel mittlerweile aufgrund seiner besseren Wirkung der ASS vorgezogen wird (Hogan et al., 2015).

Der Vorteil dieser Thrombozytenaggregationshemmer ist, dass sie der Katze beide oral, in Tablettenform, verabreicht werden können. Die etwas aktuellere Studie von Hogan et al. (2015) zeigt, dass die Rezidivrate für kardiogen bedingte arterielle Throm- boembolien bei Katzen unter Clopidogreltherapie bei 53 % und bei Katzen unter Aspi- rintherapie bei 75 % liegt. Nachteilig an ASS ist die Toxizität bei hohen Dosierungen bzw. langfristiger Gabe. Dies führt häufig zu gastrointestinalen Störungen, v.a. Ma- genulzera, und akuten Vergiftungserscheinungen mit Beeinträchtigungen der Nieren- funktion (Konturek et al., 1981; Whittle et al., 1985; Villar et al., 1998; Smith et al., 2003), weshalb Clopidogrel als Therapeutikum bevorzugt werden sollte (Hogan et al., 2015). Basierend auf der Studie von Hogan et al. (2004), in der Clopidogreldosierun-

(14)

Einleitung

- 2 -

gen zwischen 18,75 und 75 mg pro Katze ohne signifikanten Unterschied in der Wir- kung getestet wurden, wird Clopidogrel mittlerweile in einer täglichen Standarddosie- rung von 18,75 mg (1/4 der 75 mg Tablette) pro Katze verabreicht. Bislang gibt es aber noch keine Studie, die sich mit einer noch niedrigeren Dosierung befasst. Obwohl Clopidogrel von der Katze relativ gut vertragen wird und es selten zu Nebenwirkungen kommt (Hogan et al., 2015), wäre eine Dosisreduktion bei gleicher Wirksamkeit, be- sonders bei Tieren mit Unverträglichkeitsanzeichen von Vorteil.

Zur Überwachung der Therapie mit Clopidogrel hat sich beim Menschen und bei Tieren die Plättchenaggregation als geeignetste Methode bewährt (Müller et al., 2008; Ho et al., 2016), wobei zu beachten ist, dass der passende Antagonist gewählt wird. Beim Impedanz-Aggregometer Multiplate^®-Analyser hat sich für Clopidogrel die mit Adeno- sindiphosphat (ADP) induzierte Plättchenaggregation am geeignetsten herausgestellt (Velik-Salchner et al., 2008). Obwohl sich das Plättchenfunktionsanalysegerät PFA- 100^®beim Menschen nur bedingt zur Überprüfung des plättchenhemmenden Effektes von Clopidogrel eignet (Mani et al., 2006; Dyszkiewicz-Korpanty et al., 2007; Müller et al., 2008), sind in der vorliegenden Arbeit basierend auf vielversprechenden Ergebnis- sen beim Hund vergleichbare Messungen mit dieser einfach zu handhabenden Me- thode gemacht worden. Interessanterweise zeigte nun auch eine kürzlich publizierte Studie, dass sich der plättchenhemmende Effekt von Clopidogrel bei der Katze mittels des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100^® nachweisen lässt (Ho et al., 2016).

Neben den bisher genannten antithrombotischen Medikamenten gibt es eine ganze Reihe neuerer Antikoagulanzien, die als direkte Inhibitoren des Gerinnungsfaktors Xa agieren und zur Behandlung venöser Thrombosen beim Menschen eingesetzt werden.

Sie binden reversibel an diesen Gerinnungsfaktor und weisen somit eine bessere Steuerbarkeit sowie eine signifikant niedrigere Blutungsgefahr im Vergleich zu den herkömmlichen Antikoagulanzien auf (Heindl und Spannagl, 2009). Diese Eigenschaf- ten und die Möglichkeit, sie oral verabreichen zu können, machen diese neuen Antiko- agulanzien interessant für die Veterinärmedizin. Zur Anwendung der neuen Faktor Xa- Inhibitoren in der Tiermedizin gibt es lediglich experimentelle Studien, die sich mit der

(15)

Einleitung

- 3 -

Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Rivaroxaban beim Hund (Conversy et al., 2013) und Apixaban bei der Katze (Myers et al., 2015) befassen.

Auch wenn die Faktor Xa-Inhibitoren wie Apixaban beim Menschen keiner routinemä- ßigen labordiagnostischen Überwachung und Dosisanpassung bedürfen (Heindl und Spannagl, 2009; Tripodi, 2012), ist es wünschenswert, deren Auswirkungen auf in vitro Tests zu kennen, z. B. für die Etablierung von Dosierungsschemata, zur Ermittlung von Restkonzentrationen im Blut vor operativen Eingriffen oder bei thromboemboli- schen Vorkommnissen unter Therapie (Tripodi, 2012). Mehrere in vitro Studien im Hu- manbereich haben sich mit der antikoagulatorischen Wirkung von Faktor Xa-Inhibito- ren auf die Thrombingenerierung (TG) befasst und beschreiben einen deutlichen antikoagulatorischen Effekt auf alle Parameter der TG (Gerotziafas et al., 2007; Wong et al., 2013; Tripodi et al., 2015). In der Tiermedizin gibt es lediglich einzelne Studien, die sich mit der Untersuchung der TG beim Hund unter verschieden Gesichtspunkten befassen (Allegret et al., 2011; Witten, 2011; Conversy et al., 2013; Dengate et al., 2016).

Zum einen ging es um den Einfluss von Hämostasestörungen auf die Parameter der TG (Witten, 2011; Dengate et al., 2016) und zum anderen um die Überwachung von Antikoagulanzien, insbesondere die Auswirkung von Heparin und Faktor Xa-Inhibito- ren auf die TG (Allegret et al., 2011; Conversy et al., 2013). Bei der Katze findet die TG bisher nach Kenntnis der Autorin noch keine Anwendung.

Die vorliegende Arbeit befasst sich im ersten Teil mit der Etablierung des Plättchen- funktionanalysegerätes PFA-100^® und des modernen Impedanz-Aggregometers Mul- tiplate^®-Analyser als diagnostische Methoden zur Untersuchung von Plättchenfunkti- onsparametern im Katzenblut und zum Monitoring von Plättcheninhibitoren. Zum einen sind Referenzwerte für das Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100^® erstellt worden und zum anderen sollte mittels Thrombozytenfunktionsdiagnostik herausgefunden werden, ob eine reduzierte Dosierung von Clopidogrel (10 mg pro Tier und Tag) in gleicher Weise die Plättchenfunktion bei der Katze hemmt wie die Standarddosierung von 18,75 mg pro Katze.

Im zweiten Teil der Studie geht es darum, die TG als diagnostische Methode zur Un- tersuchung von Katzenblut im Hinblick auf die Überwachung der modernen Faktor Xa-

(16)

Einleitung

- 4 -

Inhibitoren zu evaluieren. Nach Überprüfung der Präzision und der Erstellung von Re- ferenzwerten für verschiedene Konzentrationen von Gewebethromboplastin („tissue factor“, TF) für diese Spezies wird hierzu der Einfluss der Apixabangabe zu verschiedenen Zeitpunkten auf die TG im Vergleich zu anderen Hämostasetests überprüft.

(17)

Literaturübersicht

- 5 - 2. Literaturübersicht

2.1 Clopidogrel: Klinischer Einsatz und dessen Monitoring bei Mensch und Tier

2.1.1 Pharmakologie und Anwendung beim Mensch

Clopidogrel zählt zu den modernen Thrombozytenaggregationshemmern. Es gehört zur Gruppe der Thienopyridine, die irreversibel den ADP-Rezeptor auf der Thrombozy- tenmembran hemmen (Pereillo et al., 2002). Clopidogrel ist in vitro inaktiv und wird nach oraler Aufnahme und Resorption über den Magendarmtrakt in der Leber durch das Enzym Cytochrom P450-1A in die aktive Form umgewandelt (Pereillo et al., 2002, Brainard et al., 2010). Zuerst entsteht mit 2-oxo-Clopidogrel ein Zwischenprodukt, das durch Hydrolyse in den endgültigen aktiven Metaboliten, ein Thiolderivat, umgewandelt wird (Pereillo et al., 2002). Durch diesen aktiven Metaboliten wird der P2Y12-Re- zeptor auf der Thrombozytenmembran inaktiviert (Müller et al., 2007), was im Endef- fekt den cAMP-Spiegel im Thrombozyten erhöht (Savi et al., 2001) und die ADP-induzierte Sekretion der α-Granula und die Adhäsion am Subendothel hemmt (Gawaz, 1999). Dadurch werden die Thrombozyten während ihrer gesamten Lebensdauer von 7–10 Tagen in ihrer Funktion blockiert (Weber et al. 2001).

In der Humanmedizin dient Clopidogrel der Sekundärprophylaxe nach Herzinfarkten, bei Bestehen einer peripheren Verschlusskrankheit, um eine Thrombusbildung in den verkalkten und eingeengten Gefäßen zu vermeiden und zur Behandlung jeglicher Form des akuten Koronarsyndroms (Sabatine et al., 2005; Reaume et al., 2008;

Wallentin et al., 2009). Im Rahmen der CAPRIE-Studie (1996) und der CURE-Studie (2001) konnte gezeigt werden, dass Clopidogrel als Monotherapie und in Kombination mit ASS bei den oben genannten Erkrankungen, die assoziiert sind mit inflammatori- schen und prothrombotischen systemischen und lokalen Veränderungen im koronaren, zerebralen und peripheren arteriellen Gefäßsystem (Mittermaier, 2007), eine signifikante Risikoreduktion zeigt. Dabei wurde Clopidogrel in einer Dosierung von 75 mg einmal täglich eingesetzt. Um die verzögert einsetzende plättchenhemmende Wirkung

(18)

Literaturübersicht

- 6 -

von Clopidogrel zu kompensieren, wird bei akuten perkutanen koronaren Interventio- nen eine Anfangsdosis von 300 mg empfohlen. Danach wird auf die tägliche Standard- dosierung von 75 mg einmal täglich reduziert (Savcic et al., 1999; Müller et al. 2001;

Hochholzer et al., 2005). Aufgrund von Clopidogrelresistenzen beim Menschen bzw.

aufgrund von einer geringeren Wirksamkeit von Clopidogrel durch Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten wird auch hier eine höhere Anfangsdosis, aber auch eine höhere Erhaltungsdosis empfohlen (Geisler und Gawaz, 2006).

Eine verlässliche Methode, um die durch Clopidogrel induzierte Plättchenaggregation zu ermitteln, ist die Impedanz-Aggregation (Dyszkiewicz-Korpanty et al., 2007; Müller et al., 2008). In einigen experimentellen Studien ist auch das Plättchenfunktionanaly- segerät PFA-100^® zur Überprüfung der Wirkung von Clopidogrel getestet worden (Gei- ger et al., 2005; Mani et al., 2006; Dyszkiewicz-Korpanty et al., 2007; Müller et al., 2008). Alle genannten Studien kamen zur selben Auffassung, dass sich das Plättchen- funktionsanalysegerät PFA-100^® nicht zum Monitoring einer Clopidogreltherapie eignet wie in Abschnitt 2.1.4.1 dargestellt. Die Vollblut-Impedanz-Aggregometrie wies allerdings sehr verlässliche Ergebnisse in Bezug auf den hemmenden Effekt von Clopidogrel auf. Die ADP-induzierte Plättchenaggregation mit den Agonistenkonzent- rationen 10 und 20 µM war in der in vivo Studie von Dyszkiewicz-Korpanty et al. (2007) mit einer einmal täglichen Clopidogreldosis von 75 mg signifikant reduziert. Die mit 1 und 2 µg/ml Kollagen induzierte Aggregation wies nur einen geringen Effekt auf. Zu einem ähnlichen Ergebnis kam die Studie von Müller et al. (2007), in der die mit 6,4 µM ADP induzierte Plättchenaggregation signifikant reduziert war bei Patienten unter Clopidogreleinfluss (75 mg einmal täglich).

2.1.2 Indikation und Anwendung beim Hund

In der Tiermedizin ist die Anwendung von Clopidogrel noch nicht so weit verbreitet.

Beim Hund kommt Clopidogrel u. a. bei Erkrankungen wie immunhämolytischer Anä- mie, Hyperadrenokortizismus, Diabetes mellitus, Sepsis, und Neoplasien zur Anwen- dung, da es aufgrund der hier bestehenden Hyperkoagulabilität zu einem erhöhten

(19)

Literaturübersicht

- 7 -

Thromboserisiko kommen kann (Kitrell und Berkwitt, 2012), so dass eine Thrombozy- tenaggregationshemmung bei diesen Erkrankungen indiziert ist (Wiinberg et al., 2012).

Dieser Umstand veranlasste Brainard et al. (2010), die Pharmakodynamik und Phar- makokinetik von Clopidogrel bei Hunden zu untersuchen. Die 8 in dieser Studie verwendeten gesunden Hunde bekamen jeweils unterschiedliche Dosierungen an Clopidogrel (im Median 1,13 mg/kg alle 24 Stunden für 3 Tage, 0,5 mg/kg alle 24 Stun- den für 3 Tage und 1,09 mg/kg alle 24 Stunden über 5 Tage). Die Pharmakodynamik wurde dabei mittels optischer Aggregometrie, Thrombelastographie und Vollblutaggre- gation bestimmt. Die ADP- und Kollagen-induzierte optische Plättchenaggregation war in allen Behandlungsgruppen reduziert und der plättchenhemmende Effekt von Clopidogrel hielt noch ungefähr 8 Tage nach Absetzen der Medikation an. Es gab auch keinen signifikanten Unterschied zwischen den unterschiedlichen Clopidogreldosie- rungen. Bei der ADP-induzierten Vollblut-Impedanz-Aggregometrie sah es in dieser Studie etwas anders aus. In der Gruppe der hohen Dosierung gab es innerhalb einer Stunde nach Clopidogrelapplikation eine signifikante (P = 0,04) Reduzierung der Im- pedanz. Die Werte in der Gruppe mit der niedrigen Dosierung waren im Vergleich zum Ausgangswert nicht signifikant (P = 0,12) verändert. Auf die Thrombelastograpie hatte keine der Clopidogreldosierungen einen Einfluss. Eine weitere Studie konnte den inhibitorischen Effekt von Clopidogrel mittels Plättchenaggregation und Plättchenfunkti- onsanalysegerät PFA-100^® bei Hunden nachweisen (Biermann und Mischke, 2013).

In dieser Studie wurden die 18 gesunden Hunde in 3 Versuchsgruppen aufgeteilt, die jeweils unterschiedliche Dosierungen an Clopidogrel erhielten (0,5 mg/kg, 1 mg/kg bzw. 2 mg/kg einmal täglich über 7 Tage). Die statistische Auswertung der Ergebnisse dieser Studie ergab, dass es lediglich bei der ADP-induzierten Plättchenaggregation einen signifikanten Unterschied zwischen den unterschiedlichen Dosierungen gab.

Höhere Dosierungen von mindestens 2 mg/kg erwiesen sich dabei am brauchbarsten, um eine adäquate Hemmung der Plättchenfunktion hervorzurufen. In der Studie von Goodwin et al. (2007) wurden verschiedene Versuchsreihen mit unterschiedlichen Clopidogrel-Dosierungen (1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg und 4 mg/kg jeweils einmal täg- lich über 7 Tage) an gesunden Hunden getestet und der inhibitorische Effekt mittels Mundschleimhautblutungszeit und Kollagen-induzierten (5 µg/ml) Vollblutaggregation

(20)

Literaturübersicht

- 8 -

an bestimmten Zeitpunkten nach Medikamentenapplikation ermittelt. Zusätzlich gab es eine Versuchsreihe, in der eine einmalige Anfangsdosierung von 10 mg/kg gewählt wurde. Die hohe Anfangsdosierung erreichte innerhalb von 90 Minuten den maximalen plättchenhemmenden Effekt, der ansonsten erst am Tag 3 mit der 3 mg/kg-Dosierung erzielt wurde. Ansonsten zeigten alle Versuchsreihen eine maximale Plättchenaggre- gation zwischen den Tagen 3 und 5 bis auf die initiale 2 mg/kg Versuchsreihe. Sie wurde aufgrund von einer inadequaten Plättchenaggregation eingestellt. Die Studie von Goodwin et al. (2007) kam auch zu dem Ergebnis, dass sich die Mundschleim- hautblutungszeit nicht als adäquater Test zur Überwachung einer Clopidogreltherapie bei Hunden eignet, da sie zwischen den Hunden untereinander, bei jedem einzelnen Hund und den Dosis-Studien sehr variiert. Alle genannten Hundestudien wiesen eine gute Verträglichkeit von Clopidogrel und kein Auftreten von Nebenwirkungen wie Hä- morrhagien bei dieser Spezies auf.

2.1.3 Anwendung bei der Katze

Bei Katzen mit hyperthropher Kardiomyopathie (HCM) sind arterielle Thromboembo- lien die häufigste Komplikation (Fuentes, 2012). Zur Prävention und Therapie dieser Thromboembolien kommen bei dieser Spezies u. a Thrombozytenaggegationshem- mer wie z. B Clopidogrel zum Einsatz (Hogan et al., 2015).

In der zugänglichen Literatur gibt es einige experimentelle Studien, die sich mit dem plättchenhemmenden Effekt von Clopidogrel bei Katzen befassen (Hogan et al., 2004;

Hamel-Jolette et al., 2009; Ho et al., 2016), aber auch eine positiv-kontrollierte klinische Studie (Hogan et al., 2015).

In der Studie von Hogan et al. (2004) wurde Clopidogrel in verschiedenen Dosierungen getestet. Fünf Katzen bekamen jeweils über einen Zeitraum von 7 bzw. 10 Tagen Clopidogrel in einer Dosierung von 18,75 mg, 37,5 mg und 75 mg einmal täglich pro Katze. Um den thrombozytenhemmenden Effekt zu beurteilen, haben Hogan et al.

(2004) die ADP- und Kollagen-induzierte Plättchenaggregation und die Mundschleim- hautblutungszeit vor Versuchsbeginn, an definierten Tagen während der

(21)

Literaturübersicht

- 9 -

Clopidogrelgabe und an bestimmten Tagen nach Beendigung der Medikamentenap- plikation ermittelt. Alle 3 Dosierungen zeigten dosisunabhängig eine Minderung der Plättchenaggregation und eine verlängerte Mundschleimhautblutungszeit. In einer weiteren Studie wurden 9 gesunden Katzen 18,75 mg Clopidogrel einmal alle 24 Stun- den über 3 Tage verabreicht (Hamel-Jolette et al., 2009). Die Blutentnahmen zur Über- prüfung der Plättchenaggregation mittels des Analysegerätes „Plateletworks“ erfolgten in dieser Studie am 1. Tag vor der Medikamentengabe und am 4. Tag. Bei 4 Katzen wurde die Plättchenaggregation zusätzlich 5, 10, 15, 30 und 60 Minuten vor und nach der Clopidogrelgabe bestimmt. Auch in dieser Studie war ein signifikanter (p < 0,01) hemmender Effekt durch Clopidogrel auf die Plättchenaggregation auszumachen.

Eine kürzlich erschienene Studie befasst sich ebenfalls mit dem plättchenhemmenden Effekt von Clopidogrel auf verschiedene Plättchenfunktionstests (Multiplate^®-Analyser, PFA-100^®, Plateletworks) (Ho et al., 2016). Jeweils 12 Katzen erhielten 18,75 mg Clopidogrel einmal täglich über 8 Tage oral. Weitere 12 bekamen neben einer bestimmten verabreichten Aspirindosis zusätzlich Clopidogrel an den Tagen 4 bis 8. Die Plättchenaggregation und Plättchenfunktion ist in der Studie von Ho et al. (2016) am ersten Tag vor Medikamentengabe und am 4. und 8. Tag bestimmt worden.

Clopidogrel hatte dabei die Plättchenfunktion signifikant (P < 0,005) erniedrigt im Ver- gleich zum Ausgangswert. Dabei wurde kein signifikanter Unterschied in der Plättchen- funktion ermittelt bei den Katzen, die Clopidogrel entweder für 4 bzw. 8 Tage erhielten.

Auf die Plättchenaggregation hatte Clopidogrel keinen Einfluss in dieser Studie. Dabei spielte der zur Induktion verwendete Agonist keine Rolle. Der plättchenhemmende Ef- fekt von Clopidogrel konnte darüber hinaus auch mittels Plateletworks erfasst werden.

Die positiv-kontrollierte klinische Studie von Hogan et al. (2015) befasste sich im Ge- gensatz zu den vorher erwähnten Studien mit einer Langzeitgabe von Clopidogrel über durchschnittlich 185 Tage (4–2034 Tage). Dort bekamen 42 Katzen einmal täglich 18,75 mg Clopidogrel. Anders als in den vorangegangenen Studien hatten diese Kat- zen eine Erkrankungsvorgeschichte mit einer arteriellen Thromboembolie und einer Herzerkrankung, bei der das Auftreten eines im Herzen gebildeten Thrombus wahr- scheinlich ist. Die Katzen blieben solange in der Studie, bis sie entweder ein Rezidiv der kardiogen bedingten arteriellen Thromboembolie bekamen oder aufgrund der

(22)

Literaturübersicht

- 10 -

Herzerkrankung verstarben bzw. euthanasiert werden mussten. In der Studie von Ho- gan et al. (2015) wurden die Langzeitgabe und Wirkung von Clopidogrel mit der von ASS verglichen mit dem Ergebnis, dass Clopidogrel ASS überlegen war, was die Re- zidivprophylaxe einer kardiogen verursachten arteriellen Thromboembolie anbelangte.

Basierend auf den Ergebnissen dieser Studien, wird Clopidogrel zurzeit in einer Stan- darddosierung von 18,75 mg (1/4 Tablette Clopidogrel 75 mg) pro Katze einmal täglich zur Prophylaxe von Aortenthrombosen aufgrund von hypertropher Kardiomyopathie verabreicht (Smith, 2012; Hogan et al., 2015).

Bei der Behandlung mit Clopidogrel treten bei Katzen kaum Nebenwirkungen auf. In den Studien von Hogan et al. (2004) und Hamel-Jolette et al. (2009) gab es keine unvorhergesehenen Blutungen oder Abweichungen in den klinischen Untersuchun- gen. Lediglich eine Katze zeigte eine selbstlimitierende Diarrhoe. In der Langzeitstudie von Hogan et al. (2015) traten weder Blutungen noch Erbrechen oder gastrointestinale Probleme auf. Bei allen Katzen gab es nach einem Monat Therapie mit Clopidogrel eine Erniedrigung der weißen Blutzellen und eine signifikante Erhöhung des Lebe- renzyms Alanin-Aminotransferase, aber keine lag außerhalb des Referenzbereiches.

Nur bei einer Katze kam es zu einer generellen Erhöhung der Leberenzyme und einen daraus resultierenden Ikterus.

2.1.4 Ausgewählte Methoden zur in vitro Bestimmung der Plättchenfunktion

2.1.4.1 Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100^®

Seit den frühen 1970ern wird versucht die Plättchenfunktion beim Menschen mittels in vitro Testsystemen zu überprüfen und die in vivo Blutungszeit zu ersetzen (Kundu et al., 1994; Mammen et al., 1995). Das in den 1990ern entwickelte Plättchenfunktions- analysegerät PFA-100^® ist eines davon und basiert auf dem Konzept des Vorläufer- modells Thrombostat 4000, das im Jahre 1985 von Kratzer und Born entwickelt wurde.

Die Plättchenfunktionsanalyse dient der quantitativen Überprüfung der primären Hä- mostase (Kundu et al., 1994; Mammen et al., 1995). Mit Natriumcitrat antikoaguliertes

(23)

Literaturübersicht

- 11 -

Vollblut wird dabei unter konstantem Vakuum aus dem Probenreservoir der austausch- baren Testkartusche durch eine ebenfalls in der Kartusche enthaltene Kapillare ge- saugt, an deren Ende sich eine Membran befindet, die eine Öffnung besitzt. Die Memb- ran ist entweder mit Kollagen und Adenosindiphosphat (CADP-Testkartusche) oder Kollagen und Epinephrin (CEPI-Testkartusche) beschichtet (Harrison, 2005). In Ver- bindung mit dem Agonisten auf der Membran und unter Einfluss der hohen Scherge- schwindigkeit formt sich ein Plättchenpfropf, der die Öffnung in der Membran zuneh- mend verschließt und den Blutfluss durch das Gerät blockiert. Die Thrombusbildung wird als Funktion der Zeit gemessen, die benötigt wird die Membranöffnung zu ver- schließen (Verschlusszeit) (Rand et al., 2003).

In der Humanmedizin dient die CEPI-Testkartusche des Plättchenfunktionsanalysege- rät PFA-100^® vornehmlich der Überwachung einer plättchenhemmenden Therapie mit ASS oder einer Desmopressin-Behandlung bei Patienten mit Hämophilie A (Favaloro, 2008), detektiert aber auch geerbte Plättchenfunktionsstörungen, wie z. B. den Sto- rage-Pool-Defekt (Harrison et al., 1999). Ist die Verschlusszeit der CADP-Testkartu- sche zusätzlich zur CEPI-Testkartusche verlängert, gibt das einen Hinweis auf schwer- wiegendere Thrombozytopathien wie von-Willebrand-Krankheit, Glanzmann-Throm- basthenie und Bernard-Soulier-Syndrom (Mammen et al., 1998; Rand et al., 2003).

Um den plättchenhemmenden Effekt von Clopidogrel zu ermitteln, eignet sich das Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100^® beim Menschen nur bedingt, da er hierfür eine geringe Sensitivität besitzt (Mani et al., 2006; Dyszkiewicz-Korpanty et al., 2007;

Müller et al., 2008). In der Studie von Mani et al. (2006) erhielten 43 Patienten mit arterieller Verschlusskrankheit Clopidogrel. Die Plättchenfunktion wurde mittels der CEPI- und CADP-Testkartuschen des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100^® ermittelt. Nur 14 % der Patienten zeigten eine verlängerte Verschlusszeit bei den CEPI- Testkartuschen und lediglich 7 % bei den CADP-Testkartuschen. Ein ähnlicher Effekt ist in der Studie von Dyszkiewicz-Korpanty et al. (2007) auszumachen. Dort lagen lediglich 29 % der Ergebnisse für die Verschlusszeit der gesunden Probanden nach zehntägiger Clopidogrelgabe oberhalb des Referenzbereiches für die CADP-Testkar- tusche. In einer weiteren Studie, in der 39 Patienten mit manifester kardiovaskulärer

(24)

Literaturübersicht

- 12 -

Erkrankung 75 mg Clopidogrel einmal täglich erhielten, wurden auch keine Verlänge- rungen der Verschlusszeiten mit der CEPI-Testkartusche festgestellt im Vergleich zu Patienten ohne plättchenhemmender Therapie (P > 0,200) (Müller et al., 2008). Die CADP-Testkartusche ergab bei keiner der Versuchsgruppen ein Ergebnis. Lediglich in der Versuchsgruppe, in der Clopidogrel mit ASS kombiniert wurde, gab es eine deutliche Verlängerung der CEPI-Verschlusszeit (P < 0,001), was auf den plättchenhem- menden Effekt der ASS zurückzuführen ist, da die Kombination der beiden Medika- mente das gleiche Ergebnis geliefert hat wie ASS alleine, so wie Müller et al. es schon in einer vorangegangenen Studie aus dem Jahre 2003 mit ähnlichem Versuchsaufbau festgestellt haben.

In der Tiermedizin liegen zum Hund die meisten Studien vor: In der Studie von Mischke und Keidel (2003) ist die Sensitivität des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100^® hinsichtlich Plättchenfunktionsstörungen beim Hund getestet worden. Bei Hunden mit von-Willebrand-Krankheit waren die Verschlusszeiten und das verbrauchte Probenvo- lumen mit der CADP-Testkartusche erhöht. Korrespondierend zu einigen Studien im Humanbereich (Homoncik et al., 2000; Müller et al., 2008) haben Mischke und Keidel (2003) ebenfalls festgestellt, dass auch beim Hund die CEPI-Testkartusche sensitiver auf ASS reagiert als die CADP-Testkartusche. Zusätzlich sind in der genannten Studie Referenzwerte für die CADP-Testkartusche (53–98 Sekunden) und für die CEPI-Test- kartusche (92–>300 Sekunden) erstellt worden. Vergleichbare Referenzwerte weist auch die Studie von Callan und Giger (2001) für die Verschlusszeit der CADP-Test- kartusche (52–86 Sekunden) und der CEPI-Testkartusche (97–225 Sekunden) auf.

Darüber hinaus haben Callan und Giger (2001) das Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100^® auch bei Hunden mit primären Plättchenfunktiosstörungen wie von-Wille- brand-Krankheit und Thrombozytopenie angewendet. Die Ergebnisse waren ver- gleichbar mit denen von Mischke und Keidel (2003). Die Verschlusszeiten bei von- Willebrand-Krankheit und Thrombozytopenie waren signifikant verlängert. Clancey et al. (2009) haben für die mittels CADP-Testkartusche gemessene Verschlusszeit beim Hund einen Referenzbereich von 48–79 Sekunden ermittelt. Darüber hinaus sind in dieser Studie Hunde mit Herzerkrankungen wie Klappendefekten, Aortenstenosen und allgemeinen Herzgeräuschen untersucht worden. Sie zeigten signifikant verlängerte

(25)

Literaturübersicht

- 13 -

Verschlusszeiten gegenüber gesunden Hunden (Clancey et al., 2009). Auch zur Katze liegen mittlerweile einige Studien zu Referenzwerten, möglichen Veränderungen bei Erkrankungen und Beeinflussung durch Plättchenfunktionshemmer vor (Jandrey et al., 2008; Ho et al., 2016). Bei Katzen mit HCM zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Verschlusszeit im Vergleich zu gesunden Katzen (Jandrey et al., 2008). Dazu wurden bei Jandrey et al. (2008) Blutproben von 30 Katzen mit HCM und von 42 gesunden Katzen untersucht und verglichen. Die mediane Verschlusszeit der gesunden Katzen lag bei 64 Sekunden und die der erkrankten Katzen bei 74 Sekunden. Darüber hinaus sind von den gesunden Katzen in dieser Studie für die CADP-Testkartuschen Referenzwerte (43–176 Sekunden) für Katzenblut erstellt worden. In einer weiteren Studie sind ebenfalls Referenzwerte (46–89 Sekunden) für Katzenblut für die CADP- Testkartusche des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100^® basierend auf den Blutproben von 46 gesunden Katzen erstellt worden (Ho et al., 2015). Die Arbeits- gruppe hat in einer aktuellen Arbeit auch einen deutlichen Effekt von Clopidogrel auf die Verschlusszeit der CADP-Testkartusche nachweisen können (Ho et al., 2016;

siehe 2.1.3).

2.1.4.2 Vollblut-Impedanz-Aggregometrie mit dem Multiplate^®-Analyser

Bei dem von Cardinal und Flower (1980) beschriebenen Testverfahren wird die Aggre- gation der Blutplättchen anhand einer Widerstandsänderung in Vollblut gemessen.

Hierzu wird eine Messeinheit mit zwei Elektroden in die Probe verbracht, an deren Oberfläche die Blutplättchen aggregieren (Calatzis, 2007). Der Multiplate^®-Analyser gehört zu diesen Messgeräten, die die Thrombozytenaggregation in verdünntem, mit Citrat bzw. Hirudin antikoaguliertem Vollblut bestimmt. Diverse Studien haben gezeigt, dass sowohl beim Menschen als auch beim Hund das mit Hirudin antikoagulierte Blut höhere Messsignale erzielt als Citratblut, so dass ersteres das Standardprobenmate- rial darstellt (Tóth et al., 2006; Kalbantner et al., 2010).

Die vom Gerät gemessene Widerstandsänderung wird in Form einer Kurve wiedergegeben. Der wichtigste Parameter, der sich davon ablesen lässt, ist die Fläche unter

(26)

Literaturübersicht

- 14 -

der Kurve („area under the curve“, AUC). Sie ist abhängig von den beiden anderen von der Kurve ablesbaren Parametern. Das sind die Geschwindigkeit („velocity“), sie spiegelt die Steigung der Impedanz über die Zeit wider, und die maximale Plättchenag- gregation (Marschner et al., 2012). Die unterschiedlichen Agonisten dienen unterschiedlichen Anwendungen. Der Multiplate^®-ADPTest detektiert die ADP-induzierte Plättchenaktivierung durch ADP-Rezeptor-Antagonisten wie zum Beispiel Clopidogrel.

Der Multiplate^®-ASPITest verwendet Arachidonsäure als Antagonisten. Mit ihm lässt sich die Cyclooxygenase-abhängige Plättchenaggregation bestimmen. Er reagiert sensitiv auf ASS, nichtsteroidale Antiphlogistika und andere Cyclooxygenasehemmer.

Der Multiplate^®-COLTest ist sensitiv auf Störungen der Kollagen-induzierten Plätt- chenaggregation (Marschner et al., 2012). Die Vollblut-Impedanz-Aggregometrie dient in der Humanmedizin nicht nur der Überwachung von plättchenhemmenden Thera- pien, sondern wird auch als Untersuchungsmethode zur Einschätzung von erworbe- nem und geerbten Plättchenfunktionsstörungen genutzt (Dyszkiewicz-Korpanty et al., 2005; Calatzis, 2007).

Auf Grund der oben genannten Einsatzmöglichkeiten der Vollblut-Impedanz-Aggrego- metrie wäre diese labordiagnostische Methode durchaus auch in der Tiermedizin ein- setzbar. Zur Anwendung des Multiplate^®-Analysers gibt es vereinzelte tiermedizinische Studien u. a. bei Hunden und Katzen. Kalbantner et al. (2010) haben sich mit der Er- stellung von Referenzwerten und der für die Messung von Hundeblut optimalen Ago- nistenkonzentration befasst. Für diese Spezies hat sich herausgestellt, dass sich die Agonisten ADP, Arachidonsäure und Kollagen in den optimierten Konzentrationen 10 μmol/l ADP, 1 mmol/l Arachidonsäure und 5 μg/ml Kollagen am besten eignen, da sie eine signifikante Plättchenaggregation induziert haben (Kalbantner et al., 2010). Die Studie von Marschner et al. (2012) befasste sich dagegen mit der Messung von unter- schiedlich antikoagliertem Hundeblut. Dabei untersuchten sie die Plättchenaggrega- tion von mit Citrat, Hirudin bzw. Heparin versetzte Blutproben von gesunden Hunden.

Die Agonistenkonzetrationen (6,5 µmol/l ADP, 0,5 mmol/l Arachidonsäure, 3,2 µl/ml Kollagen) wählten Marschner et al. (2012) nach empfohlenen Herstellerangaben. Bei den verwendeten Agonistenkonzentrationen erschien für Marschner et al. (2012) He- parin als das geeignetste Antikoagulanz zur Untersuchung von caninen Plasmaproben

(27)

Literaturübersicht

- 15 -

mittels Vollblut-Impedanz-Aggregometrie zu sein, da es bei den mit Hirudin versetzten Plasmaproben zu signifikanten spontanen Plättchenaggregation kam. Die Versuchs- reihe mit citrierten Plasmaproben wurde aufgrund niedriger Aggregation abgebrochen.

Weitere Studien befassten sich mit dem Einfluss der Testzeit und der Probenlagerung auf die Aggregometrie bei Hunden (Abid et al., 2013; Minde und Mischke, 2013).

Hinsichtlich der Anwendung des Multiplate^®-Analysers bei der Katze gibt es in der zu- gänglichen Literatur nur wenige Studien: Magee et al. (2014) haben Blut von 10 gesunden Katzen mit den humanen GP IIb/IIIa-Rezeptorantagonisten Eptifibatide bzw.

Abciximab versetzt und deren Auswirkung auf die ADP-induzierte Plättchenaggrega- tion (6,5 µmol ADP) getestet. Dabei konnte eine signifikante (P < 0,001) Hemmung der maximalen Plättchenaggregation durch Eptifibatide im Vergleich zum medianen Ba- salwert erzielt werden. Der Rezeptorantagonist Abciximab hatte keine Auswirkungen auf die maximale Plättchenaggregation. Eine weitere Studie befasste sich mit der Er- stellung von Referenzwerten für den Multiplate^®-Analyser bei der Katze (Ho et al., 2015). Dort wurde für den Parameter AUC Referenzwerte für die Agonisten ADP (11–

176 U), Arachidonsäure (59–129 U) und Kollagen (32–129 U) ermittelt. Hierbei wurden die Agonisten entsprechend der vom Hersteller für den Menschen empfohlene Kon- zentration eingesetzt. Die Blutproben stammten von einer unterschiedlichen Anzahl gesunder Katzen (53 für ADP, 50 für Arachidonsäure und 49 für Kollagen). In ihrer bereits angeführten weiteren Arbeit beschrieben Ho et al. (2016) die Auswirkungen der Behandlung mit Plättchenfunktionshemmern auf das Ergebnis des Multiplate^®-Analy- sers (siehe 2.1.3).

(28)

Literaturübersicht

- 16 -

2.2 Thrombingenerierung und ihre Rolle bei der Überwachung von Faktor Xa- Inhibitoren

2.2.1 Methode und Anwendung

Die TG ist eine alte und bewährte Labormethode in der Humanmedizin. Bei den kon- ventionellen Gerinnungstests Prothrombinzeit (PT) und aktivierte partielle Thrombo- plastinzeit (aPTT) sind zum Zeitpunkt der Gerinnselbildung lediglich ca. 5 % des gesamten Thrombins gebildet worden (Mann et al., 2003). Da die restlichen 95 % des Thrombins nicht erfasst werden, gehen weitere wichtige Informationen der Gerinnung verloren (Mann et al., 2003). TG-Tests erfassen die gesamten Ergebnisse der Interak- tionen zwischen Proteasen und Inhibitoren des Gerinnungssystems und sind dement- sprechend den physiologischen Bedingungen näher als PT bzw. aPTT (Wilkens, 2011).

Das Verfahren wird u.a. bei der Hämophiliediagnostik zum Abschätzen der Blutungs- neigung (Salvagno et al. 2009) und zum Abschätzen des Risikos einer wiederkehren- den Thrombose (Eichinger et al. 2008) angewendet. Darüber hinaus bietet die TG die Möglichkeit der Therapieüberwachung von Antikoagulanzien. So ist sie u. a. im Hin- blick auf die Überwachung der Heparintherapie (Al Dieri et al., 2004; Robert et al., 2009), Vitamin-K-Antagonisten (Altman et al., 2007), Plättchenaggregationshemmern (Altman et al., 2006), Hirudin (Samama et al., 2007) und direkten Thrombin- und Fak- tor-Xa-Inhibitoren (Boström et al., 2004; Gerotziafas et al., 2007) in verschiedenen in vitro Studien getestet worden. Abgesehen von Hirudin habe alle Antikoagulanzien im therapeutischen Bereich die Parameter der TG signifikant beeinflusst, so dass sich alle Autoren einig waren, dass sich die TG zur Überwachung von Antikoagulanzienthera- pien eignen würde (Al Dieri et al., 2004; Boström et al., 2004; Altman et al., 2006;

Altman et al., 2007; Samama et al., 2007; Gerotziafas et al., 2007; Robert et al., 2009) (siehe 2.2.3).

(29)

Literaturübersicht

- 17 -

Bei der nach Hemker et al. (2002) entwickelten Methode, der „Calibrated Automated Thrombography“ (CAT), wird bei der TG die Umsetzung eines fluorogenen thrombin- abhängigen Substrats nach Aktivierung mit einer bestimmten Konzentration an TF ermittelt. Dadurch wird die kontinuierliche Registrierung der Thrombinaktivität einer plätt- chenarmen Plasmaprobe ermöglicht. Für die Messungen sind derzeit 3 verchiedene TF-Konzentrationen (PPP [„platelet poor plasma“, plättchenarmes Plasma] Reagent 1 pM, PPP Reagent 5 pM, PPP Reagent 20 pM) kommerziell erhältlich.

Graphisch wird die TG mittels des Thrombogramms dargestellt, von dem sich die Pa- rameter Latenzzeit, endogenes Thrombinpotenzial (ETP), Thrombinpeak, Zeit bis zum Peak und Reaktionsdauer ableiten lassen (Abbildung 1). Die Latenzzeit beginnt mit dem Beginn der Messung bis zum Anstieg der Kurve und stimmt dabei gut mit der Gerinnungszeit überein. Das ETP stellt die Menge des aktiven Thrombins im Plasma dar, die potentiell bei der Aktivierung des Gerinnungssystems gebildet werden kann und entspricht der AUC (Hemker et al. 2006; Eichinger et al., 2008). Laut Wilkens (2011) spiegelt das ETP von den vielen Parametern der TG diese am besten wieder.

Der Thrombinpeak gibt die maximal produzierte Thrombinkonzentration wieder. Dem- entsprechend bezeichnet die Zeit bis zum Peak die Zeit vom Start der Messung bis zum Erreichen des Thrombinpeaks (Hemker et al. 2006). Die Gesamtdauer der TG wird durch den Parameter Reaktionsdauer wiedergegeben. Sie geht vom Start der Reaktion bis zum Abfall der Kurve hin zur Nulllinie (Hemker et al. 2006).

Chantarangkul et al. (2003) untersuchte den Einfluss verschiedener TF-Konzentratio- nen (1 pM–40 pM) auf das ETP bei klinisch gesunden Menschen und konnte zeigen, dass sich mit steigender TF-Konzentration von 1 pM auf 10 pM das ETP der TG zu- nächst um bis zu ca. 27 % erhöht. Ab einer TF-Konzentration von 10 pM gab es keinen weiteren Anstieg des ETP. Den gleichen Effekt konnten Chantarangkul et al. (2003) auch bei Patienten beobachten, die Antikoagulantien erhielten. Aufgrund dieser Ab- hängigkeit der TG von den verwendeten TF-Konzentrationen (Hemker et al., 2003) ist es schwierig eine internationale Vergleichbarkeit zu gewährleisten bzw. einheitliche Referenzwerte zu erstellen (Dargaud et al., 2007; van Veen et al., 2009). Dargaud et

(30)

Literaturübersicht

- 18 -

al. (2012) haben in ihrer internationalen Multi Center Studie versucht eine standardi- sierte Arbeitsanweisung für die TG nach der CAT-Methode zu evaluieren. Dafür untersuchten sie an verschiedenen Laboratorien gepoolte plättchenarme Plasmaproben von gesunden Individuen, Hämophilie A Patienten und von Patienten mit einer Vorge- schichte mit venöser Thromboembolie aufgrund von einer heterozygoten Prothrombin G20210A Mutation im Hinblick auf die intra-assay, inter-assay und inter-center Varia- bilität. Einen Teil der Ergebnisse verglichen sie mit zwei kommerziell hergestellten Re- ferenzplasmaproben. Als Vergleichsparameter wählten die Autoren das ETP. Die mediane intra-assay Variabilität war bei allen Plasmaproben unter 5,9 % und die inter- assay Variabilität unter 15,7 %. Die inter-center Variabilität lag zwischen 9,8–21,3 %.

Im Vergleich dazu lag die inter-center Variabilität der beiden Referenzplasmaproben zwischen 3,6–15 %. Fazit der Studie von Dargaud et al. (2012) war, dass sich die Variabilität der TG nach der CAT-Methode durch die Einhaltung einer normierten Ver- suchsdurchführung mit einheitlichen Gerätschaften, standardisierten Reagenzien, ein- heitlicher Handhabung des Probenmaterials und sorgfältig ausgesuchten Referenz- plasmaproben reduziert werden kann. Auch schon in einer früher erschienenen Studie gab es das Verlangen nach einer standardisierten Durchführung der TG (Gerotziafas et al., 2005). In ihrer Studie evaluierten sie die Präzision verschiedener TG-Parameter, indem sie plättchenreiche Plasmaproben von gesunden Menschen mit unterschiedlichen TF-Konzentrationen (0 pM–30 pM) versetzten und mit der TG untersuchten. Die intra-assay Variabilität lag dabei unter 9 % unabhängig welche TF-Konzentration verwendet wurde. Die inter-assay Variabilität war in Anwesenheit von TF gering. Stei- gende TF-Konzentrationen haben die inter-assay Variabilität nicht signifikant beeinflusst. Die in dieser Studie zusätzlich untersuchte inter-individuelle Variabilität war relativ hoch und lag zwischen 18–45 %. Gerotziafas et al. (2005) kamen zu dem Ent- schluss, dass die TG im plättchenreichen Plasma eine akzeptable Präzision hat mit geringer inter-assay und intra-assay Variabilität.

In der Tiermedizin ist die TG nach Kenntnis der Autorin als diagnostische Maßnahme noch nicht etabliert. Lediglich einzelne Studien befassten sich mit der Untersuchung der TG des Hundes (Allegret et al., 2011; Witten, 2011; Conversy et al., 2013; Dengate et al., 2016). Allegret et al. (2011) untersuchten die TG im caninen Plasma hinsichtlich

(31)

Literaturübersicht

- 19 -

der Einsetzbarkeit zum Monitoring der Therapie mit unfraktioniertem Heparin. Dafür haben sie Plasmaproben von 12 gesunden Beagles mit der CAT-Methode untersucht.

Sechs der Tiere erhielten eine bestimmte Menge an Heparin und die anderen 6 dienten als Kontrollgruppe. In dieser Studie wurde allerdings nur ein TF-Reagenz (PPP Rea- gent 5 pM) verwendet. Als Vergleichsparameter verwendeten sie das ETP. Das ETP war bei den Hunden, die Heparin erhielten im Median 38,5 ± 7,8 % geringer als bei den gesunden Hunden. Die intra-assay Variabilität für die gesunden Hunde lag bei ihnen für das ETP bei 7,1 % und die inter-assay Variabilität bei 12,9 %. Zusammen- fassend waren die Autoren der Meinung, dass sich die TG durchaus zur Überprüfung einer Heparintherapie bei Hunden eignen könnte. Die Effizienz der TG bei einer Lang- zeitgabe und höheren Dosierungen von Heparin müsste allerdings noch in weiterfüh- renden Studien evaluiert werden. Die Studie von Witten (2011) befasste sich neben technischen Aspekten mit der Erstellung von Referenzwerten für alle drei verfügbaren TF-Reagenzien (PPP Reagent 1 pM, PPP Reagent 5 pM, PPP Reagent 20 pM), wobei eine deutliche Streuung aller TG-Parameter bei allen TF-Konzentrationen auffiel. Dar- über hinaus befasste sich die Studie auch mit der TG bei Hunden mit Hypo- (Hämo- philie A und -B) und Hyperkoagulopathien (Morbus Cushing, entzündliche und tumor- öse Erkrankungen). Abgesehen von den hämophilen Hunden, wiesen Hunde mit Hy- perkoagulopathien im Vergleich zu gesunden Hunden ein erhöhtes ETP auf. Die Stu- die von Dengate et al. (2016) untersuchte den Unterschied der TG-Parameter zwischen gesunden Hunden und Hunden mit einer Thrombose. Dabei fanden sie heraus, dass die Parameter Thrombinpeak und ETP keinen signifikanten Unterschied aufwie- sen (P = 0,87; P = 0,24). Lediglich die Latenzzeit war bei Hunden mit Thrombose signifikant länger als bei den gesunden Hunden (P < 0,001). Eine weitere canine Studie verwendete die TG, um in vitro den antikoagulierenden Effekt des Faktor Xa-Inhibitors Rivaroxaban in caninem Plasma zu demonstrieren (Conversy et al., 2013). Dazu wurden gespikte Poolplasmaproben von 20 gesunden Beagles mit dem Fluorometer nach der CAT-Methode untersucht. Conversy et al. (2013) verwendeten dabei lediglich nur die mittlere der kommerziell verfügbaren TF-Konzentrationen (PPP Reagent 5 pM).

Das Testsystem reagierte sensitiv auf den Zusatz von Rivaroxaban, sodass sich die

(32)

Literaturübersicht

- 20 -

TG analog zum Menschen (Gerotziafas et al., 2007) für ein Monitoring einer Rivarox- abantherapie eignen würde (siehe 2.2.3).

Bezüglich der Anwendung der TG bei der Katze gibt es in der zugänglichen Literatur bislang keine Angaben. Da aber Antikoagulanzien eine wesentliche Rolle bei der Pro- phylaxe und Therapie von Aortenthrombosen bei der Katze spielen (Fuentes, 2012), könnte die TG bei der Etablierung wirksamer Antikoagulanzientherapien und der The- rapieüberwachung eine geeignete Labormethode darstellen.

2.2.2 Faktor Xa-Inhibitoren

Apixaban gehört neben Rivaroxaban zu einer Gruppe von neuen oralen Antikoagulan- zien, die in der Humanmedizin zur Thromboseprophylaxe eingesetzt werden. Sie zäh- len zu den direkten Inhibitoren des aktivierten Gerinnungsfaktors Xa (Perzborn et al., 2005; Wong et al., 2011). Sie hemmen in vitro sowohl die Aktivität von freiem Faktor Xa als auch an Prothrombinase und im Gerinnsel gebundenem Faktor Xa (Perzborn, 2010; Wong et al. 2011). Rivaroxaban ist für die Prophylaxe und Behandlung verschiedener thrombotischer Erkrankungen, wie der Prophylaxe von venösen Thromboembo- lien nach elektiven Hüft- und Kniegelenksoperationen, Therapie von tiefen Beinven- enthrombosen und systemischen Embolien entwickelt worden (Eriksson et al., 2009;

Turpie, 2010; EINSTEIN Investigators, 2010; EINSTEIN-PE Investigators, 2012). Api- xaban ist in Deutschland beim Menschen genauso wie Rivaroxaban für die Prophylaxe von venösen Thromboembolien nach elektiven Hüft- und Kniegelenksoperationen sowie zur Prophylaxe von Schlaganfällen, systemischen Embolien mit nicht valvulären Vorhofflimmern und des akuten Koronarsyndroms bei erwachsenen Patienten zuge- lassen (APPRAISE Steering Committee and Investigators, 2009, Granger et al, 2011, Connolly et al., 2011). Darüber hinaus erhielt Apixaban die Zulassung zur Behandlung und Prophylaxe der tiefen venösen Thrombosen und Lungenembolien (Agnelli et al., 2013).

(33)

Literaturübersicht

- 21 -

Diese neuen oralen Antikoagulanzien bedürfen aufgrund ihrer guten Verträglichkeit und vorhersehbaren Wirkung in aller Regel keiner routinemäßigen labordiagnostischen Überwachung (Heindl und Spannagl, 2009). Die Bestimmung der Anti-Faktor- Xa Aktivität ist aber ein zuverlässigerer Test im Vergleich zu den Gerinnungstests PT und aPTT, um die Anwesenheit dieser Antikoagulanzien im Blut zu überprüfen (Barret et al., 2010; Samama et al., 2012). Sie basiert auf einem Test mit einem chromogenen, Faktor Xa-spezifischen Substrat, dessen amidolytische Aktivität und damit das zu er- fassende Farbsignal umgekehrt proportional zur Konzentration an Faktor Xa-Inhibitor ist (Toschi und Lettino, 2011; Gehrie und Laposata, 2012).

In die klinische Tiermedizin haben die Faktor Xa-Inhibitoren bislang noch keinen Ein- zug erhalten. Es gibt lediglich experimentelle Studien bezüglich der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik. So haben Conversy et al. (2013) den antikoagulatorischen Effekt von Rivaroxaban in vitro in caninen Plasma untersucht. Sie haben Poolplasma von 20 gesunden Beagles mit verschiedenen Rivaroxabankonzentrationen versetzt und mit verschiedenen Hämostasetests (PT, aPTT, TG und Bestimmung der Anti- Xa- Aktivität) untersucht. Rivaroxaban hat in dieser Studie eine konzentrationsabhängige Verlängerung aller Gerinnungsparameter verursacht. In steigender Dosierung hat Ri- varoxaban die Parameter Latenzzeit und Zeit bis zum Thrombinpeak der TG erhöht und die Parameter Thrombinpeak und ETP erniedrigt. Es zeigte sich, dass die TG die sensitivste Labormethode war, gefolgt von der Anti-Xa-Aktivität und der PT und aPTT, um die antikoagulatorische Wirkung Rivaroxaban in Hundeblut zu erfassen (Conversy et al., 2013) Eine aktuelle Studie bei der Katze befasste sich mit der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von oral verabreichten Rivaroxaban (Dixon-Jimenez et al., 2016). Sechs gesunde Katzen erhielten pro Versuchsdurchlauf entweder 1,25 mg, 2,5 mg oder 5 mg Rivaroxaban über verschiedene Zeiträume (3 Tage, 7 Tage, 28 Tage).

Die in dieser Studie verwendeten Hämostasetests (verdünnte Prothrombinzeit, aPTT und Bestimmung der Anti-Xa-Aktivität) zeigten auch hier eine konzentrationsabhän- gige Verlängerung der Gerinnungsparameter. Am verlässlichsten zeigte sich auch hier die Anti-Xa-Aktivität. Darüber hinaus zeigte die Studie, dass Rivaroxaban in einer beim Menschen für Thromboseprophylaxe effektiven Plasmakonzentration von der Katze gut vertragen wird.

(34)

Literaturübersicht

- 22 -

Apixaban wurde im Vorfeld für die Zulassung in der Humanmedizin bei Ratten, Kanin- chen und Hunden getestet (Zhang et al., 2009; He et al., 2011). In diesen Studien erwies sich Apixaban als gut verträglich mit einer langsamen Clearance und guter oraler Bioverfügbarkeit in Ratte und Hund mit ungefähr 50 % und mehr (He et al., 2011).

Eine Ausnahme bildete das Kaninchen. Bei dieser Spezies lag die Bioverfügbarkeit lediglich bei 3 %, da die Apixaban Plasmakonzentration sehr schnell abfällt (T1/2 = 0,6 Std) (Zhang et al., 2009). Diese guten Eigenschaften beim Hund und eingeschränkt bei der Ratte veranlassten Myers et al. (2015) die Pharmakokinetik und Pharmakody- namik von Apixaban bei Katzen zu testen, da Antikoagulanzien zur Therapie und Pro- phylaxe von feliner Aortenthrombosen eine wichtige Rolle spielen und Apixaban eine Alternative zu den sonst gebräuchlichen Medikamenten darstellt. Fünf klinisch gesunde Katzen haben eine einmalige Dosis von 0,2 mg/kg Apixaban oral verabreicht bekommen. Die Blutentnahmen erfolgten einmal vor der Medikamentengabe und 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 und 1440 Minuten danach. Die Pharmakokinetik wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmt und die Pharmakodyna- mik über die Messung der Faktor Xa-Aktivität ermittelt. Die Studie hatte zum Ergebnis, dass Apixaban nach einmaliger Gabe von 0,2 mg/kg oral bzw. intravenös an 5 gesunden Katzen den Faktor Xa zuverlässig hemmt. Die Faktor Xa-Aktivität korrelierte dabei umgekehrt proportional mit der Apixabanplasmakonzentration. 360 Minuten nach einmaliger Gabe von Apixaban war die Faktor Xa-Aktivität wieder auf ihre Ausgangsakti- vität zurückgekehrt. Die pharmakokinetischen Ergebnisse dieser Studie zeigten nach oraler Gabe eine mittelgradige Elimination (48,6 ml/min), kurze Halbwertszeit (198,5 min) und ebenso eine hohe Bioverfügbarkeit (85,5 %) bei Katzen im Vergleich zu oben genannten Spezies und dem Menschen (Bioverfügbarkeit 60 %; Zhang et al., 2009;

Frost et al, 2013). Es bleibt allerdings noch zu klären, inwieweit Apixaban und andere Faktor Xa-Inhibitoren bei mehrmaliger Verabreichung für Katzen verträglich und sicher sind und ob sie sich in klinischen Studien als effektiv zur Prophylaxe und Therapie von thromboembolische Erkrankungen erweisen.

(35)

Literaturübersicht

- 23 -

2.2.3 Einfluss der Faktor Xa-Inhibitoren auf die Parameter der Thrombingene- rierung

Mit der TG lassen sich eine Vielzahl von Antikoagulanzien wie Vitamin-K Antagonisten, Heparine, Hirudin, FIIa- und FXa-Inhibitoren erfassen (Tripodi et al., 2007; Wilkens 2011). Obwohl die Faktor Xa-Inhibitoren in aller Regel kein Monitoring benötigen, ist es dennoch wünschenswert eine verlässliche Methode zur Überwachung zu haben (Heindl und Spannagl, 2009). So wurde in diversen in vitro Studien der inhibitorische Effekt der direkten Faktor Xa-Inhibitoren Rivaroxaban und Apixaban auf die TG in hu- manem plättchenarmen bzw. plättchenreichen Plasma untersucht (Gerotziafas et al., 2007; Wong et al., 2013; Tripodi et al., 2015). In allen Studien konnte ein dosisabhän- giger Effekt auf die Parameter der TG ermittelt werden. Tripodi et al. (2015) haben dafür Poolplasmaproben von 20 gesunden Personen mit unterschiedlichen Konzent- rationen an Apixaban (0, 10, 20, 50, 100, 200, 500 und 1000 ng/ml) gemischt und mit der TG nach der CAT-Methode gemessen. Zur Aktivierung der Gerinnung verwendeten die Autoren TF in einer Konzentration von 1 pM. Mit steigenden Apixabankonzent- rationen wurden das ETP und der Thrombinpeak gemindert und die Latenzzeit verlän- gert. Dabei war das ETP bei einer Apixabankonzentration von 200 ng/ml um 28 % erniedrigt im Vergleich zu 0 ng/ml Apixaban. Der Thrombinpeak verringerte sich im Vergleich zum ETP um 58 %. Zusätzlich zu der TG haben Tripodi et al. (2015) auch den antikoagulatorischen Effekt von Apixaban auf die PT und aPTT untersucht und kamen zu dem Entschluss, dass die TG die sensitivere Labormethode im Hinblick auf Apixaban ist. Wong et al. (2013) fanden in ihrer Studie heraus, dass die TG-Parameter, die im Zusammenhang mit der direkten Thombinbildung stehen, sensitiver sind als das ETP. Dafür untersuchten sie in ihrer Studie den inhibitorischen Einfluss der Antikoa- gulanzien Apixaban und Rivaroxaban auf alle Parameter der TG. Für ihre Untersu- chung versetzten sie gepoolte plättchenarme humane Plasmaproben mit aufsteigen- den Konzentrationen (0,01–10 µM) des jeweiligen Faktor Xa-Inhibitors. Beide zeigten sie die Eigenschafte die Latenzzeit und die Zeit bis zum Thrombinpeak dosisabhängig

(36)

Literaturübersicht

- 24 -

zu verlängern und das ETP zu erniedrigen. In der vorangegangenen Studie von Ge- rotziafas et al. (2007) wurden unter gleichen Bedingungen plättchereiche Blutplasma- proben mit unterschiedlichen Konzentrationen das Faktor Xa-Inhibitors Rivaroxaban (0–700 nM) vermischt und die Parameter der TG untersucht. Auch Rivaroxaban er- niedrigte das ETP mit steigender Blutplasmakonzentration. Neben dem ETP wurden in dieser Studie auch die Latenzzeit und der Thrombinpeak berücksichtigt. Die Latenz- zeit verlängerte sich dosisabhängig und reagierte wie die Thrombinbildungszeit (Thrombinpeak/Zeit bis Thrombinpeak-Latenzzeit) sensitiver auf die Hemmung des Faktors Xa durch Rivaroxaban als das ETP (Gerotziafas et al., 2007). Eine 50 %-ige Reduktion des ETP wurde schon mit 35 nM Rivaroxaban erreicht und eine fast kom- plette Hemmung (90 %) bei einer Konzentration von 100 nM Rivaroxaban. Es fiel aber auch auf, dass die Rivaroxabankonzentration, die benötigt wurde, um die Latenzzeit zu verdoppeln 3,5fach niedriger war als die Konzentration für eine 50 %-ige Reduktion des EPTs. In einer weiteren in vitro Studie wurde die Wirkung des direkten Faktor Xa- Inhibitors Otamixaban in gepoolten plättchenarmen Plasmaproben auf die TG untersucht (Bloemen et al., 2012). Für die Aktivierung der TG wählten sie eine TF-Konzent- ration von 5 pM. Die von den Autoren ausgewählte Konzentration von 200 nM hatte einen starken inhibitorischen Effekt auf den Thrombinpeak und einen weniger starken auf das ETP. Auch sie kamen unabhängig von den zuvor genannten Studien zu dem Ergebnis, dass das ETP weniger sensitiv auf den Faktor Xa-Inhibitor reagiert als z. B.

der Parameter Thrombinpeak.

In wie weit sich die TG bzw. einzelne Parameter der TG für die Überwachung von Faktor Xa Inhibitoren eignet, muss noch in vivo bestätigt werden. Die in vitro Studien zeigen aber auf, dass die TG durchaus das Potential dazu hat.

(37)

Material, Tiere und Methoden

- 25 - 3. Material, Tiere und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Geräte und Bezugsquellen

Aesculap Suhl GmbH, Suhl

 GT 420, Schermaschine

 GT 608, Scherkopfaufsatz

Beckmann Coulter GmbH, Krefeld

 Allegra™ Centrifuge, Kühlzentrifuge

Eppendorf AG, Hamburg

 Reference^® variabel, 10–100 µl Kolbenhubpipette

 Reference^® variabel, 200–1000 µl Kolbenhubpipette

 Centrifuge 5418, Mikrozentrifuge

Hettich Zentrifugen, Tuttlingen

 Haematokrit 210, Hämofuge

Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach

 Wasserbad

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

 Cobas C311 Roche Hitachi, Analyseautomat

 Multiplate^®-Analyser, Impedanz-Aggregometer

(38)

- 26 - Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn

 Advia 120 Hematology System

 PFA-100^®, Analysegerät für Thrombozytenfunktionstests

Tem International GmbH, München

 ROTEM^® delta, Gerät zur Messung der Rotationselastometrie

Thermo Scientific, Schwerte

 Fluoroskan Ascent Fluorometer, Gerät zur Messung der Thrombingenerierung

Trinity Biotech, Lemgo

 Amax Destiny Plus, Gerinnungsautomat

3.1.2 Reagenzien und Bezugsquellen

B. Braun Melsung AG, Melsung

 Isotone Kochsalzlösung 0,9 % (Natriumchloridlösung, NaCl)

 Softasept^® N Hautdesinfektion

Diagnostica Stago S.A.S., Asnières sur Seine Cedex, Frankreich

 C.K. Prest^®: gepufferte Kaolinsuspension (Aktivator 5 mg/ml), lyophilisiertes Cephalin (Plättchenersatz) aus Kaninchenhirngewebe (Reagenz zur Messung der aPTT)

 STA Calciumchlorid 0,025 mol/l (Startreagenz zur Messung der aPTT)

Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen

 Coamatic Heparin Test (Testkit zur Messung der Anti-Xa-Aktivität)

 Humanfibrinogen, lyophilisiert, zur Herstellung einer Fibrinogenlösung für die modifizierte Messung der PT

(39)

- 27 - Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

 Multiplate^® ADPtest (Adenosindiphosphat)

 Multiplate^® COLtest (Kollagen)

 Multiplate^® ASPItest (Arachidonsäure)

Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg

 Thromborel^® S, Reagenz zur Messung der PT

 Imidazol Puffer, Reagenz zur Messung der PT

Technoclone GmbH, Vienna, Austria

 TECHNOVIEW Apixaban Calibrator (CAL 1 0 ng/ml)

 TECHNOVIEW Apixaban Calibrator (CAL 2 ~50 ng/ml)

 TECHNOVIEW Apixaban Control High (CONT H ~300 ng/ml)

 TECHNOVIEW Apixaban Control Low (CONT L ~120 ng/ml)

 Star-tem^® (Enthält 0,2 mol/l CaCL2 in HEPES Puffersubstanz pH 7,4 und 0,1

% Natriumazid; Reagenz zur Rekalzifizierung von Citratblut oder -plasma.)

 In-tem^® (Enthält partielles Thromboplastin/Phospholipid [aus Kaninchenhirn]

und Ellagsäure. Dies führt über die Kontaktphase zur Aktivierung des intrinsischen Gerinnungssystems.)

 Ex-tem^® (Enthält Gewebethromboplastin [Tissue Factor], welches zur Aktivie- rung des extrinsischen Gerinnungssystems führt.)

(40)

- 28 - Thrombinoscope BV, Maastricht, Niederlande

 FluCa-Kit: „Fluo-Substrate“, fluorogenes Substrat gelöst in DMSO, „Fluo-Buf- fer“ enthält HEPES (pH 7,35) und Calciumchlorid, fluorogenes Substrat zur Messung der Thrombingenerierung

 PPP-Reagent LOW, Gewebethromboplastin-haltige Lösung (1 pmol/l) und 4 µmol/l Phospholipide zur Initiierung der Thrombingenerierung in PPP

 PPP-Reagent 5pM, Gewebethromboplastin-haltige Lösung (5 pmol/l) und 4 µmol/l Phospholipide zur Initiierung der Thrombingenerierung in PPP

 PPP-Reagent HIGH, Gewebethromboplastin-haltige Lösung (20 pmol/l) und 4 µmol Phospholipide zur Initiierung der Thrombingenerieung in PPP

 Thrombin-Calibrator, Thrombinkalibrator, enthält Citratpuffer, bovines Protein und Saccharide

3.1.3 Verbrauchsmaterialien und Bezugsquellen

Eppendorf AG, Hamburg

 Plastibrand^® Pipettenspitzen 50-1000 µl

 Plastibrand^® Pipettenspitzen 2-100 µl

 Standard Reaktionsgefäße 3810X (1,5 ml)

 Standard Reaktionsgefäße 3810X (1,5 ml), grün (ADPtest Aliquotgefäße)

 Standard Reaktionsgefäße 3810X (1,5 ml), gelb (COLtest Aliquotgefäße)

 Standard Reaktionsgefäße 3810X (1,5 ml), rot (ASPItest Aliquotgefäße)

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

 Multiplate^® Messzellen

Sarstedt, Nümbrecht

 Mikro-Probengefäß 1,3 ml, mit Eindrückstopfen, Lithium-Heparin (35 I.E./ml)

 Mikro-Probengefäß 1,3 ml, mit Eindrückstopfen, Kalium-EDTA (1,6 mg/ml)

 Probengefäß Coagulation 9 NC/2 ml, Tri-Natriumcitrat (0,106 mol/l, 3,2%)

(41)

- 29 -

 S-Monovette^®, 3,8 ml, Probengefäß mit Tri-Natriumcitrat/Citronensäure-Puffer- lösung (0,129 mol/l, pH 5,5) für PFA

 S-Monovette^®, 2,7 ml, Probengefäß mit 0,045 mg Hirudin pro Milliliter Blut

Sartorius Biohit, Helsinki, Finnland

 Optifit Tip, Pipettenspitzen (Zubehör für Multiplate^®-Analyser und ROTEM^®)

Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn

 DADE^® PFA Druckpapier, B4170-71

 DADE^® PFA Farbband, B4170-72

 DADE^® PFA O-Ringe, B4170-78

 DADE^® PFA Initialisierungszellen, B4170-74

 DADE^® PFA Vakuum-Messzelleneinsatz, B4170-75

Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Marburg

 DADE^® PFA Collagen/ADP Test Cartridge (mit Kollagen und Adenosindiphos- pat)

 DADE^® PFA Collagen/EPI Test Cartridge (mit Kollagen und Epinephrin)

 Cups & Pins (ROTEM^®-Messzellen bestehen aus Pin oder Sensor und Cup oder Küvette)

 Tip Tray eLine (Spitze für die automatische Pipette)

 Filter eLine Pack 50 (Filter für die automatische Pipette)

Terumo Europe N.V, Leuven, Belgien

 Neolus^® Einmalkanülen 0,8 x 40 mm (21G 1 ½“) (grün)

 Neolus^® Einmalkanülen 0,7 x 30 mm (22G x 1 ¼“) (schwarz)

(42)

- 30 - Thermo Scientific, Schwerte

 Immulon 2 HB-96-Well Mikrotiterplatten

3.1.4 Medikamente und Bezugsquellen

ALIUD^® PHARMA GmbH, Laichingen

 Clopidogrel 75 mg

Bristol-Myers Squibb/Pfizer EEIG, Uxbridge, Middlesex, Großbritannien

 Eliquis^® 2,5 mg (Apixaban)

Kreuz-Apotheke, Arzneimittelherstellung und –analytik, Seelze

 Clopidogrel Kapseln 10 mg

3.2 Tiere

In der Studie wurde an insgesamt 61 klinisch gesunden Katzen der Rasse Europäisch Kurzhaar Untersuchungen durchgeführt. Von den Katzen wurden einige Tiere mehrfach für die Versuchsreihen herangezogen. Die Katzen stammten aus dem Besitz des Instituts für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover, wo die Tierhaltung in Gruppen in Gehegen erfolgte. Bei den Tieren, die mehrfach eingesetzt wurden, wurde eine Pause zwischen den Untersuchungen von mindestens fünf Wochen ein- gehalten. Die Tiere waren von unterschiedlichem Geschlecht und teilweise kastriert.

Das Alter lag zwischen 6 Monaten und 10 Jahren und 7 Monaten und das Körperge- wicht lag zwischen 2,3 und 6,4 kg. Während des Untersuchungszeitraums erfolgte die Haltung in Einzelboxen mit freiem Zugang zu Wasser und Katzentoilette. Die Fütterung richtete sich nach den Blutentnahmeintervallen. Zwölf Stunden vor Versuchsbeginn wurde das Futter entzogen.