Vorbereitung der Tiere

Die Katzen wurden vor den Blutprobenentnahmen jeweils über einen Zeitraum von 12 Stunden nüchtern gehalten. Vor der Durchführung der Blutentnahme zur Erstellung der Referenzwerte bzw. vor deren Verwendung für die Hauptversuche wurden die Kat-zen klinisch allgemeinuntersucht, um den Gesundheitszustand festzustellen. Darüber hinaus wurde noch einmalig eine sonographische Untersuchung des Herzens durch-geführt, um eine Herzerkrankung ausschließen zu können. Zudem wurde zur Verifizie-rung des Gesundheitsstatus eine labordiagnostische Untersuchung (Blutbild, klinisch-chemisches Profil) durchgeführt.Nach Ende der jeweiligen Prozedur wurden die Kat-zen wieder in die Versuchstierhaltung des Institutes für Parasitologie integriert.

3.4.2 Blutentnahmen

Die Blutentnahmen erfolgten durch Venenpunktion mit Einmalkanülen (Ø 0,8 x 40 mm bzw. Ø 0,7 x 30 mm) an leicht gestauten peripheren Venen (Vena cephalica ante-brachii, Vena femoralis). Die Punktionsstelle wurde vor der Blutentnahme rasiert und mit einem alkoholischen Desinfektionsmittel desinfiziert. Bevor die Katzen an den ein-zelnen Versuchsteilen teilgenommen haben, wurde ihnen zur Anfertigung des roten Blutbildes und zur Überprüfung der wichtigsten klinisch-chemischen Parameter jeweils ein mit Lithium-Heparin (35 I.E./ml) und ein mit Kalium-EDTA (1,6 mg/ml) beschicktes 1,3 ml-Probengefäß bis maximal zur Marke 0,65 ml abgenommen. Die Blutentnahmen der 59 Katzen für die Referenzwertbestimmung erfolgte derart, dass einmal 3 Proben-gefäße mit Tri-Natriumcitrat-Lösung (0,106 mol/l) bis zur Marke 2 ml befüllt und in ei-nem zweiten Durchlauf 14 Tage später ein weiteres Probengefäß mit

Tri-Natriumcitrat-Material, Tiere und Methoden

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Lösung bis zur Marke 2 ml und ein weiteres Probengefäß mit Tri-Natriumcitrat/Citro-nensäure-Puffer-Lösung (0,129 mol/l) bis zur Marke 3,8 ml befüllt wurde. Das aus den insgesamt 4 Röhrchen mit Tri-Natriumcitrat-Lösung gewonnene Plasma (s.u.) wurde später für die Referenzwertermittlung der Thrombingenerierung verwendet und das mit gepufferter Citratlösung antikoagulierte Blut für das Plättchenfunktionsanalysegerät.

Die Blutentnahme für den Vorversuch mit dem Impedanz-Aggregometer Multiplate^® -Analyser erfolgte separat. Dafür wurden von 8 Katzen jeweils 2 mit Hirudin beschickte Probengefäße (0,045 mg Hirudin/ml Blut) bis zur Marke 2,7 ml abgenommen.

Im Hauptversuch des ersten Studienteils wurde den Katzen jeweils zu den definierten Entnahmezeitpunkten ein Probengefäß mit Tri-Natriumcitrat/Citronensäure-Puffer-Lö-sung bis zur Marke 3,8 ml und ein mit Hirudin beschicktes Probengefäß bis zur Marke 2,7 ml abgenommen. Im Hauptversuch des zweiten Teils der Studie zur Auswirkung von Apixaban wurden den Katzen pro Entnahmezeitpunkt 2 mit Tri-Natriumcitrat-Lö-sung beschickte Probengefäße bis zur Marke 2 ml abgenommen. Nach jeder Blutpro-benentnahme wurde jedes Probengefäß nach sofortigem Verschluss mehrfach vor-sichtig geschwenkt und gegebenenfalls zeitnah Plasma durch Zentrifugation gewon-nen.

3.4.3 Probenbehandlung

Die EDTA-Blutproben für das rote Blutbild wurden innerhalb von einer Stunde direkt am Hämatologiesystem Advia 120 und das nach Zentriguieren für 2 Minuten bei 14000 Umdrehungen pro Minute (ca. 16000 x g) gewonnene Lithiumheparinat-Plasma wurde mittels der vollautomatisierten Analyseautomaten Cobas C311 mit kommerziellen Re-agenzienkits und humanem Universalkalibrator untersucht.

Die für die Plättchenfunktionsanalyse entnommenen gepufferten Citratblutproben wur-den innerhalb von 2 Stunwur-den nach Blutprobenentnahme mittels des Plättchenfunkti-onsanalyegerätes PFA-100^® analysiert. Das Citratblut wurde unmittelbar nach Blutent-nahme für die Messung der Thrombelastometrie mit Hilfe des Gerätes ROTEM^® delta eingesetzt. Bei der Messung der Thrombozytenaggregation mittels des Impedanz-Ag-gregometers Multiplate^®-Analyser wurde die Hirudin-Vollblutprobe in einem Zeitraum

Material, Tiere und Methoden

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von ca. 15 bis 45 Minuten analysiert. Die restlichen Citratblutproben wurdenbei 3500 Umdrehungen pro Minute (ca. 4900 x g) für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das übstehende Plasma wurde abpipettiert, in Kunststoff-Reaktionsgefäße überführt und er-neut bei 4000 Umdrehungen pro Minute (ca. 6400 x g) für 10 Minuten bei 4°C zentri-fugiert. Das so gewonnene, annähernd plättchenfreie Plasma wurde abpipettiert und ggf. pro Tier und Probenzeitpunkt gepoolt. Das annähernd plättchenfreie Plasma wurde je nach Studienteil in Aliquots à 1000 µl bzw. 500 µl aufgeteilt und anschließend vollständig bei -80°C gefrierkonserviert. Kurz vor den jeweiligen Messungen wurden die entsprechenden Proben im Wasserbad bei 37°C aufgetaut.

3.5 Labormethoden

3.5.1 Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100^®

Die Messung mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100^® erfolgte innerhalb von 15 Minuten bis 2 Stunden nach Blutentnahme mittels austauschbarer CADP-Test-kartuschen oder CEPI-TestCADP-Test-kartuschen. Für eine Messung wurden 800 µl der felinen gepufferten Citratblutprobe in das dafür vorgesehene Reservoir einer zuvor in das Ge-rät eingesetzten Testkartusche überführt. Die Plättchenfunktionsanalyse wurde nur in einem der beiden Testkanäle durchgeführt, da es zu einer Sedimentation der Erythro-zyten in der Blutprobe, die gerade nicht gemessen wird, kommen kann, wenn sich zwei mit Blutproben beschickte Testkartuschen gleichzeitig im Gerät befinden. Eine Mes-sung dauerte maximal 30 Minuten. Die Thrombusbildung wurde als Funktion der Zeit gemessen, die benötigt wurde, die Membranöffnung innerhalb der Testkartuschen zu verschließen (Verschlusszeit). Darüber hinaus wurde auch das verbrauchte Proben-volumen bis zum Erreichen des Verschlusses der Kapillaröffnung gemessen (Gesamt-volumen).

Material, Tiere und Methoden

- 35 - 3.5.2 Multiplate^®-Analyser

Innerhalb von ca. 15 bis 45 Minuten nach Blutentnahme wurde die Hirudinblutprobe gemäß Herstellerangaben mit dem modernen Impedanz-Aggregometer Multiplate^® -Analyser untersucht. Zuerst wurden 300 µl einer auf 37°C vorgewärmten NaCl-Lösung in das Probenreservoir der Messzelle pipettiert. Anschließend wurden 300 µl der mit Hirudin antikoagulierten Blutprobe hinzugefügt und die Mischung bei 37° C für drei Minuten unter stetigem Mischen mittels eines Teflon-überzogenen Magnetrührstabes bei 800 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden 20 µl des entsprechenden Agonisten, z. B. ADP, Arachidonsäure oder Kollagen, hinzugefügt und die Messung sofort gestartet. Eine Messung dauerte 12 Minuten.

Die Ergebnisse werden als willkürliche Einheit “aggregation units” (AU) vom Gerät aus-gegeben, welche den Anstieg des elektrischen Widerstands während der Messung widerspiegeln. Die sich daraus ergebenden Messgrößen sind die Fläche unter der Kurve AUC (AUxmin), die maximale Plättchenaggregation und die velocity (AU/min), die die Steigung der Impedanz über die Zeit widerspiegelt.

3.5.3 Thrombingenerierung

Die Messung erfolgte mit dem Fluoroskan Ascent™ Fluorometer (Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland) nach der von Hemker et al. (2002) entwickelten CAT-Me-thode. Dabei wird die Umsetzung eines fluorogenen Substrats unter Einfluss einer be-stimmten Konzentration an TF ermittelt. Die kontinuierliche Registrierung der Throm-binaktivität einer Plasmaprobe wird dadurch ermöglicht.

Für die Untersuchung der TG in plättchenarmem Plasma stehen die drei TF-Reagen-zien PPP Reagent 1 pM, PPP Reagent 5 pM und PPP Reagent 20 pM zur Verfügung.

Die lyophilisierten Reagenzien mussten vor Verwendung in jeweils 1 ml destilliertem Wasser gelöst werden. Der Thrombin Calibrator ist ebenfalls lyophilisiert, wurde auf demselben Weg vorbereitet und wies laut Herstellerangaben nach Rekonstitution eine Aktivität von 650 nmol/l auf. Die Reagenzien und der Kalibrator wurden in Aliquots von 250 µl aufgeteilt und bis zur Messung bei -80° C gelagert. Zum Starten der Reaktion

Material, Tiere und Methoden

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war ein fluorogenes Substrat („FluCa-Kit“) notwendig. Diese Lösung bestand aus einer definierten Menge „Fluo-Substrat“ und „Fluo-Buffer“ und musste vor jeder Messung frisch angesetzt werden. Entsprechend dem nach Herstellerangaben vorgegebenen Mischungsverhältnis wurden gemäß dem für einen Testdurchlauf benötigten Bedarf 7,5 µl Substrat in 300 µl Puffer gelöst.

Die Ermittlung der Fluoreszenz erfolgte bei einer Exzitationswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm auf dem Grund einer 96-Well Rundbo-den-Mikrotiterplatte. Das Messintervall betrug 20 Sekunden und die Messung an sich dauerte je nach Testdurchlauf 20–45 Minuten (Referenzwerterstellung: 20 min, Apix-aban-Versuch: 0 Std-Wert: 20 min, 2 Std-Wert: 45 min, 4 Std-Wert: 35 min, 6 Std-Wert:

30 min, 8 Std-Wert: 30 min). Zwölf Wells der Platte wurden für einen Testdurchlauf benötigt. Jede Messung wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt. In die ersten drei Wells einer horizontalen Reihe der Mikrotiterplatte kam der Thrombin Calibrator, in die nächsten drei das PPP Reagent 1 pM, dann das PPP Reagent 5 pM und in die letzten drei das PPP Reagent 20 pM. Zusätzlich wurden in jedes der zwölf Wells 80 µl der Plasmaprobe pipettiert. Nach zehn Minuten Inkubationszeit im Inneren des Gerä-tes bei 37° C wurden jeweils 20 µl des fluorogenen Substrats manuell mittels einer Mehrfachpipette hinzugefügt, angefangen bei den Wells mit dem Kalibrator, dann PPP Reagent 1 pM, PPP Reagent 5 pM und PPP Reagent 20 pM, um die Reaktion zu starten. Unmittelbar im Anschluss wurde der Messvorgang am PC in der TG-Software manuell gestartet. Nach Beendigung der Messung wurden die Daten von der TG-Soft-ware verarbeitet und eine TG-Kurve mit den Parametern Latenzzeit, Thrombinpeak, ETP, Zeit bis zum Peak und Reaktionsdauer erstellt. Eine automatische Zusammen-fassung der Messwerte der 3-fach-Bestimmung durch Angabe von Mittelwert und Standardabweichung wurde von der TG-Software bereitgestellt. Für die darauffolgen-den statistischen Auswertungen wurdarauffolgen-den die Rohdaten in eine Excel-Arbeitsmappe ex-portiert.

Material, Tiere und Methoden

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Abbildung 1: Thrombogramm: Darstellung einer charakteristischen felinen Thrombingene-rierungskurve gemessen mit PPP Reagent 5 pM (dünne Kurven: drei Einzelmessungen, dicke Kurve: vom Gerät berechneter Mittelwert der drei Einzelmessungen). Aus der Kurve können die Parameter Latenzzeit (a), Thrombinpeak (b), endogenes Thrombinpotential (ETP) (c), Zeit bis zum Peak (d) und Reaktionszeit (e) abgeleitet werden.

3.5.4 ROTEM (Thrombelastometrie)

Die Thrombelastometrie wurde mit dem Gerät ROTEM^® delta laut Herstellerangaben mit Citrat antikoaguliertem Vollblut durchgeführt. Hierfür wurden mit Hilfe der zum Ge-rät zugehörigen automatischen Pipette und dem vorgegebenen Pipettierprogramm 20 µl eines rekalzifizierenden Reagenzes (Star-tem^®: enthält 200 mmol/l Calciumchlorid) und 20 µl des entsprechenden Aktivators (In-tem^®: enthält partielles Thromboplas-tin/Phospholipid und Ellagsäure als Kontaktaktivator; Ex-tem^®: enthält Gewebethrom-boplastin) in die auf 37° C vorgewärmte Messküvette überführt. Bevor die abschlie-ßend hinzugefügten 300 µl der Citratblutprobe aus dem Probenröhrchen abpipettiert wurden, wurde dieses erneut vorsichtig geschwenkt, um mögliche Sedimentationen zu

Material, Tiere und Methoden

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resuspendieren. Die Reaktion startet automatisch nach Zugabe des Blutes und wurde über insgesamt zwei Stunden registriert. Von den automatisch ausgewerteten Para-metern wurden folgende berücksichtigt: die Gerinnungszeit (Clotting Time, CT in Se-kunden), die Gerinnselbildungszeit (Clot Formation Time, CFT in SeSe-kunden), die Ge-rinnselfestigkeit (Maximum Clot Firmness, MCF in Millimeter) und die Maximale Lyse (Maximum Lysis, ML in Prozent).