Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zum transepithelialen Calcium-Transport
beim Schaf
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Mirja Rosmarie Wilkens aus Nienburg
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. B. Schröder
Physiologisches Institut
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. B. Schröder
2. Gutachter: Prof. Dr. H. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2006
Wilkens M., C. Kunert-Keil, G. Breves u. B. Schröder (2006):
Expression of the epithelium calcium channels TRPV5 and TRPV6 in sheep Vortrag, 60. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie
21. - 23.03.06 in Göttingen
Wilkens M., C. Kunert-Keil u. B. Schröder (2006):
Expression of the epithelial Ca2+ channels TRPV5 and TRPV6 in ovine Ca2+ trans- porting tissues
Poster, 85. Tagung der Deutschen Physiologischen Gesellschaft (DPG) 26. - 29.03.06 in München
Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis VIII Tabellenverzeichnis XII
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 2
2.1 Bedeutung und Regulation der Calcium-Homöostase 2
2.1.1 Calcitriol 2
2.1.2 Parathormon (PTH) 4
2.1.3 Calcitonin 4
2.2 Transepithelialer Calcium-Transport: Mechanismen 6
2.2.1 Parazellulärer Calcium-Transport 6
2.2.2 Transzellulärer Calcium-Transport 7
2.2.2.1 Einstrom über die apikale Membran durch TRPV-Kanäle 8 2.2.2.2 Transport durch das Cytosol mittels Calbindin 9 2.2.2.3 Ausschleusung über die basolaterale Membran 9
2.2.2.4 Transcaltachia 10
2.3 Calcium-Resorption in der Niere 10
2.3.1 Passive Calcium-Resorption 10
2.3.2 Aktive Calcium-Resorption 11
2.3.3 Besonderheiten beim Wiederkäuer 12
2.4 Calcium-Resorption im Gastrointestinaltrakt 13
2.4.1 Passive Calcium-Resorption 13
2.4.2 Aktive Calcium-Resorption 13
2.4.3 Besonderheiten beim Wiederkäuer 15
2.4.3.1 Bilanzstudien 15
2.4.3.2 In-vitro-Untersuchungen 17
2.4.3.3 Strukturelle Untersuchungen 20
3 Material und Methoden 22
3.1 Tiermaterial 22
3.2 Probenentnahme 22
3.2.1 Probenentnahme für die RNA-Isolierung 23 3.2.2 Probenentnahme für die Anfertigung von Gewebeschnitten 23
3.2.2.1 Fixierung 23
3.2.2.2 Gefrierschnitte 23
3.2.2.3 Paraffinschnitte 24
3.2.3 Probenentnahme für die funktionellen Untersuchungen 25
3.3 RNA-Isolierung 25
3.4 cDNA-Synthese 27
3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 27
3.5.1 PCR für die Herstellung der TRPV6-Sonde 28 3.5.2 PCR für die Sequenzierung im Kettenabbruch-Verfahren 30 3.5.3 PCR zum qualitativen Nachweis der RNA-Expression 30
3.5.4 Aufreinigung der PCR-Produkte 33
3.5.4.1 Aufreinigung für die Ligation 33
3.5.4.2 Aufreinigung für die Sequenzierung 33 3.6 Klonierung des PCR-Produktes für die Sondenherstellung 34
3.6.1 Ligation 35
3.6.2 Transformation 35
3.6.3 Präparation der Plasmid-DNA zur Erfolgskontrolle 36 3.6.4 Präparation der Plasmid-DNA zur Sondenherstellung 36
3.6.5 Restriktionsenzymverdau 36
3.7 In-situ-Hybridisierung 38
3.7.1 In-vitro-Transkription und Markierung der RNA-Sonden 38
3.7.2 Aufreinigung der RNA-Sonden 40
3.7.3 Vorbereitung der Gewebeschnitte 40
3.7.4 Prähybridisierung 41
3.7.5 Hybridisierung 41
3.7.6 Waschen 42
3.7.7 Nachweis der hybridisierten Sonde 42
3.7.8 EDV-gestützte Auswertung und Dokumentation 43 3.8 Histologische und immunhistochemische Techniken 44
3.8.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 44
3.8.2 Immunhistochemie 44
3.8.2.1 TRPV5 45
3.8.2.2 TRPV6 46
3.8.2.3 Calbindin-D9K und Calbindin-D28K 46
3.9 Funktionelle Untersuchungen 47
3.9.1 Prinzip der Ussing-Kammer-Technik 47
3.9.2 Bestimmung der Fluxraten 49
3.9.3 Versuchsablauf 50
3.9.3.1 Vorversuche 50
3.9.3.2 Unidirektionale Calcium- und Mannit-Fluxraten in Abwesenheit eines elektrochemischen Gradienten und Einfluss der elektrischen Triebkraft 52 3.9.3.3 Einfluss des Calcium-Kanal-Blockers Ruthenium Rot auf die
unidirektionalen Calcium-Fluxraten 54 3.10 Statistische Auswertung und Darstellung 54
4 Ergebnisse 55
4.1 Qualitativer Nachweis der Expression mittels RT-PCR 55 4.1.1 Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) 55 4.1.2 „Transient receptor potential vanilloid“-Kanal 6 (TRPV6) 56
4.1.3 Calbindin-D9K 56
4.1.4 Calbindin-D28K 57
4.1.5 Membranständige Calcium-ATPase (PMCA) 58
4.1.6 Natrium/Calcium-Austauscher (NCX) 59
4.2 Nachweis der Expression mittels In-situ-Hybridisierung 60
4.2.1 TRPV5 60
4.2.1.1 TRPV5-Sonden 60
4.2.1.2 In-situ-Hybridisierung TRPV5 60
4.2.2 TRPV6 63
4.2.2.1 TRPV6-Sonden 63
4.2.2.2 In-situ-Hybridisierung TRPV6 64
4.3 Immunhistochemie 66
4.3.1 TRPV5 66
4.3.2 TRPV6 69
4.3.3 Calbindin-D9K 71
4.3.4 Calbindin-D28K 73
4.4 Funktionelle Untersuchungen 76
4.4.1 Vorversuche zum Einfluss unterschiedlicher pH-Werte auf der
mucosalen Gewebeseite 76
4.4.1.1 Integrität des Gewebes 76
4.4.1.2 Elektrophysiologische Parameter 78
4.4.1.3 Unidirektionale Calcium-Fluxraten 79
4.4.2 Elektrophysiologische Parameter 81
4.4.3 Unidirektionale Calcium- und Mannit-Fluxraten in Abwesenheit eines elektrochemischen Gradienten 83
4.4.4 Einfluss der Gewebeleitfähigkeit 84
4.4.5 Einfluss der elektrischen Triebkraft auf die unidirektionalen
Calcium-Fluxraten 86 4.4.6 Einfluss des Calcium-Kanalblockers Ruthenium Rot auf die
unidirektionalen Calcium-Fluxraten 87
5 Diskussion 88
5.1 Beurteilung der angewandten Methoden 88
5.1.1 RT-PCR 88
5.1.2 In-situ-Hybridisierung 89
5.1.3 Immunhistochemie 90
5.1.4 Ussing-Kammer-Technik 91
5.2 Strukturelle Untersuchungen 92
5.2.1 Duodenum und Jejunum 92
5.2.2 Labmagen 96
5.2.4 Niere 101
5.3 Funktionelle Untersuchungen 103
5.3.1 Unidirektionale Calcium- und Mannit-Fluxraten unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten und als Funktion der elektri- schen Triebkraft 103
5.3.2 Einfluss der Gewebeleitfähigkeit 105
5.3.4 Blockierbarkeit durch Ruthenium Rot 106
5.4 Schlussfolgerungen und Ausblick 107
6 Zusammenfassung 109
7 Summary 111
8 Literaturverzeichnis 113
9 Anhang 133
A. Puffer und Lösungen für die In-situ-Hybridisierung 133 B. Puffer und Lösungen für die histologischen und
immunhistochemischen Untersuchungen 135 C. Puffer und Lösungen für die funktionellen Untersuchungen 136
D. Ergebnisse der Sequenzierung 137
E. Sondensequenzen 143
10 Danksagung 145
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AP alkalische Phosphatase
Aqua dest. Aqua destillata
ATP (ase) Adenosintriphosphat (ase)
BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat BLAST basic local alignment search tool
bp base pairs
BSA bovines Serumalbumin
CaT calcium transporter
CaR calcium sensing receptor
cDNA complementary DNA
DEPC Diethylpyrocarbonat DIG Digoxigenin DNA deoxyribonucleic acid
dNTP 2`-Desoxyribonukleosid-5`-triphosphat
E.coli Escherichia coli
ECaC epithelial calcium channel EDTA Ethylendiamintetraacetat
FE fraktionelle Exkretion
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
Gt Gewebeleitfähigkeit
HCl Salzsäure
HE Hämatoxylin-Eosin
Ic Klemmstrom
Isc Kurzschlussstrom
IPTG Isopropyl-ß-D-Thiogalaktosid Jms Fluxrate von mucosal nach serosal
Jnet Nettofluxrate
Jsm Fluxrate von serosal nach mucosal LB-Medium Luria-Bertani-Medium
MARRS membrane-associated rapid response steroid binding protein MDCK Madin Darby Canine Kidney (Nierenzellkultur)
mRNA messenger ribonucleic acid
n Stichprobenumfang NaOH Natronlauge
NBT Nitroblau-Tetrazolium NCX natrium calcium exchanger
ORF open reading frame
PBS phosphate buffered saline
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PFA Paraformaldehyd
PMCA plasma membrane Calcium-ATPase PTH Parathormon
PVDR-I Pseudovitamin-D-Mangelrachitis Typ I
RNA ribonucleic acid
RNase Ribonuklease
rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur SCFA short chain fatty acid
SD standard deviation
SDS sodium dodecyl sulfate SEM standard error of the mean SSC standard saline citrate Tab. Tabelle
TAE Tris-Acetat-EDTA TEA Triethanolamin
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan tRNA transfer ribonucleic acid
TRP (V) transient receptor potential (vanilloid) channel TS Trockensubstanz
Tween 20 Polyoxyethylenesorbitan-Monolaurat
U unit
UTP Uridintriphosphat VDR Vitamin-D-Rezeptor VDRE vitamin D responsive element
X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-ß-D-Galaktopyranosid
Abbildungsverzeichnis
Abb. 2.1: Klassisches Modell des transzellulären Ca2+-Transports in intestinalen und renalen Epithelien monogastrischer Tiere
Abb. 2.2: Präintestinale Resorption von Calcium [g·d-1] in Abhängigkeit von der alimentären Calcium-Aufnahme [g·d-1], RICKEN 2005
Abb. 2.3: Postulierte Mechanismen des aktiven Calcium-Transportes über das Pansenepithel des Wiederkäuers
Abb. 3.1: Plasmidkarte des Vektors pGEM®-T Easy
Abb. 3.2: Linearisierte Plasmid-DNA zur In-vitro-Transkription
Abb. 3.3: Hybridisierung auf den Gewebeschnitten, Erläuterungen im Text (siehe 3.8.5)
Abb. 4.1: Repräsentatives Beispiel einer RT-PCR zum Nachweis von Glycerin- aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)
Abb. 4.2: Repräsentative Beispiele einer RT-PCR zum Nachweis des
„Transient receptor potential vanilloid“-Kanals 6 (TRPV6) Abb. 4.3: Repräsentatives Beispiel einer RT-PCR zum Nachweis von
Calbindin-D9K
Abb. 4.4: Repräsentatives Beispiel einer RT-PCR zum Nachweis von Calbindin-D28K
Abb. 4.5: Repräsentatives Beispiel einer RT-PCR zum Nachweis der membran- ständigen Calcium-ATPase (PMCA)
Abb. 4.6: Repräsentatives Beispiel einer RT-PCR zum Nachweis des Natrium/Calcium-Austauschers (NCX)
Abb. 4.7: Ergebnisse der In-situ-Hybridisierung mit der TRPV5-Antisense- und Sense-Sonde, repräsentative Beispiele für die untersuchten Organe Abb. 4.8: A: TRPV6-spezifische PCR-Produkte auf einem 3%igen Agarosegel
B: EcoRI-Verdau der Klone 1 bis 6
Abb. 4.9: Ergebnisse der In-situ-Hybridisierung mit der TRPV6-Antisense- und Sense-Sonde, repräsentative Beispiele für die untersuchten Organe
Abb. 4.10: Rabbit Anti-TRPV5 auf Paraffinschnitten von Duodenum, Jejunum, Labmagen, Pansen und Niere des Schafes, Cy-3-konjugierter Goat Anti-Rabbit, repräsentative Beispiele
Abb. 4.11: Rabbit Anti-TRPV6 auf Gefrierschnitten von Duodenum, Jejunum, Labmagen, Pansen und Niere des Schafes, Cy-3-konjugierter Goat- Anti-Rabbit, repräsentative Beispiele
Abb. 4.12: Kaninchen-Antiserum gegen Calbindin-D9K auf Paraffinschnitten von Duodenum, Jejunum, Labmagen, Pansen und Niere des Schafes, Cy-3-konjugierter Goat-Anti-Rabbit
Abb. 4.13: Kaninchen-Antiserum gegen Calbindin-D28K auf Paraffinschnitten von Duodenum, Jejunum, Labmagen, Pansen und Niere des Schafes, Cy-3-konjugierter Goat-Anti-Rabbit
Abb. 4.14: HE-gefärbte Schnittpräparate des Labmagens (Fundusdrüsenbereich) A: ungestripptes Epithel
B: gestripptes Epithel
C: gestripptes Epithel nach der Inkubation in der Ussing-Kammer D: apikale Bereiche des gestrippten Epithels nach der Inkubation Abb. 4.15: Zeitlicher Verlauf der Gewebeleitfähigkeiten (Gt) in [mS·cm-2] bei
unterschiedlichen pH-Werten in der mucosalen Pufferlösung Abb. 4.16: Zeitlicher Verlauf der Klemmströme (IC) in [µEq·cm-2·h-1] bei
unterschiedlichen pH-Werten in der mucosalen Pufferlösung
Abb. 4.17: Calcium-Nettofluxraten in mucosaler Richtung (Jsm) bei unterschiedli- chen mucosalen pH-Werten und verschiedenen Klemmstufen
Abb. 4.18: Calcium-Nettofluxraten in serosaler Richtung (Jms) bei unterschiedli- chen mucosalen pH-Werten und verschiedenen Klemmstufen Abb. 4.19: Zeitlicher Verlauf der Gewebeleitfähigkeiten (Gt) in [mS·cm-2] Abb. 4.20: Zeitlicher Verlauf der Klemmströme (IC) in [µEq·cm-2·h-1]
Abb. 4.21: Unidirektionale Calcium-Fluxraten (Jsm und Jms) in [nmol·cm-2·h-1] in Abhängigkeit der entsprechenden Mannit-Fluxraten
Abb. 4.22: Abhängigkeit der unidirektionalen Calcium- und Mannit-Fluxraten in [nmol·cm-2·h-1] bezogen auf 1 mmol·l-1 der entsprechenden Substanz in der Pufferlösung von der Gewebeleitfähigkeit in [mS·cm-2]
Abb. 4.23: Unidirektionale Calcium-Fluxraten (Jsm und Jms) in [nmol·cm-2·h-1] in Abhängigkeit von der elektrischen Triebkraft ξ
Abb. 5.1: Kolokalisation von TRPV6 und Calbindin-D9K im Duodenum (A) und im Jejunum (B) des Schafes
Abb. 5.2: Übersicht zu den in 2.4.2 und 2.4.3.2 beschriebenen Studien, duo- denale Calcium-Nettofluxraten verschiedener Tierarten und Alters- stufen in [nmol·cm-2·h-1]
Abb. 5.3: Übersicht zu den in 2.4.2 und 2.4.3.2 beschriebenen Studien, Beein- flussung der duodenalen Calcium-Nettofluxraten verschiedener Tier- arten durch Behandlung mit Calcitriol (Ratten), mit Vit.-D3 (Ferkel) bzw. nach langfristiger alimentärer Calcium-Depletion (Ziegen) in [nmol·cm-2·h-1]
Abb. 5.4: Übersicht über die Expression am Calcium-Transport beteiligter Strukturen in der Niere der Maus (NIJENHUIS et al. 2003)
Abb. 5.5: Kolokalisation von Calbindin-D9K (A) und Calbindin-D28K (B) in der Niere des Schafes
Abb. 9.1: Sequenzvergleich GAPDH; GAPDH Schaf: PCR-Produkt 4.1.1;
AF030943: partielle Sequenz GAPDH Schaf, Position 310 bis 385;
Primersequenzen: GARCIA-CRESPO et al. 2005
Abb. 9.2: Sequenzvergleich TRPV6; TRPV6 Schaf: PCR-Produkt 4.1.2; TRPV6 Kaninchen: DQ013292, Position 1730 bis 1825 im ORF; TRPV6 Maus: NM_022413, 1727 bis 1833 im ORF
Abb. 9.3: Sequenzvergleich Calbindin-D9K; Calbindin-D9K Schaf: PCR-Produkt 4.1.3; Calbindin-D9K Rind: NM_174257, Position 68 bis 190 im ORF;
Calbindin-D9K Maus: NM_009789, 68 bis 190 im ORF
Abb. 9.4: Sequenzvergleich Calbindin-D28K; Calbindin-D28K Schaf: PCR-Pro- dukt 4.1.4; Calbindin-D28K Ratte: NM_031984, Position 183 bis 268 im ORF; Calbindin-D28K Maus: NM_009788, 183 bis 268 im ORF;
Abb. 9.5: Sequenzvergleich Calcium-ATPase (PMCA); PMCA Schaf: PCR- Produkt 4.1.5; Kaninchen: X59069, Position 2436 bis 2536 im ORF;
PMCA Maus: NM_026482, 2436 bis 2536 im ORF
Abb. 9.6: Sequenzvergleich Natrium/Calcium-Austauscher 1 (NCX1); NCX Schaf: PCR-Produkt 4.1.6; NCX1 Kaninchen: U52665, Position 2207 bis 2340 im ORF; NCX1 Maus: NM_011406, 2294 bis 2427 im ORF
Abb. 9.7: Sequenzvergleich TRPV6; TRPV6 Schaf: PCR-Produkt 4.2.2.1;
TRPV6 Kaninchen: DQ013292, Position 1628 bis 1955 im ORF;
TRPV6 Maus: NM_022413, 1625 bis 1952 im ORF; Primersequen- zen: HINTERDING 2002
Abb. 9.8: Sequenzen der in den In-situ-Hybridisierungen verwendeten RNA- Sonden
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1: Calcium-Konzentration im Urin verschiedener Tiere in [mg·l-1]; modifi- ziert nach KIENZLE 1991
Tab. 2.2: Steigende tägliche Calcium-Aufnahme, entsprechende Calcium- Bewegungen im Gastrointestinaltrakt und fäkale Calcium- Ausscheidung, gemessen an adulten Schafen
Tab. 2.3: Effekte einer steigenden SCFA-Konzentration in der Pufferlösung und Einfluss der Fütterung auf die Calcium-Nettofluxraten ruminaler Epithelien vom Schaf (modifiziert nach UPPAL et al. 2003)
Tab. 2.4: Übersicht über die bis zu Beginn dieser Arbeit auf RNA- oder Protein- ebene nachgewiesenen strukturellen Komponenten des von mono- gastrischen Spezies bekannten transzellulären Calcium-Transportes im Gastrointestinaltrakt verschiedener Wiederkäuer
Tab. 3.1: Paraffineinbettung
Tab. 3.2: Primersequenzen TRPV6-PCR zur Sondensynthetisierung, HINTERDING 2002
Tab. 3.3: Pipettierschema TRPV6-PCR zur Sondensynthetisierung
Tab. 3.4: Inkubationsbedingungen der TRPV6-PCR zur Sondensynthetisierung Tab. 3.5: Inkubationsbedingungen der pGEM-ECaC2-PCR zur Sequenzierung Tab. 3.6: Primersequenzen für den qualitativen Nachweis mittels RT-PCR Tab. 3.7: Pipettierschema für die RT-PCR zum Nachweis von GAPDH
Tab. 3.8: Pipettierschema für die RT-PCR zum Nachweis von TRPV6, Calbin- din D9K, Calbindin D28K, PMCA und NCX
Tab. 3.9: Inkubationsbedingungen für die RT-PCR zum Nachweis von GAPDH, TRPV6, Calbindin D9K,Calbindin D28K,PMCA und NCX
Tab. 3.10: Reaktionsansätze für den Restriktionsenzymverdau Tab. 3.11: Pipettierschema In-vitro-Transkription
Tab. 3.12: Waschprotokoll für die In-situ-Hybridisierung „TRPV5“ und „TRPV6“
Tab. 3.13: Durchführung der Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Tab. 3.14: Kammerbelegung während der Vorversuche zum Einfluss des pH-Wertes auf der mucosalen Gewebeseite auf die elektrophysiolo- gischen Parameter und die Calcium-Nettofluxraten
Tab. 3.15: Protokoll der Vorversuche zum Einfluss des pH-Wertes auf der muco- salen Gewebeseite auf die elekrophysiologischen Parameter und die Calcium-Nettofluxraten
Tab. 3.16: Versuchsablauf zum Einfluss der elektrischen Triebkraft auf die unidi- rektionalen Calcium- und Mannit-Fluxraten
Tab. 4.1: Regressionsgleichungen der Daten aus Abb. 4.22, Ergebnisse einer einfaktoriellen Varianzanalyse
Tab. 4.2: PD-abhängige und -unabhängige Anteile der unidirektionalen Cal- cium-Fluxraten (Jsm und Jms) in [nmol·cm-2·h-1]; Vergleich der Steigungen und Ordinatenabschnitte der Regressionsgleichungen
1 Einleitung
Aufgrund einer insuffizienten Adaptation der gastrointestinalen Calcium-Resorption an den durch das Einsetzen der Laktation bzw. die Trächtigkeit gesteigerten Bedarf treten beim Wiederkäuer im peripartalen Zeitraum häufig klinische und subklinische Störungen der Calcium-Homöostase auf (BRAITHWAITE et al. 1970; HORST et al.
2005). Weil solche Imbalancen unter anderem einen prädispositionierenden Faktor für eine Reihe von Erkrankungen in der frühen Laktationsperiode darstellen, kommt ihnen eine erhebliche wirtschaftliche Bedeutung zu (GOFF &HORST 1997).
Die heutigen Kenntnisse und Konzepte über die Mechanismen der Calcium-Homö- ostase basieren in erster Linie auf umfangreichen Untersuchungen an monogastri- schen Spezies. Da sich aus verschiedenen funktionellen Studien Hinweise darauf ergeben haben, dass hinsichtlich der Lokalisation und der Quantität der gastroin- testinalen Calcium-Resorption und der renalen Calcium-Exkretion beim Wiederkäuer erhebliche Unterschiede zum monogastrischen Tier bestehen, erscheint es fraglich, ob sich diese Konzepte ohne eine genauere Prüfung auf den Wiederkäuer übertra- gen lassen.
Es war daher das Ziel dieser Arbeit, die bei anderen Spezies bereits detailliert be- schriebenen Strukturen, die die Voraussetzung für den Calcitriol-regulierten, trans- zellulären Calcium-Transport darstellen, auch beim Wiederkäuer nachzuweisen. Es sollte geklärt werden, inwieweit sich die Lokalisation dieser Strukturen mit den be- kannten funktionellen Daten, beispielsweise bezüglich der Calcium-Resorption aus dem Pansen, deckt. Zu diesem Zweck wurden qualitative Nachweise auf Transkrip- tions- und Translationsebene an Geweben adulter, bedarfsgerecht mit Calcium ge- fütterter Schafe durchgeführt, die die Grundlage für weiterführende Untersuchungen in Hinblick auf die Regulation der Calcium-Homöostase beim Wiederkäuer durch Vitamin D, Parathormon und Calcitonin sowie weitere Hormone wie Östrogene und Glucocorticoide darstellen sollen.
Weiterhin wurden mithilfe der Ussing-Kammer-Technik funktionelle Untersuchungen am Labmagen durchgeführt, um bereits vorhandene Daten zur gastrointestinalen Calcium-Resorption beim Wiederkäuer zu komplettieren.
2 Literaturübersicht
2.1 Bedeutung und Regulation der Calcium-Homöostase
Das Mengenelement Calcium liegt im Organismus zu circa 99% als Strukturelement in Knochen und Zähnen vor. Da es daneben an einer Vielzahl von lebenswichtigen biologischen Funktionen, wie zum Beispiel der präsynaptischen Ausschüttung von Neurotransmittern, der Muskelkontraktion, der Sekretionstätigkeit verschiedener Drü- sen und der Blutgerinnung beteiligt ist (RAMASAMY 2006), ist es unerlässlich, dass die Konzentration an freien Calcium-Ionen (Ca2+) in der Intra- und in der Extrazellulär- flüssigkeit in engen Grenzen reguliert wird. Dafür müssen die Resorptions- und Sekretionsvorgänge sowie die Mobilisation aus dem und der Einbau in den Knochen an die aktuelle Verfügbarkeit von Calcium aus der Nahrung und an den vom Alter, Reproduktions- und Leistungsstatus des Tieres abhängenden Bedarf angepasst werden.
Im Wesentlichen geschieht dies durch das Zusammenspiel von Parathormon (PTH) und Calcitriol, die in unterschiedlicher Weise auf den Gastrointestinaltrakt, die Niere und das Skelettsystem wirken, und so die Calcium-Konzentration im Serum je nach Spezies und Alter zwischen 2,0 und 2,75 mmol·l-1 konstant halten. Das Peptidhormon Calcitonin ist an der Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase nur in vergleichs- weise geringem Umfang beteiligt (HOFF et al.2002).
2.1.1 Calcitriol
Das Steroidhormon Calcitriol (1,25-Dihydroxycholecalciferol bzw. 1,25(OH)2D3) ist der durch zwei Hydroxylierungen entstehende, biologisch aktive Metabolit des Vita- mins D3. Neben seiner wichtigen Rolle in der Regulation der Calcium-Homöostase ist Calcitriol auch an vielen verschiedenen Prozessen der Zellproliferation und der Zell- differenzierung beteiligt (AUDRAN & KUMAR 1985; BROWN et al. 1999; DUSSo et al.
2005).
Der erste Hydroxylierungsschritt am C25 erfolgt hauptsächlich in der Leber. Die Menge des dabei gebildeten 25-Hydroxyvitamins D3 (25(OH)D3) verhält sich weitge-
gen Synthese in der Haut (HOLICK 1981). Der zweite Hydroxylierungsschritt findet in der Niere am C1 statt und wird durch die 1α-Hydroxylase katalysiert. Expression und Aktivität dieses Enzyms werden nicht nur durch PTH, Calcitriol und Calcitonin (MURAYAMA et al. 1999), sondern auch direkt durch die Serum-Konzentrationen von Calcium (BUSHINSKY et al. 1985) und Phosphat (BUSHINSKY et al. 1989) reguliert.
Die genomischen Wirkungen von Calcitriol werden durch Bindung an den spezifi- schen Vitamin D-Rezeptor (VDR), einen Liganden-aktivierten Transkriptionsfaktor, und eine anschließende Heterodimerisierung mit dem Retinoid X-Rezeptor (RXR) vermittelt. Dieser Komplex interagiert dann mit den VDREs (vitamin D responsive elements) in den Promotorregionen der entsprechenden Gene, die sowohl als posi- tive als auch als negative Regulatoren der Transkription ausgebildet sein können (BROWN et al. 1999).
Über eine gesteigerte Expression von epithelialen Calciumkanälen, cytosolischen Transportproteinen, der membranständigen Calcium-ATPase im Dünndarm und des Natrium-Calcium-Austauschers in der Niere stimuliert Calcitriol die Resorption von Calcium aus dem Gastrointestinaltrakt und hemmt gleichzeitig dessen renale Aus- scheidung (HOENDEROP et al. 2005 a). Die Wirkung auf den Knochen ist abhängig von der alimentären Calcium-Verfügbarkeit und der An- oder Abwesenheit von Calcitonin. Calcitriol kann sowohl die Mobilisation von Calcium aus dem Knochen als auch die Mineralisation des Skelettsystems unterstützen (KURBEL et al. 2003, PANDA
et al. 2004).
Neben diesen relativ langsamen genomischen Effekten konnten auch Calcitriol-Wir- kungen beobachtet werden, die innerhalb von Sekunden bzw. Minuten eintreten, bei- spielsweise an Chondrozyten (BOYAN et al. 1994). Aus Enterozyten von Hühnerkü- ken konnte ein membranständiges, Calcitriol-bindendes Protein (membrane-asso- ciated rapid-response steroid-binding protein, 1,25D3-MARRS) isoliert werden, des- sen Bindung durch Calcitriol bzw. zweier Analoga den als „Transcaltachia“ bekann- ten, nicht genomisch vermittelten Transport von Calcium durch das Cytosol (siehe 2.2.2.4) beeinflusste (NEMERE et al.1994).
2.1.2 Parathormon (PTH)
Bei Parathormon (PTH) handelt es sich um ein Peptidhormon mit 84 Aminosäuren.
Es wird in der Nebenschilddrüse gebildet und in Form von Sekretgranula ge- speichert, so dass es innerhalb weniger Sekunden freigesetzt werden kann, wenn über den Calcium-sensing-Rezeptor (CaR) ein Absinken des Plasma-Calcium- Spiegels detektiert wird (BROWN &MCLEOD 2001). Die Expression von PTH wird nicht nur durch niedrige Plasma-Calcium- und Phosphat-Spiegel sondern auch durch Östrogene erhöht. Über VDREs wird die Bildung von PTH durch Calcitriol gehemmt (RAMASAMY 2006).
PTH steigert die tubuläre Rückresorption von Calcium in der Niere (GREGER et al.
1978). Über die genauen Mechanismen wird zur Zeit noch diskutiert, es konnte aber gezeigt werden, dass Proteinkinase A- und Proteinkinase C-abhängige Prozesse am Anstieg des transepithelialen Calcium-Transportes beteiligt sind (FRIEDMAN et al.
1996). Darüber hinaus bewirkt PTH über eine Aktivierung der 1α-Hydroxylase die verstärkte Synthese von Calcitriol und hat damit einen indirekten Effekt auf die gastrointestinale Resorption von Calcium.
Ob es auch am Darm zu einer direkten PTH-Wirkung kommt, ist bislang noch nicht geklärt, zumindest konnten aber im Duodenum der Ratte PTH-Rezeptoren immun- histochemisch nachgewiesen werden (GENTILI et al. 2003).
Am Knochen kommt es durch PTH zu einer gesteigerten Freisetzung von Calcium.
Chronisch erhöhte PTH-Spiegel führen demzufolge zu einer Demineralisierung des Skelettsystems. Interessanterweise scheint eine intermittierende Gabe von PTH aber auch anabole Wirkungen auf den Knochenstoffwechsel zu haben, wobei die genauen Mechanismen bislang noch nicht bekannt sind (RAMASAMY 2006).
2.1.3 Calcitonin
Das Peptidhormon Calcitonin (32 Aminosäuren) wird als Reaktion auf erhöhte Plasma-Calcium-Spiegel aus den C-Zellen der Schilddrüse sezerniert und vermindert die Mobilisation von Calcium aus dem Knochen (PECHET et al. 1967). Dabei wirkt Calcitonin direkt über spezifische Rezeptoren auf die Osteoklasten (NICHOLSON et al.
1986). Die Bedeutung des Calcitonins für die Aufrechterhaltung der Calcium-Ho-
möostase ist zurzeit noch umstritten. Eine Deletion des entsprechenden Gens bei der Maus führte zu einem klinisch unauffälligen Phänotyp mit normalen Plasma- Elektrolyt- und Hormon-Konzentrationen. Unterschiede zum Wildtyp zeigten sich erst nach einer Behandlung mit PTH in einem stärkeren Ansteigen der Plasma-Calcium- Konzentration und einer vermehrten Ausscheidung des Knochenresorptions-Markers Desoxypyridinolin mit dem Urin. Überraschenderweise war die Knochendichte in den K.O.-Mäusen höher als im Wildtyp, die Zahl der Osteoklasten war jedoch nicht ver- mindert. Es muss also davon ausgegangen werden, dass die Calcitonin-abhängigen Mechanismen am Knochen komplexer sind, als bisher angenommen wurde (HOFF et al. 2002).
Auch eine mögliche Wirkung von Calcitonin auf die Niere wird in der Literatur wider- sprüchlich diskutiert. Nachdem zunächst davon ausgegangen wurde, dass Calcitonin die Rückresorption von Calcium in der Niere hemmt (ARDAILLOU 1975), ergaben sich in späteren Arbeiten Hinweise darauf, dass Calcitonin die Calcium-Konzentration im Urin nicht beeinflusst (BARLET et al. 1983) bzw. einen Calcium sparenden Effekt an der Niere hat. An jungen, thyroparathyroidektomierten Ratten konnte gezeigt werden, dass Calcitonin die renale Calcium-Ausscheidung durch eine Wirkung auf den dicken aufsteigenden Schenkel der Henleschen Schleife vermindert. Dieser Effekt ließ sich jedoch durch eine gleichzeitige intravenöse Gabe von Calcium verhindern (QUAMME
1980). Auch die Dauer einer Calcitonin-Behandlung scheint einen Einfluss auf die Wirkung ZU haben: eine einmalige Dosis verringert bei unbehandelten Ratten die renale Calcium-Exkretion stärker als bei Tieren, die bereits zuvor über einen längeren Zeitraum mit Calcitonin behandelt worden waren (CARNEY & THOMPSON
1998). In Aufnahmestudien an Vesikeln apikaler und basolateraler Membranen aus dem distalen Tubulus des Kaninchens konnte sowohl eine Stimulation des Calcium- Transportes über die apikale Membran als auch des basolateralen Natrium/Calcium- Austauschers gezeigt werden (ZUO et al. 1997).
2.2 Transepithelialer Calcium-Transport: Mechanismen 2.2.1 Parazellulärer Calcium-Transport
Der parazelluläre Calcium-Transport über tight junctions erfolgt passiv entlang eines elektrochemischen Gradienten. Damit ist er zum einen von der luminalen Calcium- Konzentration, zum anderen von der transmuralen Potenzialdifferenz (PD) abhängig (HOENDEROP et al. 2005 a), die dem chemischen Gradienten entgegensteht, da die Blutseite gegenüber der luminalen Seite positiv geladen ist (z.B.: Pansen 20-60 mV, PRÄCHTER 2001; Dünndarm circa 12 mV, GUSTKE et al. 1981). Aus neueren Arbeiten haben sich Hinweise darauf ergeben, dass in den tight junctions möglicherweise Strukturen vorhanden sind, die sich biophysikalisch ähnlich wie Ionenkanäle verhal- ten (TANG & GOODENOUGH 2003). Es wäre also denkbar, dass ein durch solche Strukturen vermittelter Transport eine gewisse Selektivität aufweist und sich damit von einer reinen Diffusion unterscheidet.
Inwieweit der parazelluläre Calcium-Transport eine regulierbare Größe darstellt, ist bislang noch nicht hinreichend geklärt. In einer Studie an Caco-2-Zellen konnte nach Inkubation mit Calcitriol eine Abnahme des transzellulären Widerstandes und eine Erhöhung der parazellulären Permeabilität festgestellt werden (CHIRAYATH et al.
1998), außerdem wurde am Duodenum von Ratten nach einer Behandlung mit einer pharmakologischen Dosis von Calcitriol eine veränderte Expression verschiedener Proteine gezeigt, die am strukturellen Aufbau der tight junctions beteiligt sind (KUTUZOVA &DELUCA 2004).
Als weitere treibende Kraft für den parazellulären Calcium-Transport kommt der so genannte Solvent drag-Mechanismus in Frage. Hierbei wird durch die aktive Resorp- tion anderer Stoffe, wie zum Beispiel von Natrium-Ionen oder Aminosäuren ein os- motischer Gradient erzeugt, der zu einem parazellulären Nachströmen von Wasser mit den darin gelösten Ionen führt (KARBACH 1992). In relativ undichten (leaky) Epi- thelien, wie sie beispielsweise im vorderen Dünndarm anzutreffen sind, kann dieser Mechanismus eine quantitativ wichtige Rolle spielen (SCHARRER &WOLFFRAM 1987);
in sehr dichten (tight) Epithelien, wie zum Beispiel im Pansen, wird er wahrscheinlich von eher untergeordneter Bedeutung sein.
2.2.2 Transzellulärer Calcium-Transport
Der transzelluläre Calcium-Transport erfolgt in der Regel aktiv und ist Calcitriol-ab- hängig. Dabei handelt es sich um einen komplexen Prozess, der sich in drei Teil- schritte (apikaler Calcium-Import, cytosolischer Calcium-Transfer, basolateraler Cal- cium-Export) unterteilen lässt (BRONNER et al. 1986).
Dieser Mechanismus konnte inzwischen auch in der Plazenta (BELKACEMI et al. 2005) und in umgekehrter Richtung ablaufend sowie mit Calretinin als cytosolischem Protein in der Speicheldrüse (HOMANN et al. 2005) nachgewiesen werden. Aufgrund des derzeitigen Kenntnisstandes ist davon auszugehen, dass das Vorhandensein der beschriebenen Strukturen beim monogastrischen Tier eine Voraussetzung für einen aktiven, transepithelialen Calcium-Transport darstellt.
TRPV5 TRPV6
PMCA
NCX ATP
ADP + Pi
Calbindin-D9K
Calbindin-D28K Ca2+
apikal basolateral
Abb. 2.1: Klassisches Modell des transzellulären Ca2+-Transports in intestinalen (Calbindin-D9K-vermittelt) und renalen Epithelien (Calbindin-D28K-ver- mittelt) monogastrischer Tiere;
Erläuterungen im Text (2.2.2.1 bis 2.2.2.3)
2.2.2.1 Einstrom über die apikale Membran durch TRPV-Kanäle
Da das Zellinnere gegenüber dem Extrazellulärraum negativ geladen ist (PD ca.
50 mV), und darüber hinaus im Intrazellulärraum die Konzentration an freien Cal- cium-Ionen mit 0,1 bis 1 µmol·l-1 sehr niedrig ist, kommt es entlang dieses elektrochemischen Gradienten zu einem passiven Calcium-Import über die apikale Membran (FULLMER 1992). Dieser Einstrom erfolgt nach dem heutigen Wissensstand über zwei einander sehr ähnliche epitheliale Calciumkanäle. Der TRPV5-Kanal (transient receptor potential vanilloid), der bis zur Einführung einer einheitlichen Nomenklatur auch als ECaC1 (epithelial calcium channel) bzw. CaT2 (calcium transporter) angesprochen wurde, konnte erstmals in Plazenta, Niere und Dünndarm des Kaninchens beschrieben werden (HOENDEROP et al. 1999). Nahezu zeitgleich wurde der TRPV6-Kanal (ECaC2 bzw. CaT1) im Gastrointestinaltrakt der Ratte gezeigt (PENG et al. 1999). Seitdem konnten beide Kanäle mit speziesspezifischen Unterschieden hinsichtlich der speziellen Lokalisation auch beim Menschen (MÜLLER
et al. 2000, PENG et al. 2000 b, BARLEY et al. 2001), der Maus (SUZUKI et al. 2000) und dem Schwein (HINTERDING 2002) nachgewiesen werden.
Bei allen Mitgliedern der in sieben Subfamilien eingeteilten TRP-Familie handelt es sich um Kationen-Kanäle, von denen angenommen wird, dass sie aus vier Unterein- heiten mit jeweils sechs Transmembrandomänen aufgebaut sind und drei bis vier Ankyrin-Motive aufweisen (PEDERSEN et al. 2005). TRPV5 und TRPV6 bilden inner- halb dieser Familie zusammen mit TRPV1-4 die Subfamilie der TRPV-Kanäle.
TRPV1-4 sind unspezifische Kationen-Kanäle, die auf verschiedene chemische, thermische und osmotische Stimuli reagieren. Ihre Aufgaben liegen überwiegend im Bereich der Nozizeption und der Temperaturwahrnehmung (GUNTHORPE et al. 2002).
TRPV5 und TRPV6 sind hoch selektiv für Calcium-Ionen und werden durch ein An- steigen der intrazellulären Calcium-Konzentration inaktiviert sowie durch niedrige extrazelluläre pH-Werte gehemmt. Bei physiologischen Membranpotenzialen sind die beiden Kanäle konstitutiv geöffnet, ohne dass ein spezifischer Stimulus bislang bekannt wäre (HOENDEROP et al. 2000b;VENNEKENS et al. 2000).
2.2.2.2 Transport durch das Cytosol mittels Calbindin
In einem zweiten Schritt werden die Calcium-Ionen durch das Cytosol transportiert.
Da bei diesem Vorgang die cytosolische Konzentration an freien Calcium-Ionen auf- grund ihrer potenziellen Wirkung als second messenger nicht erhöht werden darf, sind Calcium-bindende Proteine nötig (SCHRÖDER et al. 1996). Bei Vögeln handelt es sich dabei in Darm und Niere ausschließlich um das Calbindin-D28K (WASSERMAN &
TAYLOR 1966). Das kurz darauf in der Darmschleimhaut der Ratte gezeigte Calbin- din-D9K (KALLFELZ et al. 1967) ist nur bei Säugetieren im Darm nachweisbar, in der Niere findet man Calbindin-D28K bzw. bei manchen Spezies auch beide Proteine (HOENDEROP et al. 2005 a). Abgesehen von dem Umstand, dass Calbindin-D28K vier und Calbindin-D9K nur zwei Calcium-Ionen bindet, sind sich die beiden Proteine funk- tionell sehr ähnlich, trotzdem besteht keine nennenswerte Sequenzhomologie (JOHNSON & KUMAR 1994). Durch die langsame Kinetik der Calbindine ist gewähr- leistet, dass zwar die intrazelluläre Konzentration an freien Calcium-Ionen niedrig gehalten wird, das für funktionelle Second messenger-Signale typische, kurzfristige Ansteigen der Calcium-Ionen-Konzentration aber nicht behindert wird (KOSTER et al.
1995).
2.2.2.3 Ausschleusung über die basolaterale Membran
Im dritten Schritt werden die Calcium-Ionen gegen einen elektrochemischen Gra- dienten an der basolateralen Seite aus der Zelle herausgeschleust. Dies geschieht entweder über eine primär aktive, membranständige Calcium-ATPase, PMCA (GHIJSEN et al. 1982) oder über einen sekundär aktiven Natrium/Calcium-Austau- scher, NCX1 (LOFFING & KAISSLING 2003). In MDCK-Zellkulturen (Madin Darby Canine Kidney) werden etwa zwei Drittel des Calciums über den NCX1 und das verbleibende Drittel über die beiden Isoformen PMCA1b und PMCA4b aus der Zelle heraustransportiert (KIP &STREHLER 2003). Im Dünndarm dagegen stellt die PMCA1b den quantitativ bedeutsamsten Mechanismus zur aktiven Calcium-Ausschleusung dar (HOENDEROP et al. 2005 a).
2.2.2.4 Transcaltachia
Unter „Transcaltachia“ versteht man einen am Duodenum von Küken festgestellten, transzellulären, passiven Transport von Calcium in Vesikeln, der sich innerhalb von Minuten durch Calcitriol stimulieren lässt („fast calcitriol response“). Der genaue Me- chanismus ist noch nicht vollständig geklärt, aber die Beobachtung, dass sich der Calcitriol-vermittelte Anstieg in der Resorption durch das Spindelgift Colchicin inhibie- ren lässt, weist auf eine Beteiligung von Mikrotubuli hin (NEMERE et al. 1984). Ob die
„Transcaltachia“ auch beim Säugetier eine Rolle spielt, ist noch umstritten. In einer Studie an Schweinen konnte zwar die Bedeutung des Cytoskeletts für den neonata- len Calcium-Transport bestätigt werden, darüber hinaus ergaben sich aber keine weiteren Hinweise auf einen möglichen vesikulären Transport (NURNUS 2000). In pre- liminären Studien an Pansenepithelien von Ziegen wurde allerdings ein „Fast res- ponse“-Mechanismus auf den ruminalen Calcium-Transport der Ziege beobachtet (BREVES et al. 1989). Interessanterweise misslang der Versuch, ähnliche Effekte an entsprechenden Geweben von Schafen auszulösen (BÖDEKER et al. 1990).
2.3 Calcium-Resorption in der Niere 2.3.1 Passive Calcium-Resorption
In der Niere müssen für die Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase über 98%
des filtrierten Calciums wieder resorbiert werden. Zum größten Teil findet diese Rückresorption auf dem passiven, parazellulären Weg im proximalen Tubulus und im dicken aufsteigenden Teil der Henleschen Schleife statt (BINDELS 1993). Inwieweit die Resorption in diesem Abschnitt einer Regulation unterliegt, konnte bislang nicht hinreichend geklärt werden, obwohl für den dicken aufsteigenden Schenkel der Henleschen Schleife eine Erhöhung der parazellulären Permeabilität durch PTH ge- zeigt werden konnte (WITTNER et al. 1993).
2.3.2 Aktive Calcium-Resorption
Aus hauptsächlich an Nagetieren durchgeführten funktionellen Studien geht hervor, dass circa 12% des ursprünglich filtrierten Calciums im distalen gewundenen Tubu- lus, im Verbindungsstück zum Sammelrohr und im kortikalen Teil des Sammelrohrs über einen aktiven, transzellulären Mechanismus rückresorbiert werden (BINDELS
1993). Bei vor kurzem konstruierten TRPV5-k.o.-Mäusen ist die Calcium- Konzentration im Urin verglichen mit der des Wildtyps um mehr als das Dreifache erhöht (HOENDEROP et al 2005 b).
Inzwischen konnten die Komponenten des unter 2.2.2 beschriebenen Trans- portsystems bei Ratte, Maus und Kaninchen mit immunhistochemischen Techniken dargestellt werden, wobei es speziesspezifische Unterschiede bezüglich der ge- nauen Lokalisation entlang des Nephrons zu geben scheint (LOFFING & KAISSLING
2003).
Eine Regulation des transzellulären Calcium-Transports im distalen Nephron erfolgt hauptsächlich über die Hormone PTH und Calcitriol.
Der PTH-Rezeptor konnte bislang auf Transkriptionsebene in der Niere der Ratte in den glomerulären Podozyten, dem proximalen Tubulus, dem dicken aufsteigenden Schenkel der Henleschen Schleife und dem distalen gewundenen Tubulus nachge- wiesen werden (LEE et al. 1996, YANG et al. 1997). PTH wirkt an der Niere direkt im Sinne einer Resorptionssteigerung und stellt damit einen schnellen, innerhalb von Minuten wirksamen Adaptationsmechanismus der Calcium-Homöostase dar (KURBEL
et al. 2003).
Calcitriol stimuliert an der Niere die Expression von Calbindin-D28K/D9K, TRPV5/6 und NCX1 (HOENDEROP et al. 2002). Da es sich hierbei um genomische Effekte handelt, sind sie den mittel- bis langfristigen Adaptationsmechanismen zuzuordnen (KURBEL
et al. 2003). So genannte „vitamin D responsive elements“ (VDRE), über die die Cal- citriol-Wirkung vermittelt wird, konnten bislang nur in den Promotorregionen von Calbindin-D9K/D28K und TRPV5/6 gezeigt werden (DARWISH & DELUCA 1992; GILL &
CHRISTAKOS 1993; HOENDEROP et al. 2001 a; NIJENHUIS et al. 2003).
2.3.3 Besonderheiten beim Wiederkäuer
Die Rolle der Niere für die Calcium-Homöostase ist tierartlich sehr unterschiedlich.
So scheiden beispielsweise Pferd und Kaninchen bei einem Überangebot von Cal- cium in der Ration große Mengen an Calcium mit dem Urin aus (MEYER et al. 1990;
KAMPHUES 1991), während beim Hund nur eine sehr geringe renale Exkretion erfolgt (HAZEWINKEL 1986). Die renale Calcium-Ausscheidung beim Wiederkäuer ist im Ver- gleich zu anderen Tierarten auch unter normocalcaemischen Bedingungen sehr niedrig und wird durch das alimentäre Calcium-Angebot weder im Sinne einer gestei- gerten noch einer verminderten Exkretion wesentlich beeinflusst (BRAITHWAITE &
RIAZUDDIN 1971). Dieser Umstand wird besonders deutlich, wenn die Mineralstoff- gehalte des Urins verschiedener Tierarten miteinander verglichen werden (Tab. 2.1).
Tab. 2.1: Calcium-Konzentration im Urin verschiedener Tiere in [mg·l-1]; modifi- ziert nach KIENZLE 1991
Spezies Pferd Hund Katze Rind Schaf Kaninchen Schwein Ca-Konz. 200-1000 20-320 30-50 10 10 2000-13000 90 Eine Aussage über die Resorptionsleistung der Niere erhält man, wenn die renale Calcium-Ausscheidung in Bezug zur glomerulären Filtrationsrate gesetzt und so die fraktionelle Calcium-Exkretion (FECa) bestimmt wird. In Fütterungsversuchen mit Kaninchen wurde bei niedrigem bzw. adäquatem Calcium-Angebot FECa von 1-2 %, bei hoher alimentärer Versorgung eine FECa von 6 % ermittelt (WHITING & QUAMME
1984). Auch beim Pferd wird bei einer hohen Calcium-Aufnahme vermehrt Calcium renal ausgeschieden, so dass die FECa auf bis zu 6,7% steigen kann (MORRIS et al.
1984). Im Unterschied dazu liegt die FECa beim Hund unter 0,7 % (GARCIA- RODRIGUEZ et al. 2003). Beim Schaf wird für die fraktionelle Exkretion von Calcium ein Wert von 0,48 % angegeben. Bei einem mehrtägigen Futterentzug geht dieser dann annähernd auf 0 % zurück. Trotzdem konnte durch die niedrigere renale Exkretion ein Absinken der Calcium-Plasmakonzentration nicht verhindert werden (BICKHARDT 1994). Es kann also davon ausgegangen werden, dass bei einem erhöhten Bedarf die Calcium-Homöostase nicht allein über eine vermehrte
Rückresorption in der Niere aufrechterhalten werden kann (RAMBERG et al. 1970;
BRAITHWAITE 1974; VAN´T KLOOSTER 1976).
Molekularbiologische Untersuchungen zur Topologie der entsprechenden Transport- proteine in der Niere des Wiederkäuers liegen bislang nicht vor.
2.4 Calcium-Resorption im Gastrointestinaltrakt 2.4.1 Passive Calcium-Resorption
Die passive, parazelluläre Calcium-Resorption kann bei entsprechenden luminalen Konzentrationen an ionisiertem Calcium entlang der gesamten Darmachse erfolgen (BRONNER et al. 1986). Ihre quantitative Bedeutung ist von der alimentären Calcium- Versorgung abhängig (BRONNER &PANSU 1999) und unterliegt wahrscheinlich tierart- lichen Unterschieden. Vitamin D-defiziente Ratten, bei denen man davon ausgeht, dass die Calcium-Homöostase ausschließlich über den parazellulären Weg auf- rechterhalten wird, können mit einer „rescue diet“ (2% Calcium, 1,25% Phosphat, 20% Laktose) vor einer Hypocalcaemie und einem in der Folge auftretenden sekun- dären Hyperparathyreoidismus geschützt werden (KOLLENKIRCHEN et al. 1991). Bei Ferkeln mit Pseudovitamin D-Mangelrachitis Typ I (PVDR-I) aufgrund eines erblichen Defektes der renalen 25-Hydroxycholecalciferol-1α-Hydroxylase konnte mit einer sol- chen Diät zwar ein höherer Blut-Calcium-Spiegel erreicht werden als mit einem han- delsüblichen Ferkelfutter, eine Hypocalcaemie ließ sich aber dennoch nicht verhin- dern (SCHLUMBOHM &HARMEYER 2004).
2.4.2 Aktive Calcium-Resorption
Aktiver, transzellulärer Transport findet bei mit verschiedenen Techniken wie der „li- gated-loop“- und der „everted-sac“-Methode untersuchten Ratte hauptsächlich im Duodenum und im proximalen Jejunum statt und ist Calcitriol-abhängig (PANSU et al.
1983). In Experimenten mit Ussing-Kammern konnten im Duodenum der Ratte bei einer Calcium-Konzentration von 1,25 mmol·l-1 in der Pufferlösung unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten Nettofluxraten in Höhe von 75,3 ±
6,9 nmol·cm-2·h-1 gemessen werden. Durch eine Behandlung der Tiere mit Calcitriol ließ sich dieser Wert ungefähr verdoppeln (JUNGBLUTH & BINSWANGER 1989). Im Ileum konnten nur bei Tieren, die über Wochen eine Calcium-arme Diät erhalten hatten, Nettofluxraten in Höhe von 23,4 ± 5,6 nmol·cm-2·h-1 beobachtet werden (NELLANS & KIMBERG 1978). Diskutiert wurde nach Ergebnissen aus Versuchen mit der Ussing-Kammer-Technik auch ein aktiver Transport von Calcium aus dem Colon (FAVUS et al. 1983). In diesem Darmabschnitt ließen sich die gemessenen Nettoflux- raten (8-17 ± 3 nmol·cm-2·h-1) durch die Gabe von Calcitriol signifikant steigern (32- 48 ± 5 nmol·cm-2·h-1). Darüber hinaus konnten im Caecum der Ratte hohe Nettoflux- raten (164 ± 10 nmol·cm-2·h-1) gezeigt werden (NELLANS &GOLDSMITH 1981).
Inzwischen konnten spezifische Transkripte des an der apikalen Calcium-Aufnahme beteiligten Kanals TRPV6 (CaT1) mithilfe der In-situ-Hybridisierung in signifikanten Mengen in den Epithelzellen von Duodenum und Caecum, auf einem weitaus gerin- geren Expressionsniveau im proximalen Jejunum und gerade noch nachweisbar im Colon gezeigt werden (PENG et al. 1999). Im Ileum gelang der Nachweis nicht. Auch TRPV5-spezifische mRNA konnte im Duodenum mithilfe von Northern-Blot-Analysen dargestellt werden. Der Grad der Expression beider Kanäle ist bei der Ratte nicht nur von der Ernährung, sondern auch vom Alter der Tiere abhängig und lässt sich mit der Quantität des Calcium-Transports korrelieren (BROWN et al. 2005).
In Bilanzstudien an fistulierten, wachsenden Schweinen konnte der größte Teil der Calcium-Absorption im Dünndarm festgestellt werden. Beeinflusst von der Fütterung waren Duodenum und Jejunum an der Gesamtsumme unterschiedlich stark beteiligt, bei Verabreichung einer Casein-haltigen Ration trat auch im Dickdarm noch eine Nettoresorption auf (PARTRIDGE 1978). In diesem Versuch konnte aufgrund des De- signs nicht zwischen aktiven und passiven Transportvorgängen unterschieden wer- den, auch eine eventuelle Sekretion von Calcium in den Gastrointestinaltrakt blieb unberücksichtigt. Später wurden mithilfe der Ussing-Kammer-Technik duodenale Calcium-Nettofluxraten von sechs bis acht Wochen alten, gesunden Absetzferkeln mit denen von PVDR-I-Tieren (siehe 2.4.1) desselben Alters verglichen. In der Kon- trollgruppe ergaben sich bei einer Calcium-Konzentration von 1,8 mmol·l-1 in der Pufferlösung auf beiden Seiten des Epithels unter Ausschluss eines elektroche- mischen Gradienten Nettofluxraten von 72,6 ± 34,8 nmol·cm-2·h-1, während bei den
Calcitriol-defizienten Tieren keine signifikanten Nettofluxraten festgestellt werden konnten (SCHRÖDER et al. 1993). Noch höhere Werte wurden bei funktionellen Untersuchungen zum Einfluss einer Vitamin D3-Behandlung an Tieren im Alter von vier bis fünf Wochen ermittelt.Die Kontrollgruppe wies duodenale Nettofluxraten von 138,3 ± 16,4 nmol·cm-2·h-1, die behandelten Tiere solche von 209,3 ± 21,4 nmol·cm-2·h-1 auf (BRANDENBURGER 2004).
Diese Ergebnisse werden von ergänzenden molekularbiologischen Daten gestützt.
Mit Northern-Blot-Analysen konnte die Expression epithelialer Calciumkanäle im Gastrointestinaltrakt des Absetzferkels gezeigt werden, eine Unterscheidung zwi- schen TRPV5 und TRPV6 war mit der verwendeten Sonde allerdings nicht möglich.
Das höchste Expressionsniveau wurde erwartungsgemäß im Duodenum ermittelt, ein deutliches Signal ergab sich auch im proximalen Jejunum (⅓ verglichen mit dem Duodenum). Im Colon konnte nur eine sehr geringe Expression (weniger als 10%
verglichen mit dem Duodenum) gezeigt werden(HINTERDING 2002).
2.4.3 Besonderheiten beim Wiederkäuer 2.4.3.1 Bilanzstudien
Zur Calcium-Resorption beim Wiederkäuer liegen zahlreiche Bilanzstudien an mehr- fach fistulierten Tieren mit zum Teil widersprüchlichen Ergebnissen vor (Tab.2.1).
Prinzipiell scheinen nicht nur Dünn- und Dickdarm, sondern auch die präintestinalen Abschnitte des Gastrointestinaltraktes sowohl zur Nettosekretion als auch zur Netto- resorption befähigt zu sein.
Betrachtet man die Ergebnisse in Zusammenhang mit der alimentären Calcium-Ver- sorgung, so ergeben sich Hinweise darauf, dass es bei hohem Calcium-Angebot in der Nahrung zu einer Verschiebung der Nettoresorption zu Gunsten der präintesti- nalen Abschnitte kommt, wobei es nicht möglich war, zwischen dem Beitrag des Vormagensystems und dem des Labmagens zu unterscheiden. Dieses Prinzip konnte nicht nur in einer Studie mit laktierenden Kühen (SCHRÖDER & BREVES 2006) sondern auch in einer Literaturauswertung von an Rindern durchgeführten Untersu- chungen (Abb. 2.2) bestätigt werden (RICKEN 2005).
Tab. 2.2: Steigende tägliche Calcium-Aufnahme, entsprechende Calcium-Bewe- gungen im Gastrointestinaltrakt (positive Werte bedeuten Nettoresorp- tion, negative Werte Nettosekretion) und fäkale Calcium-Ausscheidung, gemessen an adulten Schafen in [g·d-1]
Aufnahme präintestinal Dünndarm Dickdarm Ausscheidung Quelle
2,7 -0,8 +1,9 -0,3 1,9 WYLIE et al.
1985
3,0 -0,3 +0,8 -0,2 2,7 GREENE et al.
1983
3,2 +0,6 +1,0 -0,2 1,8 DILLON &
SCOTT 1979
4,2 -0,5 -0,5 +0,6 4,6 PFEFFER et
al. 1970
6,1 +0,4 +1,0 +0,5 4,2 BEN-
GHEDALIA et al. 1982
6,3 +0,3 +0,5 +0,1 5,4 BREVES et al.
1985
7,9 +2,4 -1,3 -0,1 6,9 RAYSSIGUIER
& PONCET 1980
8,6 +2,0 -1,4 +1,1 6,9 GRACE et al.
1974
Abb. 2.2: Präintestinale Resorption von Calcium [g·d-1] in Abhängigkeit von der alimentären Calcium-Aufnahme [g·d-1], R 2005
2.4.3.2 In-vitro-Untersuchungen
In Versuchen an verschiedenen Darmabschnitten adulter, bedarfsgerecht ernährter Schafe ließen sich mit der Ussing-Kammer-Technik bei einer Calcium-Konzentration von 1,2 mmol·l-1 in der Pufferlösung unter Ausschluss eines elektrochemischen Gra- dienten überraschenderweise nur im Jejunum zwar geringe, aber signifikant von Null verschiedene Calcium-Nettofluxraten (4,4 ± 1,7 nmol·cm-2·h-1) bestimmen. An Epi- thelien wachsender Ziegen im Alter von fünf Monaten konnten unter gleichen Bedin- gungen Nettofluxraten in Höhe von 15,4 ± 4,7 nmol·cm-2·h-1 im Duodenum und 11,3 ± 2,0 nmol·cm-2·h-1 im Jejunum gezeigt werden. Die Fluxraten im Duodenum erschie- nen zwar nach einer 9-wöchigen alimentären Calcium-Depletion erhöht, dieser Effekt war jedoch statistisch nicht signifikant. Selbst bei neugeborenen, funktionell mono- gastrischen Schafen und Ziegen lagen die Nettofluxraten mit 6,9 ± 2,3 nmol·cm-2·h-1 bzw. 6,8 ± 4,4 nmol·cm-2·h-1 weit unter dem, was aufgrund von Erfahrungen aus Ver- suchen mit Ratten und Ferkeln zu erwarten war (SCHRÖDER et al. 1997). In einer neuen Studie mit Epithelien laktierender Schlachtkühe konnte sogar eine Netto- sekretion im Duodenum und im Jejunum festgestellt werden (LIESEGANG et al. 2006).
Vor dem Hintergrund der zuvor aufgeführten Daten aus Bilanzstudien erschien es deshalb nahe liegend, auch die Rolle des Vormagensystems als potenziell relevan- ten Ort der Calcium-Resorption beim Wiederkäuer zu untersuchen.
Am Epithel des Blättermagens konnten bei einer Calcium-Konzentration von 1 mmol·l-1 im Puffer unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten Nettoflux- raten von 3,0 ± 1,9 nmol·cm-2·h-1 festgestellt werden (HÖLLER et al. 1988 a).
Deutlicher sind die Hinweise auf einen aktiven Calcium-Transport im Pansen. An Epithelien von wachsenden Ziegen konnten Nettofluxraten von 16,5 ± 2,7 nmol·cm-2·h-1 bestimmt werden, die bei einer alimentären Calcium-Depletion signi- fikant auf 25,1 ± 2,5 nmol·cm-2·h-1 anstiegen (SCHRÖDER et al. 1997).
In vergleichbaren Versuchen mit Pansenepithelien von adulten Schafen konnte deut- lich die Abhängigkeit des ruminalen Calcium-Transportes von der Anwesenheit kurz- kettiger Fettsäuren (SCFA) gezeigt werden. Ohne SCFA in der mucosalen Puffer- lösung waren die Calcium-Nettofluxraten vernachlässigbar klein, nach Zugabe eines Gemisches von 36 mmol·l-1 Acetat, 15 mmol·l-1 Propionat und 9 mmol·l-1 Butyrat konnten jedoch Nettofluxraten in Höhe von 4,9 ± 0,7 nmol·cm-2·h-1 (SCHRÖDER et al.
1997) bzw. 6,3 ± 1,9 nmol·cm-2·h-1 (SCHRÖDER et al. 1999) festgestellt werden. An jüngeren, sechs Monate alten Schafen waren unter etwas anderen Bedingungen (je 13 mmol·l-1 Acetat, Propionat und Butyrat, 2 mmol·l-1 Calcium im Puffer) bereits früher Nettofluxraten in Höhe von 13,4 ± 7,5 nmol·cm-2·h-1 gemessen worden (HÖLLER et al. 1988 b). Ob es sich bei den Unterschieden bezüglich der Quantität der Calcium-Nettofluxraten um einen Alterseffekt handelt, ist bislang nicht geklärt. Ein- deutig belegt werden konnte jedoch in einer weiteren Studie eine lineare Abhängig- keit der Calcium-Nettofluxraten von der Konzentration an SCFA in der Pufferlösung und ein Einfluss der Fütterung der Versuchstiere (Tab. 2.2) (UPPAL et al. 2003).
Tab. 2.3: Effekte einer steigenden SCFA-Konzentration in der Pufferlösung und Einfluss der Fütterung auf die Calcium-Nettofluxraten [nmol·cm-2·h-1] ruminaler Epithelien vom Schaf (modifiziert nach UPPAL et al. 2003)
ohne SCFA 40 mmol·l-1 100 mmol·l-1
Heu 2,4 ± 0,6 9,6 ± 1,6 19,2 ± 3,3
Heu und Kraftfutter 5,6 ± 0,5 17,4 ± 0,7 34,5 ± 2,7
Auch an Pansenepithelien adulter Rinder ließen sich unter Ausschluss eines elektro- chemischen Gradienten Calcium-Nettofluxraten bestimmen, die eindeutig den posi- tiven Effekt der SCFA auf den Calcium-Transport belegen. Mit Zusatz von kurzket- tigen Fettsäuren in der gleichen Konzentration wie bei SCHRÖDER et al. 1997 wurden Fluxraten von 13,8 ± 1,8 nmol·cm-2·h-1 gefunden, während die entsprechenden Werte in Abwesenheit von SCFA nur bei 3,2 ± 0,9 nmol·cm-2·h-1 lagen (RICKEN 2005).
Aufgrund dieser Befunde wird von verschiedenen Autoren für das Vormagensystem ein Calcium/Protonen-Austauscher postuliert (SCHRÖDER et al. 1999; WADHWA &
CARE 2000; UPPAL et al. 2003). Bei einem physiologischen pH-Wert im Pansen zwi- schen 5,5 und 7,0 liegen die SCFA mit einem pK-Wert von im Mittel 4,8 zu einem gewissen Anteil in undissoziierter Form vor und können ihrer lipophilen Eigenschaf- ten wegen durch die apikale Membran der Epithelzellen diffundieren. Im Cytosol (pH nahe 7,0) dissoziieren die SCFA zu SCFA- und H+, und die Protonen könnten theo- retisch gegen luminale Ca2+-Ionen ausgetauscht werden (Abb. 2.3). Ein solcher Me-
chanismus wurde bereits früher für das Colon der Ratte angenommen (LUTZ &
SCHARRER 1991), konnte bislang jedoch nicht eindeutig belegt werden.
TRPV ?
PMCA
NCX ATP
ADP + Pi
Ca2+
HSCFA H+ H+
SCFA- H+
H+
Abb. 2.3: Postulierte Mechanismen des aktiven Calcium-Transportes über das Pansenepithel des Wiederkäuers (modifiziert nach BREVES et al. 1999), TRPV: epithelialer Calcium-Kanal, HSCFA: undissoziierte Fettsäuren, PMCA: membranständige Calcium-ATPase, NCX: Natrium/Calcium- Austauscher
In den zuvor beschriebenen Bilanzstudien (siehe 2.4.3.1) war es aufgrund des Ver- suchsdesigns nicht möglich, den Anteil des Vormagensystems an der gesamten präintestinalen Calcium-Resorption getrennt von dem des Labmagens zu ermitteln.
Da die transmuralen Potenzialdifferenzen im Labmagen niedriger sind als im Pansen (PDm 13-26 mV; DAKKAK et al. 1982) und aufgrund des dort herrschenden niedrige- ren pH-Wertes mehr Calcium in ionisierter und damit resorbierbarer Form vorliegt, ist es denkbar, dass dieses Organ einen nicht unerheblichen Beitrag zur Calcium- Resorption leistet. Im Labmagen von Schafen konnten bei sich spontan einstellenden Potenzialdifferenzen und einer Calcium-Konzentration von 1 mmol·l-1 auf der sero- salen Seite bei steigenden mucosalen Calcium-Konzentrationen ab 3 mmol·l-1 Calcium-Nettofluxraten beobachtet werden, die in linearer Beziehung zur mucosalen Konzentration standen (MAHLER 1991). Die Versuche in dieser Studie wurden jedoch
nicht unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten durchgeführt, so dass keine Aussagen darüber gemacht werden konnten, ob es sich im Labmagen um einen transzellulären, aktiven oder einen parazellulären, passiven Transport von Calcium handelt.
2.4.3.3 Strukturelle Untersuchungen
Da Calbindin-D9K und die Calcium-ATPase in der Plazenta von Schaf, Ziege und Rind (MORGAN et al. 1997; WOODING et al. 1996) und auch im Duodenum des Rindes (YAMAGISHI et al. 2002; YAMAGISHI et al. 2006) nachgewiesen werden konnten, er- scheint es nahe liegend, dass der unter 2.2.2 beschriebene Mechanismus des akti- ven, transzellulären Calcium-Transportes auch beim Wiederkäuer für die Calcium- Resorption von Bedeutung ist.
Calbindin-D9K konnte mithilfe des Western Blots zwar im Jejunum des Schafes, aber bislang nicht im Pansen nachgewiesen werden (SCHRÖDER et al. 2001). Auch im Pansen des Rindes misslang der Versuch, die Expression von Calbindin-D9K mithilfe von Northern-Blot-Analysen darzustellen (YAMAGISHI et al. 2002). An Gewebe der Ziege durchgeführte Northern-Blot-Analysen ergaben Hinweise auf eine Expression epithelialer Calciumkanäle im Bereich des mittleren Duodenums bis zum proximalen Jejunum, wobei keine Unterscheidung zwischen TRPV5 und TRPV6 vorgenommen wurde (HUBER, unveröffentlichte Ergebnisse). Tab. 2.3 gibt einen Überblick über die bis zu Beginn dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse struktureller Untersuchungen am Wiederkäuer.
Tab. 2.4: Übersicht über die bis zu Beginn dieser Arbeit auf RNA- oder Protein- ebene nachgewiesenen strukturellen Komponenten des von mono- gastrischen Spezies bekannten transzellulären Calcium-Transportes im Gastrointestinaltrakt verschiedener Wiederkäuer
(VDR: Vitamin D-Rezeptor, TRPV5/TRPV6: epitheliale Calciumkanäle, PMCA: membranständige Calcium-ATPase, +: vorhanden, -: nicht vor- handen, n. u.: nicht untersucht)
Spezies Gewebe VDR TRPV5 TRPV6 Calbindin PMCA
Pansen n. u. n. u. n. u. n. u. n. u.
Dünndarm +1,2 +5 +4 n. u.
Ziege
Colon +2 n. u. n. u. n. u. n. u.
Pansen +6 n. u. n. u. - 6 n. u.
Dünndarm +6 n. u. n. u. +6 n. u.
Schaf
Colon n. u. n. u. n. u. n. u. n. u.
Pansen n. u. n. u. n. u. n. u. n. u.
Dünndarm +8 n. u. n. u. +7,8 +8
Rind
Colon +3 n. u. n. u. -7 n. u.
1) SCHRÖDER et al. 1990; 2) SCHRÖDER et al. 1995; 3)GOFF et al. 1995; 4) RITTMANN
1996; 5) HUBER, unveröffentlichte Ergebnisse, ohne Unterscheidung zwischen TRPV5 und TRPV6; 6) SCHRÖDER et al. 2001; 7) YAMAGISHI et al. 2002; 8) YAMAGISHI
et al. 2006;
3 Material und Methoden
Zur besseren Übersichtlichkeit sind die verwendeten Lösungen, die sich auf Vorrat herstellen ließen, nach Kapiteln geordnet in alphabetischer Reihenfolge in den An- hängen A bis C aufgeführt. Pufferlösungen, die unmittelbar vor der Verwendung an- gesetzt wurden, werden in den entsprechenden Kapiteln beschrieben.
3.1 Tiermaterial
Es wurden fünf weibliche, circa ein Jahr alte und zwischen 60 und 70 kg schwere Schafe der Rasse „Schwarzköpfiges Fleischschaf“ verwendet, die 14 Tage vor dem ersten Schlachttermin von einem kommerziellen Zuchtbetrieb erworben und einge- stallt wurden. Die Fütterung bestand aus Heu ad libitum und einer Kraftfutterzulage von 100 g (B930/88 deuka Schaffutter; 1% Calcium, 0,4% Phosphor; deuka Deut- sche Tiernahrung GmbH & Co. KG, D-49565 Bramsche), so dass der mit 5 g pro Tag angegebene Calcium-Bedarf der Tiere (DLG-Futterwerttabellen „Wiederkäuer“) ge- deckt wurde.
Um ein eventuelles Auftreten von Gewebeschädigungen während der funktionellen Untersuchungen durch die Inkubationsbedingungen und einen Einfluss des pH- Wertes in der Pufferlösung auf der mucosalen Gewebeseite ausschließen zu kön- nen, wurden zwei Vorversuche durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Labmagene- pithelien von ebenfalls circa einem Jahr alten Schafen verwendet, die in einem in der Nähe liegenden Schlachthof getötet worden waren.
3.2 Probenentnahme
Die Tiere wurden mittels Bolzenschuss betäubt und durch einen Kehlschnitt entblu- tet. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurden Proben aus dem ventralen Pansensack, dem Fundusbereich des Labmagens, dem proximalen Duodenum, dem proximalen Jejunum und der Niere gewonnen. Bedingt durch die notwendige Dauer der funktio-
