A B Anti-TRPV6
C. Puffer und Lösungen für die funktionellen Untersuchungen Labmagenpuffer „SCFA-frei S1“
Substanz Moleku ht
[g·mol-1
on Konzentration
-1] largewic
]
Konzentrati
[mmol·l-1] [g·l
NaCl 58,44 115,0 6,721
KCl 74,55 5,0 0,373
CaCl ·2 H O 147,02 2 2 1,2 0,176
MgCl2·6 H2O 203,3 1,2 0,244
NaH PO ·H O 137,99 2 4 2 2,3 0,317
Na HPO ·2 H O 177,99 2 4 2 0,5 0,089
NaHCO3 84,01 21,0 1,764
Glucose (wasserfrei)
180,16 10,0 1,802
Mannit 182,17 2,0 0,364
pH-Wert Carbogen-begast, 37°C : 7,41
und mit 22,0 ml 1 N HCl auf den pH-Wert 3,0 (Carbogen-begast, 37°C), der Puffer „SCFA-frei
HCl auf Wert 5 ellt.
ext nzeichnet, stammten alle Chemikalien von den
el-de Haën, D-3 eelze, e, Serva,
D-69115 Heidelberg und Sigma-Aldrich, D-82024 Taufkirchen.
Der Puffer „SCFA-frei M1“ wurde nach dem gleichen Rezept hergestellt M2“ mit 20,0 ml 1 N den pH- ,85 eingest
Falls nicht anders im T Firmen Ried
geken
0926 S Carl Roth, D-76185 Karlsruh
In diesem Anhang finden sich in den Ab 9.7 die S en der PCR-kte im Vergleic equenzen and pezies, die im al Center for chnology Inform CBI) verfügba . Die Position bezieht sich immer auf ding fra F), bei partie Sequenzen auf den veröffentlichten iede in leotidsequenz erer Spezies zu der des Schafes sind D. Ergebnisse der Sequenzierung
b. 9.1 bis equenz
Produ h zu S erer S Nation
Biote ation (N r sind
den open rea me (OR llen
Teil. Untersch der Nuk and
grau hinterlegt (_), Primersequenzen schwarz (_). Die Stern ennzeichnen der uresequenz
icht anders ch gemacht, e mmen die Prim enzen dieser
af
chen k Abweichungen in Aminosä (*).
Sofern n kenntli ntsta ersequ
Arbeit.
GAPDH Sch atgcctcctgcaccaccaactgttggcccccctggccaaggtcat AF 030943 atgcctcctgcaccaccaactgttggcccccctggccaaggtcat
GAPDH Schaf ccatgaccactttggcatcgtggagggact AF 030943 ccatgaccactttggcatcgtggagggact
Abb. 9.1: Sequenzvergleich GAPDH; GAPDH Schaf: PCR-Produkt 4.1.1;
AF030943: partielle Sequenz GAPDH Schaf, Position 310 bis 385;
Primersequenzen: GARCIA-CRESPO et al. 2005
TRPV6 Schaf tgatgggagacactcactggcgtgtagcccacgagcgggatgagc TRPV6 Kaninchen tgatgggcgacactcactggcgggtggcccacgagcgagatgagc TRPV6 Maus tgatgggtgacactcactggagagttgcccatgagcgagatgagc M G D T H W R V A H E R D E
TRPV6 Schaf tctggagggcgcaggttgtagccaccactgtgatgctggagaaga TRPV6 Kaninchen tctggagggcccaggttgtggccaccaccgtgatgctggagcgga TRPV6 Maus tctggagagcacaggttgtggccaccactgtgatgttagagcgga L W R A Q V V A T T V M L E *
TRPV6 Schaf agctgc
TRPV6 Kaninchen agttgc
TRPV6 Maus agctac
K L
Abb. 9.2: Sequenzv Kaninchen
NM_022413, 1727 bis 1833 im ORF
9K
ergleich TRPV6; TRPV6 Schaf: PCR-Produkt 4.1.2; TRPV6 : DQ013292, Position 1730 bis 1825 im ORF; TRPV6 Maus:
Calbindin-D Schaf atccaaaccagctgtccaaggaggagctgaagctattgcttcaga Rind atccaaaccaactgtccaaggaggagctgaagctactgcttcaga Calbindin-D9K
Calbindin-D9K Maus atccggaccagctctccaaggaggagctaaagctgctgattcagt P * Q L S K E E L K L L * Q
Calbindin-D9K Schaf cggaattccccagtttgctgaagggtccaagcaccctcgatgagc Calbindin-D9K Rind cggaattccccagtttgctgaagggtccaagcaccctcgatgagc Calbindin-D9K Maus cagagttccccagcctcctgaaggcttcaagtactctggacaatc T E F P S L L K * * S T L D *
Calbindin-D9K Schaf tttttgaagaactggataagaacggtgatggag Calbindin-D9K Rind tttttgaagaactagacaagaatggagatggag Calbindin-D9K Maus tctttaaggagctggataagaatggcgatggag
L * * E L D K N G D G
Abb. 9.3: Sequenzv .1.3; Ca
Calbindin-albindin-D28K Schaf
ergleich Calbindin-D9K; Calbindin-D9K Schaf: PCR-Produkt 4 lbindin-D9K Rind: NM_174257, Position 68 bis 190 im ORF;
D9K Maus: NM_009789, 68 bis 190 im ORF
C tgtggatcagtatgggcagagagatgatggaaaaataggaattgt Calbindin-D28K Ratte tgtggatcaatatgggcagagagatgatgggaaaataggaattgt Calbindin-D28K Maus tgtggatcaatatggacagagagatgatggaaaaataggaattgt V D Q Y G Q R D D G K I G I V
Schaf agagttggctcatgtgttacccacagaagagaacttcctgc Calbindin-D28K
Calbindin-D28K Ratte agagttggcccatgtcttacccaccgaagagaatttcctgc Calbindin-D28K Maus agagttggctcacgtcttacccacagaagagaatttcttgc E L A H V L P T E E N F L
Abb. 9.4: Sequenzv Cal
Calbindin-ergleich Calbindin-D28K; Calbindin-D28K Schaf: PCR-Produkt 4.1.4; bindin-D28K Ratte: NM_031984, Position 183 bis 268 im ORF;
D28K Maus: NM_009788, 183 bis 268 im ORF
PMCA Schaf gcaatgggtattgctggaactgatgtagctaaagaagcatctgat gcaatgggtattgctggaactgatgtagctaaagaagcatctgat PMCA Kaninchen
PMCA Maus gcaatgggcattgctggaactgatgtggctaaagaagcgtctgat E A S D A M G I A G T D V A K
PMCA Schaf attattctcacggatgacaattttacaagcattgttaaagcagtt PMCA Kaninchen attattctcacagatgacaactttacaagtattgtgaaagcagtt PMCA Maus attattctcacagatgacaactttacaagcattgtcaaagcagtt V K A V I I L T D D N F T S I
PMCA Schaf atgtggggacg
PMCA Kaninchen atgtggggacg PMCA Maus atgtggggacg M W G
Abb. 9.5: Sequen
-Produkt ;
A M
zvergleich Calcium-ATPase (PMCA); PMCA Schaf: PCR 4.1.5; Kaninchen: X59069, Position 2436 bis 2536 im ORF PMC aus: NM_026482, 2436 bis 2536 im ORF
NCX Schaf agaagctgccctcctgttttgactacgtgatgcactttctgactg hen agaagctgccctcctgtttcgattatgtgatgcactttctgactg NCX1 Kaninc
NCX1 Maus agaagctgccctcctgttttgattacgtgatgcactttctcacag K L P S C F D Y V M H F L T V
NCX Schaf tgttctggaaggtcctcttcgcctttgtccccccgacagagtact NCX1 Kaninchen tattctggaaggtcctctttgccttcgtccctcctacagaatact NCX1 Maus tgttctggaaggttctgtttgccttcgtcccacctacagaatact F W K V L F A F V P P T E Y W
NCX Schaf ggaacggctgggcgtgtttcatcgtctccatcctcatgattggc NCX1 Kaninchen ggaatggctgggcttgcttcattgtctccatcctcatgattggc NCX1 Maus ggaatggctgggcctgcttcattgtctccatcctcatgatcggc
N G W A C F I V S I L M I G
Abb. 9.6: Sequenz Schaf: P bis 2340
RPV6 Schaf
vergleich Natrium/Calcium-Austauscher 1 (NCX1); NCX CR-Produkt 4.1.6; NCX1 Kaninchen: U52665, Position 2207 im ORF; NCX1 Maus: NM_011406, 2294 bis 2427 im ORF
T gccctgcgaactatagcgtggatctgcccttcatgtacagcatca TRPV6 Kaninchen gccccgccaactacgccgtggacctgcccttcatgtactgcatca TRPV6 Maus gccctgccaactatgacgtggatctgcccttcatgtacagcgtta P A N Y * V D L P F M Y * *
RPV6 Schaf cctacgctgccttcgccatcatcgctgctttgctcatgctcaacc T
TRPV6 Kaninchen cctacgccgccttcggcatcatcgccacactgctcatgctcaacc TRPV6 Maus cctacgctgcctttgccatcatcgccacactgctcatgcttaacc T Y A A F * I I A * L L M L N
f tcctcatcgctatgatgggagacactcactggcgtgtagcccacg TRPV6 Scha
TRPV6 Kaninchen tgctcatcgccatgatgggcgacactcactggcgggtggcccacg TRPV6 Maus tcctcattgccatgatgggtgacactcactggagagttgcccatg L L I A M M G D T H W R V A H
agcgggatgagctctggagggcgcaggttgtagccaccactgtga TRPV6 Schaf
TRPV6 Kaninchen agcgagatgagctctggagggcccaggttgtggccaccaccgtga TRPV6 Maus agcgagatgagctctggagagcacaggttgtggccaccactgtga E R D E L W R A Q V V A T T V
TRPV6 Schaf tgctggagaagaagctgccgcgttgcctgtggcctcgctctggga TRPV6 Kaninchen tgctggagcggaagttgccacgctgcctgtggcctcgctctggga TRPV6 Maus tgttagagcggaagctacctcgttgcctgtggcctcgctctggga M L E * K L P R C L W P R S G
RPV6 Schaf tctgcgggcgcaagttcgggctgggggaccgctggttcctgcggg T
TRPV6 Kaninchen tctgcggacgcaagtacggcctgggggaccgctggttcctgcggg TRPV6 Maus tatgtgggcgagagtatggtcttggcgaccgctggttcttgaggg I C G R * * G L G D R W F L R
TRPV6 Schaf tggaagagaaacaggacatcaaccagcagcgtgtccggcgctacg TRPV6 Kaninchen tggaagacaggcaggatctcaaccggcatcggatgcggcgctatg TRPV6 Maus tggaagacaggcaagatctcaacagacaacgcatccgccgctatg V E * * Q D * N * * R * R R Y
TRPV6 Schaf cacaggccttcca TRPV6 Kaninchen cgcaggccttcaa TRPV6 Maus cacaggccttcca A Q A F
Abb. 9.7: Sequenz TRPV6
TRPV6 Maus: NM_022413, 1625 bis 1952 im ORF;
Primerse
vergleich TRPV6; TRPV6 Schaf: PCR-Produkt 4.2.2.1;
Kaninchen: DQ013292, Position 1628 bis 1955 im ORF;
quenzen: HINTERDING 2002
E. Sondensequ
TRPV6 sen
GCGAAUUG
enzen
se-Sonde (T7):
GG GGCCCGACGU CGCAUGCUCC CGGCCGCCAU GGCGGCCGCG GGAAUUCGAU UGCCCUGCGA ACUAUAGCGU GGAUCUGCCC UUCAUGUACA GCAUCACCUA CGCUGCCUUC GCCAUCAUCG CUGCUUUGCU CAUGCUCAAC CUCCUCAUCG CUAUGAUGGG AGACACUCAC UGGCGUGUAG CCCACGAGCG GGAUGAGCUC UGGAGGGCGC AGGUUGUAGC CACCACUGUG AUGCUGGAGA AGAAGCUGCC GCGUUGCCUG UGGCCUCGCU CUGGGAUCUG CGGGCGCAAG UUCGGGCUGG GGGACCGCUG GUUCCUGCGG GUGGAAGAGA AACAGGACAU CAACCAGCAG CGUGUCCGGC GCUACGCACA GGCCUUCCAA AUCACUAGUG
TRPV6 ant
AGAAUACUCA AGCUAUGCAU CCAACGCGUU GGGAGCUCUC CCAUAUGGUC GACCUGCAGG
isense-Sonde (SP6):
CGGCCGCGAA UUCACUAGUG AUUUGGAAGG CCUGUGCGUA GCGCCGGACA CGCUGCUGGU UGAUGUCCUG UUUCUCUUCC ACCCGCAGGA ACCAGCGGUC CCCCAGCCCG AACUUGCGCC CGCAGAUCCC AGAGCGAGGC CACAGGCAAC GCGGCAGCUU CUUCUCCAGC AUCACAGUGG UGGCUACAAC CUGCGCCCUC CAGAGCUCAU CCCGCUCGUG GGCUACACGC CAGUGAGUGU CUCCCAUCAU AGCGAUGAGG AGGUUGAGCA UGAGCAAAGC AGCGAUGAUG GCGAAGGCAG CGUAGGUGAU GCUGUACAUG AAGGGCAGAU CCACGCUAUA GUUCGCAGGG CAAUCGAAUU CCCGCGCGGC CGCCAUG
TR
AGAAUACUCA AGCUAUGCAU CCAACGCGUU GGGAGCUCUC CCAUAUGGUC GACCUGCAGG
PV5 sense-Sonde (SP6):
CGGCCGCGAA UUCACUAGUG AUUCAAGAAG AAAGAGGCUC GACAGAUUCU AGAACAGACC CCAGUGAAGG AGCUGGUGAG CCUGAAGUGG AAGAAAUAUG GACAGCCUUA UUUCUGCCUC CUGGGUGCUC UGUACAUCUU CUACAUGGUC UGCUUCACCA CAUGCUGUGU UUACCGCCCC CUCAAGUUCC GAGAUGCCAA CCGUACACAU GUUCGAGAUA ACACCAUCAU GGAACAGAAA UCACUACAGG AAGCAUAUGU GACUUACCAG GAUAAGAUCC GGCUGGUCGG GGAGUUGGUG ACAGUCAUUA AUCGAAUUCC CGCGCGGCCG CCAUG
Sonde (T7):
TRPV5
antisense-GGGCGAAUUG GGCCCGACGU CGCAUGCUCC CGGCCGCCAU GGCGGCCGCG GGAAUUCGAU UAAUGACUGU CACCAACUCC CCGACCAGCC GGAUCUUAUC CUGGUAAGUC ACAUAUGCUU CCUGUAGUGA UUUCUGUUCC AUGAUGGUGU UAUCUCGAAC AUGUGUACGG UUGGCAUCUC GGAACUUGAG GGGGCGGUAA ACACAGCAUG UGGUGAAGCA GACCAUGUAG AAGAUGUACA GAGCACCCAG GAGGCAGAAA UAAGGCUGUC CAUAUUUCUU CCACUUCAGG CUCACCAGCU CCUUCACUGG GGUCUGUUCU AGAAUCUGUC GAGCCUCUUU CUUCUUGAAU CACUAGUG
Abb. 9.8: Sequenzen der in den In-situ-Hybridisierungen verwendeten RNA-Sonden; die spezifischen Bereiche sind grau unterlegt (_)
10 Dan
Herrn Apl. Prof. Dr. B. Schröder für die Überlassung des interessanten Themas, us
n
… Herrn Prof. Dr. Brinkmeyer und Frau Dr. Christiane Kunert-Keil für die schöne Zeit in Karlsburg und die Einführung in die In-situ-Hybridisierung
… Herrn Prof. Dr. W. Meyer und Frau Marion Gähle für die Nutzung des Mikrotoms und die vielen Ratschläge rund um das Anfertigen von Gewebeschnitten
… Frau PD Dr. Korinna Huber für die Bereitstellung des Cyclers und die Einweisung am Fluoreszenzmikroskop
… Frau Dr. Sabine Leonhard-Marek für viele wertvolle Hinweise
… Frau Marion Burmester, Frau Ulrike Dringenberg und Frau Marion Loh für die Unterstützung bei der Durchführung der funktionellen Untersuchungen
… Frau Susanne Hoppe für die Tipps zum Umgang mit Antikörpern
… Julia Kock, Gundula Ricken, Dirk Voigtländer, Yvonne Armbrecht und Michael Rohde für die Hilfe beim Schlachten
… Alexandra Muscher für all die Diskussionen über PTH, Calcitriol, das interessante Calcitonin und den Rest der Welt
… „meinem Mann in Schottland“ Michell für die Videokonferenzen zum Thema PCR-Optimierung
… Ulf und Miriam für die Nutzung des Bauwagens und die langen Abende am Feuer
… Jana, Jutta und Gundula für die Jagd nach dem Fehlerteufel
… Purzel und May für das „kurz mal eben durch die Bibliothek huschen“
… meiner Familie für Ihre Unterstützung und Ihr Vertrauen in meine Fähigkeiten
… und natürlich Micha – für alles!
ksagung
tzt möchte ich all diejenigen erwähnen, die das Entstehen dieser Arbeit unterstützt oder überhaupt erst möglich gemacht haben. Mein herzlicher
of. Dr. G. Breves für die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und
…
seine Disk meine eige
sionsbereitschaft und die engagierte Betreuung; die Möglichkeit, auch en Ideen umsetzen zu können und einige Käsebrötchen