Untersuchungen zur Regulation
der jejunalen Calcium-Resorption beim Schaf
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Nina Mrochen
Mainz
Hannover 2010
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. B. Schröder
2. Gutachter: Prof. Dr. H. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2010
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHR 342/8-1) unterstützt.
Für Lea
Wilkens, M., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2009):
Gastrointestinal calcium (Ca) transport in sheep as affected by dietary Ca and treatment with 1.25-dihydroxyvitamin D3.
Poster: XIth International Symposiumon Ruminant Physiology 06. - 09.09.2009 in Clermont - Ferrand
Wilkens, M., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2009):
Effect of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 on macromineral homeostasis of sheep fed different levels of calcium.
Poster: 14th Workshop on Vitamin D 04. - 08.10.2009 in Brügge
Wilkens, M.R., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2010):
Effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on calcium and phosphorus homeostasis in sheep fed diets either adequate or restricted in calcium content.
Domestic Animal Endocrinology 38 (2010) 190 - 199 Mrochen, N., Wilkens, M., Breves, G., Schröder, B. (2010):
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zum intestinalen Calcium-Transport beim Schaf.
Vortrag: 19. Symposium der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft
14. - 16.02.2010 in Hannover
Wilkens, M.R., Mrochen, N., Breves, G., Schröder, B. (2010):
Gastrointestinal calcium transport in sheep as affected by calcitriol and dietary calcium supply.
Vortrag: 14th Congress of the European Society of Veterinary and Comparative Nutrition 06. - 08.09.2010 in Zürich
I
Abkürzungsverzeichnis... IV Abbildungsverzeichnis... VI Tabellenverzeichnis ... IX
1 Einleitung ... 1
1.1 Bedeutung und Aufrechterhaltung der Calcium- Homöostase ... 1
1.2 Mechanismen des intestinalen Ca2+-Transports ... 3
1.2.1 Parazellulärer Ca2+-Transport ... 4
1.2.2 Transzellulärer Ca2+-Transport ... 4
1.2.2.1 Einstrom über die apikale Membran durch TRPV-Kanäle ... 4
1.2.2.2 Transport durch das Cytosol mittels Calbindin ... 6
1.2.2.3 Ausschleusung über die basolaterale Membran ... 7
1.3 Regulation des intestinalen Ca2+-Transports ... 8
1.4 Gastrointestinaler Ca2+-Transport beim Wiederkäuer ... 9
1.5 Zielsetzung ... 12
2 Material und Methoden ... 13
2.1 Material ... 13
2.1.1 Tiere ... 13
2.1.2 Fütterung ... 13
2.1.3 Behandlung ... 14
2.1.4 Entnahme der Blutproben ... 15
2.1.5 Entnahme der Gewebeproben ... 16
2.2 Analytische Methoden ... 16
2.2.1 Konzentrationsbestimmungen in Plasmaproben ... 16
2.2.1.1 Gesamtcalcium ... 16
2.2.1.2 Phosphat ... 17
2.2.1.3 Calcitriol ... 18
2.2.2 Proteinkonzentration in Gewebepräparationen... 18
2.2.3 Enzymaktivitäten in Gewebepräparationen ... 19
2.2.3.1 Alkalische Phosphatase ... 19
2.2.3.2 Na+/K+-ATPase ... 19
2.3 Präparative Methoden ... 20
2.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese ... 20
2.3.2 Präparation von Rohmembranen ... 22
2.3.3. Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel (BSMV) ... 22
2.4 Expressionsstudien ... 26
2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 26
2.4.1.1 ß-Aktin PCR ... 27
2.4.2 Die quantitative RT-PCR ... 27
2.4.2.1 Standardreihe für die Quantifizierung PMCA-spezifischer Transkripte 27 2.4.2.2 TaqMan-PCR ... 31
II
2.4.2.3 Auswertung ... 32
2.4.3. Western Blot Analysen ... 33
2.4.3.1 SDS-Polyacrylamidelektrophorese ... 33
2.4.3.2 Tank-Blot-Verfahren ... 33
2.4.3.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen ... 34
2.4.3.4 Überprüfung der Spezifität des Antikörpers gegen die PMCA ... 35
2.4.3.5 Enzymatische Deglykosilierung des TRPV6-Proteins... 36
2.5 Funktionelle Studien ... 36
2.5.1 Durchführung der Aufnahmestudien in BSMV ... 36
2.5.2 Berechnung von [Ca2+]frei ... 37
2.5.3 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Glukoseaufnahme ... 38
2.5.4 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Calciumaufnahme ... 38
2.5.5 Inkubationsansatz zur konzentrationsabhängigen Calciumaufnahme . 39 2.5.6 Berechnung der Calciumaufnahme und der kinetischen Kenngrößen . 39 2.5.8 Einfluss des Calcium-Kanal-Blockers Ruthenium Rot auf die Calciumaufnahme in jejunale BSMV ... 41
2.6 Statistik ... 41
3 Ergebnisse ... 42
3.1 Charakterisierung des Tiermodells... 42
3.1.1 Einfluss der Fütterung auf wichtige Blutparameter ... 42
3.1.2 Unterschiede der Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma 12 h nach der Behandlung ... 43
3.2 RNA-Expression ... 43
3.3 Nachweis und Quantifizierung der spezifischen Transport-proteine im Jejunum ... 45
3.3.1 Semiquantitative Detektion des TRPV6-Proteins ... 45
3.3.2 Spezifität des PMCA-Protein-Nachweises ... 48
3.3.3 Semiquantitative Detektion des PMCA-Proteins ... 49
3.4 Charakterisierung der BSMV ... 51
3.4.1 Anreicherung der Bürstensaummembranfraktionen ... 51
3.4.2 Überprüfung der Funktionsfähigkeit der BSMV ... 52
3.4.2 Ca2+-Aufnahmeraten in jejunale BSMV ... 54
3.4.3 Der Einfluss des Calcium-Kanalblockers Ruthenium Rot auf die Ca2+- Aufnahme in jejunale BSMV ... 58
4 Diskussion ... 59
4.1 Beurteilung des Tiermodells ... 59
4.2 Beurteilung der angewandten Methoden ... 60
4.2.1 Quantitative RT-PCR ... 60
4.2.2 Western Analyse ... 61
4.2.3 Qualität der BSMV ... 64
4.2.4 Bestimmung der Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV... 66
III
4.3 Effekt der Calcium-Depletion bzw. der Calcitriolbehandlung auf die
Ca2+-Transportkomponenten im Jejunum ... 70
4.3.1 Expressionsstudien ... 70
4.3.2 Funktionelle Untersuchungen ... 75
4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick... 81
5 Zusammenfassung ... 83
6 Summary ... 85
7 Literaturverzeichnis ... 87
Anhang ... 102
A. Puffer und Lösungen für die Präparation von Gesamtmembranen und BSMV ... 102
B. Puffer und Lösungen für die Western Analyse ... 103
C. Puffer für die funktionellen Untersuchungen ... 104
Danksagung ... 105
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ANOVA analysis of variance (Varianzanalyse) A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) A. bidest. Aqua bidestillata
ATP(ase) Adenosintriphosphat(ase) bp base pairs (Basenpaare) BSMV Bürstensaummembranvesikel Ca2+ ionisiertes Calcium
[Ca2+]frei Konzentration freier Ca2+-Ionen
CaCo-2 colorectal adenocarcinoma cells (coloraktale Adenokarzinom Zellen) cDNA complementary DNA (komplementäre DNA)
cpm counts per minute (Impulse pro Minute)
Ct threshold cycle (PCR-Zyklus, in dem die Reporterfluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt)
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP 2′-Desoxyribonukleosid-5′-triphosphat
DTT Dithiothreitol
EGTA Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetat
g Vielfaches der Erd- oder Normalbeschleunigung (gn = 9,80665 m · s-2) GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
h hour (Stunde)
HEK human embyonic kidney (Nierenzellkultur)
HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N′-2-ethansulfonsäure i. m. intramuskulär
i. v. intravenös
V Km MICHAELIS-MENTEN-Konstante,
Halbsättigungskonstante bei sättigbarem Transport MDBK Madin-Darby bovine kidney (Nierenzellkultur) min Minute(n)
NCX Na+/Ca2+- exchanger (Na+/Ca2+-Austauscher) p probability value (Irrtumswahrscheinlichkeit)
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PMCA Plasmamembran-Ca2+-ATPase
PMSF Phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride PTH Parathormon
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur
s Sekunde(n)
SEM standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes) Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
TRP(V) transient receptor potential (vannilloid) channel
U unit
uS ursprüngliche Substanz VDR Vitamin D-Rezeptor
VDRE vitamin D responsive element Vmax maximale Aufnahmerate
WT Wildtyp
x arithmetisches Mittel
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: Klassisches Modell des transzellulären Ca2+-Transports in intestinalen (Calbindin-D9K-vermittelt) und renalen Epithelien
(Calbindin-D28K-vermittelt) monogastrischer Tiere; Erläuterungen im Text (1.2.2.1 bis 1.2.2.3); Wilkens 2006. ... 7 Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Präparation von jejunalen BSMV (g
bezieht sich auf rmax, die Zeitangaben beziehen sich auf die gesamte Zentrifugationsdauer). ... 25 Abb. 3.1: Darstellung der mRNA-Gehalte an GAPDH im Jejunum adäquat bzw.
restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung (x ± SEM, Anzahl der Tiere in
Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA. ... 44 Abb. 3.2: Darstellung der mRNA-Gehalte an TRPV6 im Verhältnis zu GAPDH
im Jejunum adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung (x ± SEM,
Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: ***:
p < 0,001. ... 44 Abb. 3.3: Darstellung der mRNA-Gehalte an PMCA im Verhältnis zu GAPDH
im Jejunum adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo-Behandlung (x ± SEM,
Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way ANOVA: *: p
< 0,05, ***: p < 0,001. ... 45 Abb. 3.4: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des TRPV6-
Proteins in jejunalen Membranen vom Schaf, exemplarische Membran: unbehandelte und behandelte Tiere der Calcium- Depletions-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit einem
unbehandelten, jeweils abwechselnd aufgetragen. ... 46 Abb. 3.5: Der zur Abbildung 3.4 dazugehörige semiquantitative Nachweis von
Villin ... 46 Abb. 3.6: Densitometrische Werte der TRPV6-Expression bezogen auf die
Villin-Expression, auf der betreffenden Membran sind jeweils fünf unbehandelte und fünf behandelte Tiere der Kontrollfütterungsgruppe aufgetragen. ... 47 Abb. 3.7: Expression des TRPV6-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der
unbehandelten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der behandelten Tiere normiert auf diese aufgetragen (x ± SEM, Anzahl
VII
der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05,
**: p < 0,01. ... 47 Abb. 3.8: Expression des TRPV6-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der adäquat gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der Ca- restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese aufgetragen (x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *:
p < 0,05, **: p < 0,01. ... 48 Abb. 3.9: Überprüfung der PMCA-Antikörper-Spezifität an Gesamtmembranen
verschiedener Darmabschnitte von Ratte (1), Huhn (2), Jejunum (3), Colon (4) und Pansen (5) vom Schaf. ... 49 Abb. 3.10: Typisches Beispiel des semiquantitativen Nachweises des PMCA-
Proteins in jejunalen Membranen vom Schaf, exemplarische Membran: behandelte Tiere der Calcium-Depletions- bzw. der Kontroll-Fütterungsgruppe sind, beginnend mit den restriktiv
gefütterten, jeweils abwechselnd aufgetragen. ... 49 Abb. 3.11: Expression des PMCA-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach einer Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-
Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der unbehandelten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der behandelten Tiere normiert auf diese aufgetragen (x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p <
0,05. ... 50 Abb. 3.12: Expression des PMCA-Proteins in Gesamtmembranen jejunaler
Enterozyten adäquat bzw. restriktiv mit Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach einer Calcitriol- (graue Säulen) bzw. Placebo-
Behandlung (weiße Säulen); der Mittelwert der Expressionswerte der adäquat gefütterten Gruppe ist gleich 1 gesetzt und die Expression der Calcium-restriktiv gefütterten Tiere normiert auf diese
aufgetragen (x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05... 50 Abb. 3.13: Zeitabhängige Glukoseaufnahme in jejunale BSMV bei RT und
0,05 mmol∙l-1 Glukose in An- und Abwesenheit von Na+ im
Inkubationsmedium. ... 53 Abb. 3.14: A23187-Quotient (Quotient der Ca2+-Aufnahme mit und ohne Zusatz
des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+-
VIII
Konzentration von 0,09 mmol∙l-1) der vier Versuchsgruppen (x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way
ANOVA: ***: p < 0,001. ... 53 Abb. 3.15: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV mit und ohne
Zusatz des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+- Konzentration von 0,09 mmol∙l-1. ... 54 Abb. 3.16: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV in den ersten 50 s
bei RT und einer freien Ca2+-Konzentration von 0,09 mmol∙l-1. ... 55 Abb. 3.17: Ca2+-Gesamtaufnahmerate in jejunale BSMV bei RT mit den
dazugehörigen unspezifischen Aufnahmeraten und den daraus resultierenden spezifischen Ca2+-Aufnahmeraten und den
berechneten Vmax und Km-Werten von 2 Schafen. ... 56 Abb. 3.18: Spezifische Ca2+-Aufnahmerate in jejunale BSMV unbehandelter
(gestrichelte Linien) bzw. mit Calcitriol behandelter (durchgezogene Linien), adäquat (schwarze Linien) bzw. restriktiv mit Calcium (graue Linien) versorgter Schafe in Abhängigkeit von der freien Ca2+-
Konzentration (Kurven stellen Mittelwerte von je 5 Tieren da). ... 57 Abb.3.19: Maximale Transportkapazität (Vmax) der Ca2+-Aufnahme in jejunale
BSMV der vier Gruppen (x ± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern);
Ergebnisse der 2-way ANOVA. ... 57 Abb. 3.20: Km-Werte der Ca2+-Aufnahme in jejunale BSMV der vier Gruppen (x
± SEM, Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der 2-way
ANOVA. ... 58 Abb. 4.1: Korrelation von PMCA mRNA mit TRPV6 mRNA. ... 71 Abb. 4.2: Ca2+-Gesamtaufnahme nach 30 s bei freier Ca2+-Konzentration von
0,09 mmol∙l-1 in jejunale BSMV von adäquat bzw. restriktiv mit
Calcium versorgter Schafe 12 Stunden nach Calcitriol- bzw. Placebo- Behandlung ... 79
IX
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1: Zusammensetzung der Pellets (in % der ursprünglichen Substanz
(uS)) ... 14
Tabelle 2.2: Mittlere tägliche Aufnahme an Nährstoffen und Mineralstoffen pro Tier und Tag (geschätzt anhand von Gruppenmittelwerten über 4 Wochen) in g bzw. % der TS (x ± SEM, n = Anzahl der Tiere) ... 15
Tabelle 2.3: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von β-Aktin ... 27
Tabelle 2.4: Primersequenzen für die PCR zum Nachweis von PMCA1b ... 28
Tabelle 2.5: Pipettierschema der PMCA-PCR... 28
Tabelle 2.7: Pipettierschema der TaqMan-PCR ... 32
Tabelle 2.8: Sondensequenz ... 32
Tabelle 2.7: Antikörper und Inkubationsbedingungen für den spezifischen Proteinnachweis ... 35
Tabelle 3.1: Ca-, Ca2+-, Pi- und Calcitriol-Konzentration im Plasma (Ca, Pi, Calcitriol) bzw. Vollblut (Ca2+) von Schafen nach einer mindestens vierwöchigen diätetischen Calcium-Depletion (x ± SEM, n = Anzahl der Tiere), Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 ... 42
Tabelle 3.2: Ca-, Ca2+- und Pi-Konzentration im Plasma (Ca, Pi) bzw. Vollblut (Ca2+) von Schafen 12 h nach Calcitriolbehandlung, Vergleich zwischen den behandelten und den unbehandelten Tieren einer Fütterungsgruppe (x ± SEM, n = Anzahl der Tiere), Ergebnisse des Students t-Tests: *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 ... 43
Tabelle 3.3: Spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) und der Na+/K+-ATPase im Ausgangshomogenat und der Vesikelsuspension. Darstellung der Anreicherungsfaktoren als Quotient aus den Werten von Suspension und Homogenat. Relative Anreicherung wurde als Quotient aus BSM:BLM dargestellt. (x ± SEM, n = Anzahl der Tiere) ... 51
1
1 Einleitung
1.1 Bedeutung und Aufrechterhaltung der Calcium- Homöostase
Calcium besitzt nicht nur in seiner ionisierten Form die Funktion eines Second messengers, sondern ist auch darüber hinaus in vielfältiger Weise an verschiedenen Abläufen innerhalb des Körpers, wie zum Beispiel der Muskelkontraktion, der präsynaptischen Ausschüttung von Neurotransmittern, der Blutgerinnung sowie der Sekretionstätigkeit verschiedener Drüsen, beteiligt (RAMASAMY 2006). Es ist daher essentiell, dass die Calcium-Konzentration im Plasma konstant gehalten wird, bei den meisten Säugetieren je nach Alter und Spezies zwischen 2,2 und 2,5 mmol∙l-1 (SCHRÖDER & BREVES 2006).
Für die enge Regulation des Plasmacalciumspiegels sind die drei Hormone Calcitriol, Parathormon (PTH) und Calcitonin, die in unterschiedlicher Weise auf den Gastrointestinaltrakt, die Niere und das Skelettsystem wirken, von entscheidender Bedeutung (RAMASAMY 2006).
Das Steroidhormon Calcitriol, die biologisch aktivste Form des Vitamin D, entsteht im Körper durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere aus dem mit der pflanzlichen Nahrung als Ergocalciferol (Vitamin D2) aufgenommenen oder mit der tierischen Nahrung aufgenommenen bzw. UV-Licht-abhängig körpereigen gebildetem Prohormon Vitamin D3 (Cholcalciferol). Der in der Niere ablaufende zweite Hydroxylierungsschritt am C1 wird durch die 1α-Hydroxylase katalysiert, deren Aktivität streng reguliert ist (FRASER & KODICEK 1970). Ein erniedrigter Calciumspiegel (BUSHINSKY et al. 1985), ein niedriger Phosphatspiegel (TANAKA
&DELUCA 1973), sowie erhöhtes PTH (GARABEDIAN et al. 1972) führen zu einer Aktivierung des Enzyms. Calcitriol selbst wirkt über negative Feedback- Mechanismen hemmend auf die 1α-Hydroxylase (TRECHSEL et al. 1979, SHINKI et al. 1997).
Calcitriol wirkt über eine gesteigerte Expression von Strukturen, die an der gastrointestinalen Resorption (siehe auch 1.2.2) und der renalen Rückresorption von Calcium beteiligt sind, stimulierend auf die Aufnahme aus der Nahrung und hemmt gleichzeitig dessen renale Ausscheidung (HOENDEROP et al. 2005). Vermittelt wird die genomische Wirkung durch Bindung an einen spezialisierten Vitamin D-Rezeptor (VDR), der als ligandenaktivierter Transkriptionsfaktor fungiert und sich nach Bildung eines Heterodimers mit dem Retinoid X Rezeptor (RXR) an Vitamin D-abhängige
2
Elemente (VDREs) in den Promotorregionen der entsprechenden Zielgene anlagert und so die Transkription reguliert (HOENDEROP et al. 2005). Am Knochen kann Calcitriol auf unterschiedliche Weise wirken. Zum einen unterstützt ein erhöhter Calcitriolspiegel die Mineralisierung des Skelettsystems, dabei handelt es sich aber vermutlich um einen indirekten Effekt durch die vermehrte Bereitstellung von Calcium im Blut. Zum anderen fördert Calcitriol im Zusammenspiel mit PTH die Mobilisation von Calcium aus dem Knochen (BROWN et al. 1999).
Neben den relativ langsamen genomischen Effekten konnten auch Calcitriol- Wirkungen beobachtet werden, die innerhalb von Sekunden bzw. Minuten eintreten.
Bei Hühnern kam es durch Zugabe von Calcitriol ins Lumen innerhalb von wenigen Minuten zu einer Steigerung des Calcium-Transportes im Duodenum (NEMERE et al. 1984). Bei dem als „Transcaltachia“ bezeichneten Vorgang wird Calcium apikal in endozytotische Vesikel aufgenommen und nach Verschmelzung mit Lysosomen zur basolateralen Seite transportiert, wo es durch Exozytose freigesetzt wird. Als membranständiger Rezeptor, der diese nichtgenomische Wirkung vermitteln soll, wurde der 1,25D3-MARRS identifiziert (NEMERE et al. 2004).
Das in der Nebenschilddrüse gebildete Parathormon (PTH), ein Peptidhormon mit 84 Aminosäuren, spielt unter physiologischen Bedingungen eine entscheidende Rolle bei der Regulation kurzzeitiger Schwankungen des Plasmacalciumlevels (HOENDEROP et al. 2005). Bei einem vom Calcium-sensing-Rezeptor (CaR) registrierten Abfall der Ca2+-Konzentration wird PTH, aufgrund der Speicherung in Form von Sekretgranula in der Nebenschilddrüse, innerhalb weniger Sekunden freigesetzt (BROWN & MACLEOD 2001) und wirkt hauptsächlich an Niere und Knochen über Bindung an den membranständigen Parathormon-Rezeptor. PTH steigert die tubuläre Rückresorption von Calcium in der Niere (GREGER et al. 1978) und fördert die Mobilisation aus dem Knochen. Außerdem erhöht PTH durch Aktivierung der 1α-Hydroxylase die Synthese von Calcitriol und wirkt somit indirekt auch auf die intestinale Calciumresorption (HOENDEROP et al. 2005). Eine längerfristige pathologische Erniedrigung des Calciumspiegels bzw. eine Calcium- Phosphor-Imbalanz kann zu einem sekundären Hyperparathyreoidismus mit dauerhaft erhöhten PTH-Spiegeln führen.
Calcitonin, ein Peptidhormon mit 32 Aminosäuren, wird bei einem erhöhten Plasmacalciumspiegel aus den C-Zellen der Schilddrüse freigesetzt. Durch
3
Unterdrückung der resorptiven Effekte von PTH am Knochen fördert Calcitonin eine vermehrte Einlagerung von Calcium in das Skelettsystem (PECHET et al. 1967).
Physiologischerweise auftretende, vorübergehende Belastungen der Calcium- Homöostase, wie z.B. ein erhöhter Bedarf während des Wachstums oder eine verminderte Verfügbarkeit von Calcium in der Nahrung, erfordern ein komplexes Zusammenspiel der genannten Regulationsmechanismen. Besondere Herausforderungen treten dabei beim weiblichen Tier auf. Bedingt durch die massive Bedarfserhöhung während der Trächtigkeit und die sehr plötzlich eintretende zusätzliche Belastung des Calcium-Haushaltes durch Einsetzen der Laktation muss die Adaptation besonders effizient bzw. schnell erfolgen.
Da beim Wiederkäuer negative Calcium-Bilanzen nicht durch Verminderung der basal schon sehr niedrigen renalen Calcium-Ausscheidung ausgeglichen werden können (BRAITHWAITE & RIAZUDDIN 1971), geschieht dies vermutlich hauptsächlich durch eine vermehrte Mobilisation aus dem Skelett und eine Steigerung der Resorption aus dem Gastrointestinaltrakt.
Beim monogastrischen Tier findet eine regulierte und bei erhöhtem Bedarf entsprechend angepasste intestinale Resorption hauptsächlich im Duodenum statt (PANSU et al. 1983). Aus zahlreichen Untersuchungen ist jedoch bekannt, dass sich die Lokalisation und die genauen Mechanismen der gastrointestinalen Calcium- Resorption des Wiederkäuers von denen des monogastrischen Tieres zumindest teilweise unterscheiden. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass das Duodenum weder beim Rind noch beim Schaf eine bedeutende Rolle für die intestinale Absorption von Calcium hat (siehe 1.4). Stattdessen scheint beim Wiederkäuer, neben der präintestinalen Calcium-Aufnahme, die Resorption schwerpunktmäßig im Jejunum lokalisiert zu sein. (PHILLIPSON & STORRY 1965, BEN-GHEDALIA et al.
1975, SCHRÖDER & BREVES 2006).
1.2 Mechanismen des intestinalen Ca
2+-Transports
Der intestinale Transport von Calcium in seiner ionisierten Form (Ca2+) kann prinzipiell auf zwei unterschiedlichen Wegen ablaufen: parazellulär über einen nicht- sättigbaren, passiv verlaufenden Transport und transzellulär über einen aktiven Transport.
4 1.2.1 Parazellulärer Ca2+-Transport
Der parazelluläre Ca2+-Transport über die Tight junctions stellt einen von der luminalen Konzentration und dem elektrischen Gradienten abhängigen Diffusionsprozess dar, der prinzipiell entlang der gesamten Darmachse stattfinden kann (BRONNER et al. 1986). Da die Menge an parazellulär transportiertem Ca2+
positiv mit der Verweildauer des Chymus in den einzelnen Darmabschnitten korreliert, tritt bei normaler Calcium-Versorgung diese Transportform beim monogastrischen Tier vor allem im distalen Dünndarm, d. h. im Ileum auf (BRONNER 2003), wo die mittlere Verweildauer mit 100-120 min um ein Vielfaches größer ist als im Duodenum mit nur 2-6 min (MARCUS & LENGEMANN 1962). Die quantitative Bedeutung des parazellulären Transports am Gesamt-Ca2+-Transport ist von der alimentären Calcium-Versorgung abhängig (BRONNER & PANSU 1999).
Eine weitere mögliche Triebkraft des parazellulären Transports stellt der Solvent drag-Mechanismus dar. Hierbei wird durch aktive Resorption anderer Stoffe, wie zum Beispiel Na+-Ionen oder Glukose ein osmotischer Gradient erzeugt, der zu einem parazellulären Nachströmen von Wasser mit den darin gelösten Ionen, unter anderem Calcium, führt (KARBACH 1992).
1.2.2 Transzellulärer Ca2+-Transport
Der transzelluläre Ca2+-Transport ist ein sättigbarer, aktiv ablaufender Prozess, der Ca2+ prinzipiell auch gegen einen Gradienten aus dem Darmlumen ins Blut transportiert. Mengenmäßig tritt diese Transportform besonders in Belastungssituationen, wie einer niedrigen Calciumverfügbarkeit in der Nahrung, in den Vordergrund (BRONNER & PANSU 1999). Er gliedert sich in drei Teilschritte (apikaler Calcium-Einstrom, cytosolischer Calcium-Transfer, basolaterale Calcium- Ausschleusung) (BRONNER et al. 1986, BRONNER 1992). Beim monogastrischen Tier ist er hauptsächlich im proximalen Dünndarm, vor allem im Duodenum lokalisiert und unterliegt einer Regulation durch Calcitriol (PANSU et al. 1983, BRONNER 1992).
1.2.2.1 Einstrom über die apikale Membran durch TRPV-Kanäle
Der Einstrom von Ca2+ in die Zelle erfolgt passiv entlang eines steilen elektrochemischen Gradienten durch zwei einander sehr ähnliche, spezifische Ca2+-
5
Kanäle (TRPV5 und TRPV6) der Bürstensaummembran. Die initiale Calcium- Aufnahme über die TRPV-Kanäle wird als geschwindigkeitslimitierender Schritt des Gesamtprozesses angesehen. (HOENDEROP et al. 2002a, NIJENHUIS et al. 2005).
Der TRPV5-Kanal wurde erstmals in Niere, Dünndarm und Plazenta des Kaninchens beschrieben (HOENDEROP et al. 1999), zeitnah dazu konnte der TRPV6-Kanal im Darm der Ratte gezeigt werden (PENG et al. 1999). In der Folge konnten diese Kanäle bei weiteren Spezies, u. a. bei der Maus (SUZUKI et al. 2000), dem Menschen (PENG et al. 2000), beim Schwein (HINTERDING 2002; CHOI et al.
2009) und beim Schaf (WILKENS et al. 2009), nachgewiesen werden. Beide Kanäle gehören zur TRP-Familie (transient receptor potential) und werden auf Grund ihrer Sequenzhomologie, zusammen mit TRPV1-4 der Subfamilie der TRPV-Kanäle (Vanilloid) zugeordnet.
Wie alle Kanäle der TRP-Familie sind sie aus vier Untereinheiten mit sechs Transmembrandomänen aufgebaut und weisen mehrere N-terminale Ankyrin-Motive auf (HOENDEROP et al. 1999). TRPV5 und TRPV6 zeigen eine 75%-Homologie auf AS-Ebene, wobei Unterschiede hauptsächlich in den N- und C-terminalen Segmenten lokalisiert sind (PENG et al. 1999, PENG et al. 2003).
In der TRP-Familie bilden sie eine Gruppe hochselektiver Ca2+-Kanäle, die bei physiologischem Membranpotenzial konstitutiv geöffnet sind (VENNEKENS et al.
2000). Beide werden durch ein Ansteigen der intrazellulären Ca2+-Konzentration inaktiviert, wobei dieser Prozess bei TRPV6 durch eine initiale, gefolgt von einer langsameren Inaktivierungsphase charakterisiert ist während TRPV5 nur die langsame Inaktivierungsphase zeigt (HOENDEROP et al. 2002a). Eine verglichen mit TRPV6 100-fach höhere Affinität des TRPV5-Kanals zu dem Inhibitor Ruthenium Rot zeigt einen weiteren Unterschied der funktionellen Eigenschaften (HOENDEROP et al. 2001).
TRPV5 und TRPV6 werden in Niere, Darm und anderen Geweben wie Pankreas, Prostata, Hoden und Speicheldrüse (HOENDEROP et al. 1999; HOENDEROP et al.
2001) coexprimiert, wobei TRPV5 jedoch die wichtigste Isoform in der Niere ist. Im Darm ist TRPV6 quantitativ am bedeutendsten und entscheidend an der regulierten Calcium-Resorption beteiligt. Deutlich wird dies am Beispiel eines TRPV6-Knockout Modells. Die Mäuse waren zwar lebensfähig, zeigten jedoch eine deutlich reduzierte intestinale Ca2+-Absortion (40%), mangelnde Gewichtszunahmen, eine geringere Knochendichte und eine verminderte Fruchtbarkeit, wobei die Serum-Calciumspiegel
6
bei adäquater Versorgung unbeeinflusst waren. Bei einer zusätzlichen alimentären Calcium-Depletion entwickelten die Tiere eine Hypocalcämie (BIANCO et al. 2007).
1.2.2.2 Transport durch das Cytosol mittels Calbindin
Beim zweiten Teilschritt des transzellulären Transports müssen die eingeströmten Ca2+-Ionen durch das Cytosol auf die basolaterale Seite transportiert werden.
Gleichzeitig muss aber sichergestellt sein, dass die intrazelluläre Ca2+-Konzentration niedrig gehalten wird, damit die Second messenger-Funktion des freien Ca2+ erhalten bleibt. Erreicht wird dies durch Calcium-bindende Proteine, deren Funktion hauptsächlich darin besteht, die Ca2+-Ionen im Cytosol abzupuffern (SCHRÖDER et al. 1996). Außerdem vermitteln sie einen 70-mal schnelleren Transport von Ca2+
durch die Zelle, verglichen mit freier Diffusion der Ionen (BRONNER et al. 1986). Von einigen Autoren wird angegeben, dass dieser Schritt des cytosolischen Transfers geschwindigkeitslimitierend für den transzellulären Transport zu sein scheint, da im Duodenum der Ratte ein linearer Zusammenhang zwischen Calbindin-Menge und Transportrate besteht (SLEPCHENKO & BRONNER 2001). In einer Studie an CaCo-2 Zellen gingen hohe Calbindin-Konzentrationen jedoch nicht mit einer erhöhten Calcium-Transportrate einher (FLEET et al. 2002). SPENCER et al. (1976) konnten zeigen, dass es bei rachitischen Hühnern nach einer Calcitriolbehandlung zu einem Anstieg der Calbindin-D28K-Konzentration mit einem Maximum nach 48 h kommt. Die ebenfalls erhöhte Calcium-Absorption konnte nicht über den gleichen Zeitraum beobachtet werden, sie erreichte ihr Maximum bereits 8 h nach Behandlung und fiel dann wieder ab auf 25% der maximalen Rate nach 48 h.
Anhand des Molekulargewichts unterscheidet man zwei Typen des Calcium- Bindungsproteins, Calbindin-D9K und Calbindin-D28K. Beide Proteine sind strukturell nicht verwandt. Calbindin-D9K besitzt zwei Calcium-Bindungsstellen, Calbindin-D28K
kann vier Calcium-Ionen binden (BREDDERMAN & WASSERMAN 1974, FULLMER & WASSERMAN 1981). Calbindin-D9K wird bei Säugetieren hauptsächlich in der Darmschleimhaut exprimiert, ist aber in geringerem Maße auch in der Niere nachweisbar (THOMASSET et al. 1982, HOENDEROP et al. 2005, WILKENS 2006).
Calbindin-D28K ist in Niere, Pankreas, Plazenta, Knochen und Gehirn präsent (HOENDEROP et al. 2005). Bei Vögeln ist in Darm und Niere ausschließlich Calbindin-D28K vorhanden (FULLMER & WASSERMAN 1987, HOENDEROP et al.
2005).
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Durch die langsame Kinetik der Calbindine ist gewährleistet, dass zwar die intrazelluläre Konzentration an freien Calcium-Ionen niedrig gehalten wird, das für funktionelle Second messenger-Signale typische kurzfristige Ansteigen der Calcium- Konzentration aber nicht behindert wird (KOSTER et al. 1995).
1.2.2.3 Ausschleusung über die basolaterale Membran
Im dritten Schritt werden die Calcium-Ionen gegen einen elektrochemischen Gradienten mit zwei unterschiedliche Ca2+-Transportmechanismen über die basolaterale Membran aus der Zelle ins Plasma geschleust. Von der primär aktiven, membranständigen Calcium-ATPase (PMCA) sind vier verschiedene Isoformen mit mehreren Splicevarianten bekannt, wobei im Dünndarm die Isoform PMCA1b den quantitativ bedeutendsten Mechanismus zur aktiven Ca2+-Ausschleusung darstellt (HOENDEROP et al. 2005). Von untergeordneter Bedeutung ist der sekundär aktive 3Na+/Ca2+-Austauscher (NCX1) der hauptsächlich an der renalen Ca2+-Resorption beteiligt ist und intestinal nur sehr niedrig exprimiert wird (HILDMANN et al. 1982, HOENDEROP et al. 2005).
Abb. 1.1: Klassisches Modell des transzellulären Ca2+-Transports in intestinalen (Calbindin-D9K-vermittelt) und renalen Epithelien (Calbindin-D28K- vermittelt) monogastrischer Tiere; Erläuterungen im Text (1.2.2.1 bis 1.2.2.3); Wilkens 2006.
TRPV5 TRPV6
PMCA
NCX
ATP
ADP + Pi
Calbindin-D9K
Calbindin-D28K
Ca2+
apikal basolateral
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1.3 Regulation des intestinalen Ca
2+-Transports
Die intestinale Ca2+-Aufnahme ist ein wichtiges Stellglied bei der Regulation der Calcium-Homöostase, da es die einzige exogene Zufuhrmöglichkeit von Calcium in das extrazelluläre Kompartiment des Körpers darstellt (RAMASAMY 2006).
Der aktive transzelluläre Ca2+-Transport wird im Wesentlichen durch das Steroidhormon Calcitriol (1α,25(OH)2-VitaminD3), der biologisch aktivsten Form des Vitamins D, reguliert. Calcitriol stimuliert am Darm die Expression von TRPV6, Calbindin-D9K und PMCA1b (VAN ABEL et al. 2003). Vitamin D responsive elements (VDREs), über die die Calcitriolwirkung vermittelt wird, konnten in den Promotorregionen von TRPV6 (MEYER et al. 2006), Calbindin-D9K (DARWISH &
DELUCA 1992) und PMCA1b (GLENDENNING et al. 2000) nachgewiesen werden.
Auf funktioneller Ebene konnte schon wesentlich früher die stimulierende Wirkung von Calcitriol auf den aktiven Ca2+-Transport gezeigt werden. Eine Behandlung mit Calcitriol führte bei Ratten zu einer Verdopplung der Calcium-Nettofluxraten im Duodenum (JUNGBLUTH & BISWANGER 1989).
Von der Regulation des parazellulären Ca2+-Transportes hat man bislang weniger konkrete Vorstellungen. Es konnte jedoch an CaCo-2 Zelllinien gezeigt werden, dass Calcitriol die Leitfähigkeit der Tight junctions erhöht und somit zu einem verstärkten parazellulären Ca2+-Transport führt (CHIRAYATH et al. 1998).
Eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation des intestinalen Calcium- Transports kommt auch der alimentären Calcium-Versorgung zu. Ein niedriges Calcium-Angebot in der Nahrung erhöht die Effizienz der intestinalen Calcium- Absorption über Adaptationsmechanismen des Vitamin D-Systems (WASSERMAN et al. 1992). Das durch die alimentäre Calcium-Depletion hervorgerufene vorübergehende Absinken des Plasma-Calcium-Spiegels bewirkt, über eine Stimulation der 1α-Hydroxylase, eine Erhöhung der Calcitriol-Konzentration im Plasma. Infolge dessen kommt es zu einer Erhöhung der mRNA-Expression von TRPV5 und TRPV6 (BROWN et al. 2005), Calbindin-D28K sowie der Protein- Expression von PMCA und NCX (WASSERMAN et al. 1992, CENTENO et al. 2004).
Demgegenüber scheint eine alimentäre Calcium-Supplementation den intestinalen Calcium-Transport calcitriolunabhängig zu regulieren. Demonstriert wurde dies anhand von 1α-OH-Knockout Mäusen, die das klinische Bild einer Pseudovitamin-D- Mangel-Rachitis mit Hypocalcämie, undetektierbaren Calcitriol-Spiegeln und sekundärem Hyperparathyreoidismus zeigten. Durch Fütterung einer calciumreichen
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„Rescue diet“ (2% Calcium und 20% Laktose) kam es zu einer Normalisierung des Calcium-Spiegels (HOENDEROP et al. 2004). Außerdem erhöht sich die Expression der am intestinalen Ca2+-Transport beteiligten Proteine, TRPV6, Calbindin-D9K und PMCA1b (VAN ABEL et al. 2003). Jedoch sind die molekularen Mechanismen dieser calcitriolunabhängigen Genregulation bislang nicht bekannt. Denkbar wäre, dass neben den bekannten VDREs in den Promotorregionen der Ca2+-Transportergene so genannte Ca2+-abhängige Elemente (CaREs) vorhanden sind (HOENDEROP et al.
2005). GALLIN & GREENBERG (1995) konnten die Existenz solcher CaREs, die auffällige Ähnlichkeiten mit cAMP-abhängigen Elementen aufwiesen, in Nervenzellen zeigen.
Neben Calcitriol sind weitere Hormone an der Regulation des intestinalen Calcium- Transports beteiligt. Das bei erniedrigtem Plasmacalciumspiegel ausgeschüttete PTH greift hauptsächlich am Knochen und an der Niere an und erhöht die Calcium- Mobilisation bzw. steigert die tubuläre Rückresorption von Calcium. Durch Aktivierung der 1α-Hydroxylase steigert es die Synthese von Calcitriol, und wirkt somit indirekt auch auf die intestinale Ca2+-Resorption (HOENDEROP et al. 2005).
Es konnte aber auch ein direkter Effekt von PTH auf Enterozyten gezeigt werden.
Dabei erhöhte PTH die Ca2+-Aufnahme in isolierte Duodenumzellen der Ratte (PICOTTO 2001). Außerdem konnten PTH-Rezeptoren an Enterozyten des Villus immunhistochemisch nachgewiesen werden (GENTILI et al. 2003).
1.4 Gastrointestinaler Ca
2+-Transport beim Wiederkäuer
Zur Ca2+-Resorption beim Wiederkäuer liegen zahlreiche, zum Teil widersprüchliche Ergebnisse vor.
In Bilanzstudien an fistulierten Schafen konnte gezeigt werden, dass prinzipiell nicht nur Dünn- und Dickdarm, sondern auch die präintestinalen Abschnitte des Gastrointestinaltraktes sowohl zur Nettosekretion als auch zur Nettoresorption von Calcium befähigt sind. In einigen Untersuchungen stellte sich heraus, dass in Vormägen und Labmagen zum Teil eine Sekretion von Calcium auftrat, die durch Nettoresorption im Dünndarm bzw. Dickdarm mehr als kompensiert wurde (PFEFFER et al. 1970, GREENE et al. 1983, WYLIE et al. 1985). In anderen Untersuchungen wurde festgestellt, dass ein beträchtlicher Anteil der täglichen Ca2+- Aufnahme präintestinal erfolgt (RAYSSIGUIER & PONCET 1980). Ähnliche
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widersprüchliche Beobachtungen wurden auch in Bilanzstudien an Rindern gemacht.
So beobachteten GREENE et al. (1983) in einer Studie an jungen Bullen eine Nettoresorption von Calcium aus den Vormägen und dem Dickdarm, im Dünndarm hingegen wurde Calcium sezerniert. In einer weiteren Studie ergaben sich Hinweise darauf, dass das Vormagen/Labmagen-Kompartiment sogar der ausschließliche Abschnitt des Gastrointestinaltraktes für die Ca2+-Nettoresorption ist (GREENE et al.
1988).
Diese unterschiedlichen Ergebnisse lassen sich in Einklang bringen, wenn man die präintestinalen und intestinalen Anteile an der gesamten Calcium-Resorption in Abhängigkeit der alimentären Calcium-Versorgung betrachtet. Bei diesem Vorgehen ergeben sich Hinweise darauf, dass es bei hohem Calcium-Angebot in der Nahrung zu einer Verschiebung der Hauptlokalisation der Calcium-Nettoresorption in die präintestinalen Abschnitte kommt (SCHRÖDER & BREVES 2006). Die intestinale Resorption von Calcium scheint also erst mit abnehmendem alimentärem Angebot an Bedeutung zu gewinnen.
Auch In-vitro-Untersuchungen zeigten einen aktiven Ca2+-Transport im Pansen. An Epithelien von wachsenden Ziegen und adulten Schafen konnten mit der Ussing- Kammer-Technik unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten signifikante Nettofluxraten bestimmt werden (HÖLLER et al. 1988, SCHRÖDER et al. 1997). Der Transport scheint aber nur in Anwesenheit kurzkettiger Fettsäuren in der mucosalen Pufferlösung stattzufinden (SCHRÖDER et al. 1999).
Bei In-vitro-Versuchen an verschiedenen Darmabschnitten von Schafen und Ziegen verschiedenen Alters zeigten sich deutliche Speziesunterschiede. So ließen sich bei adulten, bedarfsgerecht mit Calcium versorgten Schafen mit der Ussing-Kammer- Technik unter Ausschluss eines elektrochemischen Gradienten nur im Jejunum signifikant von Null verschiedene Calcium-Nettofluxraten bestimmen (SCHRÖDER et al. 1997). Überraschenderweise konnten im Duodenum, welches die Hauptlokalisation für den aktiven Ca2+-Transport beim monogastrischen Tier darstellt, keine signifikanten Nettofluxraten gefunden werden. An Epithelien wachsender Ziegen jedoch konnten unter gleichen Bedingungen im Duodenum und im Jejunum signifikante Nettofluxraten gezeigt werden. Allerdings waren die für die Calcium- Nettofluxraten beider Spezies ermittelten Werte nur sehr gering und lagen weit unter den Werten von monogastrischen Tieren (SCHRÖDER et al. 1997). In einer neueren Studie an Epithelien adulter, laktierender Schlachtkühe wurde sogar eine
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Nettosekretion im Duodenum und im Colon beobachtet (LIESEGANG et al. 2006).
SIDLER-LAUFF et al. (2010) beobachteten eine Nettosekretion im Duodenum wachsender Ziegen.
Auch Untersuchungen zur Regulation des gastrointestinalen Ca2+-Transportes beim Wiederkäuer zeigten deutliche Speziesunterschiede auf. Bezüglich der Resorption von Calcium aus dem Vormagensystem ergeben sich aus verschiedenen Untersuchungen Hinweise darauf, dass diese keiner Regulation durch Calcitriol unterliegt (SCHRÖDER et al. 2001; SIDLER-LAUFF et al. 2010). Für die intestinale Resorption konnte zwar anhand molekularbiologischer Studien nachgewiesen werden, dass beim Wiederkäuer die strukturellen Voraussetzungen für einen aktiven, calcitriolregulierten Ca2+-Transport vorhanden sind, die Regulation konnte funktionell aber noch nicht eindeutig gezeigt werden.
So konnte beim Rind die Expression von VDR, Calbindin-D9K und PMCA im Duodenum demonstriert werden (YAMAGISHI et al. 2002, YAMAGISHI et al. 2006).
Im Dünndarm der Ziege konnten der VDR, Calbindin-D9K und TRPV6nachgewiesen werden (SCHRÖDER et al. 1995; RITTMANN 1996, MUSCHER unveröffentlichte Ergebnisse). Eine alimentäre Calcium-Depletion über neun Wochen, verbunden mit einem deutlichen Anstieg der Calcitriolspiegel von 130 auf 230 pmol∙l-1, hatte jedoch keinen signifikanten Effekt auf die Calcium-Nettofluxraten im Duodenum und Jejunum von wachsenden Ziegen (SCHRÖDER et al. 1997). Ebenfalls konnten im Dünndarm von Schafen VDR, Calbindin-D9K, TRPV6 und PMCA nachgewiesen werden (SCHRÖDER et al. 2001, WILKENS 2006). Laktierende Schafe, die mit 0,1 µg/kg 1α-Hydroxyvitamin D3 i. m. über zehn Tage behandelt wurden, zeigten einen deutlichen Anstieg der Calcium-Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt, wobei aufgrund des Versuchsdesigns aber nicht auf beteiligte Darmsegmente geschlossen werden konnte (BRAITHWAITE 1978). Bei Lämmern konnte nach zweiwöchiger Calcium-Restriktion unter Anwendung der „Thiry-Vella loop“-Technik eine erhöhte Effizienz der Calcium-Absorption im Jejunum beobachtet werden (ABDEL-HAFEEZ et al. 1982). Jedoch konnte bei Schafen eine Steigerung der Nettofluxraten im Jejunum durch eine Calcium-Depletion bzw. eine Vitamin D3- Behandlung bislang nicht gezeigt werden.
Warum trotz des Vorhandenseins dieser Strukturen an jejunalen Epithelien vom Schaf bislang keine entsprechende Regulierbarkeit der Calcium-Nettofluxraten wie bei monogastrischen Tieren gezeigt werden konnte, bleibt unklar.
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1.5 Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulierbarkeit des Ca2+-Transportes im Jejunum des Schafes zu überprüfen.
Dazu sollte die Wirkung einer alimentären Calcium-Depletion, einer Behandlung mit Calcitriol in pharmakologischer Dosierung und der Kombination aus Depletion und Behandlung auf Expression und Aktivität der am transzellulären Ca2+-Transport beteiligten Strukturen untersucht werden.
Dass das verwendete Behandlungsprotokoll zu einer Stimulation der gastrointestinalen Aufnahme von Calcium führt, konnte bereits in vorangegangenen funktionellen Studien demonstriert werden (Wilkens et al. 2010). In der vorliegenden Arbeit wurde nun die Expression des apikalen Calcium-Kanals TRPV6 und der basolateralen Calcium-Pumpe PMCA1b mithilfe von quantitativer RT-PCR und Western Blot Analysen auf Transkriptions- und Translationsebene bestimmt, während die Aktivität des Kanals mittels Uptake-Studien an isolierten Bürstensaummembranvesikeln erfasst werden sollten.
13
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Tiere
Es standen 20 weibliche, ca. sechs Monate alte und zwischen 30 und 40 kg schwere Schafe der Rasse „Suffolk“ zur Verfügung, die ca. sechs Wochen vor dem ersten Schlachttermin von einem kommerziellen Zuchtbetrieb gekauft und eingestallt wurden. Nach einer zweiwöchigen Adaptationsphase wurden die Tiere in vier Versuchsgruppen mit jeweils fünf Tieren eingeteilt.
2.1.2 Fütterung
Zwei Gruppen (Calcium-Depletions-Fütterungsgruppen, Ca-) erhielten ein Versuchs- futter mit reduziertem Calciumgehalt (0,14% im Kraftfutter), die beiden anderen Gruppen (Kontroll-Fütterungsgruppen, Kon) wurden bedarfsgerecht mit Calcium (1,44% im Kraftfutter) versorgt. Die Schafe wurden zu fünft in mit Sägespänen eingestreuten Laufboxen gehalten und auch gruppenweise gefüttert. Die tägliche Ration pro Tier und Tag setzte sich aus 90 g Heu und 660 g Kraftfutter zusammen.
Stroh, dessen Mineralstoffgehalt vor Versuchsbeginn analytisch bestimmt worden war, und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Zusammensetzung der Pellets ist der Tabelle 2.1 zu entnehmen. Die Ration wurde auf drei Mahlzeiten am Tag verteilt und das nicht aufgenommene Futter rückgewogen. Anhand der Differenz zwischen der vorgelegten Futtermenge und der Rückwaage konnte die tägliche Aufnahme pro Tier und Tag geschätzt werden (Tab. 2.2). Zwischen den beiden Fütterungsgruppen bestand nur in der aufgenommenen Calcium-Menge ein signifikanter Unterschied, diese betrug bei den Tieren der Kontrollfütterungsgruppen 10,37 ± 0,1 g und in den Calcium-Depletions- Fütterungsgruppen 2,6 ± 0,04 g pro Tier und Tag.
Während der mindestens vier Wochen dauernden Fütterungsphase wurden in wöchentlichem Abstand die Gewichtszunahmen kontrolliert, sowie am Ende der Fütterungsperiode Blutproben aus der V. jugularis entnommen, um die Konzentration von Gesamtcalcium (Ca), ionisiertem Calcium (Ca²+ ), Phosphat (Pi) und Calcitriol zu bestimmen.
14 2.1.3 Behandlung
Je fünf Tiere der Calcium-Depletions- bzw. Kontrollfütterunggruppen wurden zwölf Stunden vor der Schlachtung mit Calcitriol in einer Dosierung von 0,5 µg pro kg Körpergewicht behandelt. Mittels Infusion über einen Venenkatheter wurde den Tieren eine entsprechende Menge Calcitriol gelöst in 180 ml physiologischer Kochsalzlösung verabreicht. Polysorbat 20 diente als Lösungsvermittler. Die restlichen Tiere erhielten ein Placebopräparat, bestehend aus physiologischer Kochsalzlösung und Polysorbat 20.
Tabelle 2.1: Zusammensetzung der Pellets (in % der ursprünglichen Substanz (uS))
Inhaltsstoffe
(in % der ursprünglichen Substanz)
Diät
Ca-Depletion Kontrolle
Gerste 26,7 25,8
Hafer 29,7 28,7
Weizenkleie 14,8 14,3
Sojaextraktionsschrot 14,8 14,3
Sojabohnen 11,9 11,5
Sojaöl 1,5 1,4
NaH2PO4 ∙ 2 H2O 0,6 0,6
CaCO3 --- 3,4
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Tabelle 2.2: Mittlere tägliche Aufnahme an Nährstoffen und Mineralstoffen pro Tier und Tag (geschätzt anhand von Gruppenmittelwerten über 4 Wochen) in g bzw. % der TS (x ± SEM, n = Anzahl der Tiere)
Tägliche Aufnahme
Ca-Depletion n = 10
Kontrolle n = 10
TS (kg) 1,01 ± 0,02 1,12 ± 0,01
ME (MJ) 9,4 ± 0,11 10,0 ± 0,10
Calcium (g) 2,60 ± 0,04 10,37 ± 0,10 Phosphor (g) 4,17 ± 0,04 4,24 ± 0,04 Magnesium (g) 1,80 ± 0,02 1,80 ± 0,02 Natrium (g) 0,95 ± 0,01 1,03 ± 0,01
Rohfett 4,4% 4,8%
Rohfaser 24,2% 25,8%
Rohprotein 13,1% 11,6%
Stärke +
Zucker 20,8% 18,8%
2.1.4 Entnahme der Blutproben
Vor Beginn und im Anschluss an die Behandlung wurden in zweistündigem Abstand Blutproben aus der V. jugularis über einen Venenkatheter in Lithium-Heparin- Monovetten (Monovette® 9mlLH; Fa. Sarstedt, 51588 Nümbrecht) entnommen.
Mit Hilfe einer ionen-sensitiven Elektrode (Rapidlab™ 348; Siemens Healthcare Dagnostics GmbH, 65760 Eschborn) wurde unmittelbar danach die Konzentrationen an ionisiertem Calcium (Ca2+) im Vollblut gemessen.
In einem anschließenden Zentrifugationsschritt für 10 min bei 3500 rpm (Minifuge 2;
Heraeus Instruments, 63450 Hanau) wurde das Blutplasma isoliert und bis zur weiteren Analyse bei -20°C eingefroren.
16 2.1.5 Entnahme der Gewebeproben
Zwölf Stunden nach der Behandlung wurden die Tiere mittels Bolzenschuss betäubt und durch einen Kehlschnitt entblutet. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurden Proben aus dem proximalen Jejunum entnommen. Die Entnahme der Gewebeproben erfolgte innerhalb von 10 min nach dem Töten der Tiere.
Für die Isolierung von RNA und Zellmembranen für Western Analysen wurden 20 bis 30 cm des proximalen Jejunums entnommen, am Mesenterialansatz aufgeschnitten und in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung mehrfach gespült. Von dem Darmabschnitt, mit der serosalen Seite auf einer eisgekühlten Glasplatte liegend, wurde nun unter Zuhilfenahme eines Objektträgers der lumenseitige Anteil der Darmwand, d.h. die Lamina epithelialis und die Lamina propria der Tunica mucosa, von der Lamina muscularis mucosae separiert und das auf diese Weise gewonnene Material in flüssigem Stickstoff eingefroren. Bis zur weiteren Bearbeitung wurden die Mukosaproben bei -80°C gelagert.
Für die Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel wurde ein Jejunumstück von 2 m Länge kaudal der Entnahmestelle der Proben für die RNA- Isolierung mehrfach mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung gespült.
Anschließend wurden die Darmstücke auf mesenterialer Seite der Länge nach aufgeschnitten, erneut bis zur vollständigen Entfernung vorhandener Ingestareste gespült und in Alufolie gewickelt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung bis zur Präparation der Bürstensaummembranvesikel (BSMV) erfolgte ebenfalls bei -80°C.
2.2 Analytische Methoden
2.2.1 Konzentrationsbestimmungen in Plasmaproben 2.2.1.1 Gesamtcalcium
Der Gehalt an Gesamtcalcium im Blutplasma wurde mit Hilfe der o-Kresolphtalein- Komplexon-Methode bestimmt (SARKAR & CHAUHAN 1967). Das Testprinzip beruht auf der Bildung eines violetten Komplexes aus Calcium und o-Kresolphtalein- Komplexon in alkalischer Lösung, dessen Farbintensität zur Calciumkonzentration direkt proportional ist. Jeweils 25 µl Probe bzw. Standardlösung (2 mmol∙l-1 CaCl2) wurden mit 500 µl einer 2-Amino-2-Methylpropanol-Lösung (3,5 mmol∙l-1, pH 10,8)
17
und 500 µl Farbstofflösung (0,16 mmol∙l-1 o-Kresolphtalein-Komplexon, 6,89 mmol∙l-1 8-Hydroxychinolin in 0,06 mmol∙l-1 HCl) vermischt. Nach 10 min wurde die Extinktion im Photometer (DU® 640 Spectrophotometer; Beckman Coulter GmbH, 47807 Krefeld) bei einer Wellenlänge von 570 nm gegen einen Leerwert gemessen. Die Messung erfolgte für alle Proben jeweils im Doppelansatz.
Die Berechnung der Calciumwerte erfolgte mit nachstehender Formel:
ExtinktionProbe
Ca-KonzentrationProbe = --- x KonzentrationStandard [mmol∙l-1] ExtinktionStandard
2.2.1.2 Phosphat
Die Messung beruht auf der Bildung eines gelben Farbkomplexes aus Pi mit Molybdat und Vanadat in salpetersaurer Lösung, dessen Farbintensität proportional zur Pi-Konzentration ist (PETER 1982). Vorab wurden die Proben einer Enteiweißung unterzogen. Dazu wurden die Plasmaproben 1:10 mit Trichloressigsäure (1,2 mmol∙l-1) versetzt und 10 min bei 805 g und 4°C zentrifugiert (GS-15R Centrifuge; Beckman Coulter GmbH, 47807 Krefeld). Anschließend wurden jeweils 400 µl des Überstandes bzw. 400 µl Standardlösung (0,161 mmol∙l-1 KH2PO4) mit dem gleichen Volumen Ammoniumvanadat- (21 mmol∙l-1) und Ammoniummolybdat- Lösung (40 mmol∙l-1) vermischt. Nach 10 min wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 405 nm gegen den Leerwert gemessen. Alle Messungen wurden im Doppelansatz durchgeführt.
Die Pi-Konzentration der Probe ergibt sich aus folgender Formel:
ExtinktionProbe
Pi-KonzentrationProbe = ---- x KonzentrationStandard [mmol∙l-1] ExtinktionStandard
18 2.2.1.3 Calcitriol
Die Bestimmung der Konzentration von Calcitriol im Blutplasma erfolgte durch die Firma Immundiagnostik AG (64625 Bensheim) mittels eines kommerziell erhältlichen Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assays (ELISA).
2.2.2 Proteinkonzentration in Gewebepräparationen
Zur Quantifizierung der in den Western Blot Analysen und den Uptake-Studien eingesetzten Membranpräparationen, sowie zur Überprüfung der Anreicherung apikaler Membranen nach der Bürstensaummembranvesikel-Präparation, wurden die entsprechenden Proteinkonzentrationen mithilfe des BIO-RAD Proteinassays (Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) bestimmt. Das Absorptionsmaximum des enthaltenen Farbstoffes, Coomassie-Brillant-Blau G-250, verschiebt sich in saurer Lösung durch Bindung an Proteinstrukturen von 465 nm nach 595 nm (BRADFORD 1976). Hierbei wird der zuvor als rotes Kation vorliegende Farbstoff in seine anionische Form überführt und färbt sich blau. Durch zeitgleiche Messung einer Standardreihe bekannter Konzentrationen an gamma-Globulin (BIO-RAD Protein Standard; Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) ist die Ermittlung unbekannter Probenwerte möglich. Die Inkubation mit oberflächenaktivem Saponin vor der Zugabe des Farbreagenz verbessert die Darstellung der Proteinbindungsstellen.
Nach dem Auftauen der Proben wurden diese durch mehrmaliges Aufziehen mit einer 1 ml-Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle homogenisiert und anschließend 1:20 mit A. dest. verdünnt. 50 µl der verdünnten Probe bzw. 50 µl A.
dest. als Leerwert wurden mit gleicher Menge an Saponinlösung (1%ig) vermischt.
Nach einer 20 minütigen Inkubationszeit erfolgte die Zugabe von 2,5 ml des zuvor 1:5 mit A. dest. verdünnten Bio-Rad-Farbreagenz zu allen Proben. Nach weiteren 10 min konnte die Extinktion im Photometer bei einer Wellenlänge von 595 nm gegen den Leerwert gemessen werden. Parallel dazu wurde die Extinktion von vier verschiedenen Konzentrationen (0,139, 0,278, 0,417 und 0,556 mg∙ml-1) eines gamma-Globulin-Standards ermittelt. Alle Messungen wurden jeweils im Doppelansatz durchgeführt. Aus den Extinktions- und Konzentrationswerten des Standardproteins wurde eine lineare Regression erstellt, aus welcher die Proteinwerte der Proben berechnet werden konnten.
19
2.2.3 Enzymaktivitäten in Gewebepräparationen
Um die Anreicherung apikaler Membranen durch die Differentialzentrifugation (2.3.3) zu bestimmen, wurden Aktivitäten von Leitenzymen der apikalen bzw. der basolateralen Membranen in Vollhomogenat und Vesikel-Präparation bestimmt und zueinander ins Verhältnis gesetzt.
2.2.3.1 Alkalische Phosphatase
Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP), Leitenzym der apikalen Membran, wurde nach der von KAWADE (1964) beschriebenen Methode bestimmt. Hierbei wird farbloses p-Nitrophenylphosphat durch die AP hydrolytisch in Phosphat und p- Nitrophenyl gespalten. Die entstandene Menge an gelbem p-Nitrophenyl pro Zeiteinheit ist proportional zur Aktivität der AP und kann photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt werden.
Je 50 µl der auf Eis aufgetauten und durch mehrmaliges Aufziehen mit einer 1 ml- Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle homogenisierten Probe wurde mit 3 ml auf 25°C temperiertem AP-Puffer (1,02 mol∙l-1 Diethanolamin, 0,51 mmol∙l-1 MgCl2, 10 mmol∙l-1 Na-Nitrophenylphosphat, pH 9,8) vermischt. Im Anschluss wurde die Extinktion in 1 minütigen Intervallen über einen Zeitraum von 4 min bei 405 nm gegen Luft gemessen. Die Aktivität konnte durch Multiplikation der Extinktionsänderung pro Minute (E3min- E2min) mit dem versuchsinternen Faktor 3300 in der Einheit U∙l-1 berechnet werden.
Für die Auswertung wurden diese Ergebnisse auf den zuvor ermittelten Proteingehalt bezogen.
2.2.3.2 Na+/K+-ATPase
Die Aktivität der Na+/K+-ATPase, Leitenzym für die basolaterale Membran, wurde nach der Methode von MIRCHEFF u. WRIGHT (1976) photometrisch bestimmt.
Durch die ATPase-Aktivität wird aus ATP anorganisches Phosphat frei, welches in saurer Lösung mit Molybdat Phosphomolybdänsäure bildet. Diese wird zu Molybdänsäure, einem blauen Farbkomplex, reduziert und kann bei einer Wellenlänge von 690 nm photometrisch bestimmt werden. Durch Zusatz von Ouabain kann spezifisch die Aktivität der Na+/K+-ATPase gehemmt werden, so dass sich dann aus der Differenz der Umsetzung von ATP in einem Ansatz mit und einem ohne Ouabain die Aktivität des Enzyms in der Präparation errechnen lässt.
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Die Proben wurden auf Eis aufgetaut und mit A. dest. eine Verdünnung hergestellt, von der 20 µl mit jeweils 0,5 ml Assaymix-Puffer (5 mmol∙l-1 MgCl2, 100 mmol∙l-1 NaCl, 10 mmol∙l-1 KCl, 100 mmol∙l-1 Tris (basisch), 2 mmol∙l-1 ATP, 3 mmol∙l-1 EDTA, pH 7, 4 bei 37°C) bzw. Assaymix-Puffer mit Ouabainzusatz (6,86 mmol∙l-1 Ouabain) 30 min bei 37°C inkubiert wurden. Durch die Zugabe von 0,5 ml 5%iger Trichloressigsäure wurde die ATPase-Reaktion gestoppt, die weiteren Zugaben erfolgten alle bei Raumtemperatur. Die Zugabe von 1 ml Farbreagenz (1,15 mol∙l-1 H2SO4, 8,9 mmol∙l-1 Ammoniumheptamolybdat, 143,8 mmol∙l-1 FeSO4) führte zur Bildung eines blauen Farbkomplexes mit dem freigesetzten anorganischen Phosphat. Nach einer 30 minütigen Inkubation wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 690 nm gegen einen Leerwert bestimmt. Die Aktivität der Na+/K+- ATPase wurde anhand der Differenz der Extinktionswerte mit Ouabainhemmung und ohne Hemmung sowie nachfolgender Multiplikation mit dem versuchsinternen Faktor 862 in der Einheit U∙l-1 berechnet und auf die zuvor ermittelte Proteinkonzentration bezogen.
2.3 Präparative Methoden
Zur besseren Übersicht sind die verwendeten Puffer und Lösungen, die sich auf Vorrat herstellen ließen, in alphabetischer Reihenfolge im Anhang A aufgeführt.
2.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den jejunalen Mukosaproben wurde das RNeasy® Mini-Kit (QIAGEN GmbH, 40724 Hilden) mit den darin enthaltenen Puffern RLT, RW1 und RPE gemäß den Herstellerangaben verwendet. Vor Präparationsbeginn wurde der RLT-Puffer zunächst mit 1% ß-Mercaptoethanol, zur Spaltung der Disulfidbrücken, versetzt.
Das Probenmaterial wurde in einem mit flüssigem Stickstoff vorgekühltem Mörser zerkleinert. Anschließend wurden ca. 30 mg der pulverisierten Probe in einem vorgekühlten Eppendorf-Tube (Eppendorf AG, 22331 Hamburg) mit 600 µl des vorbereiteten RLT-Puffers vermischt. Durch zehnmaliges Aufziehen mit einer 1 ml-
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Einmalspritze und einer 0,45 x 23 mm Kanüle wurde die Probe homogenisiert. Alle weiteren Präparationsschritte erfolgten bei Raumtemperatur.
Zunächst wurde das Homogenat zur Beseitigung von Zelltrümmern 3 min bei 13 000 rpm (Biofuge pico; Heraeus Instruments, 63450 Hanau) zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abpipettiert und auf eine gDNA-Eliminationssäule gegeben.
Diese wurde für 1 min bei 13 000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde zur Fällung der RNA mit dem gleichen Volumen 70%igem Ethanol vermischt und anschließend in zwei Schritten auf eine RNeasy®-Säule überführt. Durch eine 1 minütige Zentrifugation bei 13 000 rpm wurden die gelösten Nukleinsäuren ins Innere der Säule getrieben, wo eine Anlagerung an eine Kieselgelmembran erfolgte.
Anschließend wurden drei Waschschritte durchgeführt, zunächst mit 700 µl RW1- Puffer, dann zweimal mit je 500 µl ethanolhaltigem RPE-Puffer. Bei den ersten beiden Waschschritten wurde mit 13 000 rpm für 1 min zentrifugiert, beim letzten zur vollständigen Trocknung der Säule für 2 min. Der Durchfluss wurde jeweils verworfen. Nach dem Trocknen wurde die RNeasy®-Säule in ein neues Sammelgefäß verbracht und die gebundene Gesamt-RNA mit 50 µl RNAse-freiem Wasser durch Zentrifugation bei 13 000 rpm für eine Minute eluiert.
Nach Abschluss der Isolierung wurde die Gesamt-RNA photometrisch quantifiziert (Eppendorf Biophotometer; Eppendorf AG, 22331 Hamburg) und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt.
Zum Umschreiben der isolierten Gesamt-RNA wurden TaqMan-Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems, Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim) verwendet. Zunächst wurde ein so genannter Master-Mix angesetzt, der je Probe 2,5 µl 10-fach Puffer, 5,5 µl MgCl2 (25 mmol∙l-1), 5,0 µl dNTPs (10 mmol∙l-1), 0,625 µl Random-Hexamere, 0,625 µl Oligo(dT)-Primer, 0,5 µl RNase-Inhibitor sowie 0,68 µl Reverse Transkriptase (50 U∙µl-1) enthielt. Von der entsprechenden RNA- Präparation wurde ein zu 200 ng äquivalentes Volumen mit RNase-freiem Wasser auf ein Volumen von 9,6 µl erweitert und mit 15,4 µl Master-Mix versetzt. Die Inkubation im Thermocycler (MyCycler; Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München) lief unter folgenden Bedingungen ab: 10 min 25°C, 45 min 48°C und 5 min 95°C. Nach Abschluss des Programms wurden die Reaktionsgefäße auf 4°C herunter gekühlt und die synthetisierte cDNA bei -20°C gelagert. Zur Kontrolle der Umschreibung wurde eine PCR mit den Primern „ACTB for“ und „ACTB rev“ zum
