Untersuchungen zur Resorption von ätherischen Ölen über die Zitzenschleimhaut
am isoliert perfundierten Rindereuter
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr.med.vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Kathrin Maurer aus Braunschweig
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Privatdozent Dr. Dr. Alfonso Lampen
Tag der mündlichen Prüfung: 23. Mai 2003
1. Einleitung...1
2. Literaturübersicht...2
2.1. Das Rindereuter... 2
2.1.1. Anatomie... 2
2.1.1.1. Allgemeiner Aufbau des Euters... 2
2.1.1.2. Haut... 3
2.1.1.3. Bau des Drüsenkörpers... 3
2.1.1.4. Bau der Zitze... 5
2.1.1.5. Blutversorgung ... 7
2.1.1.5.1. Arterien ... 7
2.1.1.5.2. Venen ... 7
2.1.2. Isoliert perfundiertes Rindereuter... 10
2.2. Ätherische Öle ... 13
2.2.1. Allgemeines ... 13
2.2.2. Chemie ... 13
2.2.2.1. Allgemein ... 13
2.2.2.2. Terpene... 13
2.2.3. Anwendungsmöglichkeiten in der Medizin ... 14
2.2.4. Pharmakokinetische Studien ... 16
2.2.5. Anwendung in der Tiermedizin ... 17
2.2.6. Myrtol standardisiert ... 18
2.2.6.1. Allgemeines... 18
2.2.6.2. Wirkprofil von Myrtol standardisiert ... 21
2.2.6.3. Einsatzgebiete / klinische Studien... 21
2.2.6.3.1. Akute Bronchitis... 21
2.2.6.3.2. Chronische Bronchitis... 22
2.2.6.3.3. Akute Sinusitis ... 22
2.2.6.3.4. Chronische Sinusitis ... 22
2.2.6.4. Pharmakokinetische Studien... 22
2.3. Chromatographische Verfahren... 25
2.3.1. Allgemeiner Überblick... 25
2.3.2. Gaschromatographie ... 26
2.3.2.1. Allgemein ... 26
2.3.2.2. Aufbau des Gaschromatographen ... 27
2.3.2.2.1. Trägergas ... 28
2.3.2.2.2. Injektor... 29
2.3.2.2.3. Ofen... 30
2.3.2.2.4. Trennsäule... 30
2.3.2.2.5. Detektor ... 31
2.3.2.2.5.1. Allgemein ... 31
2.3.2.2.5.2. Massenspektrometer... 33
2.3.2.3. Einsatzmöglichkeiten bei ätherischen Ölen... 35
2.3.3. Entwicklung der Methode... 37
3. Material und Methoden ...43
3.1. Voruntersuchungen ... 43
3.1.1. Perfusatproben ... 43
3.1.2. In-vitro-Verteilungsversuche ... 44
3.1.2.1. Untersuchungen mit Emulgatoren... 44
3.1.2.2. Untersuchungen mit Milch... 45
3.1.3. Gewebeproben ... 45
3.2. Das isoliert perfundierte Rindereuter ... 46
3.2.1. Versuchsmaterial ... 46
3.2.1.1. Organgewinnung... 46
3.2.1.2. Perfusionsmedium ... 46
3.2.2. Verwendete Substanzen... 47
3.2.2.1. Myrtol standardisiert ... 47
3.2.2.2. α-Pinen... 47
3.2.2.3. R-Limonen... 48
3.2.2.4. 1,8-Cineol... 48
3.2.3. Versuchsaufbau... 48
3.2.4. Versuchsablauf ... 50
3.2.4.1. Präparation... 50
3.2.4.2. Beginn der Perfusion... 50
3.2.4.3. Applikation der Substanzen... 50
3.2.4.4. Vitalitätsparameter ... 51
3.2.4.4.1. Glukoseverbrauch... 51
3.2.4.4.2. Laktatgehalt ... 51
3.2.4.4.3. Euterhauttemperatur... 52
3.2.5. Versuchsumfang... 52
3.2.5.1. Perfusatproben... 52
3.2.5.2. Gewebeproben... 52
3.3. Bestimmung von Myrtol standardisiert... 53
3.3.1. Material... 53
3.3.1.1. Geräte ... 53
3.3.1.2. Referenzsubstanzen ... 53
3.3.1.3. Reagenzien ... 54
3.3.2. Herstellung der Lösungen... 54
3.3.2.1. Stammlösungen ... 54
3.3.2.2. Lösungen der Standardkurve ... 54
3.3.2.3. Qualitätskontrollproben ... 55
3.3.2.4. Interner Standard ... 56
3.3.3. Validierung der Methode... 57
3.3.3.1. Pre-Study-Validierung ... 57
3.3.3.1.1. Spezifität... 57
3.3.3.1.2. Linearität... 57
3.3.3.1.3. Präzision / Richtigkeit ... 57
3.3.3.1.4. Wiederfindung... 58
3.3.3.1.5. Stabilität... 58
3.3.3.2. In-Study-Validierung... 59
3.3.4. Aufarbeitung der Proben... 59
3.3.4.1. Proben der Standardkurve und Qualitätskontrollproben... 59
3.3.4.2. Euterperfusatproben... 60
3.3.4.3. Gewebeproben... 60
3.3.4.3.1. Proben der Standardkurve und Qualitätskontrollproben ... 60
3.3.4.3.2. Proben der behandelten Zitzen ... 60
3.3.5. Chromatographische Bedingungen ... 62
3.3.6. Auswertung der Daten ... 63
3.3.6.1. Daten für die Validierung... 63
3.3.6.2. Daten für die individuellen Euterproben – Perfusat und Gewebe... 64
4. Ergebnisse...65
4.1. Ergebnisse der Pre-Study-Validierung... 65
4.1.1. Spezifität ... 65
4.1.2. Linearität ... 68
4.1.3. Präzision / Richtigkeit ... 71
4.1.4. Wiederfindung... 76
4.1.5. Stabilität... 76
4.2. Ergebnisse der Voruntersuchungen ... 80
4.2.1. Perfusatproben ... 80
4.2.2. In-vitro-Verteilungsversuche ... 83
4.2.2.1. Untersuchungen mit Emulgatoren... 83
4.2.2.2. Untersuchungen mit Milch... 83
4.2.3. Gewebeproben ... 84
4.2.4. Schlussfolgerung ... 84
4.3. Ergebnisse der Euterproben – Perfusat... 85
4.3.1. Resorption von Myrtol standardisiert ... 85
4.3.2. Resorption von 1,8-Cineol ... 90
4.3.3. Resorption von R-Limonen ... 92
4.3.4. Resorption von α-Pinen ... 94
4.4. Konzentration in der Zitzenschleimhaut ... 97
4.4.1. Gewebeproben von mit Myrtol standardisiert behandelten Eutern ... 97
4.4.2. Gewebeproben von mit 1,8-Cineol behandelten Eutern ... 101
4.4.3. Gewebeproben von mit R-Limonen behandelten Eutern ... 102
4.4.4. Gewebeproben von mit α-Pinen behandelten Eutern ... 104
5. Diskussion ...106
5.1. Ergebnisse der Perfusatproben ... 106
5.2. Ergebnisse der Gewebeproben... 107
5.3. Eignung des isoliert perfundierten Rindereutermodells für Studien über die intrazisternale Resorption ätherischer Öle... 108
5.2. Eignung der entwickelten GC / MS-Methode zur Analytik ätherischer Öle im Perfusat des isoliert perfundierten Rindereuters... 111
6. Zusammenfassung...113
6.1. Zusammenfassung... 113
6.2. Summary... 116
7. Literaturverzeichnis ...118
8. Tabellenanhang ...127
Abkürzungen
A. / Aa. Arteria / Arteriae
α alpha
Abb. Abbildung
bzw. beziehungsweise c Konzentration cm Zentimeter cm3 Kubikzentimeter dest. destilliert
d.h. das heißt E Eichpunkt EI electron impact eV Elektronenvolt
FID Flammenionisationsdetektor
g Gramm
GC Gaschromatograph
h Stunde
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie IS interner Standard
kg Kilogramm
LLOQ lower limit of quantification
m Meter
µg Mikrogramm MHz Megahertz min Minute µl Mikroliter ml Milliliter mm Millimeter µm Mikrometer ms Millisekunde
MS Massenspektrometer m/z Masse durch Ladung N2 Stickstoff
ng Nanogramm org. organisch
PCI positive chemische Ionisation psi 1 psi ≈ 7000 Pascal
QC quality control sample s Sekunde
SIM selected / single ion monitoring Tab. Tabelle
u. und
V. / Vv. Vena / Venae V Verdünnung z.B. zum Beispiel
1. Einleitung
Das isoliert perfundierte Rindereuter ist ein nun schon seit längerem bekanntes In- vitro-Modell zur Untersuchung der dermalen Penetration und Resorption von Wirkstoffen. Als Nebenprodukt bei der Schlachtung von Rindern ist das Euter einfach und ohne großen Kostenaufwand zu gewinnen; die leicht zu präparierenden arteriellen und venösen Zugänge des Organs ermöglichen einen schnellen Beginn der Perfusion im Institut. Neben grundlegenden Untersuchungen zur Eignung des Rindereutermodells im Hinblick auf Vitalität etc. wurden schon verschiedene Untersuchungen mit unterschiedlichen Substanzen durchgeführt.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Resorption von intrazisternal applizierten Substanzen am isoliert perfundierten Rindereuter zu untersuchen.
Die dabei angewandte Substanz Myrtol standardisiert ist Wirkstoff eines humanmedizinischen Fertigarzneimittels, das als magensaftresistente Kapsel eingenommen und vornehmlich im Dünndarm resorbiert wird. Eine Fragestellung sollte sein, ob die Resorption der stark lipophilen Substanz Myrtol standardisiert über die Zitzenschleimhaut prädiktiv für die Bioverfügbarkeit beim Menschen sein kann.
Ätherische Öle und Präparate, die ätherische Öle enthalten, werden seit jeher in vielfältiger Art und Weise eingesetzt. Probleme bereitet jedoch häufig die Analyse der Einzelkomponenten im Hinblick auf chemische Charakterisierung, Gehalt, Qualitätskontrolle oder Verunreinigungen. Ein erster wichtiger Teil der Arbeit ist demnach die Entwicklung einer Methode zur Analyse der drei Hauptkomponenten von Myrtol standardisiert α-Pinen, R-Limonen und 1,8-Cineol im Euterperfusat.
Literaturdaten zeigten, dass die Konzentrationen dieser drei Hauptkomponenten im Blut des Menschen im Nanogramm-Bereich liegen. Auch beim Übertritt in das Perfusat des isoliert perfundierten Rindereuters musste demzufolge mit niedrigen Konzentrationen gerechnet und dies bei der Analytik berücksichtigt werden.
2. Literaturübersicht
2.1. Das Rindereuter
2.1.1. Anatomie
2.1.1.1. Allgemeiner Aufbau des Euters
Das Euter, Mamma oder Uber, des Rindes stellt einen halbkugeligen Drüsenkörper, Corpus mammae, dar, der aus vier Mammarkomplexen mit je einer Zitze, Papilla mammae, zusammengesetzt ist und bei einer laktierenden Kuh je nach Milch- und Blutgehalt 5-10 kg und mehr wiegen kann (HABERMEHL 1996). Auch andere Faktoren wie Alter der Tiere, Rasse und Fütterung beeinflussen Ausbildung und Größe der Milchdrüse. Aufgrund des Aufbaues ihres Ausführungsgangsystems und dessen Drüseneinheiten handelt es sich bei der Milchdrüse um eine zusammengesetzte tubuläre Drüse mit verzweigten, alveolären Endstücken, die auch als Stapeldrüse bezeichnet wird (LIEBICH et al. 1998).
Jede Milchdrüse besteht aus vier Vierteln, die mit je einer Zitze ausgestattet und deren Drüsenbezirke weitgehend voneinander getrennt sind. Dies konnte durch Füllung mit verschieden gefärbten Injektionsmassen vom Strichkanal aus bewiesen werden (HABERMEHL 1996) und ist im Hinblick auf die eigenen Versuche mit ätherischen Ölen ein wichtiger Aspekt. Das Ligamentum suspensorium uberis (mittleres Aufhängeband) grenzt die Hälften ab; es bestehen jedoch auch arterielle Querverbindungen zwischen den beiden Euterhälften.
Jedes Euterviertel weist ein Hohlraumsystem auf, welches sich aus dem Zitzen- oder Strichkanal (Ductus papillaris), der Milchzisterne mit dem Zitzen- und Drüsenteil (Pars papillaris und Pars glandularis sinus lactiferi), den Milchgängen (Ductus lactiferi) und den Alveolen als eigentliche Drüsenendstücke zusammensetzt.
2.1.1.2. Haut
Überzogen wird das Euter von der Euterhaut, deren Bau dem allgemeinen Aufbau der äußeren Haut mit Epidermis, Corium und Hypodermis entspricht. Je nach Bereich ist sie dünn, leicht verschieblich und weist feine Haare auf, die als Einzelhaare locker verteilt vorkommen (LUDEWIG et al. 1996).
Die Haut der Zitzen ist haar- und drüsenlos. Da eine Subcutis (Tela subcutanea oder Unterhaut) fehlt, ist sie fest und unverschieblich mit der bindegewebigen Unterlage verbunden (MICHEL 1994). Das stark verzweigte, hohe Stratum papillare dient durch eine Verzahnung von Epidermis (Oberhaut) und Corium (Lederhaut) einer festen aber elastischen Verbindung, so dass die beim Melkakt nötigen Verformungen der Zitze ermöglicht werden. Auch die relativ dünne verhornte Epidermis mit 4-13 Lagen Stratum spinosum, 2-3 Lagen sehr deutlichem Stratum granulosum und wenigen Lagen Stratum corneum passt sich beim Melkakt an. Zwischen Stratum granulosum und Stratum corneum ist an manchen Stellen ein ein- bis zweilagiges Stratum lucidum ausgebildet (LUDEWIG et al. 1996; MICHEL 1994).
2.1.1.3. Bau des Drüsenkörpers
Der Drüsenkörper wird von der Euterkapsel, Capsula uberis, umgeben. Von dieser dringen Bindegewebssepten in das Innere des Drüsenkörpers ein, grenzen Einheiten des Drüsenparenchyms ab und bedingen dessen charakteristische, blattartige Anordnung (MICHEL 1994). Das bindegewebige Stützgerüst der Milchdrüse bildet eine in sich geschlossene funktionelle Einheit, die einen beachtlichen Grad von Dehnungsfähigkeit besitzt (HABERMEHL 1996).
Die Schnittfläche eines laktierenden Euters zeigt zahlreiche, unregelmäßig runde, gekörnte Felder von gelblicher Farbe, die Drüsenläppchen, Lobuli glandulae mammariae. Sie werden von dichtstehenden, traubenartigen Drüsenbläschen, Glandulae mammariae, gebildet, die von kontraktilen Korbzellen (Myoepithelzellen), feinsten Bindegewebsfasern und Blutkapillaren umhüllt sind. Diese auch als Drüsenendstücke bezeichneten Bläschen haben eine verzweigt alveolare Form und
ein in der Regel einschichtiges niedrig-kubisches bis hoch-zylindrisches Epithel (HABERMEHL 1996). Dies ändert sich je nach Sekretions- und Füllungszustand: In sekretgefüllten Alveolen ist das Epithel niedrig und wird dann bei Sekretbildung isoprismatisch bis hin zu hochprismatisch während der Sekretabgabe (LIEBICH et al.
1998; SMOLLICH 1992). Neben dem Drüsenepithel besteht die Wand der Alveolen aus der Basalmembran (Membrana propria) und dem Myoepithel, welches die Funktion glatter Muskelzellen erfüllt. Gemeinsam mit dem umgebenden Bindegewebe und den darin liegenden Kapillaren bildet die Alveolenwand die Grundlage der Blut-Milch-Schranke (MICHEL 1994). Das Epithel der Milchdrüse trennt als Lipidmembran Blut mit einem pH-Wert von 7,4 von Milch mit einem etwas niedrigeren pH-Wert (ca. 6,6). Basische Komponenten trifft man daher in der Milch in einer höheren Konzentration als im Plasma, saure Komponenten in einer niedrigeren Konzentration an (SCHANKER 1964). Eine Passage durch die hydrophilen Poren dieser Blut-Euter-Schranke ist mit einem Molekülgewicht von > 200 ausgeschlossen (RASMUSSEN 1971). Nur die nicht-ionisierte, nicht-protein-gebundene Fraktion eines Medikamentes kann durch die Blut und Milch trennende biologische Membran diffundieren (RASMUSSEN 1972).
Der charakteristische Aufbau der Drüsenbläschen trägt zu einer enormen Oberflächenvergrößerung bei und verleiht der Milchdrüse die Struktur einer apokrinen Speicherdrüse mit der Fähigkeit zu ausgesprochener Sekretstapelung (HABERMEHL 1996).
Die Milchdrüsenläppchen sind an die intralobulären Drüsengänge, die auch als kleine Milchgänge bzw. Milchkapillaren bezeichnet werden, angehängt. Häufig münden mehrere kleine Gänge in einen gemeinsamen Hohlraum, aus dem der mittelgroße Ausführungsgang hervorgeht. Die mittelgroßen und großen Milchgänge liegen mit ihren sinusartigen Erweiterungen interlobulär im Interstitium und münden schließlich als Hauptgänge in den Drüsenteil der Milchzisterne. Die Anzahl dieser Hauptgänge variiert zwischen 9-15 Stück pro Euterviertel (MICHEL 1994).
Der Wandaufbau der kleinen Milchgänge entspricht weitgehend dem der Alveolen.
Das Epithel ist einschichtig und zeigt deutlich Sekretionsmerkmale wie Golgi-
Apparat, raues endoplasmatisches Retikulum, hochprismatische Zellen mit lumenwärts vorspringenden Sekretkuppen und Fetttropfen. Die mittelgroßen und großen Milchgänge sind mit einem zweischichtigen Zylinderepithel ausgekleidet (HABERMEHL 1996; MICHEL 1994).
Die Drüsenzisterne ist durch hohe Schleimhautfalten in Buchten geteilt, in welche die zahlreichen großen Milchgänge mit 5-17 mm weiten Öffnungen einmünden. Das Fassungsvermögen der Drüsenzisterne beträgt beim Rind etwa 500 cm3, das des gesamten Hohlraumsystems eines Euters mittlerer Größe und Leistung etwa 10 Liter (HABERMEHL 1996), kann jedoch individuell sehr unterschiedlich sein (MICHEL 1994).
2.1.1.4. Bau der Zitze
Eine durchschnittlich große Zitze ist etwa 6-8 cm lang mit einem Durchmesser von 2,5-3,2 cm (MICHEL 1994). Die Wand der Zitze besteht aus der äußeren Haut, einer bindegewebig-muskulösen Mittelschicht und dem Epithel des Zitzenkanals bzw. der Zisterne (MICHEL 1994). Die haar- und drüsenlose, aber reichlich mit sensiblen Nerven ausgestattete Kutis ist fest und unverschieblich mit der bindegewebig- muskulös-elastischen Unterlage verbunden.
Die Propria mucosae der Zitzenwand besteht aus kollagenem und elastischem Bindegewebe sowie zahlreichen Bündeln glatter Muskelzellen (HABERMEHL 1996).
Die Muskelfasern der Mittelschicht bilden ein vorwiegend längsorientiertes, netzartiges Spiralsystem, dessen Funktion beim Verschluss der Zitze sowie beim Öffnen und Schließen während des Melkaktes deutlich wird (MICHEL 1994).
Eingebettet in die Propria liegen zahlreiche dickwandige muskelstarke Venen. Bei manchen Tieren können auch hier geringe Mengen an Drüsengewebe ausgebildet sein (MONTEIRO-RIVIERE 1998).
Der ca. 8-11 mm lange Strichkanal hat eine punktförmige Öffnung, Ostium papillare, nach außen und ist zitzenwärts durch einen etwas vorspringenden Faltenkranz, die
Fürstenberg´sche Rosette, von der angrenzenden Zitzenzisterne abgegrenzt (HABERMEHL 1996). Am Ostium papillare bilden zahlreiche Bündel glatter Muskelzellen einen engmaschigen, muskulös-elastischen Netzverband, der die Aufgabe eines Schließmuskels, den sogenannten Musculus sphincter papillae, übernimmt (SMOLLICH 1992). Die in feine Längsfalten gelegte weiße Schleimhaut des Strichkanals trägt ein mehrschichtig verhorntes Plattenepithel mit ausgeprägtem Stratum granulosum (HABERMEHL 1996).
Der an den Strichkanal angrenzende Hohlraum der Zitze, die Zitzenzisterne, ist beim Rind groß und langgestreckt und reicht basal als Drüsenzisterne weit in die Drüsenmasse des Euters hinein (HABERMEHL 1996). Das Fassungsvermögen des Zisternenhohlraums beträgt ca. 10-15 ml. Die Auskleidung der Zisterne besteht aus einem meist zweischichtigen hochprismatischen Zylinderepithel, hat eine gelbliche Farbe und lässt ein reiches netzartiges Leisten- und Faltenmuster erkennen (HABERMEHL 1996). Die regelmäßige Ausbildung mit Sekundär- und Tertiärfalten führt zu einer starken Oberflächenvergrößerung (MICHEL 1994). Der Wechsel zum mehrschichtigen Plattenepithel des Zitzenkanals erfolgt beim Wiederkäuer unmittelbar (LIEBICH et al. 1998).
Am Übergang vom Zitzen- zum Drüsenteil der Zisterne besteht in der Regel eine deutliche Verengung, die durch eine 2-6 mm dicke Ringfalte bedingt ist und aus straffem Bindegewebe und zirkulär angeordneten Venen (Fürstenberg´scher Venenring) besteht. Dieser Venenring sowie die elastisch-muskulösen Fasern um den Strichkanal verhindern ein Abfließen der Milch außerhalb des Saugens bzw.
Melkens (HABERMEHL 1996). Bei manchen Tieren sind Gewebetrabekel ausgebildet, die sich am Übergang Zitzen- zu Drüsenzisterne von Wand zu Wand ausdehnen und den Milchfluss verlangsamen können (MONTEIRO-RIVIERE 1998).
2.1.1.5. Blutversorgung 2.1.1.5.1. Arterien
Die arterielle Vaskularisation des bovinen Euters wird neben einigen kleineren Zuflüssen aus der Arteria pudenda interna vor allem durch die Arteria pudenda externa sichergestellt.
Nach Durchtritt durch den Leistenspalt (Spatium inguinale) zusammen mit der gleichnamigen Vene und den Hauptlymphgefäßen des Euters, teilt sich die A. pudenda externa in eine vordere und hintere Euterarterie, A. mammaria cranialis und caudalis. Zusammen mit der A. mammaria media, deren Ursprung individuell beachtliche Unterschiede aufweist, versorgen sie mit ihren zahlreichen Ästen das gesamte Euter.
Der arteriellen Versorgung der Zitze dient jeweils nur eine Zitzenarterie, A. papillaris, die jedoch von den verschiedensten Gefäßen abzweigen kann. Sie verläuft nahe der Innenfläche der Zitzenwand zwischen den größeren, stark verzweigten Venen gestreckt von der Basis zur Zitzenspitze. Während des Melk- oder Saugvorgangs fließt besonders viel Blut durch die Gefäße im Zitzenbereich (MONTEIRO-RIVIERE 1998). Außer der A. papillaris sind noch weitere, feine Arterien vorhanden, die an die Haut herantreten.
Auffällig ist, dass die linksseitigen Eutergefäße oft stärker entwickelt sind als die der rechten Seite (HABERMEHL 1996).
2.1.1.5.2. Venen
Aus dem Zitzenschwellkörper, Plexus venosus papillaris, gelangt das Blut über zahlreiche Zitzenvenen, Vv. papillares in einen an der Zitzenbasis gelegenen Gefäßkranz, den Fürstenberg´schen Venenring, Circulus venosus papillae. Die dickwandigen, muskelstarken, mit Klappen ausgestatteten Vv. papillares liegen in mehreren Lagen in der Gefäßschicht der Zitzenwand und anastomosieren miteinander.
Von der Zitzenbasis wird das Blut über unmittelbar unter der Haut gelegene Eutervenen, Vv. sinuum superficiales laterales und im Innern der Milchdrüse zusammen mit den gleichnamigen Arterien verlaufende Venen an die Euterbasis geführt. Hier treten sie in die vordere und hintere Eutervene, V. mammaria cranialis und caudalis ein.
Kranial wird das Blut von der V. pudenda externa durch das Spatium inguinale in die V. pudendoepigastrica, durch die Schenkelspaltvene, V. labialis dorsalis und mammaria, kaudodorsal über den Sitzbeinausschnitt in die zur Beckenhöhle ziehende V. pudenda interna, oder durch die meist sehr voluminöse, die Bauchhaut deutlich vorwölbende und unterschiedlich stark gewundene Milchader, V. epigastria cranialis superficialis, abgeführt (HABERMEHL 1996).
Abbildung 2.1.1. verdeutlicht die Blutgefäßversorgung einer Rindereuterhälfte.
1 A. und V. pudenda externa 2 A. und V. mammaria caud.
3 A. und V. mammaria cran.
4 A. mammaria med.
5 V. epigastria cran. superf.
6 Circulus venosus papillae 7 Vv. papillares
Abb. 2.1.1.: Blutgefäßversorgung einer Rindereuterhälfte (nach WENDT et al. 1994)
2.1.2. Isoliert perfundiertes Rindereuter
Das Modell des isoliert perfundierten Rindereuters wurde schon 1939 von PETERSEN et al. erwähnt. 1941 folgte eine ausführliche Beschreibung des Versuchsaufbaus (PETERSEN et al. 1941). Die Autoren sahen schon damals die Vorteile des Einsatzes eines isolierten Organs bei Studien über Milchbildung, Milchzusammensetzung und -sekretion: Störfaktoren, die außerhalb der Milchdrüse Veränderungen am Blut hervorrufen könnten, wurden so eliminiert. Veränderungen durch variablen Blutfluss, Blutdruck oder Substanzen, die der Milchdrüse zugegeben wurden, konnten studiert werden. Außerdem war die exakte quantitative Erfassung infundierter, gespeicherter, metabolisierter und über Milch oder Perfusat ausgeschiedener Substanzen möglich.
Erste Versuche wurden mit oxigeniertem und gefiltertem Blut durchgeführt. Zusätze wie Heparin, Natriumcitrat und Dextransulfat kamen als Antikoagulantien zum Einsatz. PETERSEN et al. (1939, 1941) verwendeten bei der Perfusion eine künstliche Lunge bzw. ein künstliches Herz und führten Versuche von durchschnittlich 360 Minuten Dauer durch. PEETERS et al. (1947) arbeiteten mit Euterhälften, die nach Trennung des Euters in der Medianen parallel perfundiert wurden. So erhielten sie zwei analoge Versuchsorgane, die vergleichende Versuche, wie z. B. jene zur Bestimmung des Respirationsquotienten (PEETERS et al. 1952), möglich machten. Auch TINDAL (1957) trennte die beiden Euterhälften und perfundierte sie isoliert. Das Problem einer im Verlauf des Versuchs fortschreitenden Vasokonstriktion wurde durch Zugabe von gefäßerweiternden Stoffen wie Dibenamin und Dibenzylin (α-Rezeptorenblocker) gelöst. Außerdem erreichte TINDAL (1957) während der ersten Stunde der Perfusion eine Milch-Leistungsfähigkeit von bis zu 79 % verglichen mit den individuellen In-vivo-Milchmengen.
Analoge Versuche wurden von HARDWICK et al. (1960) sowie von LINZELL et al.
(1972) an Ziegeneutern durchgeführt. Sie präparierten die Milchdrüsen der Tiere unter epiduraler Anästhesie ab, um möglichst lange eine physiologische Blutversorgung zu gewährleisten und die Milchproduktion in vitro nicht unnötig zu verringern.
Auch BRÄUNIG (1979) teilte das Rindereuter in der Medianen. Als Perfusionsmedium wurde eine Mischung aus gewaschenen Erythrozyten und einer Tyrodelösung nach Lembeck verwendet. Ziel der Versuche war es, die Ausscheidung und Resorption von Arzneimitteln über die Milch zu untersuchen.
ARENS (1991) verwandte das gesamte Euter und heparinisierte Tyrodelösung als Perfusionsmedium und zeigte, dass das isoliert perfundierte Rindereuter neben Diffusionszellen, dem isoliert perfundierten Schweinehautlappen sowie dem isoliert perfundierten Kaninchenohr als In-vitro-Modell zur Untersuchung der dermalen Resorption geeignet ist. Bestätigt wurde die Eignung des isoliert perfundierten Rindereuters für Untersuchungen zur transdermalen Penetration und Absorption durch KIETZMANN et al. (1991, 1993a, 1993b, 1995, 1997) sowie MEYER (1997).
Vorteile des Eutermodells sind die recht einfache Beschaffung und Vorbereitung ohne großen technischen und zeitlichen Aufwand sowie eine Einsparung von Tierversuchen, da die Organe von Schlachttieren stammen. MAAß (1993) und STERL (1998) prüften am isoliert perfundierten Rindereuter weiterhin die Verträglichkeit von hautirritierenden Substanzen, welche im Tierversuch aus Gründen der Ethik und des Tierschutzes nur begrenzt zu testen wären. MAAß (1993) stellte außerdem Untersuchungen zur Lebensfähigkeit des isoliert perfundierten Euters an und ermittelte euterspezifische Grenzwerte, die auch heute noch für Vitalitätsprüfungen der Euter herangezogen werden.
EHINGER et al. (1998, 2000, 2001) untersuchten am Eutermodell die Verteilung intrazisternal applizierter Antibiotika mit dem Ergebnis, dass die Nutzung des isoliert perfundierten Rindereuters für die Ergänzung pharmakokinetischer Untersuchungen intrazisternal verabreichter Substanzen sinnvoll erscheint. So kann dieses Modell z.B. helfen, bei standardisierten Bedingungen mit gesunden Milchdrüsen eine Vorauswahl für in vivo zu testende Formulierungen zu treffen.
Eine weitere Einsatzmöglichkeit des Eutermodells wurde durch BÄUMER et al.
(2000) beschrieben: Nach Hautirritation mit topisch applizierter Arachidonsäure wurden Untersuchungen über die Synthese von Eicosanoiden durchgeführt. Die Ergebnisse bewiesen eine Eignung des Rindereutermodells als In-vitro-Modell für Studien über antiinflammatorische Effekte von Testsubstanzen, welche die
Eicosanoid-Synthese beeinflussen. Von BÄUMER et al. (2001) wurden dabei die Effekte von steroidalen sowie nicht-steroidalen Antiphlogistika mit dem isoliert perfundierten Rindereutermodell untersucht.
GROß (2000) stellte schließlich Versuche mit subkutan injizierten Substanzen am isoliert perfundierten Rindereuter an. Zielsetzung war eine vergleichende Untersuchung zur enzymatischen Resorptionsbeschleunigung von Xylazin und Ketamin, die bei der Wildtierimmobilisation eingesetzt werden.
2.2. Ätherische Öle
2.2.1. Allgemeines
Die Bezeichnung „Ätherische Öle“ ist eine Sammelbezeichnung für alle duftenden Stoffe, die durch physikalische (v.a. destillative) Verfahren aus Pflanzen, Pflanzenteilen und Gewürzen gewonnen werden. Riechstoffe aus natürlichen Quellen wie z.B. ätherische Öle werden seit Jahrtausenden genutzt. Die englische Bezeichnung "essential oils" kommt von der ursprünglichen Annahme, dass diese flüchtigen Pflanzenduftstoffe essentiell für die jeweilige Pflanze waren (RÖMPP 1995). Ätherische Öle bzw. ihre Inhaltsstoffe sind im täglichen Leben allgegenwärtig, beispielsweise als Bestandteile von Parfums, Zahnpasten, Bonbons, Kaugummis, Bohnerwachs, Schuhcremes oder Spirituosen.
2.2.2. Chemie
2.2.2.1. Allgemein
Ätherische Öle sind neben ihrer unterschiedlichen Wirkweise chemisch gesehen sehr heterogen. Es sind komplizierte Gemische von teilweise leicht flüchtigen Alkoholen, Aldehyden, Ketonen, Estern, Lactonen, Schwefel- und stickstoffhaltigen Verbindungen sowie Kohlenwasserstoffen. Ätherische Öle neigen zur Autooxidation, daher sollten sie möglichst kühl und licht- und sauerstoffgeschützt aufbewahrt werden. Die Mehrzahl der geruchsbestimmenden Bestandteile der ätherischen Öle gehören den Mono- und Sesquiterpenen an.
2.2.2.2. Terpene
Der Name „Terpene“ stammt von August Kekulé von Stradonitz (1829-1896), einem Chemiker, der Kohlenwasserstoffe der Grundformel C10H16 aufgrund ihrer Anwesenheit in Terpentinöl so bezeichnete. Die Untersuchungen seines Mitarbeiters Otto Wallach (1847-1931) legten den Grundstein für die Terpenforschung und
führten zur Aufklärung einiger häufig vorkommender Monoterpene wie Pinen, Camphen, Limonen, Terpinen, Terpinolen und Phellandren (BRAUN 2002). Terpene lassen sich formal als Polymerisationsprodukte des Kohlenwasserstoffs Isopren (C5H8) auffassen. Nach der Anzahl der Isopren-Reste unterscheidet man:
- Monoterpene C10H16
- Sesquiterpene C15H24
- Diterpene C20H32
- Sesterpene C25H40
- Triterpene C30H48
- Tetraterpene C40H64
- Polyterpene (C5H8)n
Aus den gebildeten azyklischen Kohlenwasserstoffen können durch Substitutionen, Oxidationen, Zyklisierungen, Umlagerungen usw. eine Vielzahl von Verbindungen gebildet werden. Man versteht unter Terpenen sowohl die Kohlenwasserstoffe als auch die sich davon ableitenden Alkohole, Ketone, Aldehyde und Ester. Die meisten Terpene und ihre Derivate tragen Trivialnamen. Man unterscheidet azyklische, mono-, bi- und trizyklische Terpene (RÖMPP 1995). Auf die drei Hauptkomponenten des Myrtols, die auch zu den Terpenen zählen, wird in Abschnitt 2.2.6. näher eingegangen.
2.2.3. Anwendungsmöglichkeiten in der Medizin
Die Anwendungsmöglichkeiten für ätherische Öle sind vielfältig, jedoch auch nicht unumstritten. Einige ätherische Öle gelten als appetitanregend, verdauungsfördernd und schleimlösend, da sie einen milden Reiz auf die Schleimhaut des Atmungs- und Verdauungstraktes auslösen. Außerdem sollen sie mikrobizid, fungizid und insektenabwehrend wirken (RÖMPP 1995).
SCHILCHER (1984 u. 1986) schreibt den ätherischen Ölen folgende Wirkungen zu:
Bei äußerlicher Anwendung - hyperämisierend - antiphlogistisch
- antiseptisch-desinfizierend - granulationsfördernd - desodorierend
- insektizid bzw. insektenabwehrend Bei innerlicher Anwendung - expektorierend
- appetitanregend, choleretisch, cholekinetisch, karminativ
- spasmolytisch - antiphlogistisch
- antiseptisch-desinfizierend - diuretisch
- sedierend
- Herz und Kreislauf anregend
Valide klinische Untersuchungen zu ätherischen Ölen sind rar. Das Problem ist die hohe Vielfalt der arzneilich verwendeten ätherischen Öle. Präparate mit oft mehreren Wirkstoffen machen eine Vergleichbarkeit unmöglich (LAUX et al. 1997). HÄNSEL (1992) schreibt den ätherischen Ölen z.B. bei der Behandlung des Schnupfens eher subjektiv zu erfassende Wirkungen zu: Die als Rhinologika eingesetzten ätherischen Öle wie Menthol, Eucalyptusöl und Kampfer haben keine wissenschaftlich nachgewiesene Wirkung auf die Erweiterung des Nasenvolumens, führen jedoch beim Patienten zu dem subjektiven Gefühl des freieren Durchatmens.
Die genauen Wirkungsmechanismen der ätherischen Öle sind noch nicht geklärt.
Man nimmt jedoch an, dass die Einzelkomponenten aufgrund ihrer Lipophilie in Wechselwirkungen mit den Zellmembranen treten können. TEUSCHER et al. (1990) postulieren, dass die Wirkung bei hohen Konzentrationen durch Membranschädigung entsteht, während mittlere Konzentrationen eher (den Lokalanästhetika ähnlich) membranabdichtend wirken. Ätherische Öle in sehr niedriger Konzentration werden
entsprechend ihrer physiko-chemischen Eigenschaften und der Molekülgestalt ihrer Komponenten in bestimmte Areale der Zellmembran eingelagert. Dort beeinflussen sie die dort lokalisierten Enzyme, Carrier, Ionenkanäle oder Rezeptoren und können damit zu spezifischen Reaktionen führen.
Ätherische Öle können vor allem bei Missbrauch oder nicht bestimmungsgemäßem Gebrauch auch toxisch und allergisierend wirken. Aufgrund ihrer Lipophilie werden sie im Organismus in lipophile Gewebe verteilt und pulmonal und/oder nach ihrer Metabolisierung renal ausgeschieden (LANGENECKERT 1998). So können sie vor allem das zentrale Nervensystem, Nieren und Atemwege schädigen, da ihre Eliminierung bei toxischen Dosen in unveränderter Form erfolgt. Die lokale Reizwirkung kann zu hämorrhagischer Gastroenteritis, Bronchitis, Pneumonitis, Lungenödemen, Blasenbildung, Nekrosen, Parenchym - und Gefäßschädigung von Nieren und Harnwegen, Krämpfen, Koma und Atemlähmung bis hin zum Tod führen (SEEGER 2001). Besonders bei Kindern unter 2 Jahren ist die Anwendung von ätherischen Ölen kontraindiziert: Es kann neben Bauchschmerzen, Übelkeit und Erbrechen zu Verkrampfungen des Kehlkopfes, Atemstörungen, Unruhe, Zittern und Bewegungsstörungen kommen. Ein Grund hierfür ist die Tatsache, dass die Nasenschleimhaut ein Reflexorgan des autonomen Nervensystems mit Fernwirkung auf Herz, Kreislauf und Lunge darstellt und bei Kindern unter 2 Jahren die Reflexbereitschaft besonders groß zu sein scheint (HÄNSEL 1992). Auch SCHILCHER (1984) zählt allergene, phototoxische bzw. photosensibilisierende, nekrotisierende, narkotisierende, abortive, nephrotoxische, hepatotoxische und sogar kanzerogene Nebenwirkungen auf, die vor allem bei ätherischen Ölen mit einem hohen Anteil an ungesättigten Verbindungen auftreten sollen.
2.2.4. Pharmakokinetische Studien
Trotz der großen Anzahl pflanzlicher Arzneimittel, die ätherische Öle oder deren Verbindungen enthalten, existieren nur wenige Studien zur systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik. KOHLERT (2001) gibt einen Überblick über die teilweise detaillierten, teilweise spärlichen Daten, die vor allem aus Tierexperimenten
gewonnen wurden. MEYER et al. (1959) untersuchten z.B. die Aufnahme ätherischer Öle über die Haut, wobei sie nicht die ätherischen Öle selbst, sondern die Wirkung von Physostigmin (Eserin), ein Cholinesterase-Hemmstoff, der von diesen
„mitgeschleppt“ wurde, bestimmten. RÖMMELT et al. (1974 u. 1978), SCHÄFER et al. (1982), SCHUSTER et al. (1986) sowie WEYERS et al. (1989) untersuchten ebenfalls die Aufnahme von ätherischen Ölen über die Haut und kamen zu dem Ergebnis, dass diese praktische keine Diffusionsbarriere für die Aufnahme der Wirkstoffe darstellt. Bereits kurze Zeit nach dem Auftragen bzw. Kontakt mit dem Wirkstoff wurden Spuren der ätherischen Öle im Blut gefunden. SCHUSTER et al.
(1986) sprechen der Haut als Applikationsort sogar Effekte zu, die der intravenösen Applikation gleichkommen sollen. Meist fehlen jedoch quantitative, anhand validierter Meßmethoden gewonnene Daten aus kontrollierten klinischen Studien. Auf pharmakokinetische Studien von Myrtol standardisiert wird in Abschnitt 2.2.6.4. näher eingegangen.
2.2.5. Anwendung in der Tiermedizin
Auch in der Tiermedizin werden ätherische Öle verwendet. Einsatzgebiete sind u.a.
Entzündungen, Verletzungen und stumpfe Traumata, Erkrankungen der Luftwege sowie der Magen-Darm-Trakt. Häufig verwendete ätherische Öle sind dabei Menthol, Eucalyptusöl, Pfefferminzöl, Kampfer, Thymol oder Cineol. GOLLNISCH (2002) bescheinigt den ätherischen Ölen sogar eine Steigerung der Mastleistung bei Schweinen. Auch bei der Wundbehandlung werden ätherische Öle, v.a. aus der Kamillenblüte, eingesetzt (RIEDEL-CASPARI et al. 2002). Sie sollen neben antiphlogistischen und antimikrobiellen Effekten auch die Wundreinigung, Granulation und Epithelisierung fördern. Teebaumöl (Melaleuca aternifolia) soll antimikrobiell und juckreizstillend wirken, sowie eine fungistatische und fungizide Wirkung v.a. auf Malassezia pachydermatis, eine ubiquitäre Hefeart, haben (WESELER et al. 2002).
2.2.6. Myrtol standardisiert
2.2.6.1. Allgemeines
Myrtol standardisiert ist der arzneilich wirksame Bestandteil von Gelomyrtol®- bzw.
Gelomyrtol® forte-Kapseln (120 bzw. 300 mg Myrtol standardisiert), ein Präparat der Firma Pohl-Boskamp zur Anwendung beim Menschen.
Zusammensetzung:
Die drei Hauptbestandteile des Arzneimittels sind α-Pinen, R-Limonen und 1,8- Cineol, die der Stoffklasse der Terpene zugehörig sind. 300 mg Myrtol standardisiert enthält mindestens 20 mg α-Pinen, 75 mg R-Limonen und 75 mg 1,8-Cineol neben sonstigen Kapselfüllstoffen.
α-Pinen:
α-Pinen ist eine ungesättigte Terpen-Kohlenwasserstoffverbindung mit der Summenformel C10H16 und einem Molekulargewicht von 136,23. α-Pinen leitet sich neben β- und δ-Pinen von Pinan ab und kommt in der Natur vor allem in ätherischen Ölen aus Nadelhölzern vor (α-Pinen in weit über 400 Arten). Der Siedepunkt von α- Pinen liegt bei 156°C. Pinene sind farblose, terpentinartig riechende, leicht brennbare, Haut und Schleimhäute reizende Flüssigkeiten (RÖMPP 1995). Die Abbildung 2.2.1. zeigt die Strukturformel von α-Pinen.
Abb. 2.2.1.: Strukturformel von α-Pinen (nach KOHLERT 2001)
R-Limonen:
R-Limonen bzw. 1,8-p-Menthadien ist ebenfalls ein Terpen-Kohlenwasserstoff mit der Summenformel C10H16 und einem Molekulargewicht von 136,23. Es ist eine angenehm zitronenartig riechende Flüssigkeit, die in der Natur häufig in Kümmel-, Dill-, Citronen-, Edeltannen-, Pfefferminz-, Campherölen etc. vorkommt. Der Siedepunkt von R-Limonen liegt bei 176°C (RÖMPP 1995). Die Abbildung 2.2.2.
verdeutlicht die Strukturformel von R-Limonen.
Abb. 2.2.2.: Strukturformel von R-Limonen (nach KOHLERT 2001)
1,8-Cineol:
1,8-Cineol bzw. Eukalyptol ist ein gesättigtes Terpen-Oxid mit der Summenformel C10H18O und dem Molekulargewicht 154,24. Es ist eine farblose, würzig kampferähnlich riechende Flüssigkeit, die als Hauptbestandteil (bis zu 85 %) in Eucalyptusöl vorhanden ist. Technisches Cineol wird durch fraktionierte Destillation von Eucalyptusöl gewonnen. Der Siedepunkt liegt bei 176-177°C (RÖMPP 1995).
Abbildung 2.2.3. zeigt die Strukturformel. 1,8-Cineol ist die Hauptkomponente in Myrtol standardisiert.
Abb. 2.2.3.: Strukturformel von 1,8-Cineol (nach KOHLERT 2001)
GRIMM (1987) führte eine Studie über die inhalative Therapie mit 1,8-Cineol (Soledum® Balsam) bei chronischer Bronchitis und Asthma durch und schrieb 1,8- Cineol eine spasmolytische, sekretolytische, entzündungshemmende und surfactant- ähnliche Wirkung zu. Positiv bewertete er, dass sich 1,8-Cineol als eines der wenigen gesättigten Monoterpene von den aufgrund möglicher Hydroperoxidbildung bedenklichen ungesättigten Terpenen, die sich in Eucalyptusöl befinden, unterscheidet. DOROW (1989) führte eine In-vivo-Messung (Radio-Aerosol- Szintigraphie) vor und nach Therapie mit 1,8-Cineol (Soledum® Kapseln) bei Patienten mit chronisch obstruktiver Bronchitis durch. Das Ergebnis ergab eine positive Beeinflussung der mukoziliaren Clearance der Probanden, die jedoch durch β2-Adrenergika wesentlich stärker stimuliert wurde. 1998 wurden von JUERGENS et al. Untersuchungen an asthmakranken Patienten durchgeführt. Aufgrund von Unverträglichkeitsreaktionen und paradoxen bronchokonstriktorischen Reaktionen vor allem bei Behandlung mit Terpen-Stoffgemischen werden Terpene normalerweise nicht bei Asthma eingesetzt. Die Untersuchungen führten jedoch zu dem Ergebnis, dass 1,8-Cineol (Soledum® Kapseln) deutlich bronchodilatatorische Eigenschaften und in vitro sogar ein steroidartiges Wirkprofil ohne bisher nachgewiesene typisch glukokortikosteroidartige Nebenwirkungen haben soll.
SANTOS et al. (2000) wiesen durch Untersuchungen an Ratten und Mäusen einen antiinflammatorischen und antinociceptiven Effekt von 1,8-Cineol nach.
Pharmakokinetische Untersuchungen von JÄGER et al. (1996) nach bzw. bei Inhalation von 1,8-Cineol ergaben eine gute Absorption über die Atemluft mit einem Plasma-Maximum von 459-1135 ng/ml nach ca. 18 Minuten und einer zweiphasigen
Elimination. LANGENECKERT (1998) untersuchte ebenfalls die Pharmakokinetik und relative Bioverfügbarkeit von 1,8-Cineol (neben α-Pinen und Menthol) nach dermaler, inhalativer und peroraler Applikation. Sowohl die dermale als auch inhalative Applikation führten zu messbaren Blutkonzentrationen der verwendeten Substanzen, auch wenn deutlich geringere Konzentrationen auftraten als nach peroraler Aufnahme (cmax für 1,8-Cineol peroral: 600 ng/ml; cmax für 1,8-Cineol inhalativ: 300 ng/ml; cmax für 1,8-Cineol dermal: 22 ng/ml).
2.2.6.2. Wirkprofil von Myrtol standardisiert
Der Gebrauchsinformation zu Gelomyrtol® forte zufolge wirkt Myrtol standardisiert schleimverflüssigend, fördert den Sekretabtransport, erleichtert das Abhusten und wirkt entzündungshemmend. WITTIG (2002) erstellt ein pharmakodynamisches Gesamtprofil, wobei Myrtol standardisiert nicht nur die drei klassischen Effekte von Mukopharmaka (Sekretolyse, Mukolyse, Sekretomotorik) zugeordnet werden.
Zahlreiche Studien zeigen auch antioxidative, antiinflammatorische, antimikrobielle sowie bronchospasmolytische Eigenschaften. Hierbei wurde u.a. auch das isoliert perfundierte Rindereuter als Versuchsmodell eingesetzt (BEUSCHER et al. 1998).
Myrtol standardisiert wurde über die Perfusionsflüssigkeit appliziert und minderte den durch einen Entzündungsreiz (Tetradecanoylphorbol-13-acetat-Applikation in die Zitze) induzierten Prostaglandin E2-Anstieg. Dies bestätigte die antiinflammatorischen Wirkqualitäten von Myrtol standardisiert.
2.2.6.3. Einsatzgebiete / klinische Studien
Anwendungsgebiete für Myrtol standardisiert sind akute und chronische Bronchitis sowie Sinusitis.
2.2.6.3.1. Akute Bronchitis
MATTHYS et al. (2000) verglichen in einer multizentrischen, randomisierten, doppel- blinden und placebo-kontrollierten Studie Myrtol standardisiert mit dem Sekretolytikum Ambroxol sowie mit dem β-Laktam-Antibiotikum Cefuroxim. Das Ergebnis war, dass Myrtol standardisiert als gut belegte Alternative zu Antibiotika bei
der Behandlung der unspezifischen akuten Bronchitis betrachtet werden kann, ohne das für Antibiotika-typische Risiko einer bakteriellen Resistenzentwicklung zu beinhalten.
2.2.6.3.2. Chronische Bronchitis
MEISTER et al. (1999) führten eine Langzeitbehandlung bei Patienten mit chronischer Bronchitis in den Wintermonaten durch. Diese multizentrische, randomisierte, doppel-blinde und placebo-kontrollierte Studie ergab, dass Intensität und Häufigkeit der neuerlichen Verschlimmerung, sowie Antibiotikabedarf und Beeinträchtigung der Lebensqualität durch Husten und Auswurf durch Myrtol standardisiert statistisch signifikant und in einem klinisch relevanten Ausmaß gesenkt wurde.
2.2.6.3.3. Akute Sinusitis
FEDERSPIL et al. (1997) stellten Untersuchungen zum Stellenwert einer Sekretolytikatherapie mit Myrtol standardisiert sowie einem anderen ätherischen Öl bei akuten unkomplizierten Sinusitiden neben einer Nasenschleimhaut- abschwellenden Therapie an. Das Ergebnis zeigte im Vergleich zur Placebogruppe einen statistisch signifikanten Unterschied im Ausmaß der allgemeinen Symptomenverbesserung in der Gruppe mit Myrtol standardisiert. Der Einsatz von ätherischen Ölen ist somit therapeutisch effektiv.
2.2.6.3.4. Chronische Sinusitis
WITTIG (2002) beschreibt eine Studie an ambulanten Patienten mit chronischer Sinusitis. Ein Vergleich von Myrtol standardisiert, Cineol, Ambroxol und Placebo ergab bei Behandlung mit Myrtol standardisiert eine höhere Anzahl von symptomfreien Patienten nach 10 Tagen. Röntgenologische Aufnahmen der Nasennebenhöhlen bestätigten dieses Ergebnis.
2.2.6.4. Pharmakokinetische Studien
Die relative Bioverfügbarkeit und die pharmakokinetischen Eigenschaften von Myrtol standardisiert wurden am Menschen in einer offenen, randomisierten Cross-over- Studie untersucht (ZIMMERMANN et al. 1995). Verglichen wurden die
magensaftresistenten Gelomyrtol®– bzw. Gelomyrtol® forte-Kapseln mit zerbissenen Kapseln. Als Leitsubstanz wurde 1,8-Cineol gewählt, da α-Pinen und R-Limonen nicht bei allen Probanden messbare Werte erreichten. Die Tabellen 2.2.1. und 2.2.2.
zeigen die wichtigsten pharmakokinetischen Parameter für 1,8-Cineol.
Tab. 2.2.1.: Pharmakokinetische Parameter für 1,8-Cineol im Vergleich Gelomyrtol®- Kapsel (120 mg Myrtol stand.), zerbissen / nicht zerbissen, n = 20
Parameter N Gelomyrtol®, zerbissen Gelomyrtol®, nicht zerbissen
Geometr.
Mittel Minimum Maximum Geometr.
Mittel Minimum Maximum cmax [ng/ml] 20 108,3 25,7 447,1 72,4 23,8 260,1
tmax [h] 20 0,7 0,25 3,0 2,3 0,5 5,0
AUC [ng x h/ml] 20 220,8 83,1 619,6 212,7 77,8 660,0 tlag [h] 20 0,25 0,25 0,25 1,44 0,25 4,0
Tab. 2.2.2.: Pharmakokinetische Parameter für 1,8-Cineol im Vergleich Gelomyrtol®
forte-Kapsel (300 mg Myrtol stand.), zerbissen / nicht zerbissen, n = 20
Parameter N Gelomyrtol® forte, zerbissen Gelomyrtol® forte, nicht zerbissen
Geometr.
Mittel Minimum Maximum Geometr.
Mittel Minimum Maximum cmax [ng/ml] 20 204,9 29,0 673,7 168,4 60,8 679,9
tmax [h] 20 1,08 0,25 5,0 2,57 1,75 5,0
AUC [ng x h/ml] 20 642,6 72,9 1612,4 648,0 118,1 1965,0
tlag [h] 20 0,33 0,25 1,75 1,19 0,5 2,5
Es ergibt sich für 1,8-Cineol eine relative Bioverfügbarkeit von annähernd 100 % (93,2 % bzw. 95,6 %) aus dem Vergleich der 1,8-Cineol-Plasmakonzentrationen nach Einnahme von Gelomyrtol®- und Gelomyrtol® forte-Kapseln zerbissen bzw.
nicht zerbissen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die magensaftresistenten Kapseln einen therapeutischen Vorteil durch die verzögerte Wirkstofffreisetzung (höhere Verzögerungszeit tlag) sowie die über längere Zeit vorhandene
Plasmakonzentration haben. Gelomyrtol® und Gelomyrtol® forte zeigen trotz unterschiedlicher Wirkstoffstärke eine annähernd dosisproportionale Pharmakokinetik. WITTIG (2002) erwähnt eine weitere pharmakokinetische Studie, in der α-Pinen, R-Limonen und 1,8-Cineol als Markersubstanzen nach Gabe von Myrtol standardisiert in Sputumproben der Probanden in relativ hohen Konzentrationen nachgewiesen wurden.
2.3. Chromatographische Verfahren
2.3.1. Allgemeiner Überblick
Die Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Verfahren zur analytischen oder präparativen Trennung von Stoffgemischen durch Verteilung eines Stoffes zwischen einer beweglichen, mobilen Phase und einer zweiten, stationären Phase, die nicht miteinander mischbar sind, aufgrund von Adsorptions- oder Lösungsvorgängen. Die erste durchgeführte Chromatographieart war die von dem Russen Mikhail Tswett erfundene Papierchromatographie kurz nach der Jahrhundertwende. Er trennte aus Blättern extrahierte Blattfarbstoffe, die als farbige Banden sichtbar wurden und vergab deshalb den Namen „Chromatographie“:
chroma bedeutet im Griechischen „Farbe“, graphein bedeutet „schreiben“ (SKOOG et al. 1996).
Die chromatographische Trennung beruht auf zwei Effekten: Beim Sorptionsprozess, der von der stationären Phase verursacht wird, werden die Substanzen durch Ab- oder Adsorption an das Trägermaterial festgehalten, beim Desorptionsprozess, werden die Substanzen dagegen vom Träger durch das Lösemittel (mobile Phase) abgelöst und weitertransportiert.
Man unterscheidet grundsätzlich zwischen Adsorptionschromatographie und Verteilungschromatographie. Zur Adsorptionschromatographie gehören u.a.
Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Säulenchromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und die Adsorptionsgaschromatographie.
Hier beruht die Trennung auf der Adsorption der Probensubstanzen an die stationäre Phase mit folgender Desorption durch die mobile Phase. Bei der Verteilungschromatographie herrscht eine dynamische Verteilung der Probensubstanzen zwischen stationärer und mobiler Phase. Zu dieser Art der Chromatographie gehören die Verteilungs-Dünnschichtchromatographie, die Verteilungs-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und die Verteilungs- Gaschromatographie (GOTTWALD 1995).
Eine weitere Einteilung kann in Säulenchromatographie, hier befindet sich die stationäre Phase in einem schmalen Rohr, und planare Chromatographie, hier ist die stationäre Phase auf einer Platte, erfolgen. Wenn man bei der Säulenchromatographie einen Detektor, der auf die zu analysierenden Substanzen anspricht, am Ende der Säule anbringt, erhält man ein Signal (Peak) in Abhängigkeit von der Zeit. Aus dem gewonnenen Ausdruck (Chromatogramm), einem Konzentrationsprofil der zu trennenden Stoffe in der Trennstrecke, erhält man Angaben zur qualitativen und quantitativen Zusammensetzung des Stoffgemisches.
Die Identifizierung der Probenkomponenten erfolgt durch den Vergleich der charakteristischen Peaks auf der Zeitachse, die Fläche unter den jeweiligen Peaks lässt auf den Gehalt der Komponenten in der aufgegebenen Probe schließen (SKOOG et al. 1996).
Da die Analytik in der vorliegenden Arbeit mittels Gaschromatographie erfolgt, wird im Weiteren nur auf diese chromatographische Methode eingegangen.
2.3.2. Gaschromatographie
2.3.2.1. Allgemein
Gaschromatographie ist eine Bezeichnung für eine Chromatographie zur Trennung von Stoffgemischen, die gasförmig vorliegen oder sich unzersetzt verdampfen lassen bzw. verflüchtigt werden können (normalerweise Stoffe mit einer molaren Masse
> 500 g/mol und einem Siedepunkt > 400 °C). Als mobile Phase dient ein Gas. Man unterscheidet zwischen der häufigeren Gas-Flüssigkeits-Verteilungschromatographie (GLC = gas liquid chromatography) und der Adsorptions-Gaschromatographie (GSC = gas solid chromatography). Erstere hat als Trennmedium eine flüssige stationäre Phase, letztere eine Feststoffsäule (RÖMPP 1995).
2.3.2.2. Aufbau des Gaschromatographen
Durch das System eines Gaschromatographen fließt ein Gasstrom, dessen Geschwindigkeit reproduzierbar einzustellen ist. Das Trägergas als mobile Phase passiert den Probeneinlass (Injektor) und schleust die flüssigen oder gasförmigen Proben (meist als vorher verdampften „Probendampfpfropf“) in die Trennsäule. Diese befindet sich im kontinuierlich oder definiert beheizbaren Ofenraum. Hier „pendeln“
die Moleküle durch den dynamischen Prozess der Ab- und Desorption ständig zwischen stationärer und mobiler Phase. Die örtliche Differenz, die sich durch ein unterschiedliches Phasenverhalten ausgebildet hat, wird im Verlauf der ganzen Säule größer, sodass es schließlich zur Trennung der Substanzen kommt. Dies ist beeinflussbar durch
- Art der stationären Phase - Siedepunkt der Komponenten - Länge der Säule
- Innendurchmesser der Säule - Temperatur
- Art des Trägergases
- Trägergasgeschwindigkeit.
Die Komponentengaspfröpfe verlassen örtlich getrennt die Trennsäule und werden im nachgeschalteten Detektor erkannt. Es erfolgt eine zeitliche Registrierung und die Lieferung einer elektrischen Signalgröße, die entweder der Stoffmasse oder der Stoffkonzentration proportional ist. Eine Endverstärkung dieser Signale kann durch einen Analogschreiber (X/Y-Schreiber), einen elektrischen Integrator, PC- Erfassungssysteme oder PC-Erfassungs- und Steuerungssysteme erfolgen (GOTTWALD 1995). Abbildung 2.3.1. zeigt ein prinzipielles Funktionsbild eines Gaschromatographen mit Split-Injektion.
Abb. 2.3.1.: Prinzipielles Funktionsbild eines Gaschromatographen mit Split-Injektion (nach GOTTWALD 1995)
2.3.2.2.1. Trägergas
Das Trägergas stellt die mobile Phase des Gaschromatographen dar und schleust die eingespritzten und verdampften Substanzen durch die Trennsäule. Außerdem ist es ein Gleichgewichtsmedium zur Herstellung des Gleichgewichtes von Probenmolekülen zwischen Flüssigkeits- und Gasphase. Es werden vor allem Wasserstoff, Helium, Stickstoff und eine Argon / Methan-Mischung verwendet, die gegenüber den Probensubstanzen chemisch inert sein müssen. Für Kapillar- Gaschromatographie und GC / MS-Kopplung sind besonders hochreine Trägergase von guter Qualität notwendig (z.B. 6,0 ≈ 99,9999 %). Reaktive Stoffe wie Sauerstoff und Wasser können an Zuleitungen und in den Trennsäulen zu erheblichen, irreversiblen Schäden führen. Eine Oxidation der stationären Phase kann z.B. zu einer rapiden Verschlechterung der Trennleistung führen und bei der Kopplung von Gaschromatograph und Massenspektrometer muss man auf H2O- und O2-Peaks mit den charakteristischen Massen 18 bzw. 32 Amu achten.
Ein Reduzierventil reduziert den Flaschendruck auf einen Arbeitsdruck, der die gewünschte lineare Gasgeschwindigkeit im ganzen GC-System aufrecht erhalten
muss. Er ist abhängig von der notwendigen Gasgeschwindigkeit, von der Art des Trägergases, von Durchmesser und Länge der Trennsäule, von der Temperatur des Ofens sowie von der Art des Einspritzsystems. Die lineare Gasgeschwindigkeit (cm / s) bzw. der Gasvolumenstrom (ml / min) werden durch den inneren Durchmesser der Säule bestimmt (GOTTWALD 1995).
2.3.2.2.2. Injektor
Die Aufgabe des Injektors ist es, die flüssige oder gasförmige Probe in den Trägergasstrom einzuschleusen. Je nach Bauweise unterscheidet man die Direktinjektion, die Split-Injektion, die Split- / Splitless-Injektion sowie die On-Column- Injektion. Bei der Split- / Splitless-Injektion, die bei der eigenen Analytik angewandt wurde, können z.B. Spuren von leicht verdampfbaren Substanzen in hochverdünnten Lösungen untersucht werden. Eine relativ große Menge Lösemittel und sehr wenig Probenkomponente werden dabei in den heißen Injektor gespritzt. Der Splitbetrieb ist zunächst unterbrochen. Die anschließende Trennsäule ist unbeheizt bzw. 10-20 °C unterhalb der Siedetemperatur des Lösemittels. Dadurch kondensiert die Probe am Säulenanfang. Nun wird der Splitbetrieb wieder aufgenommen und gleichzeitig das Temperaturprogramm zum Säulenaufheizen gestartet. Durch die Erhöhung der Temperatur wird zuerst das niedriger siedende Lösemittel vom Säulenkopf entfernt.
Dies führt zu einer „Lösemittelfokussierung“ d.h. einer Aufkonzentrierung der Proben durch das spätere Verdampfen derselben.
Die maximale Menge der auf die Trennsäule gegebenen Probe ist abhängig vom Innendurchmesser der Säule sowie von der Filmdicke der stationären Phase.
Auch bei der Einspritztechnik kennt man verschiedene Methoden. Man unterscheidet zwischen der gefüllten Nadeltechnik, der Leere-Nadel-Technik, der Luftpfropftechnik mit heißer oder kalter Nadel, der Spültechnik sowie der Sandwich-Technik (GOTTWALD 1995). In unserem Fall ist die komplette Nadel gefüllt. Die Injektion erfolgt sehr schnell (fast injection), um ein mögliches Verdampfen der Probe vor dem Einschuss zu verhindern.
2.3.2.2.3. Ofen
Die Aufgabe des Ofens ist es, isotherme Temperaturen oder Temperaturprogramme einzuhalten (isotherme oder temperaturprogrammierte Gaschromatographie). Die jeweilige Temperatur hängt von den Siedepunkten der zu trennenden Stoffe ab. Ein Anstieg der Temperatur bedingt eine kürzere Retentionszeit aber auch eine schlechtere Selektivität.
2.3.2.2.4. Trennsäule
Aufgabe der Trennsäule ist die Trennung der Probensubstanzen durch Sorptions- / Desorptionsprozesse. Man unterscheidet zwischen gepackten Säulen und Kapillarsäulen. Bei den gepackten Säulen befindet sich die flüssige stationäre Phase auf porösem, inerten Trägermaterial wie z.B. Silicagel oder aufgeschäumter Keramik.
Sie werden bei einfachen Trennproblemen und hohen Beladungen verwendet. Die flexiblen Kapillarsäulen bestehen vor allem aus hochreinem Quarzsand (fused silica) und sind mit einer dünnen Polyimidschicht beschichtet. Der weitere Aufbau bedingt eine erneute Unterteilung in Filmkapillarsäulen (WCOT, wall coated open tubular) und Schichtkapillarsäulen (PLOT, porous layer open tubular). Bei den PLOT-Säulen liegt die stationäre Phase als feste Schicht um die Innenwandung der Säule. Sie haben einen Durchmesser von 5-50 µm und als nahezu „leere“ Säulen bedingen sie kaum einen Widerstand für das Trägergas. Der Trennungsmechanismus beruht in einer Gas-Feststoff-Adsorption. Durch eine höhere Trennleistung werden sie vor allem in der Spurenanalytik eingesetzt. Bei WCOT-Säulen liegt die stationäre Phase als Film um die Innenwandung der Säule. Das Phasenverhältnis (β = Innendurchmesser / 4 · Filmdicke) unterteilt diese Säulen in Dickfilm- (β < 150) und Dünnfilm- (β > 300) Säulen. Folgende Bedingungen werden an die stationäre Phase der WCOT-Säulen gestellt: Die Probenmoleküle müssen ein Gleichgewicht zwischen Gasphase und stationärer Phase ausbilden können, d.h. die Probe muss teilweise in der stationären Phase lösbar sein. Generell ist das Lösungsbestreben hoch, wenn die Polarität von Lösemittel und von zu lösendem Stoff in etwa übereinstimmen. Unpolare bis polare stationäre Phasen wären z.B. Polysiloxane.
Abbildung 2.3.2. zeigt den Polysiloxangrundkörper, dessen Polarität durch
Modifikationen des Grundgerüstes fein abgestuft werden kann. In unserem Fall wurde zu 50 % Methylpolysiloxan (d.h. R = -CH3) verwendet.
Abb. 2.3.2.: Polysiloxangrundkörper (nach GOTTWALD 1995)
Unpolare stationäre Phasen vom Kohlenwasserstofftyp kann man durch die Verwendung von langkettigen, gesättigten Alkanen herstellen.
Sehr polare Säulen können durch die Verwendung von Polyethern als stationäre Phase erzeugt werden.
Die stationäre Phase darf sich nicht chemisch durch die Probe oder durch erhöhte Temperaturen verändern. Außerdem haben diese Säulen eine Maximal- und Minimaltemperatur, in deren Bereich sie eingesetzt werden dürfen.
2.3.2.2.5. Detektor 2.3.2.2.5.1. Allgemein
Die Aufgabe des Detektors ist die Signalerzeugung für ein Chromatogramm, mit dem danach eine qualitative oder quantitative Auswertung durchgeführt werden kann.
Verlässt eine andere Substanz als das Trägergas die Säule, wird durch den Detektor eine der Komponentenmenge proportionale elektrische Signalgröße erzeugt. Dieses Signal ist entweder der Konzentration (ng/ml) oder der Stoffmasse der zu detektierenden Substanz proportional. Aus der Peakfläche bzw. Peakhöhe des entsprechenden Substanzpeaks kann über einen Standard auf die Menge der
Substanz / quantitative Zusammensetzung des Substanzgemisches geschlossen werden.
Häufig verwendete Detektoren sind u.a.
- Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD) - Flammenionisationsdetektor (FID) - Elektroneneinfangdetektor (ECD) - Thermoionischer Detektor (TID) - Massenspektrometer (MS).
Der Wärmeleitfähigkeitsdetektor ist ein universell einsetzbarer Detektor. Das Messprinzip ist eine kontinuierliche Messung des Unterschieds in der Wärmeleitfähigkeit von reinem Trägergas und Säuleneluat mit einer Hitzedrahtmethode.
Der Flammenionisationsdetektor, ein selektiver Detektor, der auch häufig in der Ätherisch-Öl-Analytik eingesetzt wird, spricht auf Verbindungen an, die in heißer Wasserstoffflamme zu Ionen dissoziieren. Kohlenstoffhaltige Verbindungen z.B.
bilden in der Flamme CH-Radikale, die mit Sauerstoffradikalen reagieren. Die angeregten Oxidationsprodukte zerfallen unter Ionisierung und werden anschließend an der Kollektorelektrode entladen. Dabei fließt Strom im Pico-Ampere-Bereich, der mit einem Elektrometer erfasst, digitalisiert und zu einem Ausgabegerät geleitet wird.
Dieser Stromfluss verhält sich proportional zur verbrannten Probenmenge.
Der Elektroneneinfangdetektor (electron-capture detector, ECD) erfasst hauptsächlich halogenhaltige und metallorganische Verbindungen. Das durch ß- Teilchen ionisierte Trägergas erzeugt an der Kollektorelektrode einen konstanten
„Hintergrundstrom“. Eluiert nun eine elektroneneinfangende Substanz in den Detektor, nimmt die Zahl der Elektronen ab, welche die Kollektorelektrode erreichen.
Die verursachte Differenz wird vom Detektor als Signal ausgegeben (SKOOG et al.
1996).
Der Thermoionische Detektor spricht selektiv auf Substanzen an, die Stickstoff oder Phosphor enthalten.
Da in der vorliegenden Arbeit mit einem Massenspektrometer gearbeitet wurde, wird im folgenden Abschnitt darauf näher eingegangen.
2.3.2.2.5.2. Massenspektrometer
Massenspektrometrie ist die Bezeichnung für ein physikalisches Verfahren, dass Ionen entsprechend ihrem Verhältnis Masse zu Ladung (m/z) auftrennt und registriert. Dafür braucht ein Massenspektrometer ein Einlasssystem, eine Einrichtung zur Erzeugung von Ionen („Ionenquelle“), eine Trennvorrichtung („Massenanalysator“), einen Auffänger / Detektor zur Registrierung der Ionen, eine Datenanlage und eine Pumpe zur Erzeugung des benötigten Vakuums (RÖMPP 1995).
In unserem Fall ist der Gaschromatograph direkt mit der Ionisierungskammer des Massenspektrometers gekoppelt. Die Ionisation erfolgt im Hochvakuum in der Ionenquelle. Neben Ionisationsarten wie Feld- oder Funkenionisation, sind die beiden Hauptmethoden die Ionisierung der Moleküle durch Elektronenstoß (EI = electron impact) und die positive oder negative chemische Ionisation mit ionisiertem Reaktandgas.
Bei der Ionisierung durch Elektronenstoß (70 eV) werden die Moleküle durch Elektronenbeschuss fragmentiert.
Die chemische Ionisation erfolgt durch Kollision der gasförmigen Atome einer Probe mit Ionen, die durch Elektronenbeschuss eines im Überschuss vorliegenden Reaktandgases erzeugt wurden. Meist verwendet man positive Ionen, aber auch die Ionisation mit negativen Ionen wird gelegentlich bei Analyten verwendet, die stark elektronegative Atome enthalten. Einer der häufigsten Reaktanten ist Methan (CH4), das mit hochenergetischen Elektronen unter Bildung verschiedener Ionen wie CH4+·, CH3+ und CH2+· reagiert. Dabei herrschen CH4+·-Ionen vor (etwa 90 % des Reaktionsproduktes). Sie reagieren sehr schnell mit weiteren Methanmolekülen wie folgt:
CH4+· + CH4 → CH5+ + CH3· CH3+ + CH4 → C2H5+ + H2
Generell sind Zusammenstöße mit Probenmolekülen XH und CH5+ oder C2H5+ sehr reaktiv und führen zu Protonen- oder Hydridtransfer:
CH5+ + XH → XH2+ + CH4 Protonentransfer C2H5+ + XH → XH2+ + C2H4 Protonentransfer C2H5+ + XH → X+ + C2H6 Hydridtransfer
Die Protonentransferreaktion ergibt Ionen der Masse (M + 1)+, während die Hydridtransferreaktion Ionen erzeugt, dessen Masse um eine Einheit niedriger ist als die des Analyten [(M – 1)+] (SKOOG et al. 1996). Eine dritte Möglichkeit wäre die Assoziationsreaktion, die durch Übertragung des Ions C2H5+ auf den Analyten sogenannte Assoziationskomplexe oder Adduktionen bildet [(M + 29)+] (SCHULTZE et al. 1992).
Allgemein gilt die chemische Ionisation als schonenderes Fragmentierungsverfahren.
Durch das ionisierte Reaktandgas werden Fragmente mit höherem Massen- Ladungsverhältnis und somit einer höheren Spezifität gebildet. CI-Spektren sind jedoch sehr abhängig von experimentellen Parametern, so dass der Vergleich mit Literaturdaten wie beim EI-Modus im Allgemeinen nicht möglich ist (SCHULTZE et al. 1992).
Der Massenanalysator sollte in der Lage sein, zwischen geringstfügigen Massendifferenzen zu unterscheiden. Außerdem muss er für eine ausreichende Zahl von Ionen durchlässig sein, um sofort messbare Ionenströme zu gewährleisten. Die am häufigsten verwendeten Massenanalysatoren sind Quadrupolanalysatoren, die eher als Massenfilter bezeichnet werden, da sie nur Ionen in einem engen Bereich von m/z-Verhältnissen passieren lassen, die anderen jedoch neutralisieren und als ungeladene Moleküle entfernen. Das Herz des Gerätes ist ein Satz von vier parallel zueinander angeordneten runden Stabelektroden. An jedes Paar gegenüberliegender Elektroden ist eine Gleichspannung, überlagert von einer
hochfrequenten Wechselspannung gelegt. Die Ionen werden ab der Quelle in den Raum zwischen den Stäben gelenkt und der Ionenstrahl wird durch das dortige Hochfrequenzfeld zu Schwingungen angeregt, die massenabhängig sind. Nur für Ionen einer bestimmten Masse bleibt die Schwingungsamplitude klein. Diese können das System passieren und in den Auffänger / Detektor gelangen, der Rest trifft auf die Stäbe und wird eliminiert. Durch die Änderung der Werte für Gleich- und Wechselspannung wird das geforderte Massenspektrum „durchfahren“ (RÖMPP 1995). Ist das Spektrometer auf einen geeigneten m/z-Wert eingestellt, kann das in den Auffänger / Detektor gelangte Ion als Funktion der Zeit aufgezeichnet werden.
Diese Technik nennt man Erfassung ausgewählter / einzelner Ionen bzw. SIM (selected / single ion monitoring)-Modus im Gegensatz zum Scan-Modus, bei dem vollständige Massenspektren (1-10 Spektren / s) aufgenommen werden. Der Auffänger / Detektor ist in den meisten Fällen ein Elektronenvervielfacher. Dieser Detektor besteht aus einer Kathode und mehreren hintereinandergeschalteten Dynoden, die unter jeweils höherer Spannung stehen. Die Kathode als auch die Dynoden besitzen Kupfer-/Beryllium-Oberflächen, aus denen Elektronenlawinen austreten, wenn energiereiche Ionen oder Elektronen auftreffen (SKOOG et al.
1996).
2.3.2.3. Einsatzmöglichkeiten bei ätherischen Ölen
Ätherische Öle sind aufgrund ihrer Flüchtigkeit prädestiniert für die Analyse mittels Gaschromatographie (ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY 1997). Im Laufe der Zeit nahm der Einsatz ätherischer Öle immer mehr zu, so dass die analytische Beurteilung dieser Substanzen an Bedeutung gewann (KUBECZKA 1992). Waren laut WICHTL (1992) erst in einigen wenigen Monographien ätherischer Öle im Deutschen Arzneibuch eine gaschromatographische Prüfung auf Reinheit und Gehalt vorgesehen, ist im Europäischen Arzneibuch 2002 bei den meisten ätherischen Ölen neben der Dünnschichtchromatographie auch die Gaschromatographie erwähnt. Für die Qualitätsbeurteilung eines ätherischen Öles waren und sind nicht nur die Hauptkomponenten, sondern auch Komponenten mit geringerer Konzentration, die auch zu den physiologisch wirksamen Bestandteilen gehören können, wichtig. Mit
der Gaschromatographie waren einfach, genau und meist mühelos auch Spurenkomponenten registrier- und quantifizierbar (KUBECZKA 1992). Auch die Echtheitskontrolle bzw. der Nachweis auf Naturbelassenheit wurde immer wichtiger, da die Anzahl der Imitationen, Rekonstitutionen und synthetischen Analoga zunahm.
Dies führte zu Kopplungen von kapillarer Gaschromatographie mit der Isotopenmassenspektrometrie, sowie dem Einsatz von achiralen und chiralen Säulen (MOSANDL 1992). LOCKWOOD (2001) fasst die Entwicklung zusammen: Bereits kurz nach Einführung der Gaschromatographie in den 50er Jahren war diese Methode Mittel der Wahl, um ätherische Öle zu separieren, identifizieren sowie quantifizieren. Neben dem früheren Einsatz von gepackten Säulen, die mit verschiedenen stationären Phasen beschichtet sind, werden seit 1986 85 % der gaschromatographischen Analysen mit Kapillarsäulen durchgeführt. Die Entdeckung chiraler Phasen erlaubt seit 1990 auch die Trennung von enantiomeren Inhaltsstoffen. BRAUN et al. (2001) weisen darauf hin, dass somit Verfälschungen bei ätherischen Ölen wesentlich sicherer erkannt werden können, als mit achiralen Methoden. Ein weiterer Schritt war die Entwicklung der multidimensionalen Gaschromatographie. Hier werden z.B. verschiedene Techniken wie HPLC und GC oder zwei Gaschromatographen bzw. zwei gaschromatographische Säulen hintereinander gekoppelt. Dies soll je nach Substanz eine bessere Trennung bewirken.
Neben Detektionsmöglichkeiten wie die Olfaktometrie, die laut LOCKWOOD (2001) vor allem in Lebensmittel- und Parfumindustrie angewandt wird, ist der Flammenionisationsdetektor (FID) der am häufigsten verwendete Detektor in Ätherisch-Öl-Analysen. Auch das Europäische Arzneibuch verweist in den meisten Monographien für ätherische Öle auf den Flammionisationsdetektor, mit dem die ätherischen Öle quantifiziert werden sollen. Die Massenspektrometrie wird bei ätherischen Ölen vor allem zur Identifizierung der Komponenten eingesetzt. Der Vorteil hierbei ist die Kopplung von Retentionszeit und Massenspektrum der zu analysierenden Substanz. Vor allem bei komplexen ätherischen Ölen kann es zu überlappenden Peaks kommen, die mit einem FID nicht sicher quantifiziert werden,
