Identifikation vulnerabler Stenosen der Arteria carotis interna: Bedeutung der Monozyten-Subpopulationen und assoziierter Chemokine in der Carotis-Atherosklerose und im ischämischen Schlaganfall

II Angenommen von dem Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 29.03.2016

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum

Betreuerin: Prof. Dr. med. Karin Weißenborn Referent: PD Dr. med. Michael-Ulrich Brehm Korreferentin: Prof. Dr. med. Anja Windhagen Tag der mündlichen Prüfung: 29.03.2016 Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. med. Christoph Gutenbrunner PD Dr. med. Gerald Küther

Prof. Dr. med. Makoto Nakamura

III

Meinen Eltern

IV

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ... IV

I. Einleitung ... 1

I.1 Epidemiologie und Ätiologie des Schlaganfalls ... 1

I.2 Stenosen der Arteria carotis interna (ACI) ... 2

I.2.1 Epidemiologie der ACI-Stenose ... 2

I.2.2 Diagnostik der ACI-Stenose ... 2

I.2.3 Therapie der ACI-Stenose ... 3

I.3 Atherosklerose ... 6

I.3.1 Historischer Abriss der Atherosklerose-Forschung ... 6

I.3.2 Histopathologie und Pathogenese... 6

I.3.3 Konzept der vulnerablen Plaque ... 8

I.4 Monozyten-Subpopulationen ... 9

I.4.1 Eigenschaften und Funktion ... 11

I.4.2 Monozyten-Subpopulationen in der Atherosklerose ... 13

I.5 Inflammation nach ischämischem Schlaganfall ... 15

I.6 Chemokine ... 16

I.6.1 Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1, CCL2) ... 16

I.6.2 Fractalkine (CX3CL1) ... 17

I.7 Fragestellung und Zielsetzung ... 18

II. Material und Methoden ... 20

II.1 Material ... 20

II.2 Patientenkollektiv (Projekt 1) ... 22

II.2.1 Einschlusskriterien ... 22

II.2.2 Ausschlusskriterien ... 23

II.3 Studienprotokoll (Projekt 1) ... 23

II.4 Klinische Scores ... 26

II.5 Klinische Parameter ... 26

II.6 Durchflusszytometrische Analyse (FACS) ... 27

II.7 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA; Projekt 1) ... 32

II.7.1 Prinzip des Assays ... 32

II.7.2 Vorbereitungen ... 33

II.7.3 Messprotokoll ... 33

II.8 Histopathologie ... 34

V

II.9 Statistische Methoden (Projekt 1) ... 39

II.10 Patientenkollektiv (Projekt 2) ... 39

II.10.1 Einschlusskriterien ... 40

II.10.2 Ausschlusskriterien ... 40

II.11 Studienprotokoll (Projekt 2) ... 40

II.12 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA; Projekt 2) ... 41

II.13 Statistische Methoden (Projekt 2) ... 41

III. Ergebnisse ... 42

III.1 Projekt 1 ... 42

III.1.1 Epidemiologische Daten ... 42

III.1.2 Monozyten-Subpopulationen ... 44

III.1.2.1 Zellzahlen der Monozyten-Subpopulationen ... 44

III.1.2.2 Zellzahlen der Monozyten-Subpopulationen im Verlauf ... 46

III.1.2.3 Zellzahlen der Monozyten-Subpopulationen im Schlaganfall ... 47

III.1.2.4 Zellzahlen der Monozyten-Subpopulationen und kardiovaskuläres Risiko ... 48

III.1.3 s-CRP, IL-6 und S100B ... 49

III.1.4 MCP-1 und Fractalkine ... 49

III.1.4.1 MCP-1-Plasmakonzentrationen im Studienkollektiv ... 49

III.1.4.2 Fractalkine-Plasmakonzentrationen im Studienkollektiv ... 50

III.1.4.3 Fractalkine-Plasmakonzentrationen im Schlaganfall ... 50

III.1.5 Histopathologische Ergebnisse ... 51

III.1.5.1 Histologische Gruppenunterschiede ... 51

III.1.5.2 Relation von Monozyten-Subpopulationen mit histologischen Kriterien ... 53

III.2 Projekt 2 ... 55

III.2.1 Epidemiologische Daten ... 55

III.2.2 Der zeitliche Verlauf von Fractalkine nach ischämischem Schlaganfall ... 55

III.2.2.1 Fractalkine in Abhängigkeit vom Schlaganfall-Schweregrad ... 55

III.2.2.2 Dynamik von Fractalkine in Abhängigkeit vom Schlaganfall-Outcome ... 58

III.2.2.3 Assoziation von Fractalkine mit anderen Biomarkern ... 59

IV. Diskussion ... 60

IV.1 Rolle der Monozyten-Subpopulationen in der Atherosklerose ... 61

IV.2 Monozyten-Subpopulationen als potenzielle Vulnerabilitätsmarker für ACI-Stenosen? ... 62

IV.3 Monozyten-Subpopulationen und kardiovaskuläres Risiko ... 66

IV.4 Monozyten-Subpopulationen im ischämischen Schlaganfall ... 66

VI

IV.5 Histologische Merkmale der ACI-Stenose ... 68

IV.6 Fractalkine als Biomarker im ischämischen Schlaganfall ... 69

IV.7 Limitationen ... 72

V. Zusammenfassung ... 73

VI. Anhang ... 75

VI.1 Abbildungsverzeichnis ... 75

VI.2 Tabellenverzeichnis ... 76

VI.3 Abkürzungsverzeichnis ... 78

VI.4 Scores ... 80

VI.4.1 National Institutes of Health Stroke Scale ... 80

VI.4.2 Modified Rankin Scale ... 82

VI.4.3 Essener Schlaganfall-Risikoscore ... 82

VI.5 Auswertung von S100B, IL-6 und s-CRP in Projekt 1 ... 82

VI.6 Auswertung der Histologie in Verbindung mit den Monozyten-Subpopulationen ... 83

VI.7 Korrelation von Fractalkine mit anderen Biomarkern und Zellzahlen ... 84

VI.8 Einwilligungserklärung ... 91

VII. Literaturverzeichnis ... 93

VIII. Lebenslauf ...105

IX. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 6 und 7 ...107

X. Danksagung ...108

1

I. Einleitung

I.1 Epidemiologie und Ätiologie des Schlaganfalls

Der Schlaganfall ist weltweit eine der bedeutendsten und folgenschwersten Erkrankungen. In Deutschland ist er die dritthäufigste Todesursache (1). Insgesamt ereignen sich in Deutschland jährlich ca. 262.000 Schlaganfälle (2). Während die Mortalität des Schlaganfalls im westlichen Europa vor allem aufgrund der besseren Versorgung seit einigen Jahrzehnten sinkt (3), ist er weiterhin die häufigste Ursache für Invalidität (4).

Damit ist die Erkrankung nicht nur für das Individuum von Relevanz, sondern hat auch einen enormen sozioökonomischen Einfluss (5). Große Bedeutung kommt daher der Prävention des Schlaganfalls zu und die Verbesserung der Risikostratifizierung von Patienten ist im Fokus weltweiter Forschungsbemühungen.

Der Begriff Schlaganfall umfasst den Verlust von Funktionen des zentralen Nervensystems (ZNS) aufgrund einer Störung des zerebralen Blutflusses. Jener ist Folge entweder eines Verschlusses, der zur Ischämie führt, oder einer Ruptur (Hämorrhagie) eines Gefäßes. Die Ausprägung der zerebralen Ischämie ist sehr variabel. Der Schweregrad der Symptomatik reicht von einem vorübergehenden Ausfall (Transitorisch-ischämische Attacke, TIA) bis hin zu einem malignen Infarkt mit konsekutivem, ausgedehntem Hirnödem. Auch die Art der Symptomatik ist mannigfaltig:

Je nach betroffenem Hirnareal können die Motorik, die Sensibilität, die Vigilanz, das visuelle System, die Sprache oder die Kognition eingeschränkt sein.

Wichtige Ätiologien für die Entstehung eines ischämischen Schlaganfalls, anhand derer er klassifiziert wird (TOAST-Kriterien (6)), sind die kardiale Embolie (26 % der Fälle), die Mikroangiopathie (21 %) und Makroangiopathie (21 %). Seltene Ursachen stellen u.

a. Dissektionen (1,5 %) und Vaskulitiden (0,3 %) dar. In ca. 23 % der Fälle bleibt die Ursache unklar (7). Unter den Makroangiopathien nimmt die arterio-arterielle Embolie mit 90 % den größten Anteil in Anspruch.

2

I.2 Stenosen der Arteria carotis interna (ACI)

I.2.1 Epidemiologie der ACI-Stenose

Etwa 10 – 15 % aller ischämischen Schlaganfälle entstehen auf dem Boden einer Stenose der Arteria carotis interna (ACI) (8). Die meisten durch Carotis-Stenosen verursachten Schlaganfälle sind durch eine arterio-arterielle Embolie begründet (ca. 80 %). Bei etwa 20 % der Fälle handelt es sich um hämodynamisch bedingte Ischämien.

Laut einer 2010 erschienenen Metaanalyse von vier epidemiologischen Studien mit insgesamt 23706 Studienteilnehmern beträgt die Prävalenz einer hochgradigen, d.h.

mehr als 70-prozentigen ACI-Stenose bei unter 50 Jahre alten Männern 0,1 % und bei über 80-jährigen Männern 3,1 %. Bei Frauen liegt die Spannweite bei gleichen Altersgruppen bei 0 % bis 0,9 %. Moderate Stenosen (<70 %) liegen bei bis zu 7,5 % der über 80-jährigen Männern und 5,0 % der über 80-jährigen Frauen vor (9).

Abbildung 1: Geschlechts- und altersspezifische Prävalenzen der moderaten (A) und hochgradigen (≥70 %) ACI-Stenose (B). Mit freundlicher Genehmigung aus: de Weerd et al.

2010 (9).

I.2.2 Diagnostik der ACI-Stenose

Klinischer Standard zur Diagnose und Quantifizierung einer ACI-Stenose ist die Doppler- Sonographie. Dieses Verfahren kann jedoch nicht nur Aufschluss über den Stenosegrad geben, sondern gibt in einem gewissen Rahmen auch Informationen über morpho- logische Aspekte der Plaque. So ist beispielsweise beschrieben worden, dass eine sich in der Sonographie echoreich darstellende Stenose als prognostisch günstiges Zeichen zu werten ist (10). Ebenso kann die Plaque-Oberfläche Aufschluss geben, indem etwaige Unregelmäßigkeiten Anzeichen für ein erhöhtes Risiko einer Plaqueruptur aufzeigen

3 können. Zur Stenosegraduierung im Ultraschall bestehen verschiedene Maße, die ver- wendet werden. Das NASCET-Maß beschreibt den lokalen Durchmesser des stenosierten Lumens im Vergleich zum distalen, normal weiten Lumen, wohingegen das ECST-Maß als Vergleichswert den gedachten Durchmesser im Stenosebereich nutzt.

Weitere gebräuchliche diagnostische Verfahren sind die computertomographische Angiographie (CTA) und die Magnetresonanz-Angiographie (MRA) sowie die invasive digitale Subtraktionsangiographie (DSA), die den eigentlichen Goldstandard zur Quanti- fizierung von ACI-Stenosen darstellt (4).

Eine weitere sonographische Technik zur Plaque-Evaluation stellt die Darstellung von Micro Embolic Signs (MES) in der A. cerebri media mittels transcranieller Doppler- sonographie dar (11). Diesbezüglich wurde gezeigt, dass die Rate der detektierten embolischen Partikel pro Zeiteinheit positiv mit dem Auftreten von Schlaganfällen und TIA korreliert (12).

I.2.3 Therapie der ACI-Stenose

In mehreren internationalen Studien wurde untersucht, ob sich sogenannte asympto- matische ACI-Stenosen, die bislang weder klinisch noch bildmorphologisch passagere oder bleibende zerebrale Ischämien verursacht haben, von den symptomatischen Stenosen durch ihr Risiko eine erneute Symptomatik hervorzurufen, unterscheiden. Im Folgenden wird auf die vier wichtigsten Studien eingegangen, die sich mit der Carotis- Stenose befassen und auch regelmäßig Eingang in die Therapieempfehlungen der Leitlinien finden.

Zur Therapie symptomatischer ACI-Stenosen:

NASCET (North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial) (13) ECST (European Carotid Surgery Trial) (14)

Zur Therapie asymptomatischer ACI-Stenosen:

ACAS (Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Trial) (15) ACST (Asymptomatic Carotid Surgery Trial) (16)

4 Diese vier randomisierten, kontrollierten Studien untersuchten vornehmlich das Schlaganfallrisiko aufgrund einer ACI-Stenose und die Effekte durch die chirurgische Therapie, d. h. die Thrombendarteriektomie.

Aus den Ergebnissen geht hervor, dass Stenosen, die bereits eine Symptomatik (gemeint sind damit Schlaganfälle jeglicher Schwere einschließlich TIA) verursacht haben, im Vergleich zu asymptomatischen Stenosen ein deutlich erhöhtes Risiko für einen erneuten Schlaganfall bergen (10). Das Risiko steigt, wie aus der unten stehenden Tabelle 1 deutlich wird, mit dem Grad der Stenose. Aus den vorliegenden Daten wurde entsprechend geschlussfolgert, dass bei hochgradigen (d.h. ≥70-prozentigen) symptomatischen ACI-Stenosen die Indikation zur Operation bestehen sollte, so wie es auch in den deutschen Leitlinien vorgesehen ist (1).

NASCET ECST

Stenosegrad N Zeit (Monate) Schlaganfallrate Stenosegrad N Zeit (Monate) Schlaganfallrate

<50 % 690 60 19 %

50–69 % 428 60 22 % 60–69 % 137 36 11 %

70–79 % 43 24 21 % 70–79 % 170 36 9 %

80–89 % 33 24 27 % 80–89 % 159 36 21 %

90–99 % 24 24 35 % 90–99 % 60 36 32 %

80–99 % 57 24 31 % 80–99 % 219 36 24 %

ACAS ACST

Stenosegrad N Zeit (Monate) Schlaganfallrate Stenosegrad N Zeit (Monate) Schlaganfallrate

60–69 % 131 36 6 % 60–79 % 642 60 10 %

70–79 % 94 36 5 % 80–99 % 918 60 10 %

80–99 % 88 36 3 %

Tabelle 1: Schlaganfallrisiko in Abhängigkeit vom Stenosegrad gemäß NASCET, ECST, ACAS und ACST. Zur Quantifizierung der Stenosen wurden unterschiedliche Maße verwendet (s.

I.2.2). Modifiziert nach: Golledge et al. 2008 (10).

Die großen Studien NASCET und ECST konnten ferner belegen, dass im Fall einer hochgradigen symptomatischen Stenose die Operation der rein medikamentösen Therapie in Bezug auf das Auftreten neuer ipsilateraler Schlaganfälle überlegen ist. Die Thrombendarteriektomie (TEA) ist daher momentan das Verfahren der Wahl zur Therapie hochgradiger symptomatischer ACI-Stenosen.

5 Die klassische TEA erfolgt nach Abklemmen des Gefäßes durch eine Längsarteriotomie und anschließender Entfernung der Plaque mittels eines Dissektors. Oft wird das Gefäßsegment anschließend mit einer Patch-Plastik versorgt. Als Alternative hat sich die Eversionsendarteriektomie etabliert, bei der im Gegensatz hierzu eine Transsektion des Gefäßes stattfindet und hiernach die Gefäßwand nach außen „gekrempelt“ wird, sodass die Plaque in Form eines Eversionszylinders oder Teile eines solchen gewonnen wird.

Abschließend wird die ACI wiederum an den Abgang re-inseriert.

Im Rahmen der TEA können schwerwiegende Komplikationen auftreten, wie ein iatrogener Schlaganfall oder eine Verletzung der N. laryngeus recurrens und N.

hypoglossus (17, 18). Aufgrund der chirurgischen Manipulation in Nähe des Glomus caroticum kann es auch postoperativ zu erheblichen Blutdruckschwankungen kommen, die ihrerseits, vor allem bei kardiovaskulär komorbiden Patienten, Komplikationen hervorrufen können. Bezogen auf die Mortalität und Schlaganfälle wurde die 30-Tages- Komplikationsrate auf 6,34 % beziffert (19). Die Operation sollte laut der Leitlinien, basierend auf den Ergebnissen der NACSET- und der ECST-Studie, daher in Zentren erfolgen, die eine Komplikationsrate von weniger als 6 % aufweisen, damit der sekun- därpräventive Effekt der Therapie einer symptomatischen ACI-Stenose gewahrt bleibt.

Besonders profitieren Patienten von der Therapie, wenn der Stenosegrad zwischen 70

% und 95 % liegt und wenn der Eingriff möglichst zeitnah nach dem Ereignis stattfindet, da die Gefahr einer erneuten Ischämie insbesondere in der Frühphase hoch ist (20). Schwieriger gestaltet sich die Frage, inwiefern Patienten mit einer bislang asymptomatischen ACI-Stenose im Sinne einer Primärprävention einer chirurgischen Therapie unterzogen werden sollten. Die oben erwähnten ACAS- und ACST-Studien beschreiben eine jährliche Risikoreduktion für das Auftreten eines Schlaganfalls von 1 % nach Operation einer asymptomatischen Stenose. Hier muss die Komplikationsrate unter 3 % liegen, damit ein präventiver Effekt zu verzeichnen ist. Eine Analyse über vier Studien zeigte unter anderem, dass eine TEA an 53 Patienten mit asymptomatischer ACI-Stenose durchgeführt werden muss, um einen Schlaganfall innerhalb eines Zeitraums von drei Jahren zu verhindern, so dass statistisch gesehen 52 Patienten einer unnötigen Operation unterzogen würden (21). Einige neuere Studien postulieren sogar eine Gleichwertigkeit von medikamentöser und operativer Therapie (17). Die Indika- tionsstellung zur TEA bei hochgradigen asymptomatischen ACI-Stenosen ist daher momentan schwierig zu stellen.

6 Aufgrund der Tatsache, dass es außer dem Vorliegen einer stattgehabten Symptomatik kaum zuverlässige prognostische Marker bzw. Untersuchungen gibt, die eine Risiko- stratifizierung bezüglich der Vulnerabilität von Carotis-Stenosen zulassen, wird nach neuen Methoden gesucht, um die Notwendigkeit einer chirurgischen Intervention - auch bislang asymptomatischer Stenosen - besser abschätzen zu können.

I.3 Atherosklerose

I.3.1 Historischer Abriss der Atherosklerose-Forschung

Die der ACI-Stenose zugrundeliegende Pathologie ist hauptsächlich die Atherosklerose.

Weitaus seltener sind Vaskulitiden, fibromuskuläre Dysplasien, Dissektionen oder Fibrosen nach Strahlentherapie ursächlich (22).

Der Begriff „Arteriosklerose“ wurde 1833 von Lobstein eingeführt. Dieser bezeichnet hiermit die vor allem durch Kalzifizierung gekennzeichneten Veränderungen von Gefäßen aufgrund von Alterung und/oder veränderter lokaler Hämodynamik (23). Bereits Virchow propagierte 1862 zusätzlich einen inflammatorischen Aspekt, der als Folge intimaler Schädigung der Gefäßwand zu einer proliferativen Antwort führe (24). Diese wichtige Theorie wurde später vielfach weiter modifiziert. Beispielsweise ergänzte Marchand 1904 den Aspekt der Intimaverfettung und prägte den Begriff Atherosklerose (25). 1977 führten Ross et al. die bekannte „Response-to-injury- Hypothese“ ein, die die initiale Endothelschädigung und darauf folgende Einwanderung von Entzündungszellen in die Gefäßwand als Entstehungsmechanismus der Erkrankung beschreibt (26).

I.3.2 Histopathologie und Pathogenese

Die von Stary et al. 1995 (27) veröffentlichte Klassifikation atherosklerotischer Läsionen der American Heart Association (AHA) beschreibt die verschiedenen ineinander übergehenden Stadien der Plaquebildung und –aufrechterhaltung und deren histologische Korrelate (s. Tabelle 2). Zunächst kommt es zu einer Schädigung des Endothels und damit verbundener Dysfunktion. Dies geschieht durch Faktoren wie der

8 Matrixmetalloproteasen (MMP) produziert, die zum Abbau extrazellulärer Matrix beitragen (29-31).

Durch weitere, auch extrazelluläre Lipidakkumulation (Typ III), wächst die Läsion und bildet eine atheromatöse Plaque (Typ IV), die vom Blutstrom durch eine aus glatten Gefäßmuskelzellen (Vascular Smooth Muscle Cells, VSMC), welche aus der Media ein- wandern, bestehende fibröse Kappe abgegrenzt wird. Außerdem kommt es durch Untergang von Schaumzellen zu einem nekrotischen Kern.

Am Ende dieses unter Umständen Jahrzehnte andauernden Prozesses steht eine fibroatheromatöse (Typ V) oder komplexe (vulnerable) Läsion (Typ VI), die das Risiko der Plaque-Ruptur birgt, d.h. dem Aufbrechen der fibrösen Kappe und konsekutiver Thrombusbildung. Wichtig ist die Unterscheidung zwischen den Begriffen vulnerable und symptomatische Plaque, da die Thrombusbildung nicht zwingenderweise eine Symptomatik nach sich ziehen muss (32).

I.3.3 Konzept der vulnerablen Plaque

Als vulnerabel wird eine Plaque dann bezeichnet, wenn die Gefahr der Ruptur besteht.

Dies ist die mit Abstand häufigste Ursache für die Bildung eines intraluminalen Thrombus. Weitaus seltener ist bei Carotis-Plaques eine so genannte Plaque-Erosion ursächlich, d.h. ein Verlust von Endothelzellen aufgrund von Gefäßspasmen. Ebenso selten finden sich kalzifizierte Knötchen als Grund für die Thrombusformation (33, 34). Die Ulzeration der Plaque-Oberfläche wird durch verschiedene Faktoren begünstigt (35). So ist eine Verschmälerung der fibrösen Kappe mit einer verringerten Belastbarkeit durch Scherkräfte einhergehend. In der Oxford Plaque-Studie von 2008 wurden 428 symptomatische Carotis-Plaques histopathologisch untersucht. Die Autoren definieren die kritische fibröse Kappendicke auf einen Cut-Off-Wert in Höhe von 200 µm (36). Sobald die Kappendicke unter diesem Wert liegt, besteht eine signifikant höhere Rate an Rupturen. Darüber hinaus scheint eine dünne fibröse Kappe mit erhöhten inflammatorischen Zellzahlen einherzugehen sowie gehäuftem Auftreten von Einblutungen in die Plaque.

Der Abbau von Kollagen, der hauptsächlich durch von Makrophagen gebildete Proteasen vorgenommen wird, trägt ebenfalls zu einer erhöhten Instabilität bei. Des Weiteren

9 kann das Einsprießen von neuen Gefäßen in die Plaque (Neovaskularisierung) eine Plaque-Ruptur begünstigen. Dies kommt durch die Bildung pro-angiogenetischer Faktoren durch T-Zellen und Makrophagen zustande und sorgt wiederum für eine erhöhte Permeabilität von inflammatorischen Zellen in die Läsion sowie für ein gesteigertes Risiko der Hämorrhagie (37, 38).

In einigen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass zum einen jedoch auch asymptomatische Plaques in der Histologie eine Ruptur zeigen können und zum anderen bei Weitem nicht alle symptomatisch gewordenen Plaques dieses Kriterium erfüllen.

Dennoch konnten Golledge et al. in einer Metaanalyse über 5 Studien demonstrieren, dass die Plaque-Ruptur signifikant häufiger in symptomatischen Plaques anzutreffen ist (39).

I.4 Monozyten-Subpopulationen

Die Monozyten machen 3 - 6 % der Leukozyten aus und stellen die größten Zellen dieser Gruppe dar. Charakteristisch und namensgebend ist der große Zellkern. Seit langem ist bekannt, dass die Monozyten die Vorläufer der Gewebsmakrophagen und einiger dendritischer Zellen sind. Der Monozyt selbst entwickelt sich aus einer myeloiden Stammzelle, die er mit den neutrophilen Granulozyten gemein hat, unter Wirkung von GM-CSF und M-CSF über das Stadium des Monoblasten. Die Gesamtheit der Monozyten und ihre Vorläufer sowie die gewebsständigen und spezialisierten Makrophagen und die dendritischen Zellen bezeichnet man als mononukleäres Phagozytensystem (MPS; s.

Abb. 2) (40).

Aufgaben dieses Systems sind vornehmlich das Erkennen und Beseitigen eindringender Pathogene und die Initiation von Mechanismen sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunantwort (41). Die das MPS umfassenden Zellen sind an der Entstehung einer Vielzahl von Erkrankungen beteiligt, so bspw. an infektiösen, autoimmu- nologischen und hämatologisch-malignen Krankheiten (42).

Ziegler-Heitbrock und Kollegen beschrieben 1989 erstmals, dass der monozytäre Zelltyp keine, wie bis dahin angenommen, homogene Gruppe darstellt, sondern aus zumindest zwei Subpopulationen besteht, die mittels Durchflusszytometrie voneinander unter- schieden werden können (43). Heute wissen wir, dass es drei Subsets sind, die die

10 Monozyten ausmachen und die sich durch die Expression des Lipopoly- saccharidrezeptors (LPS) CD14 und des FcγRIII-Rezeptors CD16 differenzieren lassen (44). Hierbei nehmen die so genannten klassischen Monozyten mit ca. 85 % den größten Anteil in Anspruch. Sie präsentieren als charakteristisches Merkmal CD14 und werden im Folgenden auch als CD14-Monozyten bezeichnet. Davon abzugrenzen sind Mono- zyten, die zusätzlich CD16 auf ihrer Oberfläche tragen (ca. 15 %). Bis vor einiger Zeit wurden diese Zellen als eine Subpopulation aufgefasst, jedoch wurde dieses Konzept aufgrund verschiedener Charakteristika und Funktionen zweier Subsets innerhalb dieser Gruppe aufgegeben (45).

Abbildung 2: Schematische Darstellung des MPS. G-CFU: Granulocyte Colony-forming Unit;

GM-CFU: Granulocyte/Macrophage Colony-forming Unit; HSC: Haematopoietic Stem Cell; M- CFU: Macrophage Colony-forming Unit. Mit freundlicher Genehmigung aus: Gordon et al.

2005 (40).

So werden neben der klassischen Subpopulation auch die so genannten intermediären Monozyten, die gleichermaßen CD14 und CD16 präsentieren („doppelt-positive“) sowie

11 die nicht-klassischen Monozyten, die hauptsächlich CD16 tragen, unterschieden (s.

Tabelle 3).

Monozyten-Subpopulation Anteil Marker

Klassische Monozyten ca. 85 % CD14⁺⁺CD16^-

Intermediäre Monozyten ca. 5 % CD14⁺⁺CD16⁺

CD16⁺ Nicht-klassische Monozyten ca. 10 % CD14⁺CD16⁺⁺

Tabelle 3: Übersicht der drei Monozyten-Subpopulationen.

I.4.1 Eigenschaften und Funktion

Durch durchflusszytometrische Analysen sind die Monozyten-Subsets hinsichtlich der von ihnen exprimierten Marker weiter charakterisiert worden. Der aktuelle Wissens- stand über die auf den Monozyten-Subpopulationen vorzufindenden Marker findet sich in Tabelle 4.

Tabelle 4: Auf der Zelloberfläche präsentierte Marker der Monozyten-Subpopulationen (46, 47).

Um die Funktion der Monozyten und ihre Rolle in Erkrankungsprozessen zu klären, wurden vielfache Studien in vitro und im Mausmodell unternommen. In der Maus finden sich mindestens zwei Monozyten-Subsets, die nach dem Oberflächenmerkmal Lymphocyte Antigen 6 Complex (Ly6C) unterschieden werden. Ly6C^hi -Monozyten ent- sprechen dem aktuellen Kenntnisstand zufolge am ehesten den klassischen und inter-

Monozyten- Subpopulation

klassisch intermediär nicht-klassisch

v. a.

präsentierte Marker

 CD14

 CCR2

 CD62L

 FcγRI

 CLEC4D

 CLE5A

 IL13Rα1

 CXCR1

 CXCR2

 VEGFR1

 ScR-A

 CD14

 CD16

 CCR2

 MHC II

 HLA-DR

 CD74

 Tie-2

 CD105

 CD16

 CD43

 Siglec10

 SLAN

 CD11c

 CX₃CR1

 CCR5

12 mediären, Ly6C^low den nichtklassischen Monozyten (48, 49). Die Vergleichbarkeit der Zellgruppen wird hauptsächlich mit der Übereinstimmung in der Oberflächenmarker- und Genexpression begründet. Auch wenn sich die Ergebnisse der Studien im Mausmodell nicht gänzlich auf den menschlichen Organismus übertragen lassen, bieten sie doch wichtige Anhalte für die Verhaltensweisen von Monozyten unter bestimmten Bedingungen.

Trotz intensiver Grundlagenforschung sind die Funktionen der jeweiligen Monozyten- Subpopulationen jedoch bisher nur lückenhaft aufgeklärt. Sicher ist, dass die Monozyten-Subsets in einer großen Bandbreite von Erkrankungen eine Rolle spielen. Im Besonderen wurde die Bedeutung der Zellen in Infektions- und entzündlichen Krankheiten im Rahmen von klinischen Studien untersucht, wie bspw. der Sepsis (50) oder bei Virushepatitiden (51, 52). Auch bei immunologisch vermittelten Erkrankungen, wie dem Asthma bronchiale (53), dem M. Crohn (54) und der rheumatoiden Arthritis (55) zeigten sich Veränderungen der Monozyten-Subpopulationen. Den zugrundelie- genden Studien gemein ist, dass die hauptsächlichen Veränderungen in der Expansion des intermediären Subsets bestehen.

Aufgrund der gesteigerten Bildung proinflammatorischer Zytokine wie dem Tumor- Nekrose-Faktor-alpha (TNFα) und Interleukin (IL)-6 unter LPS-Stimulation und geringer Produktion des antiinflammatorischen IL-10 wurden die murinen Ly6C^hi- Monozyten als inflammatorisch bezeichnet. Eine aktuelle Nomenklatur hat hiervon allerdings Abstand genommen, da die Befunde auf in vitro-Experimenten basieren und somit nicht sicher auf die Funktion im Organismus schließen lassen (45). Außerdem gibt es hier eine Diskrepanz zu den Befunden klinischer Studien, aufgrund derer die CD16- tragenden Zellen als proinflammatorisch bezeichnet worden sind (44). Beim Menschen sind es die intermediären Monozyten, die vermehrt proinflammatorische Zytokine unter LPS-Stimulation ausschütten (56), weshalb die Bezeichnung inflammatorisch eher irreführend ist. Dennoch sind die intermediären Monozyten auch in Bezug auf die Antigenpräsentation potenter als die anderen Subsets. Sie weisen mehr Humanes Leukozytenantigen DR (HLA-DR), einem Klasse II Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC II), auf. Ebenso unterscheidet sich die Potenz der Phagozytose: In einer Studie internalisierten klassische Monozyten weitaus mehr Nanopartikel als die nichtklassischen (57). Auch bilden die klassischen und intermediären Monozyten

13 reaktive Sauerstoffspezies (ROS), wohingegen die nichtklassischen Monozyten dies nicht tun (58).

Zusammenfassend lässt sich auf Basis dieser Befunde sagen, dass es zumindest Hinweise darauf gibt, dass die klassischen und intermediären Monozyten eher die Entzündung begünstigen und die nichtklassischen Monozyten gegensätzlich hierzu eher anti- inflammatorisch wirksam sind. Die Einwanderung der Monozyten in das Gewebe geschieht über verschiedene Wege: Klassische Monozyten werden hauptsächlich durch MCP-1 (CCL-2) und CCL-5 angelockt. Nicht-klassische Monozyten werden vornehmlich durch CCL-5 und CX3CL1 rekrutiert (59, 60). Blockierung des letzteren Weges führt zu einer Verminderung des Patrollierens der Ly6C^low-Monozyten (61).

In einer Zellkultur-Studie ist gezeigt worden, dass die Monozyten als Ly6C^hi das Knochenmark verlassen und über den Verlust von Ly6C heranreifen (62). Auffray et al.

konnten in einem intravitalen Mikroskopie-Experiment demonstrieren, dass Ly6C^low- Monozyten abhängig von dem Integrin Leukozyten-Funktionsantigen 1 (LFA-1) und dem Chemokinrezeptor CX3CR-1 an der Gefäßwand patrollieren („Patrolling Monocytes“) und unter örtlichen infektiösen Bedingungen (L. monocytogenes) in das Gewebe einwandern und sich in Makrophagen umwandeln (61). Wie dieser Reifungsprozess genau vonstattengeht und welche Bedingungen hierfür erfüllt sein müssen, ist aktuell noch ungeklärt (63).

I.4.2 Monozyten-Subpopulationen in der Atherosklerose

Das monozytäre System spielt eine Schlüsselrolle in der Atherosklerose. Monozyten sind bereits im ersten sichtbaren Stadium einer atherosklerotischen Plaque, der fatty streak lesion, erkennbar (64) und somit wahrscheinlich die ersten Zellen, die die Atherogenese vorantreiben. Sie sind Vorläufer der Makrophagen, die ihrerseits wichtige Funktionen in der Aufrechterhaltung und Progression der Atherosklerose einnehmen. Auch die Makrophagen lassen sich in Subsets unterteilen (M1- und M2-Makrophagen). Es gibt Hinweise, dass M1-Makrophagen eher Entzündungsprozesse begünstigen, wohingegen M2-Makrophagen antiinflammatorisch aktiv sein könnten (35). Ob und wie ein Mono- zyten-Subset präferentiell in ein Makrophagen-Subset konvertiert, ist gegenwärtig noch nicht gesichert. Einige Autoren postulieren eine Konversion von klassischen Monozyten

14 zu M1-Makrophagen und nicht-klassischen Monozyten zu M2-Makrophagen innerhalb atherosklerotischer Plaques. Alle Monozyten-Subpopulationen dringen in atherosklerotische Läsionen ein. Jedoch sind die klassischen Monozyten diesbezüglich die Potentesten (60, 65). Die Chemotaxis und Einwanderung der Monozyten-Subsets wird unter anderem mithilfe der Chemokinrezeptoren CCR2, CCR5 und CX3CR1 bewerkstelligt (60, 66) (s. Abb. 3). Inwieweit die verschiedenen Subpopulationen einen Einfluss auf die Vulnerabilität einer Plaque haben und somit ggf. einen prognostischen Wert als Marker für das Schlaganfallrisiko einer bestehenden Stenose haben könnten, ist bislang nicht untersucht worden.

Abbildung 3: Darstellung der Einwanderung von Monozyten in die Gefäßwand. A: Zunächst kommt es zur chemotaktischen Anlockung der Zellen in Richtung des Endothels. B: Das membrangebundene Chemokin CX₃CL1 (Fractalkine) und das über Glykosaminoglykane (GAG) präsentierte CCL2 (MCP-1) werden von den entsprechenden auf dem Monozyten exprimierten Rezeptoren gebunden. Hiernach kommt es zur Anbindung und anschließendem Rollen auf dem Endothel mittels verschiedener weiterer Adhäsionsmoleküle (Selektine, Integrine) (nicht dargestellt). C: Nach fester Adhäsion kommt es zur Diapedese in die Intima.

D: Die Monozyten entwickeln sich zu Makrophagen, die durch Aufnahme von Lipiden zu Schaumzellen konvertieren (E). Letztere sind ebenfalls ihrerseits inflammatorisch aktiv und tragen somit zur Atherogenese weiter bei (F). Mit freundlicher Genehmigung aus: George &

Johnson 2010 (35).

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I.5 Inflammation nach ischämischem Schlaganfall

Inflammatorische Prozesse sind nicht nur für die Atherogenese und Vulnerabilität atherosklerotischer Läsionen relevant, sondern auch in der Pathophysiologie nach zerebraler Ischämie entscheidend. Das Areal des Schlaganfalls lässt sich in zwei Regionen unterteilen: Zum einen in den Infarktkern, in dem aufgrund der schlechten Perfusion der Zelltod der Neurone unumgänglich ist und zum anderen in die so genannte Penumbra, die zwar funktionell eingeschränktem, jedoch potenziell noch zu rettendem Hirngewebe entspricht (67, 68). Die Rettung letzteren Areals ist daher im Fokus der modernen Schlaganfallmedizin.

Die Hirnzellen in der Penumbra sind jedoch nicht allein durch die mangelnde Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen gefährdet, sondern auch durch eine Vielzahl komplexer und z. T. noch unverstandener Mechanismen, die sich der Ischämie anschließen und als so genannte „ischämische Kaskade“ bezeichnet werden.

Zusammengefasst kommt es nach Verbrauch der Energiespeicher der Zellen neben einem Versagen von Ionenpumpen und hiermit verbundenem Elektrolyt- Ungleichgewicht zu einem Ausstoß von exzitotoxisch wirksamen Neurotransmittern, insbesondere von Glutamat, der Bildung von ROS und so genannter DAMPs (Damage- associated molecular pattern molecules), die wesentlich zur Initiierung der inflammatorischen Antwort beitragen (69, 70). Lokale Entzündungsmediatoren bewir- ken im Folgenden die Aktivierung ortsständiger Zellen, wie Mikroglia und Astrozyten (71). Die Ausschüttung von Chemokinen führt zur Rekrutierung peripherer Immunzellen, die innerhalb von Stunden bis Tagen stattfindet und einem für den jeweiligen Zelltyp spezifischen zeitlichen Ablauf zu folgen scheint (72). Auch verschiedene Zytokine lassen sich nach einem ischämischen Schlaganfall in einem bestimmten zeitlichen Muster im peripheren Blut nachweisen (73).

Viele experimentelle Arbeiten zeigten nachteilige Auswirkungen der Inflammations- reaktion nach Schlaganfall, wie bspw. eine Zunahme des neuronalen Schadens, der fokalen Schädigung der Blut-Hirn-Schranke und einer gesteigerten Plättchenaggregation (71). Auf der anderen Seite liegen auch Ergebnisse vor, die auf regenerative Effekte durch entzündliche Prozesse nach einem ischämischen Schlaganfall schließen lassen (69).

16

I.6 Chemokine

Chemokine sind chemotaktische Zytokine, also Proteine, die als Lockstoff die Bewegungsrichtung von Zellen entlang ihres Konzentrationsgefälles beeinflussen können. Es handelt sich bei ihnen um eine Familie von ca. 50 Chemokinen mit einem Molekulargewicht von 8 – 10 kDa (74). Insgesamt wurden bislang vier Chemokin- Gruppen mit folgenden Sequenzen identifiziert: C, CC, CXC und CX3C. Die Nomenklatur richtet sich nach der Position der Cysteinreste: Chemokine mit einer C-C-Sequenz haben zwei direkt benachbarte Cysteinreste, während diese bei C-X-C-Chemokinen durch eine Aminosäure getrennt sind usw. Die Gruppen unterscheiden sich nicht nur in der Form, sondern auch in ihrer Funktion hinsichtlich der von ihnen bevorzugt angelockten Zellen.

Bei den korrespondierenden Chemokin-Rezeptoren handelt es sich um G-Protein- gekoppelte Rezeptoren, die der gleichen Nomenklatur unterliegen.

Über Glykosaminoglykane (GAG) können Chemokine auf der Oberfläche von Zellen präsentiert werden. CX3CL1 (Fractalkine) stellt insofern eine Ausnahme dar, als es membrangebunden synthetisiert wird (74). Chemokine erfüllen eine Vielzahl von Aufgaben in inflammatorischen Prozessen und sind u.a. auch an der Einwanderung von Zellen aus dem Blutsstrom in das Gewebe beteiligt.

I.6.1 Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1, CCL2)

MCP-1 gehört der Familie der C-C-Chemokine an und hat - wie der Name sagt - eine potente chemotaktische Wirkung auf Monozyten. Sein korrespondierender Rezeptor CCR2 findet sich hauptsächlich auf den klassischen und intermediären Monozyten- Subsets. MCP-1 selbst wird u. a. von Endothelzellen und glatten Muskelzellen gebildet und ist in atherosklerotischen Plaques stark nachweisbar (75).

MCP-1 gehört zu den Chemokinen, die als erste in der Atherosklerose-Forschung Bedeutung fanden. Mäuse, die genetisch defizient für CCR2 sind (CCR2-Knockout), bilden kleinere atherosklerotische Läsionen aus (76, 77). Durch Statin-Therapie kann es zu einer Reduktion von MCP-1 kommen (78). Nach einem ischämischen Schlaganfall steigt die MCP-1-Konzentration im Blut binnen weniger Stunden an und ist mit dem Outcome assoziiert (73).

17 I.6.2 Fractalkine (CX3CL1)

Fractalkine ist das einzige Chemokin mit CX3C-Motiv. Es wurde im Jahr 1997 entdeckt (79) und wird seitdem im Hinblick auf verschiedene immunologische und inflammatorische Krankheiten hin untersucht. Eine wichtige Besonderheit dieses Chemokins ist seine Eigenschaft sowohl als membrangebunden, als auch - nach einer proteolytischen Abspaltung vornehmlich durch Metalloproteasen (v. a. ADAM10) (80) - als löslich vorzuliegen. Hierdurch erfüllt Fractalkine nicht nur chemotaktische, sondern auch adhäsive Funktionen für Immunzellen, wie auch für Monozyten und zwar insbesondere für das nichtklassische Subset (s. Abb. 3).

Fractalkine wird hauptsächlich von Endothelzellen und Neuronen exprimiert, sein korrespondierender Rezeptor CX3CR1 findet sich auf CD16+-Monozyten, NK-Zellen, T- Lymphozyten (60) und Mikroglia, den ortsständigen Makrophagen des ZNS. An Stellen atherosklerotisch-veränderter Gefäßwand wird Fractalkine in allen Stadien exprimiert und wurde aufgrund seiner chemotaktischen Funktion für Monozyten als pro-atherogen angesehen (81).

Die Interaktion zwischen CX3CL1 und CX3CR1 ist im Gehirn von entscheidender Bedeutung für Kommunikation von Neuronen und Mikroglia (82-84). In mehreren in vitro-Studien konnte ein inhibitorischer Effekt von Fractalkine auf die mikrogliale Aktivität gezeigt werden (85-88) und es gibt diverse Hinweise auf eine protektive Funktion in neurodegenerativen Krankheiten, wie dem M. Alzheimer (85) und dem M.

Parkinson (86). Auch in Schlaganfall-Modellen konnten protektive Eigenschaften de- monstriert werden: So hatten Nagetiere, bei denen ein künstlicher Schlaganfall durch Media-Okklusion hervorgerufen wurde und anschließend exogenes Fractalkine intraventrikulär injiziert wurde, kleinere Infarzierungsareale und auch weniger neurologische Defizite als Kontroll-Tiere (89). Jedoch sind auch gegensätzliche Ergebnisse publiziert worden, die einer rein neuroprotektiven Natur von Fractalkine zu widersprechen scheinen. Beispielsweise sind Mäuse, die eine zugeführte genetische Defizienz von CX3CL1 tragen, weniger anfällig für zerebrale Ischämien (89-91).

18

I.7 Fragestellung und Zielsetzung

Stenosen der ACI sind eine häufige Ursache von Schlaganfällen. Mit der Carotis-TEA steht eine effektive Therapie zur Verminderung des Schlaganfallrisikos zur Verfügung.

Jedoch ist nicht klar, inwiefern asymptomatische Stenosen einer operativen Therapie bedürfen und wie Patienten mit vulnerablen, jedoch bislang asymptomatischen ACI- Stenosen identifiziert werden können. Eine bessere Abschätzung der Vulnerabilität durch Biomarker wäre ein wichtiger Schritt in Richtung einer individuellen Indikationsstellung für eine primärprophylaktische Therapie. Die Monozyten- Subpopulationen scheinen an den atherosklerotisch bedingten Erkrankungen maßgeblich beteiligt zu sein. Es gibt mehrere Befunde, die zeigen, dass diese Zellen nicht nur reaktiv auf atherosklerotische Gefäßwandveränderungen reagieren, sondern an dem Prozess der Atherogenese teilnehmen. Bislang liegt keine Untersuchung vor, die sich konkret mit dem Zusammenhang von Monozyten-Subpopulationen und ACI- Stenosen auseinandersetzt.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Verwendbarkeit der Monozytenheterogenität als Marker der Vulnerabilität von ACI-Stenosen zu prüfen. Hierbei interessierte zunächst, ob sich Patienten mit einer symptomatischen ACI-Stenose von solchen mit einer asymptomatischen hinsichtlich der Zellzahlen der Monozytensubpopulationen im peripheren Blut unterscheiden. Vergleichend sollte untersucht werden, wie sich die Zellzahlen bei Patienten mit nachweislich kardioembolischem Hirninfarkt unter Ausschluss einer Stenose der hirnversorgenden Gefäße sowie in einem Kollektiv von Patienten ohne kardiovaskuläre Vorerkrankungen verhalten.

Zusätzlich zur Analyse der Monozytensubpopulationen sollte die Möglichkeit eruiert werden, ob eine Analyse verschiedener Inflammationsmarker zweckdienlich sein kann.

Insbesondere sollte hierbei die Konzentration von Chemokinen, die an der Chemotaxis der Zellen beteiligt sind (MCP-1 und Fractalkine), im peripheren Blut untersucht werden.

Durch Gewinnung des jeweiligen OP-Präparates sollte eine histopathologische Begutachtung der Plaques ermöglicht werden, um etwaige Assoziationen zu den Befunden der Blut-Analysen zu überprüfen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, den

19 zeitlichen Verlauf der oben genannten Parameter bei Patienten mit Carotis-Stenosen nach der TEA darzustellen.

Aufgrund von Ergebnissen, die aus der Messung des Chemokins Fractalkine resultierten, wurde dieses im Rahmen der vorliegenden Arbeit zusätzlich in bereits vorhandenen Proben eines weiteren Schlaganfall-Kollektives (N = 55) gemessen. Diese retrospektive Studie wird im Folgenden als „Projekt 2“ bezeichnet. Hierbei sollte der akute sowie der Langzeit-Verlauf von Fractalkine nach einem ischämischen Schlaganfall dargestellt und der Zusammenhang zu Schweregrad und Outcome sowie zu anderen Biomarkern untersucht werden.

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II. Material und Methoden

II.1 Material

Geräte

 BD FACScalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)

 BEP III System (Siemens Healthcare, Erlangen, Deutschland)

 Microcentrifuge 5415D (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) FACS-Antikörper

 CD14 PerCP antihuman MΦP9, 345786 BD (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)

 CD16 FITC antihuman Clone 3G8, 302006 Biolegend (Biolegend, San Diego, CA, USA)

 HLA-DR PE antihuman Clone L243, 307606 Biolegend (Biolegend, San Diego, CA, USA)

FACS-Tubes

 TruCount Tubes, 340334 BD (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)

FACS-Erythrozytenlysepuffer

 EDTA 0,1 mM

 KHCO3 10 mM

 NH4CL 0,15 M ELISA

 Human CX3CL1/Fractalkine Quantikine ELISA Kit DCX310 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)

 Human CCL2/MCP-1 Quantikine ELISA Kit DCP00 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)

21 PBS-Lösung

 BioWhittaker DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (mit Ca²⁺ + Mg²⁺)), BE17-513F Lonza

Pipettenspitzen

 Biosphere Filter Tags 20µl, 100µl, 1000µl (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland)

Monovetten/Tubes

 EDTA S-Monovette 2,7 ml (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland)

 Serum S-Monovette 5,5 ml (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland)

 Serum S-Monovette 7,5 ml (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland)

 EDTA S-Monovette 7,5 ml (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland)

 Heparin S-Monovette 7,5 ml (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland)

 Sarstedt Tubes 50 ml (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland) Histologische Färbungen

 Hämatoxylin und Eosin (H&E)

 Elastica-van Gieson (EvG)

 KiM1P (bereitgestellt von der Pathologie der Universität Kiel, Deutschland; nach:

Radzun et al. (92)) Software

 Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)

 Microsoft Word 2010 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)

 GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)

 SPSS 20 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)

 BD CellQuest Pro (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)

 FlowJo (TreeStar Inc, Ashland, OR, USA)

22

II.2 Patientenkollektiv (Projekt 1)

In die vorliegende Studie sind insgesamt 43 Patienten in vier Gruppen – zwei Haupt- und zwei Kontrollgruppen eingeschlossen worden:

Hauptgruppen:

1. Patienten mit symptomatischer Carotis-Stenose (N = 11)

2. Patienten mit asymptomatischer, hochgradiger Carotis-Stenose (N = 10) Kontrollgruppen:

3. Patienten im Zustand nach kardioembolischem Schlaganfall (N = 11) 4. Patienten ohne kardiovaskuläre Ereignisse in der Vorgeschichte (N = 11)

Alle Teilnehmer der Studie wurden von einem approbierten Arzt über das Studienvorhaben aufgeklärt und das Einverständnis im Sinne des „informed consent“

schriftlich eingeholt (s. VI.8). Die Genehmigung der Studie wurde durch die Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) erteilt.

Die Patienten wurden von den neurologischen Stationen und der neurologischen Poliklinik sowie von den Stationen der Klinik für Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie der MHH rekrutiert. Bei einem der Probanden handelt es sich um einen Angehörigen eines Mitarbeiters der Studie. Die Studienteilnehmer in den Kontrollgruppen wurden dem Alter und Geschlecht nach passend zu den Patienten in den ACI-Stenose-Gruppen ausgewählt.

II.2.1 Einschlusskriterien

Das Einschlusskriterium für die beiden Hauptgruppen war die geplante Carotis-TEA. In Gruppe 3 wurden Patienten im Zustand nach einem kardioembolischen Schlaganfall aufgrund eines Vorhofflimmerns (VHF) oder eines persistierenden Foramen ovale (pFO) eingeschlossen. Bei den Studienteilnehmern in Gruppe 4 handelt es sich um Patienten mit M. Parkinson ohne kardiovaskuläre Vorgeschichte.

23 II.2.2 Ausschlusskriterien

In allen Gruppen galten als Ausschlusskriterien aktuelle Infekte, eine immunsuppressive Therapie, in Gruppe 4 zusätzlich ein kardiovaskuläres Ereignis, wie Myokardinfarkt und Schlaganfall in der Vorgeschichte. In den zwei Kontrollgruppen wurden zusätzlich Stenosen der hirnversorgenden Gefäße mittels Dopplersonographie ausgeschlossen.

II.3 Studienprotokoll (Projekt 1)

Bei allen Patienten und Probanden wurden 3 Monovetten EDTA-Blut, 2 Monovetten Serum und eine Monovette Heparin-Blut abgenommen. Hiervon wurden jeweils eine EDTA- und Serum-Probe zur Bestimmung des Differentialblutbildes und des Kreatinins genutzt. Eine weitere Serum-Probe wurde zur Bestimmung von S100B und IL-6 verwendet. Blut aus jeweils einem EDTA- und Heparinröhrchen wurde zentrifugiert und das Plasma anschließend bei -80 °C eingefroren und bis zur Bestimmung der Marker MCP-1 und Fractalkine mittels ELISA aufbewahrt. Die Monozyten-Subsets konnten mittels FACS-Analyse aus EDTA-Vollblut gemessen werden. Die Antikörpermarkierung fand innerhalb einer Stunde nach Abnahme statt.

Eruiert wurden darüber hinaus klinisch relevante Daten wie demographische Daten, die Vorgeschichte, Begleiterkrankungen, Familien- und Medikamentenanamnese und kardiovaskuläre Risikofaktoren. Zur Graduierung des kardiovaskulären Risikos wurde der Essener Schlaganfall-Risikoscore (ESRS) (93) verwendet. Bei den Schlaganfall- patienten (Gruppen 1 und 3) wurden zur Erfassung des klinischen Schweregrades des Infarktes die National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS) (94) und die modified Rankin Scale (mRS) (95) erhoben.

Im Rahmen der klinischen Routine wurde bei allen Schlaganfallpatienten eine transthorakale (TTE) bzw. transösophageale Echokardiographie (TEE) und eine Computertomographie (cCT) bzw. Magnetresonanztomographie (cMRT) des Schädels durchgeführt. Hiermit wurde die Klassifikation der Schlaganfallätiologie möglich.

Der Zeitpunkt der ersten Blutentnahme war determiniert durch die Dauer der ätiologischen Abklärung des Schlaganfalles und lag spätestens 16 Tage nach dem Ereignis, in Gruppe 1 und 2 jedoch in jedem Fall höchstens 18 Stunden präoperativ, um

24 den Zeitraum zwischen Blutentnahme und Gewinnung des Gewebes möglichst gering zu halten. Alle Studienteilnehmer haben sich einer Doppler- und Duplexsonographie der hirnversorgenden Arterien unterzogen, die durch Mitarbeiter der Neurologischen Klinik der MHH durchgeführt wurde.

Das im Rahmen der Carotis-TEA gewonnene Material stand in insgesamt 16 Fällen zur histopathologischen Aufarbeitung im Institut für Neuropathologie der Universität Göttingen zur Verfügung. Hierzu wurden die Präparate direkt nach Exzision aus dem Operationssaal abgeholt und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) transportiert. In 4 Fällen wurden die TEA-Präparate zunächst mittels Flüssigstickstoff schockgefroren und bei – 80 °C eingefroren und aufbewahrt. In 12 Fällen wurden die Präparate direkt in 4- prozentigem Formalin fixiert und verschickt.

Abbildung 4: Beispiel eines Carotis-TEA-Präparates.

In den Gruppen 1 und 2 ist eine Follow-Up-Visite drei Monate nach der ersten Messung durchgeführt worden. Im Zuge dieser Nachuntersuchung wurden wiederum die o. g.

klinischen Parameter erhoben sowie die genannten Blutwerte gemessen, mit Ausnahme des Differentialblutbildes und Kreatinins. Die Follow-Up-Visite fand in 14 Fällen in der MHH statt, in 6 Fällen bei den Patienten zuhause. Eine Übersicht über den Ablauf der Studie gibt Tabelle 5.

25 Gruppe 1. Blutentnahme und

Untersuchung

2. Blutentnahme und Untersuchung (Follow-Up-Visite) 1

(Pat. mit

symptomatischer ACI- Stenose)

Zeitpunkt (Tage nach Ereignis ± Standardabweichung):

7 Tage ± 4,347;

höchstens 18 h präoperativ

Zeitpunkt (nach 1. Visite ± Standardabweichung):

96 Tage ± 4,714

Blutparameter:

- Monozyten-Subsets - s-CRP

- IL-6 - S100B - MCP-1 - Fractalkine

- Differentialblutbild - Kreatinin

klinische Parameter:

- Doppler-und Duplex- Sonographie

- NIHSS - mRS

- Vor-/Begleiterkrankungen - Medikamente

- Risikofaktoren - ESRS

histologische Aufarbeitung der Carotis-Plaques (N = 8)

Blutparameter:

- Monozyten-Subsets - s-CRP

- IL-6 - S100B - MCP-1 - Fractalkine

klinische Parameter:

- NIHSS - mRS

- Vor-/Begleiterkrankungen - Medikamente

- Risikofaktoren - ESRS

2 (Pat. mit

asymptomatischer ACI- Stenose)

Zeitpunkt: nach Diagnosestellung,

höchstens 18 h präoperativ

Zeitpunkt (nach 1. Visite ± Standardabweichung):

99 Tage ± 7,558 Parameter: s.o.

histologische Aufarbeitung der Carotis-Plaques (N = 8)

Parameter: s.o.

3

(Pat. im Z.n.

kardioembolischem Schlaganfall)

Zeitpunkt (Tage nach Ereignis ± Standardabweichung):

3 Tage ± 2,214

keine Follow-Up-Visite

Parameter: s.o.

4

(Pat. ohne kardiovaskuläres Ereignis)

Zeitpunkt: beliebig keine Follow-Up-Visite

Parameter: s.o.

Tabelle 5: Tabellarische Darstellung des Studienprotokolls (Projekt 1)

26

II.4 Klinische Scores

Bei dem NIHSS (94) und dem mRS (95) handelt es sich um Scores, die eine Einschätzung des Grades der Beeinträchtigung von Patienten im Zustand nach einem Schlaganfall zulassen. Die beiden Tests wurden im Rahmen dieser Studie an den Patienten der zwei Schlaganfall-Gruppen (Gruppe 1 und 3) durchgeführt.

Der NIHSS besteht aus 15 Fragen, bei denen maximal 42 Punkte erreicht werden können. Je mehr Punkte erreicht werden, desto schwerer ist der untersuchte Patient betroffen. Zum Vergleich von Gruppen wurde bezüglich des Schlaganfall-Schweregrades unterschieden zwischen milden und moderat/schwerwiegenden Schlaganfällen und der Cutoff auf einen NIHSS in Höhe von 2 gelegt, da dies der Median war. Das 90-Tages- Outcome wurde definiert als ohne residuelle Symptomatik (NIHSS = 0) und mit resi- dueller Symptomatik (NIHSS >0). Der mRS bezieht sich eher auf die täglichen Aktivitäten des Patienten. Die Skala reicht von 0-6 Punkten, wobei null Punkte keine Symptomatik bedeuten und 6 Punkte dem Tod des Patienten entsprechen.

Das kardiovaskuläre Risiko wurde mittels des ESRS (93) graduiert. Dieser besteht aus 8 Faktoren und maximal 9 zu erreichenden Punkten. Ein niedriges Schlaganfallrisiko liegt bei 0-2 Punkten vor, ein hohes bei 3-6 Punkten und sehr hohes bei 7-9 Punkten.

Die beim ESRS, NIHSS und mRS durchgeführten Untersuchungen und Faktoren finden sich im Anhang (VI.4).

II.5 Klinische Parameter

Bei allen Patienten wurden klinisch relevante Parameter erhoben, wie die Risikofaktoren für die Atherosklerose, Begleit- und Vorerkrankungen, zuvor durchgeführte Operationen, Medikamente, Nikotin- und Alkoholkonsum. Zur Graduierung wurde der ESRS verwendet (s. Anhang, VI.4.3).

27

II.6 Durchflusszytometrische Analyse (FACS)

Die FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) ermöglicht die Phäno- typisierung von Zellen anhand von Lichtstreuung und Fluoreszenz. Hierbei werden die zu messenden Zellen über eine Kapillare aus einem Röhrchen angesaugt und mit Hochdruck durch das Gerät (in der vorliegenden Studie FACScalibur, Beckton Dickinson, San Jose, CA, USA) geschleust, sodass sie einzeln hintereinander das eigentliche Messsystem passieren. Hier werden sie von Laserstrahlen definierter Wellenlänge aus zwei Richtungen getroffen. Der Forward Scatter (FSC) ermöglicht durch geradlinig gemessenes Licht die Ermittlung der Größe, der Sideward Scatter (SSC) durch seitliche, im rechten Winkel zum FSC gesetzte Aufzeichnung des gestreuten Lichts die Messung der Granularität der Zelle, also das Maß der durch Oberflächenbeschaffenheit und intrazelluläre Bestandteile (v. a. Mitochondrien und Zellkern) verursachte Streuung.

Durch diese Informationen lassen sich die im Blut befindlichen Zellen mittels eines so genannten Dot-Plots, in dem SSC gegen FSC aufgetragen wird, voneinander differenzieren (s. Abb. 7).

Mittels vorheriger Markierung der Zellen durch monoklonale Antikörper, an die ein Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist, kann durch die FACS-Analyse eine Unterscheidung nach Oberflächenmerkmalen, so genannten Cluster of Differentiation (CD-Moleküle), vorgenommen werden. Die Bestrahlung des über den Antikörper an die Zelloberfläche gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffes (in der vorliegenden Studie Fluorescein- isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP)) mit der entsprechenden Wellenlänge durch Laserlicht bewirkt die nachfolgende Energieemission in Form von Licht, das wiederum detektiert wird. Die detektierte Energie korreliert mit der Anzahl der markierten CD-Moleküle, wodurch deren Verteilung auf jeder Zelle ermittelt werden kann. Die gewonnenen Daten können mit dem Programm CellQuest (Beckton Dickinson, San Jose, CA, USA) visualisiert und mit dem Programm FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) die Zellen ausgezählt werden.

Hierfür werden die entsprechenden Zellgruppen in verschiedenen Dot-Plots dargestellt und umrandet (engl. gating).

28 Abbildung 5: Darstellung des Aufbaus eines FACS-Gerätes. (Mit freundlicher Genehmigung modifiziert nach: (96))

Abbildung 6: Vergrößerte Darstellung der Funktionsweise der hydrodynamischen Fokussierung. Die Zellen werden mittels Hochdruck idealerweise in einer Linie aneinandergereiht, um so den Laserstrahl zu passieren. (Mit freundlicher Genehmigung modifiziert nach: (96))

In der vorliegenden Studie wurde das TruCount^® - System verwendet. Die hierbei zum Einsatz gekommenen speziellen Röhrchen beinhalten eine definierte Anzahl an Polyethylenkügelchen (Beads, N∼50.000), die von dem FACS-Gerät ebenso detektiert werden und als Referenz dienen. Hierdurch können nicht nur die relativen Werte, sondern die absoluten Werte an Zellen ermittelt werden. Dies geschieht über folgende Gleichung:

Anzahl) (gemessene

Beads

(absolut) Beads

Anzahl) (gemessene

Zellen

(absolut)

Zellen  

© 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. Used under permission.

© 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. Used under permission.

29 Zur FACS-Analyse der Monozyten-Subsets wurde ein von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr.

Limbourg, MHH, etabliertes Protokoll verwendet, das folgende Schritte vorsieht:

1. Pipettieren von jeweils 10 µl folgender Antikörper in das TruCount^®-Tube:

CD14 PerCP, CD16 FITC und HLA-DR PE.

2. Reverses Pipettieren von 100 μl Vollblut (EDTA) in das Tube 3. Vortexen und anschließende Inkubation in Dunkelheit für 15 min.

4. Pipettieren von 900 μl Lysepuffer

5. Vortexen und anschließende Inkubation in Dunkelheit für 15 min.

6. Starten der FACS-Analyse bei einer Durchlaufrate von ca. 3500 – 4000 Ereig- nissen pro Sekunde

7. Der durch die Messung gewonnene Datensatz wurde mit dem Programm FlowJo ausgewertet. Hierbei wurden im SSC/FSC-Plot zunächst die Monozyten (s. Abb.

8.1) ausgewählt, ebenso wie die Beads im SSC/CD14-Plot (s. Abb. 9).

Die im ersten Schritt ausgewählten Zellen wurden anschließend in einem CD14/HLA- DR-Plot (s. Abb. 8.2) in solche Zellen unterschieden, die viel HLA und solche, die wenig HLA exprimieren. Dies dient dem Zweck, Lymphozyten (v. a. NK-Zellen), die wenig HLA auf ihrer Oberfläche tragen, auszuschließen und somit weniger nicht-monozytäre Zellen im Monozyten-Gate zu analysieren.

Die so selektierten Zellen wurden schließlich in einem CD16/CD14-Plot in die drei Monozyten-Subsets unterschieden (s. Abb. 8.3). Mit Hilfe der Beads, die in einem SSC/CD14-Plot ermittelt wurden (s. Abb. 9), konnten über die o. g. Gleichung nun die absoluten Werte dieser Zellen errechnet werden.

32 Abbildung 9: Gating der als Referenz dienenden Beads.

II.7 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA; Projekt 1)

Die Plasmakonzentrationen von MCP-1 (CCL-2) und Fractalkine (CX3CL1) sind mittels Immunoassays (ELISA) bestimmt worden. Zum Einsatz sind hier direkte Sandwich- ELISA-Verfahren der Firma R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA) gekommen.

II.7.1 Prinzip des Assays

Bei dieser Messmethode befindet sich ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch gegen das zu messende Protein gerichtet ist, in jedem der 96 Wells auf der ELISA-Platte.

Wenn nun die Proben und die Standardreihe hinzu pipettiert werden, werden alle zu messenden Proteine hierdurch auf der Platte gebunden. Durch Waschschritte werden nicht gebundene Antigene entfernt. Der anschließend hinzu pipettierte spezifische polyklonale enzymbindende Antikörper setzt sich auf das zu messende Antigen. Nach einem weiteren Waschschritt wird das Substrat hinzugegeben und die Farbreaktion gestartet und nach einiger Zeit gestoppt. Die Intensität der Farbe ist proportional zu dem vorliegenden Antigen.

Beads

33 II.7.2 Vorbereitungen

Es wurden insgesamt 65 EDTA-Plasma-Proben gemessen. Diese waren bis zum Tag der Messung bei -80 °C eingefroren und wurden langsam aufgetaut. Für Gruppe 1 waren 8 MCP-1-Proben und 9 FKN-Proben, in Gruppe 2 waren 9 MCP-1-Proben und 9 FKN- Proben verfügbar. Für die Gruppen 3 und 4 konnten jeweils 10 MCP-1-Proben bestimmt werden, in Gruppe 3 11 FKN-Proben und in Gruppe 4 10 FKN-Proben. Die unter- schiedlichen Fallzahlen resultierten aus präanalytischen Gründen.

Vorbereitet wurde außerdem eine Verdünnungsreihe mit rekombinantem MCP-1, bzw.

Fractalkine als Standard. Diese bestand für die Bestimmung von MCP-1 aus folgender Konzentrationsreihe: 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,2 pg/ml, und wurde für die Fractalkine-Messung folgendermaßen hergestellt: 10 ng/ml, 5 ng/mL, 2,5 ng/ml, 1,25 ng/ml, 0,625 ng/ml, 0,312 ng/ml, 0,156 ng/ml.

II.7.3 Messprotokoll

Da sich die Protokolle der Messungen von MCP-1 und Fractalkine geringfügig unter- scheiden, wird im Folgenden ein gemeinsames Messprotokoll beschrieben und bei Unterschieden in Klammern darauf hingewiesen, um welche Prozedur es sich handelt.

1. Hinzugabe von 50 µl (MCP-1), bzw. 100 µl (Fractalkine) Verdünnungslösung in jedes Well

2. Hinzugabe von 200 µl (MCP-1), bzw. 100 µl (Fractalkine) der Standards und der Proben. Anschließende Inkubation von zwei Stunden bei Raumtemperatur (MCP- 1), bzw. drei Stunden bei 2 - 8 °C (Fractalkine)

3. 1. Waschvorgang mit 400 µl Wasch-Pufferlösung mittels Wasch-Automaten.

Dreifache Durchführung

4. Hinzugabe von 200 µl des Konjugats. Anschließende Inkubation bei Raum- temperatur für zwei Stunden (MCP-1) bzw. bei 2 - 8 °C für eine Stunde (Fractalkine)

5. 2. Waschvorgang, wie bei Schritt 3

34 6. Hinzugabe von 200 µl der Substratlösung und anschließende Inkubation für 30

Minuten bei Raumtemperatur in Dunkelheit 7. Hinzugabe von 50 µl der Stopp-Lösung

8. Messen der optischen Dichte mittels Mikroplatten-Lesegerät bei 450 nm.

II.8 Histopathologie

Die im Rahmen der TEA gewonnenen Eversionszylinder wurden unmittelbar nach Entnahme aus dem Operationssitus aus dem OP abgeholt und in PBS transportiert.

Anschließend sind 12 der Präparate umgehend in Formalin 4 % fixiert und in einem geeigneten Behältnis und durch eine sterile Kompresse geschützt zum Institut für Neuropathologie des Universitätsklinikums Göttingen, zu Händen von Herrn PD Dr. med.

W. Schulz-Schaeffer, verschickt worden. In 4 Fällen wurden die TEA-Präparate zunächst mittels Flüssigstickstoff schockgefroren und bei –80 °C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt langsam aufgetaut und dann verschickt.

Hier wurden die Präparate über einen Zeitraum von fünf Tagen mittels 20-prozentigem EDTA (pH 7,4) entmineralisiert. Die chirurgischen Präparate wurden zunächst in 3 mm dünne Schichten geschnitten und in Paraffin eingebettet (s. Abb. 10). Anschließend wurden die Paraffinblöcke in 3 µm dünne Präparate geschnitten und Färbungen mittels der histologischen Standardfärbungen Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Elastica-van Gieson (EvG) durchgeführt. Letztere Färbung dient dem Nachweis v. a. Bindegewebs- fasern, welche hiermit rot zur Darstellung kommen. Zusätzlich wurde immunhistochemisch der Pan-Makrophagenmarker KiM1P (92) verwendet, welcher von dem Pathologischen Institut der Universität Kiel zur Verfügung gestellt wurde.

Die Präparate wurden daraufhin auf Basis folgender Kriterien verblindet zu den klinischen Daten begutachtet:

 Wandfibrosierung (Anteil)

 Makrophagenmenge (Anteil)

 Mineralisierung (Anteil)

 Blutungsresorption (Anteil)

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 Granulozyteninfiltration von Einblutungen (ja/nein)

 Riesenzellen (ja/nein)

 Gefäßwandinfiltration durch Lymphozyten (ja/nein)

 Lymphozytencluster (ja/nein)

 Neovaskularisierung (ja/nein)

 Cholesterinkristalle (ja/nein)

 Plaque-Ruptur (ja/nein)

Schließlich wurden auf Basis dieser Daten durch subjektive Einschätzung durch Herrn PD Dr. med. W. Schulz-Schaeffer die Plaques als „aktiv“ oder „nicht aktiv“ gewertet.

Abbildung 10: Makroskopische Darstellung der Unterteilung eines Carotis-Präparates eines asymptomatischen Patienten.

A B

C D