4-Cycloocten-1-carbaldehyd (Terrestral pure)
Abschlußarbeit
Postgradualstudium Toxikologie an der Universität Leipzig
eingereicht von Dr.
Horst Messinger
Düsseldorf Juli 2002
Inhalt ... 2
1 Allgemeiner Teil... 3
1.1 Einleitung... 3
1.2 Toxikologische Testbatterie ... 4
2 Materialien und Methoden ... 6
2.1 Akute Toxizität...6
2.1.1 Akute orale Toxizität... 6
2.1.2 Akute dermale Toxizität...6
2.2 in-vitro Photohaemolyse...7
2.3 Akute Reizwirkungen...8
2.3.1 Hautreizung ...8
2.3.2 Augenreizung ...9
2.4 Hautsensibilisierung...9
2.5 Subchronische Toxizität ...11
2.6 Mutagenität ...13
2.6.1 in-vitro Bakterienmutagenität (Ames Test) ...13
2.6.2 in-vitro HPRT Assay in Säugerzellen...15
2.6.3 in-vitro Chromosomenaberration mit V 79 Zellinie ...16
2.6.4 in-vivo Mikronucleus-Test...20
3. Ergebnisse ...22
3.1 Akute Toxizität...22
3.1.1 Akute orale Toxizität...22
3.1.2 Akute dermale Toxizität...22
3.2 in-vitro Photohaemolyse...22
3.3 Reizwirkungen...23
3.3.1 Hautreizung ...23
3.3.2 Augenreizung ...24
3.4 Hautsensibilisierung...25
3.5 Subchronische Toxizität...27
3.6 Mutagenität ...33
3.6.1 in-vitro Bakterienmutagenität (Ames Test) ...33
3.6.2 in-vitro HPRT Assay in Säugerzellen...33
3.6.3 in-vitro Chromosomenaberration in V 79 Zellinie ...35
3.6.4 in-vivo Mikronucleus-Test...37
4 Zusammenfassung und Diskussion ...38
Einleitung
Duft und Geschmack können menschliches Empfinden und Verhalten stark beeinflussen.
Diese, meist unterschwellige Wirkung ist emotional getrieben und kaum bewußt zu steuern, was zu einer Vielzahl von kommerziellen Anwendungen für Aroma- und Riechstoffen geführt hat. Lebensmittel werden mit einer breiten Palette von Stoffen geschmacklich verbessert, wobei oft die synthetischen Aromastoffe ihre natürlichen Vorbilder an Intensität übertreffen.
Ein sehr emotionales Anwendungsgebiet für Düfte findet sich in der Parfümindustrie: mehr als 2000 verschiedene Riechstoffe und Essenzen stehen dem modernen Parfümeur zur Verfügung. Dabei entwickelt er heute nicht nur klassische Eau de Toilettes und Parfüms, sondern zunehmend industrielle Duftkompositionen, die herstellungsbedingte Eigengerüche von Hygieneprodukten wie Seifen, Desinfektionsmitteln oder Waschpulvern überdecken und damit Verbraucherakzeptanz und Kaufverhalten positiv beeinflussen.
Eine der herausragenden Entdeckungen auf dem Gebiet innovativer Riechstoffe ist die geruchsverstärkende Wirkung von 4-Cycloocten-l-carbaldehyd (Handelname Terrestral pure). Es besitzt eine starke Grünnote mit erdigen Nuancen und exotischen Fruchtnoten.
Dabei zeigt es einen ausgeprägten Verstärkungeffekt auf andere Riechstoffe und Essenzen, besonders bei fruchtigen Parfüms, denen es einen natürlicheren Charakter und Kraft verleiht.
Die Verwendung von Terrestral in Parfümrezepturen kann zu einer
signifikant reduzierten Konzentration von kostspieligen Komponenten führen.
Viele Riechstoffe sind toxikologisch ungenügend untersucht, meist mit dem Hinweis auf die vermeintlich geringen
Au D. l.
Anwendungskonzentrationen. Auf eine Reihe von Substanzen 4-Cycloocten-carbaldehyd:
„Terrestral"
wird nach Auffälligkeiten im Markt - meist vermehrte
allergische Hautreaktionen von Verbrauchern - auf freiwilliger Basis in kosmetischen Mitteln verzichtet. Das Scientific Committee on Cosmetic Products (SCC-NFP) veröffentlichte im September 2001 diesbezüglich eine Liste mit empfehlendem Charakter(1). Diese Aktivitäten
1 Opinion of the Scientific Committee on Cosmetic Products and Non-Food Products Intended for Cosmetics: An initial List of perfumery materials which must not form part of cosmetic products, adopted during the 18*
plenary meeting of 25 Sept 2001.
spezifischen regulatorischen Hintergrund stützt sich die toxikologische Absicherung von Riechstoffen heute hauptsächlich auf die gesetzlich verankerte
Produktverantwortung des Herstellers.
1.2 Toxikologische Testbatterie
Folgende Endpunkte wurden zur Bestimmung möglicher toxischer Effekte durch die Verwendung von Terrestral untersucht. Sie wurden in Anlehnung an die bestehenden Vorschriften des europäischen Chemikaliengesetzes ausgewählt, zumal es sich bei Terrestral um einen anmeldepflichtigen Neustoff handelt (2\ Die Kriterien stehen in Übereinstimmung mit den "SCC-Notes of guidance for testing of cosmetic ingredients for their safety evalua- tion" (3). Die hier vorgestellte Testbatterie untersucht die akute und subchronische Toxizität durch lokale und systemische Exposition über unterschiedliche Routen:
1) Akute orale Toxizität (OECD Methode 423, 'acute toxic class method') 2) Akute dermale Toxizität (OECD Methode 402)
3) Zytotoxizität (Photohämolytische Wirkungen)
4) Irritation a) Akute Hautreizung (OECD Methode 404) b) Akute Augenreizung (OECD Methode 405) 5) Hautsensibilisierung (OECD Methode 406, Buehler Protokoll) 6) Subchronische Toxizität (OECD Methode 408)
7) Mutagenität a) in-vitro Genmutation in Bakterien (Ames-Test, OECD Methode 471) b) in-vitro Genmutation in Säugerzellen (HPRT-Test, OECD Methode
476)
c) Chromosomenaberration in V 79 Zellinie (Cytogenetischer Assay, OECD Methode 473)
d) in-vivo Mikrokern Assay (OECD Methode 474)
Die Testbatterie ist geeignet, inherente Gefährdungspotentiale zu ermitteln und relevante Zielorgane oder -Systeme zu identifizieren. Dennoch gibt sie nur unvollständige Hinweise auf embryotoxische, teratogene oder fortpflanzungsgefährdende Eigenschaften.
- Richtlinie des Rates 67/548/EG Annex V
3 European Commision, Directorate General DG XXIV (1999), Food. Chem. Tox. 37, 357
Laborpraxis (GLP) durchgeführt.
4 Organisation for Economic Cooperation and Development - OECD (1997): ENV/MC/CHEM (98)17
2.1 Akute Toxizität
Die akute Toxizität beschreibt adverse Effekte die kurze Zeit nach Verabreichung einer Einzeldosis bzw. nach Mehrfachdosierung über einen Zeitraum von 24 Stunden beobachtet werden. Die Testsubstanz wird in aufsteigender Dosierung appliziert, toxische Effekte und Todesrate sind die zur Auswertung herangezogenen Parameter.
Das Design der für Terrestral herangezogenen Protokolle entspricht den Vorgaben der OECD- Richtlinie 423 (Akute toxische Klassen-Methode) und 402 (Akute dermale Toxizität).
2.1.1 Akute orale Toxizität
Versuchstiere'. Einer Gruppe von drei männlichen und drei weiblichen HanIbm:WIST (SPF) Ratten, das von der internationalen Richtlinie anerkannte Testsystem., wurde Terrestral in einer Limitdosis von 2000 mg/kg KG per Schlundsonde appliziert. Bei Behandlung waren die männlichen Ratten 8 (193-205 g), die weiblichen Ratten 10 Wochen alt (165-172 g). Nach einer veterinärmedizinischen Grunduntersuchung wurden die Tiere unter Laborbedingungen für eine Woche akklimatisiert. Nur äußerlich gesunde Tiere wurden in der Studie verwendet.
Versuchsdurchführung: Die Testsubstanz wurde in Polyethylenglykol 400 als Vehikel in einer Konzentration von 0,2 g/ml und einem Gesamtvolumen von 10 ml/kg per Schlundsonde appliziert. Innerhalb der ersten 24 Stunden wurden die Tiere viermal auf klinische Befunde untersucht, jeweils einmal in den folgenden 2-15 Tagen. Todesfälle und Allgemeinbefinden wie Atmung, Augen-, Nasen- und Hautzustand, Bewegungsverhalten und Haltung wurden parallel ermittelt. Die Körpergewichte wurden einen Tag vor der Dosierung und an den Tagen 8 und 15 bestimmt. Alle Tiere wurden am Ende der Beobachtungszeit getötet und auf makroskopische Auffälligkeiten pathologisch untersucht.
2.1.2 Akute dermale Toxizität
Da dermaler Kontakt für die Humanexposition während Herstellung und Verwendung relevant ist, wurde in der gesetzlich vorgeschriebenen zweiten Prüfling auf akute Toxizität die dermale Route gewählt.
(10-12 Wochen, 186-195 g) Hanibm:WIST (SPF) Ratten wurden mit einer dermalen Dosis von 2000 mg/kg Terrestral behandelt. Die Testsubstanz wurde in Polyethylenglykol (PEG 300) als Vehikel in einer Konzentration von 0,5 g/ml gelöst und als 4 ml/kg Aliquot appliziert. Alle Tiere wurden am ersten Tag viermal auf klinische Symptome untersucht, an den Tagen 2-15 jeweils einmal. Sterblichkeit und allgemeine Befindlichkeit wurden parallel hierzu notiert. Das Körpergewicht wurde einen Tag vor der Behandlung und an den Tagen 8 und 15 bestimmt. Am Ende der Nachbeobachtungsperiode wurden die Tiere getötet und einer makroskopisch-pathologischen Untersuchung unterzogen.
Versuchsdurchführung'. Einen Tag vor der Behandlung wurde der Rücken elektrisch geschoren und etwa 10% der Körperoberfläche freigelegt. Nur Tiere, die die Vorbehandlung ohne Hautirritation und Verletzungen überstanden, wurden für die Folgebehandlung zugelassen. 24 Stunden später wurde die Testsubstanz in einer Konzentration von 2000 mg/kg KG gleichmäßig über die geschorene Hautpartie verteilt und mit einem semiokklusiven Verband bedeckt. Das Applikationsvolumen betrug 4 ml/kg KG. 24 Stunden nach der Applikation wurde der Verband entfernt und die behandelte Hautregion mit warmem Wasser gespült. Anschließend wurde die Stelle begutachtet.
2.2 in-vitro Photohämolyse
Eine in-vitro Screening zur Photohämolyse ist sowohl zur Bestimmung allgemeiner zytotoxischer Eigenschaften wie auch der Phototoxizität in einem breiten Wellenlängenbereich geeignet. Nur Stoffe, die im UV-Bereich absorbieren, sind potentiell geeignet, eine phototoxische Wirkung auszuüben, weshalb vor einer Prüfung auf Photohämolyse grundsätzlich ein UV-Spektrum der Testsubstanz aufgenommen wird. Da Terrestral im Wellenlängenbereich von 295-400 nm absorbiert, ist es potentiell phototoxisch und wurde entsprechend untersucht.
Das hier gewählte Testsystem ermittelt die spezifische Zerstörung von Erythrozytenmembranen mit und ohne UV Bestrahlung.
Versuchsdurchführung: EDTA-Humanblut wurde für drei Minuten zentrifügiert (10 °C, ca. 1800g) und die Erythrozyten abgetrennt. Das Plasma wurde dekantiert und die resultierenden Pellets 3-4 mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Pellets wurden zum Schluß in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und als Initiallösung verwendet. Bei 4°C ist diese Lösung etwa eine Woche haltbar. Vor der eigentlichen
photometrisch bestimmt. 980 ul Terrestral und 20 jil Erythrozytenlösung wurden auf einer 24iger-Mikrotiterplatte gemischt und sowohl mit als auch ohne UV-Bestrahlung für 150 Minuten inkubiert. Die verwendeten UV-Dosen waren 15 J UVA/cm2 bei einem absoluten UVB-Anteil von ca. l J/cm2. Der Wellenlängenbereich betrug 295-400 nm. Nach Zentrifugation (ca. 700 g, 3 Min.) wurden den Kavitäten 200 ul entnommen und bei 525 nm photometrisch vermessen. Chlorpromazin diente als Positivkontrolle.
2.3 Akute Reizwirkungen
Testsysteme zur Untersuchung von Haut- und Augenreizung bestimmen reversible und irreversible Entzündungsprozesse und deren Folgen nach Applikation einer Testsubstanz.
Internationale Standard-Testmethode ist OECD-Richtlinie No. 404 für die Hautreizung (identisch mit EU-Richtlinie 67/548/EG Annex V B4) und OECD 405 für Augenreizung (67/548/EG Annex V B5).
Versuchstiere: Je drei weibliche SPF Albinokaninchen (2.5-2.6 kg KG) der Rasse Mol:Russian von Mollegaard Breeding and Research Centre A/S, Ejby, wurden für die Untersuchungen verwendet. Ohrmarken dienten zur individuellen Identifizierung. Die Studien wurden in klimatisierten Räumen bei 20°C ± 3°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 ± 15% und 10 Luftwechseln pro Stunde durchgeführt. Ein Heil-Dunkel-Zyklus von je 12 Stunden wurde eingehalten. Die Tiere wurden eine Woche vor Beginn der Untersuchungen akklimatisiert. Pelletiertes Futter und mit Salzsäure auf pH 2,5 eingestelltes Trinkwasser standen ad libitum zur Verfügung. Analysen auf mögliche Kontaminationen wurden regelmäßig durchgeführt.
2.3.1 Hautreizung
Versuchsdurchführung: Die Versuchstiere wurden fixiert und die geschorene Hautpartie in vier Sektoren unterteilt. Die beiden hinteren Flächen wurden mit der Testsubstanz behandelt, die vorderen dienten als Kontrollflächen für das Vehikel. 0,5 ml der Substanz wurden auf Verbandsgaze aufgetragen und diese auf der Testfläche fixiert.
Nach 4 Stunden wurde der Verband entfernt, die Applikationsstelle markiert und mit warmem Seifenwasser abgespült. Hautreaktionen wurden l Stunde, 24, 48 und 72 Stunden nach Abnahme der Verbände bewertet. Zur Nachbeobachtung wurde ebenfalls nach 7, 14 und 21
bewertet. Die Werte der 24, 48 und 72 Stunden-Ablesung wurden gemittelt und primär zur Bewertung herangezogen. Die Nachbeobachtungszeit diente der Überprüfung möglicher irreversibler Effekte.
2.3.2 Augenreizung
Versuchsdurchfiihnmg: Am Tag vor der Prüfung wurden beide Augen des Versuchstiers mit der Spaltlampe unter Normal- und UV-Licht auf pathologische Befunde untersucht. Die Untersuchung wurde unter Zugabe von Fluorescein wiederholt. Während das rechte Auge als Kontrolle diente, wurde in den Spalt zwischen Augapfel und unterem Augenlid des linken die Menge von 0,1 ml Prüfsubstanz gegeben. Danach wurden die Augenlider für eine Sekunde zusammengedrückt. Eine und 24 Stunden nach der Behandlung wurden die Augen untersucht und Chemosis, Oedem- und Erythembildung von Konjunktiva, Cornea und Iris nach dem Draize-Schema bewertet. Nach der 24-Stunden-Ablesung wurde in das Auge Fluorescein instilliert. Nach Spülen mit 20 ml einer 0.9 % Natriumchlorid-Lösung wurden die Augen unter der UV-Lampe erneut untersucht, um die flächenmäßige Ausdehnung eventueller Schädigungen zu ermitteln. Die Untersuchung wurde nach 48 und 72 Stunden sowie nach 7 Tagen wiederholt, um die Reversibilität der Effekte zu dokumentieren.
2.4 Hautsensibilisierung
Hautsensibilisierung (Allergische Kontaktdermatitis) ist eine Immunreaktion vom Typ IV, die üblicherweise durch wiederholten Hautkontakt mit einem Allergen ausgelöst wird. Die überschießende Immunantwort führt beim Menschen typischerweise zu Urticaria, Pruritis, Erythem- und Oedembildung mit Entwicklung von Vesikeln oder Papeln. Das für die Neustoffanmeldung noch vorgeschriebene Testsystem bedient sich Meerschweinchen, jedoch bieten modernere Protokolle, die die Zellproliferation in den aurikularen Lymphknoten von Mäusen nach topischer Applikation der Testsubstanz messen, experimentelle Vorteile (5). Aus den genannten regulatorischen Gründen haben wir die Methode nach OECD-Richtlinie No. 406 (identisch mit EU-Richtlinie 67/548/EC Annex V B6) unter Anwendung des Bühler- Protokols herangezogen.
5 Gerberick, GF; Ryan, CA; Kimber, I; Dearman, RJ; Lea, LJ; Basketter, DA. Am J Contact Dermatitis, H, 3-18 (2000)
Versuchstiere: Vierzig weibliche SPF Albinomeerschweinchen, Stamm Dunkin Hartley wurden von der Tierzucht Schonwalde GmbH, D-163 52 Schonwalde bezogen. Zu Beginn der Studie wogen die Tiere zwischen 255 und 379 g. Vor der eigentlichen Prüfung wurden die Tiere mindestens 6 Tage akklimatisiert. An zwei weiteren Tieren wurden die Voruntersuchungen zur Ermittlung der Reizschwelle durchgeführt. Der Haltungsraum wurde mit gefilterter Luft der Temperatur 2FC ± 3°C und der relativen Luftfeuchtigkeit 55% ± 15%
versorgt (10 Luftwechsel/Stunde). Ein künstlicher Hell-Dunkel-Zyklus von je 12 Stunden wurde eingerichtet. Je zwei bis drei Tiere wurden in einem Makrolonkäfig der Abmessung 1800 cm2 gehalten. Futter und Trinkwasser, zu denen freier Zugang bestand, wurden regelmäßig auf Kontaminationen bzw. den Nährstoffgehalt untersucht. Das Trinkwasser war Vitamin C-angereichtert und mit Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt, um mikrobielle Kontamination zu verhindern. Die Tiere wurden statistisch auf drei Gruppen verteilt und markiert.
Versuchsdurchführimg: Zwei Tiere wurden mit 25 %, 50 %, 75 % und unverdünntem Terrestral topisch behandelt, um die Reizschwelle für die Induktions- und Auslösebehandlung zur ermitteln. Nur leichte Rötungen (Erythem Grad 1) wurden in der höchsten Dosisgruppe beobachtet. Folglich wurde unverdünntes Terrestral für die erste Induktionsbehandlung verwendet. Für die zweite und dritte Induktionsbehandlung wurde die Konzentration auf 75 % gesenkt. Die Auslösebehandlung wurde mit 40%iger Lösung durchgeführt. Eine anschließend wiederholte Auslösebehandlung erfolgte mit l%iger und 10%iger Lösung. Induktion: Am Tag vor der Induktionsbehandlung wurde eine Fläche von 4 x 6 cm geschoren. Zur Induktionsbehandlung wurde ein Filterpapier (Whatman No. 3M, 2.5 x 2.5 cm) mit etwa 0,2 ml der Testsubstanz getränkt und dieses okklusiv mit einem Klebestreifen auf dem Hautareal befestigt (Blenderm, 5x5 cm). Der Rumpf wurde mit einem Verband umwickelt und die Testsubstanz für 6 Stunden dort belassen. Die Prozedur wurde an den Tagen 7 und 15 mit den o. g. Konzentrationen wiederholt. 24 Stunden nach Entfernen des Verbandes wurden die Applikationsstellen untersucht und bewertet. Die Kontrolltiere wurden nur mit dem Vehikel behandelt.
Auslösebehandlung: Vier Wochen nach der ersten Induktion (Tag 28) wurde die Auslösebehandlung eingeleitet. An Tag 27 wurde eine 4x6 cm große Fläche auf der linken Flanke geschoren. Einen Tag später wurde nach dem für die Induktion beschriebenen Verfahren 0,2 ml einer 40%igen Lösung von Terrestral appliziert. Neben dieser Applikationsstelle wurde ein Filterpapier mit dem Vehikel appliziert.
Wiederholte Auslösebehandlung: Zur Bestätigung der Ergebnisse aus der Auslösebehandlung wurden nach weiteren zwei Wochen Lösungen der Konzentration 1% und 10% auf den linken Flanken der Versuchstiere aufgetragen.
Auswertungen: 24 und 48 Stunden nach Entfernung des Verbandes wurden die Applikationsstellen untersucht. Das folgende Bewertungsschema wurde herangezogen: Keine sichtbare Veränderung = 0, Leichtes oder diskretes Erythem = l, Mäßiges oder konfluentes Erythem = 2, Starkes Erythem oder Schwellung = 3. Mindestens einmal pro Tag wurden die Tiere auf pathologische Befunde hin untersucht.
2.5 Subchronische Toxizität
Die subchronische Toxizität betrachtet Effekte nach wiederholter Dosierung einer Testsubstanz über einen Zeitraum von maximal 10% der mittleren Lebenserwartung einer Spezies. Gerade für Stoffe, bei denen ein regelmäßiger Kontakt mit dem Menschen beabsichtigt oder unvermeidbar ist, sind Daten zur subchronischen Toxizität besonders bedeutsam, da sie über den Vergleich mit der zu erwartetenden Exposition Risikobewertungen erlauben. Die international anerkannte Testmethode ist OECD-Richtlinie No. 408. Über einen Zeitraum von 90 Tagen wird die Testsubstanz oral mehreren Dosisgruppen verabreicht.
Versuchstiere: Männliche und weibliche WISTAR [Hanibm:WIST] Ratten (6-7 Wochen alt), SPF Qualität, bezogen von RCC Ltd, Schweiz, wurden randomisiert, individuell markiert und in Metabolismuskäfigen in Gruppen zu 5 Tieren gehalten. Die Käfige waren mit Lignocell (Schul AG, Schweiz) ausgelegt und die Tiere hatten ad libitum Zugang zu Provimi Kuba 3433 Rattennahrung (Provimi Kuba, CH) sowie zu unter mikrobiologischer und chemischer Kontrolle stehendem Trinkwasser. Die Haltungsbedingungen waren 22 ± 3 °C, relative Luftfeuchtigkeit zwischen 40-70% und ein 12 Stunden Heil-Dunkel-Zyklus wurde künstlich eingehalten. Vor der Behandlung wurden die Tiere 14 Tage lang akklimatisiert.
Versuchsdurchführung: Die Versuchstiere erhielten Aliquots von 5 ml/kg KG in den Dosierungen 10, 50 und 250 mg/kg KG/Tag Terrestral in PEG 300 als Vehikel. Die Kontrollgruppe erhielt ausschließlich das Vehikel. Die gewählten Dosierungen wurden mit Hilfe einer 14-tägigen Dosisfindungsstudie ermittelt, die vor der eigentlichen Hauptstudie durchgeführt wurde. Tiere, die während der Studie moribund wurden, wurden in extremis
getötet. Zweimal täglich wurden Sterblichkeit und Allgemeinbefinden kontrolliert, während äußere klinische Befunde einmal täglich aufgenommen wurden. Einmal wöchentlich wurde eine ausführliche klinische Untersuchung durchgeführt. Zu Beginn der Dosisfindungsstudie und zu Beginn der Hauptstudie wurden alle verwendeten Tiere einem modifizierten Irwin Screening unterworfen, mit Bestimmung der Griffstärke an Vorder- und Hinterläufen sowie Ermittlung der lokomotorischen Aktivität (functional observation battery, FOB).
Futterverbrauch und Körpergewichtsentwicklung wurden einmal wöchentlich aufgezeichnet.
Alle verbliebenen Dosis- und Kontrolltiere wurden am Ende der Studie getötet und einer vollständigen pathologischen Obduktion unterworfen. Folgende Organe wurden makroskopisch und histologisch untersucht: Nebenniere*, Aorta, Gehirn*, Knochen und Knochenmark, Innereien, Augen incl. Sehnerv, Epididymis (Nebenhoden)*, Herz*, Nieren*, Leber*, Lungen, Lymphknoten, Milchdrüsen, Ovarien bzw. Testis*, Pancreas, Hypophyse, Prostata, Speicheldrüsen, Ischiasnerv, Samenvesikel, Skelettmuskel, Rückenmark, Milz*, Magen, Thyroid*, Thymus, Zunge, Luftröhre, Harnblase, Uterus und Vagina. Von mit einem Stern gekennzeichneten Organen wurden zusätzlich absolute und relative Organgewichte ermittelt. Die Proben wurden nach histologischen Standardverfahren aufgearbeitet, in Paraffinwachs eingebettet, auf eine Dicke von ca. 2-4 um geschnitten und mit Haematoxylin und Eosin angefärbt.
In der hämatologischen Untersuchung wurden folgende Parameter aufgenommen und automatisch mit einem Sysmex (TOA) E-4000 Analysator gemessen: Haemoblobin (Hgb), rote Blutkörperchen (Red Blood Cell Count, RBC), Haematocritwert (Hct), Plättchenzahl (Plt) und weiße Blutkörperchen (White Blood Cell Count, WBC). Normoblasten, Heinz- Körperchen, Leukocyten und Morphologie der roten Blutkörperchen wurden mit einem Leitz Laborlux 12 Mikroskop bestimmt. Die Koagulation wurde mit einem IL ACL Coagulation System ermittelt.
Mit einem Hitachi 917 Discrete Random-Access Analyser wurden folgende klinisch- chemischen Parameter gemessen: Glucose, Harnstoff, Kreatinin, Harnsäure, Bilirubin, Blutfette (Cholesterin, Triglyceride, Phospholipide), Aspartataminotransferase, Alaninaminotransferase, Lactatdehydrogenase, Kreatinkinase, alkalische Phosphatase, gamma-Glutamyltransferase, Gesamtprotein und Plasmaionen (Ca2+, K+, Na+, PO43~,Ci"). Mit der Urinanalyse wurden physikalische Eigenschaften, Proteine, Glucose, Ketone, Bilirubin, Nitrit, Urobilinogen, Urinsediment, Blutbestandteile und kristalline Rückstände untersucht.
90-Tage Hauptstudie: 10 Tiere pro Geschlechtsgruppe wurden täglich für 91 (Männchen) bzw. 92 Tage mit Dosen von 0, 10, 50 und 250 mg/kg KG behandelt (Gruppe l bis 4). Die Recovery-Gruppe bestand aus 5 Tieren, die Dosen von 0 and 250 mg/kg KG erhielten. Die Dosierungen der Hauptstudie beruhten auf den Befunden der 14-tägigen Dosisfmdungsstudie.
An Tag 91 bzw. 92 wurden alle Tiere der Gruppen 1-4 getötet und den o. g. Untersuchungen unterzogen.
2.6 Mutagenität
Mutagenität ist die Eigenschaft, Erbmaterial eines Organismus durch chemische oder physikalische Veränderung von Genen (Genmutationen) oder Chromosomen (Chromosomenaberrationen) zu schädigen.
Genmutationen können mit Hilfe verschiedener Testsysteme in-vitro erkannt werden: Im Ames-Test mit Salmonella typhimurium nach OECD-Richtlinie No. 471 (identisch mit EU Richtlinie 67/548/EG Annex V No B14) wird eine selektive Mutation einer histidin- auxotrophen Mutante zur Prototrophie ausgenutzt.
Chromosomenaberrationen werden in-vitro durch den Cytogenetischen Assay mit V79 Lungenfibroblasten erkannt. Gemäß der OECD-Richtlinie No 473 (identisch mit EU Richtlinie 67/548/EG Annex V No. B10) werden Zellen mit und ohne metabolische Aktivierung der Testsubstanz ausgesetzt. Anschließend wird die Zellteilung in der Metaphase arretiert und nach Präparation der Chromosomen lassen sich Mikrokernbildungen, Bizentrismen, Strangbrüche, Translokationen, Inversionen oder Deletionen mikroskopisch identifizieren.
In-vivo können klastogene Eigenschaften mit Hilfe der in OECD-Richtlinie No. 476 beschriebenen Methode in Knochenmarkszellen der Maus ermittelt werden. Nach Behandlung der Versuchstiere mit der Testsubstanz werden Knochenmarkszellen isoliert, präpariert und mikroskopisch auf Mikrokerne und andere Aberrationen untersucht.
2.6.1 in-vitro Bakterienmutagenität (Ames Test)
Versuchsdurchführung: Terrestral wurde in folgenden Konzentrationen in DMSO gelöst: 0,8;
40; 200; 1000 und 5000 jig/plate (1. Experiment) sowie 50, 100, 200, 400 und 600 jig/Platte (2. Experiment). Das Lösungsmittel DMSO wurde mit der frischen Zellsuspension als Negativkontrolle geführt. Als Positivkontrolle diente Natriumazid in den Teststämmen
TA 100 und TA 1535, 9-Aminoacridin im Teststamm TA 1537 und 4-Nitro-o- phenylendiarain in den Teststämmen TA 98 und TA 1538, jeweils ohne metabolische Aktivierung durch S9-mix. Die Enzymaktivität des Phenobarbital/ß-Naphthoflavon- indizierten S9-Mixes wurde durch Positiv-Prüfung mit 2-Aminoanthracen in allen Stämmen getestet. Der S9-Mix wurde zusätzlich auf Sterilität geprüft. 0,5 ml der Stammkulturen wurden in 20 ml Standard I Nährlösung überfuhrt, vorsichtig gemischt und im Schüttler für 12 Stunden über Nacht bei 37°C und einer Schüttelfrequenz von 90 min"1 inkubiert. Die Bakteriensuspension hatte einen Zelltiter von ca. 3.2 x 108 - 1.5 x 109 lebenden Zellen/ml. Die frisch hergestellten Zellsuspensionen wurden bei 4°C aufbewahrt.
Media: Nährlösung: Standard I Nährlösung für Mikrobiologie (Merck art. no. 7882). 25 g/l wurden in destilliertem Wasser aufgenommen und im Autoklaven sterilisiert (20 min. bei 121 °C). Deckagar: 9 g Bacto Agar (Difco) und 5 g/l NaCl (Merck art. no. 6404) wurden am Tag der Prüfung in Wasser gelöst und autoklaviert (20 min. bei 121 °C). Nach Sterilisierung wurde das Medium bei 40°C gelagert. Petrischalen: 9 cm Petrischalen wurden mit 30 ml Glucose-Minimalmedium befüllt (1.5 % Bacto Agar in Vogel-Bonner-Medium mit 2 % Glucose) und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Lebermiki'osomenfraktion (S9-mix): Der S9 Mix wurde als fertiges Produkt von CCR (D-64380 Roßdorf/Darmstadt, West Germany) bezogen. Es wurde folgendermaßen hergestellt: Männliche Wistar-Ratten erhielten dreimal Dosen von 80 mg/kg KG Phenobarbital intraperitoneal und ß-Naphthoflavon oral an aufeinanderfolgenden Tagen. Die Leber wurde 24 Stunden später sektioniert und unter aseptischen Bedingungen mit Kaliumchlorid-Lösung homogenisiert. Nach Zentrifugation bei 9000 g wurde das Überstehende als S9-Fraktion isoliert. Nicht sofort verwendete S9-Fraktion wurde bei -80°C gelagert. Die Mikrosomenaktivität wurde mit Salmonella typhimurium Stamm TA 98 durch Prüfung an 2-Aminoanthracen and Benzo(a)pyren ermittelt.
Zusammensetzung von l ml S9-mix: S9-Fraktion 0,1 ml, MgCh 8 umol, KC1 33 umol, NADP 4 umol, Glucose-6-phosphat 5 umol, Natriumphosphatpuffer 100 umol (pH 7,4).
Versuchsdurchführung'. 10 ml einer sterilen 0,5 mM-Histidin-0.5 mM-Biotin-Lösung pro 100 ml Agar wurden miteinander gemischt. 2 ml dieses Weichagar wurden in sterile Reagenzgläser gefüllt und jeweils 0,1 ml des Teststammes und 0,1 ml Testsubstanz wurden zugegeben. Bei Prüfungen mit S9-Mix wurden 0,5 ml S9-Mix zur Lösung gegeben, bei Prüfungen ohne S9 Mix 0,5 ml Pufferlösung. Nach Durchmischung wurde die Lösung auf die sterilen Agra-Böden gegossen. In beiden Testserien mit und ohne S9 Mix wurden jeweils 5 Konzentrationen der Testsubstanz verwendet. Nach Aushärten der Agarplatten wurden die Petrischalen über Kopf bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Die entwickelten
Revertantenkolonien wurden automatisch ausgezählt. Die im Diskussionsteil genannten Werte sind Mittelwerte von drei Paralleluntersuchungen der jeweiligen Prüfkonzentration.
2.6.2 in-vitro HPRT Assay in Säugerzellen
Methodenbeschreibung: Dieser in-vitro Assay mit einer SäugerZellinie wurde gemäß der OECD-Richtlinie 476 durchgeführt. Der HPRT-Test nutzt Mutationen im Gen für Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) in Gegenwart und Abwesenheit metabolischer Aktivierung. Das Testsystem bestimmt sowohl Basenaustausche als auch Rasterschub-Mutationen. Die V79-Chinesische Hamster Zellinie ist für diese Untersuchung etabliert. Die Zellinie hat eine hohe Proliferationsrate und eine hohe Plattierungseffizienz von mehr als 50%. Die Zellinie hat einen stabilen Karyotyp und eine geringe natürliche Polyploidierate (Lieferant: Bayer AG, Deutschland).
Media: Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) 960 ml, L-Glutamin 10 ml, Penicillin/Streptomycin (5000iU/ml/5000ug/ml) 20 ml, nicht essentielle Aminosäuren l ml.
Für die Herstellung des fötalen Kälberserum-Mediums (PCS) wurden 100 ml EMEM durch PCS ersetzt. Als Positivkontrolle ohne metabolische Aktivierung diente Ethylmethansulfonat (EMS). (EMS gelöst in Nährmedium in der Konzentration 4 mM; Sigma Chemie, D-8024 Deisenhofen, Germany), Dimethylbenzanthracen (DMBA) diente als Positivkontrolle im Experiment unter metabolischer Aktivierung (DMBA gelöst in DMSO/Nährmedium in der Konzentration 2,5 |J.g/ml). Aus den Vorratskulturen wurden zusammen mit zusätzlichen 15 ml Kulturmedium etwa 500 000 Zellen pro Kolben übertragen (Minimal Essential Medium, MEM, Zusatz von 10% PCS). Die Kultur wurde bei 37°C in angefeuchteter 5%-CO2
Atmosphäre inkubiert.
Versuchsdurchführung: Die Zytotoxizität wurde in einem Vorversuch ermittelt. Dabei diente die relative Plattierungseffizienz (RPE) als Maß für die Toxizität. Semi- bis subkonfluente Kulturen in logarhythmischem Wachstum wurden trypsinisiert und eine Einzelzellsuspension wurde hergestellt. Der Zelltiter wurde ermittelt und 200 Zellen pro Kolben (25 cm2, 5 ml zusätzliches Kulturmedium) ausgesät. Nach einem Tag wurde das Kulturmedium durch serumfreies MEM ersetzt. Die Testsubstanz wurde in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, im Metabolismus-Experiment wurde S9-Mix zugefügt. Nach 4 Stunden Kulturzeit wurde das Medium verworfen und nach zweimaliger Spülung mit Kochsalzlösung durch neues Nährmedium ersetzt. Die Konzentration wurde von l bis 1000 jag/ml eingestellt,
jeweils mit und ohne S9-Mix. Alle Untersuchungen wurden als Doppelversuche durchgerührt.
Die Zellkulturen wurden für 6 Tage unter Standardbedingungen weiterkultiviert. Am Ende der Inkubationszeit wurde das Medium verworfen, die Zellen angefärbt, gezählt und die Plattierungseffizienz (Zahl der gefundenen Zellen/Zahl der ausgesäten Zellen) berechnet.
Gemäß den Toxizitätsdaten des Vorexperiments wurden die folgenden Konzentrationen im Hauptversuch gewählt.
Ohne S9-Mix (in jig/ml) Mit S9-Mix (in fig/ml) I.Experiment 0 , 6 - 2 - 6 - 2 0 - 6 0 3 - 1 0 - 3 0 - 1 0 0 - 2 0 0 2. Experiment 0 , 2 - 0 , 5 - 2 - 5 - 2 0 0 , 5 - 2 - 5 - 2 0 - 5 0
1. Tag: Zellen in exponentiellem Wachstum wurden einen Tag vor dem Hauptversuch trypsinisiert und eine Einzelzellsuspension in Vollmedium angelegt. Der Zelltiter wurde bestimmt und eine definierte Zahl Zellen in einen Kolben mit Vollmedium überführt.
2. Tag: Die Zellsuspension wurden für vier Stunden mit der Testsubstanz vermischt. Das Vollmedium wurde durch Medium mit BMS (Basalmedium-Supplement) ersetzt. Nach Spülung wurde das Medium durch PCS ersetzt.
3. Tag: Die trypsinisierten Zellen wurden zu l O6 Zellen in Kolben ausgesät.
5. Tag: Um die Zellen in exponentiellem Wachstum zu halten, wurden Subkulturen angelegt.
9. Tag: Nach Trypsinisierung wurden 200 Zellen aus jedem Kolben zur Ermittlung der Plattierungseffizienz ausgesät. Die Zellen wurden ohne 6-Thioguanin in Vollmedium kultiviert. Parallel dazu wurden l O5 Zellen aus jedem Kolben zur Bestimmung der Mutationsfrequenz in Selektionsmedium in Gegenwart von 6-Thioguanin (7 ug/ml) ausgesät und kultiviert.
16. Tag: Nach Inkubation wurden die Zellen angefärbt und die Zahl der Kolonien automatisch ausgezählt.
2.6.3 in-vitro Chromosomenaberration mit V 79 Zellinie
Versuchsdurchführimg: Allgemeiner Hintergrund: Strukturelle Chromosomenaberrationen werden normalerweise im ersten Mitosezyklus nach der Behandlung mit einer Testsubstanz festgestellt. Bei der Behandlung müssen sich die Zellen in allen Zellstadien befinden, weshalb
die Zellen zu diesem Zeitpunkt in exponentiellem Wachstum sein sollen (asynchrone Population). Da der normale Zellzyklus 12 h beträgt und nach der Richtlinie die Fixierzeit etwa das 1,5-fache der Reproduktionszeit betragen sollte, sind 18 h Fixierzeit angebracht. Da einige Chemikalien eine Mitoseverzögerung auslösen und andere Chemikalien besonders in einem bestimmten Zellstadium ihre Wirkung zeigen, ist es ratsam, eine weitere Probe nach etwa 28 h zu untersuchen. Aufgrund unzureichenden metabolischen Kompetenz der V79- Zellinie wurde ein exogenes System zur Metabolisierung verwendet.
Vergleichende Negativ- und Lösungsmittelkontrollen (DMSO) wurden mitgefühlt. Als Positivkontrolle diente Ethylmethansulfonat (EMS) von Merck-Schuchardt (600 ug/ml) im Experiment ohne Metabolisierung während Cyclophosphamid (CPA) von Aldrich (0.71 ug/ml) bei metabolischer Aktivierung verwendet wurde.
Zellkultur: Die V79 Zellinie (Labor für Mutagenitätsprüfung, LMP, Technische Universität Darmstadt) wurde in flüssigem Stickstoff gelagert. Vor dem Einfrieren wurden alle Chargen auf Mykoplasmakontamination und Karyotypstabilität geprüft. Aufgetaute Kulturen wurden bei 37° C in 80 cm Plastikkolben (GREINER) vermehrt. Etwa 5 x 105 Zellen per Kolben wurden auf 15 ml MEM (Minimal Essential Medium; SEROMED), supplementiert mit 10%
fötalem Kälberserum (PCS; Boehringer Mannheim), ausgebracht. Subkulturen wurden zweimal wöchentlich angelegt. Die Zellkulturen wurden bei 37° C in angefeuchteter Atmosphäre mit 4,5 % Kohlendioxid (95,5 % Luft) inkubiert. Der S9-Mix wurde wie unter 6.2 beschrieben hergestellt.
Ein Vortest auf Wachstumsinhibition durch die Testsubstanz wurde zu den Entnahmezeitpunkten 4 und 24 Stunden durchgeführt. Die Prüfkonzentrationen wurden im Abstand von Faktor 2-3,33 gewählt. Die Testbedingungen für den Vortest auf Zytotoxizität waren identisch mit denen der Hauptstudie. Exponentiell wachsende Kulturen (14200 Zellen/Objektträger, bezogen auf 72 h Kulturzeit) wurden mit der Testsubstanz behandelt.
Eine qualitative Bewertung der Zellzahl und -morphologie wurde nach 4 Stunden vorgenommen. 24 Stunden nach der Behandlung wurde die Kultur angefärbt und die Zellen ausgezählt (2 Proben pro Konzentration). Die Zellzahl der behandelten Gruppen wird in % der Zellzahl im Verhältnis zur Zellzahl der Kontrolle angegeben. Da bei 200 ug/ml eine deutliche Toxizität erwartet wurde, wurden Prüfkonzentrationen zwischen 3,9 und 500 ug/ml (mit und ohne S9-Mix) zur Prüfung auf Zytotoxizität augewählt. Eine um 50% reduzierte Zellzahl wurde bei einer Konzentration von 31,3 ug/ml ohne S9-Mix und 250 ug/ml in Gegenwart von S9-Mix festgestellt. Unter Berücksichtigung der im Vorexperiment ermittelten
Zytotoxizität wurde das Hauptexperiment mit Konzentrationen zwischen 80 ug/ml (ohne S9- Mix) und 225 ug/ml (mit S9-mix) durchgeführt. Da im ersten Hauptexperiment weiterhin toxische Effekte beobachtet wurden, wurde die Konzentration im zweiten Hauptexperiment noch einmal reduziert. Alle Konzentrationen sind in Tabelle l zusammengefasst. Aufgrund leichter klastogener Effekte in Experiment III wurden zur Bestätigung noch die Experimente IV und V durchgeführt.
Tabelle 1: Verwendete Dosierung im Chromosomenaberrations-Assay mit Terrestral Preparations
- interval
Expositions zeit
Exp. Konzentration in ug/ml
18h 4h I
Ohne S9Mix
5,0 10,0 20,0 40,0 60,0 80,0
28h 18h
n
1,9 3,8 7,5 15,0 30,0 60,028h 28h
n
7,5 15,0 30,0 60,018h 4h
i
Mit S9Mix
62,5 125,0 150,0 175,0 200,0 225,0
28h* 4h
n
31,3 62,5 125,0 150,0 175,0 200,018h** 4h
m
31,3 62,5 93,8 125,0 150,0 175,018h 4h
m
15,6 23,4 31,3 46,9 62,5 93,828h 4h IV 46,9 55,7 66,3 78,8 93,8 111,5
28h 4h
v
46,9 55,7 66,3 78,8 93,8 111,5* aufgrund stark reduzierten Zellwachstums konnten nicht die von der Richtlinie geforderten zwei Konzentrationen ausgewertet werden. Das Experiment wurde deshalb wiederholt.
** Da die Positivkontrolle in diesem Experiment nicht reagierte, wurde dieser Teil der Untersuchungen nicht ausgewertet sondern wiederholt.
Kulturansatz'. Mehr als 50%ig konfluente Kulturen in exponentiellem Wachstum wurden bei 37° C für 5 Minuten mit Trypsin behandelt. Dann wurde die enzymatische Spaltung durch Zugabe von Kulturmedium gestoppt und eine Einzelzellsuspension erhalten. Die Trypsin- Konzentration betrug 0,2 % in Ca-Mg-freier Salzlösung (Trypsin: Difco Laboratories, Detroit, USA).
Die Ca-Mg-freie Salzlösung setzte sich wie folgt zusammen: NaCl 8000 mg/1, KC1 400 mg/1, Glucose 1000 mg/1, NaHC03 350 mg/l.
Vor der Trypsinbehandlung wurden die Zellen mit Ca-Mg-freier Salzlösung gespült, die mit 200 mg/1 EDTA versetzt war. Die Zellen wurden in mit Objektträgern ausgestatteten Quadriperm-Schalen ausgesät (Heraeus, mindestens zwei Kammern pro Gruppe und Schale).
In jeder Kammer wurden Ix l O4 -6 x l O4 Zellen ausgesät. Als Medium diente MEM + 10 % PCS (,Vollmedium').
Behandlung:
Expositionszeit 4 Stunden: Das Medium der in exponentiellem Wachstum befindlichen Kultur wurde durch serumfreies Medium (mit S9 Mix) bzw. Vollmedium mit 10% PCS (ohne S9 Mix) ersetzt. Die Medien enthielten jeweils auch die Prüfsubstanz. Für die Behandlung unter metabolischer Aktivierung wurden 50 ul S9-Mix pro ml Kulturmedium zugefügt.
Vergleichende Negativ-, Lösungsmittel- und Positivkontrollen wurden mitgeführt. Nach 4 Stunden wurden die Kulturen mit "Saline G"-Lösung gewaschen und anschließend in Vollmedium für die restliche Kulturzeit gehalten. Die "Saline G"-Lösung hatte folgende Zusammensetzung: NaCl 8000 mg/1, KC1 400 mg/1, Glucose 1100 mg/1, Na2HP04x7H20 290 mg/1, KH2P04150mg/l. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt.
Expositionszeit 18 und 28 Stunden: Das Medium der in exponentiellem Wachstum befindlichen Kultur wurde durch Vollmedium mit 10% PCS jedoch ohne S9 Mix ersetzt. Die Lösungen enthielten unterschiedliche Konzentrationen der Prüfsubstanz. Das Kulturmedium wurde bis zum Ende der Kulturzeit nicht gewechselt. Alle Kulturen wurden bei 37° C in angefeuchteter Atmosphäre unter 4,5 % CO2 (95,5 % Luft) gehalten.
Kulturansatz: 16 bzw. 26 Stunden nach Beginn der Behandlung wurde Colcemid zum Ansatz hinzugefügt (0,2 |J.g/ml Kulturmedium). Zwei Stunden später wurden die Zellen auf den Objektträgern mit hypotonischer Salzlösung für 20 Minuten bei 37°C gewaschen (0,4 % KC1). Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 3 + 1 (Methanol + Eisessig) fixiert. Es wurden beide Objektträger pro Dosisgruppe behandelt. Die Zellen wurden mit Giemsa angefärbt (E. Merck, D-64293 Darmstadt).
Zusätzlich wurden pro Dosisgruppe zwei parallele Kulturen mitgeführt, die nicht mit Colcemid behandelt wurden. Diese Kulturen wurden ebenfalls gefärbt um die Zellzahl pro 10 Felder auszuzählen. Die Toxizität der Testsubstanz ist definiert als prozentualer Rückgang der Zellzahl im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle.
Analyse der Metaphase-Zellen: Die Prüfung der Kulturen erfolgte gemäß dem Standardprotokoll der "Arbeitsgruppe der Industrie, Cytogenetik" mit Hilfe eines NIKON Microskops mit 1OO x Ölimmersionsobjektiv. Strangbrüche, Mikrokerne, Deletionen, Chromosomenaustausch und -desintegrationen wurden als Chromosomenaberrationen
bewertet. Gap-Bildung wurde registriert, jedoch nicht in die Kalkulation der Aberrationen einbezogen. Je 100 gut ausgebreitete Metaphasen pro Kultur wurden auf zytogenetische Schäden hin untersucht. Nur Metaphase-Zellen mit der charakteristischen Chromosomenzahl 22 (+1) wurden bei der Analyse berücksichtigt. Zur Beschreibung zytotoxischer Eigenschaften wurde der Mitose-Index (% Zellen in Mitose) bestimmt. Zusätzlich wurde die Zahl der polyploiden Zellen bestimmt (% polyploide Metaphasen).
2.6.4 in-vivo Mikronucleus-Test
Versuchstiere: Männliche und weibliche [NMRI]-Mäuse (8-12 Wochen alt), geliefert von BRL, Schweiz, wurden randomisiert, individuell durch Ohrmarken gekennzeichnet und in Gruppen zu fünf in Metabolismuskäfigen gehalten (Streu: 'Altromin', Lage, D). Die Tiere hatten ad libitum Zugang zu pelletierter Standard-Diät (Altromin, Lage, D) und mikobiell sowie chemisch-analytisch kontrolliertem Trinkwasser. Die Käfige wurden in einem bei 22 ± 3 °C temperierten Raum bei einer relativen Luftfeuchtigkeit zwischen 34-73% und 12 Stunden pro Tag unter Neonlicht gehalten.
Versuchsdurchführung: Terrestral wurde in Polyethylenglykol 400 (PEG 400) gelöst, das ebenfalls als Lösungsmittelkontrolle diente. Das oral applizierte Volumen betrug . 10 ml/kg KG. 24 bzw. 48 Stunden nach einer Einfachdosis der Testsubstanz wurden Knochenmarksproben zur Mikrokernanalyse entnommen.
Folgende Dosen wurden verabreicht: 24 Stunden Präparationsintervall: 150, 500 und 1500 mg/kg KG; 48 Stunden Präparationsintervall: 1500 mg/kg KG. Die höchste Dosis wurde in einem Vorversuch als die maximal tolerierte Dosis bestimmt.
40 mg/kg KG Cyclophosphamid per os diente als Positivkontrolle und zeigte eine signifikante Erhöhung der Zahl an induzierten Micronuclei.
Ungefähr 18 Stunden vor der Behandlung erhielten die Tiere nur noch Trinkwasser jedoch kein Futter. Zu Beginn der Behandlung wurden die Tiere gewogen, um eine korrekte Dosierung sicherzustellen.
Fünf voneinander unabhängige Experimente wurden durchgeführt. In Experiment I war die Expositionszeit 4 Stunden mit und ohne metabolische Aktivierung. In Experiment U war die Expositionszeit 18 Stunden ohne S9-mix. In den Experimenten III, IV und V war die Expositionszeit 4 Stunden mit S9-mix. Die Chromosomen wurden 18 Stunden (Exp. I, n und III) bzw. 28 Stunden (Exp. II, III, IV und V) nach Beginn der Behandlung mit Terrestral
präpariert. Pro Experiment wurden zwei Paralleluntersuchungen angesetzt. Pro Kultur wurden 100 Metaphasen auf strukturelle Chromosomenaberrationen untersucht.
In einer Dosis-Findungs-Studie zur Bestimmung der Toxizität wurde die Zellzahl 24 Stunden nach Beginn der Behandlung analysiert. Konzentrationen zwischen 3,9 und 500 ug/ml wurden appliziert. Eindeutig toxische Effekte wurden bei 31,3 jag/ml in Abwesenheit von S9- Mix und 250 ug/ml in Gegenwart von S9-Mix beobachtet.
Zur Bestimmung der Blutserum-Konzentration wurden 12 Tiere mit 1500 mg/kg KG behandelt. Eine bzw. drei Stunden nach der Behandlung (3 Männchen, 3 Weibchen) wurden die Tiere getötet und ausgeblutet. Das Blut wurde zentrirugiert das Serum gesammelt und bis zur Untersuchung bei -20°C aufbewahrt.
Die Femorae wurden entfernt und das Mark mit Kälberserum ausgewaschen. Die Zellsuspension wurde bei 1500 rpm (390 x g) 10 Minuten lang zentrifugiert und das Überstehende dekantiert. Ein kleiner Tropfen des Pellets wurde auf einem Objektträger ausgebreitet. Der Schmierfilm wurde an der Luft getrocknet und mit May-Grünwald (MERCK)/Giemsa (Gurr, BDH Limited Poole, GB) angefärbt. Anschließend wurden Deckgläschen montiert.
Zellanalyse: Die Objektträger wurden mit Hilfe eines NIKON Mikroskops mit lOOx Ölimmersionsobjektiv untersucht. 2000 polychromatische Erythrozyten (PCE) pro Tier wurden auf Mikrokerne hin untersucht. 10 Tiere pro Dosisgruppe (5 Männchen, 5 Weibchen) wurden auf das Vorhandensein von Mikrokernen untersucht. 2000 PCEs pro Tier wurden jeweils ausgewertet. Um einen zytotoxischen Effekt (und damit das Erreichen des Zielorgans 'Knochenmark') nachzuweisen, wurde das PCE/NCE-Verhältnis bestimmt (NCE = normochromatische Erythrozyten) und als NCEs pro 2000 PCEs angegeben.
3. Ergebnisse
3.1 Akute Toxizität 3.1.1 Akute orale Toxizität
F o l g e n d e S t e r b l i c h k e i t e n w u r d e n i n d e r D o s i s g r u p p e b e o b a c h t e t : G r u p p e l (2000 mg/kg KG): Männchen 0/3, Weibchen 1/3.
2 Männchen und 2 Weibchen waren ohne klinische Befunde. Ein Männchen der Dosisgruppe fiel durch gekrümmte Haltung an Tag 3 nach der Dosierung auf. Ein Weibchen, das letztlich an der Dosierung verstarb, zeigte wenige Stunden nach Applikation Lethargie, gekrümmte Haltung, Ataxie, Kurzatmigkeit, gesträubtes Fell und einen schlechten Allgemeinzustand. Die Körpergewichte der überlebenden Tiere entwickelten sich dem Alter und Stamm entsprechend. Pathologisch-makroskopisch zeigten sich in der männlichen Dosisgruppe keine Auffälligkeiten. Das verstorbene Weibchen zeigte eine lehmig verfärbte Leber und einen mit schwarz-brauner Masse gefüllten Magen. Die mittlere Lethaldosis konnte mit der gewählten Limitdosis nicht ermittelt werden, da während der 15-tägigen Beobachtungsphase keine weiteren Tiere verstarben. Die LDso.orai, Ratte ist größer als 2000 mg/kg KG(6).
3.1.2 Akute dermale Toxizität
Ein männliches Tier verstarb während der Akklimatisierungsphase. Keine klinischen Befunde wurden während der Beobachtungsperiode gemacht. Diskrete Erytheme waren bei allen Tieren der Dosisgruppe nach Abnahme der Verbände an Tag 2 zu beobachten.
Substanzspezifische Effekte auf Körpergewicht oder Gewichtszunahme wurden nicht gefunden. Makroskopisch pathologisch waren alle Tiere unauffällig.
Eine mittlere Lethaldosis konnte nicht bestimmt werden, da keines der Tiere während der 14- tägigen Nachbeobachtungszeit verstarb. Die LD50, dermal, Ratte ist größer 2000 mg/kg KG(7).
3.2 in-vitro Photohämolyse
Das erste und zweite Experiment lieferte HJO-Werte von 260 ug/g und 201 ug/g für unbestrahltes Terrestral. Nach Bestrahlung fielen diese Werte auf 38 ug/g und 20 ug/g. Der
6 Cognis Deutschland GmbH & Co KG, unveröffentlichte Ergebnisse, Prüfbericht R 9800699 (1999)
7 Cognis Deutschland GmbH & Co KG, unveröffentlichte Ergebnisse, Prüfbericht C 0000108-3 (2000)
Reduktionsfaktor von 7 bzw. 10 liegt deutlich über dem Faktor 3, der als Grenzwert für mögliche phototoxische Eigenschaften gilt(8).
3.3 Reizwirkungen
3.3.1 Hautreizung
Eine Stunde nach Applikation zeigten alle behandelten Tiere gut abgegrenzte Erytheme sowie mittelstarke Ödeme, die nach 24 Stunden abklangen. Nach 48 und 72 Stunden wurden keine Änderungen der Schweregrade mehr beobachtet. An Tag 7 zeigte ein Tier noch starke Krustenbildung an der Behandlungsstelle. Die beiden anderen Tiere zeigten geschlossenes Granulationsgewebe. Nach 14 Tagen fiel der Schorf ab und leichte Schuppungen mit beginnender Narbenbildung kam zum Vorschein. Nach 21 Tagen waren deutliche bräunliche Verfärbungen, starke Bildung von Narbengewebe sowie granulomatöses Gewebe an einem Tier zu erkennen. Die Ergebnisse der Einzelablesungen zeigt Tabelle 2:
Tabelle 2: Hautreizungs-Scores in drei Kaninchen nach Behandlung mit unverdünntem Terrestral
Erythembildung Oedembildung
Tier Nr.
1h 24h 48h 72h 0* 1h 24h 48h 72h 0*
Links 2 3 3 3 3 1 1 1
1
Rechts 2 3 o J 3 3.00 3 1 1 1 1.00
Links 2 2 2 2 3 1 1 1
2
Rechts 2 2 2 2 2.00 3 1 1 1 1.00
Links 2 3 3 3 o 1 1 1
o
Rechts 2 3 3 3 3.00 3 1 1 1 1.00
0 2,7 1,0
* Durchschnitte der 24, 48 und 72 Stunden-Werte
Die mittleren Erythem-Grade errreichten den Wert von 2,7 bzw. 1,0 für Ödeme.
Aufgrund der irreversiblen Effekte und der beobachteten starken Narbenbildung ist unverdünntes Terrestral als „ätzend" einzustufen(9).
Cognis Deutschland GmbH & Co KG, unveröffentlichte Ergebnisse, Prüfbericht R98900744 (1999)
3.3.2 Augenreizung
Eine Stunde nach Applikation zeigten alle Tiere eine leichte bis mittelgradige opake Trübung auf mehr als einem Viertel der Corneafläche. Die Konjunktiven waren mittelgradig diffus rot entzündet und die Lider waren teilweise deutlich geschwollen mit Tränenausfluß. Die Iris war von der Behandlung nicht betroffen.
Nach 24 Stunden waren diese Befunde weitgehend unverändert. Nach 48 Stunden begann die Regenerierung der Konjunktiven, während die Veränderungen der Cornea nach wie vor sichtbar waren. Nach 72 Stunden waren die coraealen Effekte in einem Tier abgeklungen, in zwei Tieren waren noch sehr leichte Trübungen erkennbar. Sehr leichte Rötungen der Konjunktiven in allen drei Tieren wurden festgestellt. 7 Tage nach Beginn der Behandlung waren Zeichen von Augenreizungen in allen Tieren vollständig abgeklungen. Die folgende Tabelle faßt die Einzelwerte zusammen:
Tabelle 3: Einzelscores der Untersuchung Terrestral
zur Augenreizung im Draize-Test mit Tier No. 1 Stunde 24 Stunden 48 Stunden 72 Stunden
Cornea 1 1 1 1
Iris 0 0 0 0
Conjunctiva (Erythem) 3 2 1 1
1
Conjunctiva (Chemosis) 2 2 1 0
Cornea 1 1 1 1
Iris 0 0 0 0
Conjunctiva (Erythem) 3 3 1
1
2
Conjunctiva (Chemosis) 2 2 1
1
Cornea 1 1 1 0
Iris 0 0 0 0
Conjunctiva (Erythem) -t
3
1
1
3
Conjunctiva (Chemosis) 2 3
1
1
' Cognis Deutschland GmbH & Co KG, unveröffentlichte Ergebnisse, Prüfbericht R 98 01292 (1998)
Die zur Auswertung gemäß Richtlinie 67/548/EG heranzuziehenden Mittelwerte der Ablesungen nach 24, 48 und 72 Stunden betrugen:
Cornea Opakizität 1,1 Irislesionen 0,0 Conjunctivales Erythem 1,6 Chemosis 1,3
Gemäß den Auswertekriterien der Richtlinie 67/548/EG ist Terrestral nicht als augenreizend einzustufen (10l
3.4 Hautsensibilisierung
Induktionsphase: In keinem der Versuchstiere wurden Hautreaktionen während 24 Stunden nach der ersten Induktionsbehandlung beobachtet. An Tag 6 der Behandlung waren in einigen Tieren leichte Erytheme, Schuppenbildung und Papeln zu beobachten. Aus diesem Grund wurde vor der zwiten Induktion die Konzentration der Testsubstanz auf 75% reduziert.
24 Stunden nach der zweiten Behandlung zeigten sich leichte Erytheme in einigen Tieren, die nach 13 Tagen in sehr leichte Schuppung übergegangen war. 24 Stunden nach der dritten Induktionsbehandlung wurden leichte bis mäßige Erytheme in mehreren Tieren der Versuchsgruppe nachgewiesen, die nach 21 Tagen bei fast allen Tieren in Schuppungen übergegangen waren. Aufgrund dieser Befunde wurde als Konzentration der Auslösebehandlung 40% gewählt. Der Allgemeinzustand und die Körpergewichtsentwicklung war während der Induktionsbehandlung nicht erkennbar beeinträchtigt.
Auslösebehandlung: In Tabelle 4 sind die individuellen Scores der 20 Substanztiere jeweils 24 und 48 Stunden nach der Auslösebehandlung mit 40% Terrestral wiedergegeben.
10 Cognis Deutschland GmbH & Co KG, unveröffentlichte Ergebnisse, Prüfbericht R9801248 (1998)
Tabelle 4: Einzelscores der Sensibilisierungsuntersuchung mit Terrestral nach dem Bühler-Protokoll (Ch: Auslösebehandlung, Re-Ch: wiederholte Auslösebehandlung)
24 Stunden Ablesung 48 Stunden Ablesung
Tier No
Vorderflanke Ch Re-Ch
Hinterflanke Ch Re-Ch
Vorderflanke Ch Re-Ch
Hinterflanke Ch Re-Ch
1 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0
1
0 0 0 0 0 05 0 0 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0 0 0
7
1
1
0 0 0 0 0 08 0 0 0 0 0
1
0 09
1
0 0 01
0 01
10 0 0 0 0 0
1
0 011 0
1
0 0 0 0 0 012 0
1
0 0 0 0 0 013 0 0 0 0 0 0 0 0
14 0 0 0 0 0 0 0 0
15 0 0 0 0 0 0 0 0
16 2 2 0
1
21
0 017 0
1
0 0 0 0 0 018 0 0 0 0 0 0 0 0
19
1
2 01
1
2 01
20
1
2 0 01
2 01
Aufgrund von positiven Reaktionen bei vier Tieren (25%) der Versuchsgruppe wurde eine zweite Auslösebehandlung mit 10%iger (Applikationsfläche linke Vorderflanke) und l%iger (Applikationsfläche linke Hinterflanke) Terrestral-Lösung veranlaßt, um sicher zwischen reiner Irritation und einer Sensibilisierungsreaktion unterscheiden zu können. Die Kontrollgruppe zeigte in keinem Versuch Hautreaktionen.
Auch die wiederholte Auslösebehandlung führte in fünf der induzierten Tiere zu Haureaktionen, die z. T. länger als 48 Stunden anhielten. Eine Responderrate von 15% gilt gemäß dem Bühler-Protokoll als Indiz für sensibilisierende Eigenschaften einer Testsubstanz.
Terrestral muß dementsprechend als potentiell hautsensibilisierend angesehen werden. Eine Auslöseschwelle für den Menschen läßt sich aus dem vorliegenden Prüfdesign nicht ableiten(11).
3.5 Subchronische Toxizität
Weibchen der Dosisgruppen 50 und 250 mg/kg/Tag zeigten eine deutlich reduzierte Griffstärke der Hinterpfoten. Aufgrund der beobachteten Dosis-Wirkungsbeziehung wurden die Befunde als substanzspezifisch gewertet.
Deutliche Veränderungen der hämatologischen Parameter wurden nach 13 Wochen beobachtet: Die Männchen der 250 mg/kg/Tag-Dosisgruppe wiesen reduzierte Erythrozytenzahlen und einen gesenkten Hematokritwert auf. Beide Geschlechter der höchsten Dosisgruppe zeigten eine erhöhte mittlere korpuskulare Hämoglobinkonzentration und eine Verschiebung zu hochfluoreszenten Reticulocyten. Auch diese Befunde wurden auf die Behandlung mit Terrestral zurückgeführt.
In Weibchen der Dosisgruppe 250 mg/kg/Tag waren erhöhte Lactatdehydrogenase- und Kreatinkinasespiegel nach 13-wöchiger Behandlung evident. Beide Effekte waren in der Recovery-Gruppe reversibel. Männchen derselben Dosisgruppe wiesen einen reduzierten Calcium- sowie einen erhöhten Natrium- und Chloridspiegel auf (ebenso die Männchen der 50 mg/kg/Tag-Dosisgruppe). Zusätzlich waren die Gesamtproteinlevel der höchsten männlichen Dosisgruppe erniedrigt, die ursächlich mit dem selektiv reduzierten Albuminspiegel zusammenhingen und somit zu einem erniedrigten Albumm/Globulin- Verhältnis führten.
In Weibchen der höchsten Dosisgruppe war der 18-Stunden-Urin signifikant vermehrt, dies allerdings nur nach der 4-wöchigen Recovery-Periode. Als Folge war die spezifische Dichte des Urins erniedrigt.
11 Cognis Deutschland GmbH & Co KG, unveröffentlichte Ergebnisse, Prüfbericht R9900437 (1999)
Tabelle 5: Ausgewählte klinisch-chemische Daten der Dosisgruppen 1-4 (0-250 mg/kg KG) nach 90-tägiger Behandlung mit Terrestral (incl. 4- wöchiger Recovery-Periode)
ASAT ALAT
ALP TP ALB CREA GLU URE (GOT) (GPT) LDH CK BILI LIPID CHOL
l U/l g/i g/i Mmol/l mmol/l mmol/l Mkat/l Mkat/l Mkat/l Mkat/l Mmol/l g/i mmol/l
Nach 13 Wochen Kontrolle
n=10/10 m 2.81 m 67.1 m 38.27 m 48.4 m 5.01 m 6.91 m 1.20 m 0.58 m 2.68 m 2.41 m 3. 02 m 3. 02 m 2.02 m/w w 1.09 w 68. 3 w 42.09 w 55.6 w 5.51 w 9.23 w 1.07 w 0.39 w 2.50 w 1.64 w 2.47 w 2.47 w 1.43 10 mg/kg KG/Tag
n=10/10 m 2.78 m 67.7 *m 35.08 m 49.6 m 5. 09 m 7. 13 m 1.23 m 0.57 m 2.90 m 2.84 m 1.49 m 2. 97 m 2.01 m/w w 1.06 w 70.1 w 43.41 w 55.0 w 5. 17 w 8. 67 w l . 16 *w 0.45 w 2.42 W2HÖ w 1.71 w 2.92 w 1.71 50 mg/kg KG/Tag
n=10/10 m 2.58 m 66. 4 *m 36.30 m 48.5 m 5.60 *m8.11 m1.16 m 0.57 m 2.67 m2.16 m 1.49 m 3.14 m 2.15 m/w w 0.97 w 70.4 w 42.55 w 53. 9 w 5.32 w 8. 98 w1.11 w 0.37 w 3. 63 w 2.35 w 1.87 w 2.89 w 1.70 250 mg/kg
KG/Tag
n=10/10 m 3. 34 *m 64.9 *m 35.56 m 48.7 m 5.45 m 7.49 m 1.13 m 0.55 m 2.43 m 2.21 m 1.33 m 2.83 m 1.83 m/w w 1.14 w 69. 4 w 42.26 w 54.0 w 5.47 w 8. 95 w1.11 w 0.42 *w 5.26 *w 3.36 w 1.77 w 2.84 w 1.68 Nach 17 Wochen
Kontrolle
n=5/5 m 2.46 m 67.8 m 36.64 m 50.8 m 5.71 m 5.28 m 1.16 m 0.58 m 2. 74 m 2.36 m 1.12 m 3. 02 m 1.92 m/w w 1.03 w 69.4 w 41 .86 w 57.8 w 5.39 w 7. 01 w 1.23 w 0.53 w3.16 w2.13 w 1.66 w 2.93 w 1.73 250 mg/kg
KG/Tag
n=5/5 m 2.32 m 67.8 m 36.31 m 48. 7 m 6. 56 m 5. 08 m 1.06 m 0.62 *m 1 .54 m 2.00 m1.15 m 3.20 m 2.02 m/w w 0.98 w 73.0 w 43. 32 w 57.3 w 5. 86 w 7.17 w 1.20 w 0.52 w 2.27 w 1.60 w 1.81 w 3. 00 w 1.70
ALP= alkalische Phosphatase; TP= Gesamtprotein; ALB= Albumin; CREA= Creatinin; GLU= Glucose; URE= Harnstoff; ASAT=Asparagin-Aminotransferase, ALAT= Alanin-Aminotransferase; LDH= Lactatdehydrogenase; CK=Creatininkinase, BILI=Bilirubin; LIPID= Gesamtlipid; CHOL=Cholesterin
