Folgende Endpunkte wurden zur Bestimmung möglicher toxischer Effekte durch die Verwendung von Terrestral untersucht. Sie wurden in Anlehnung an die bestehenden Vorschriften des europäischen Chemikaliengesetzes ausgewählt, zumal es sich bei Terrestral um einen anmeldepflichtigen Neustoff handelt (2\ Die Kriterien stehen in Übereinstimmung mit den "SCC-Notes of guidance for testing of cosmetic ingredients for their safety evalua-tion" (3). Die hier vorgestellte Testbatterie untersucht die akute und subchronische Toxizität durch lokale und systemische Exposition über unterschiedliche Routen:
1) Akute orale Toxizität (OECD Methode 423, 'acute toxic class method') 2) Akute dermale Toxizität (OECD Methode 402)
3) Zytotoxizität (Photohämolytische Wirkungen)
4) Irritation a) Akute Hautreizung (OECD Methode 404) b) Akute Augenreizung (OECD Methode 405) 5) Hautsensibilisierung (OECD Methode 406, Buehler Protokoll) 6) Subchronische Toxizität (OECD Methode 408)
7) Mutagenität a) in-vitro Genmutation in Bakterien (Ames-Test, OECD Methode 471) b) in-vitro Genmutation in Säugerzellen (HPRT-Test, OECD Methode
476)
c) Chromosomenaberration in V 79 Zellinie (Cytogenetischer Assay, OECD Methode 473)
d) in-vivo Mikrokern Assay (OECD Methode 474)
Die Testbatterie ist geeignet, inherente Gefährdungspotentiale zu ermitteln und relevante Zielorgane oder -Systeme zu identifizieren. Dennoch gibt sie nur unvollständige Hinweise auf embryotoxische, teratogene oder fortpflanzungsgefährdende Eigenschaften.
- Richtlinie des Rates 67/548/EG Annex V
3 European Commision, Directorate General DG XXIV (1999), Food. Chem. Tox. 37, 357
Laborpraxis (GLP) durchgeführt.
4 Organisation for Economic Cooperation and Development - OECD (1997): ENV/MC/CHEM (98)17
2.1 Akute Toxizität
Die akute Toxizität beschreibt adverse Effekte die kurze Zeit nach Verabreichung einer Einzeldosis bzw. nach Mehrfachdosierung über einen Zeitraum von 24 Stunden beobachtet werden. Die Testsubstanz wird in aufsteigender Dosierung appliziert, toxische Effekte und Todesrate sind die zur Auswertung herangezogenen Parameter.
Das Design der für Terrestral herangezogenen Protokolle entspricht den Vorgaben der OECD-Richtlinie 423 (Akute toxische Klassen-Methode) und 402 (Akute dermale Toxizität).
2.1.1 Akute orale Toxizität
Versuchstiere'. Einer Gruppe von drei männlichen und drei weiblichen HanIbm:WIST (SPF) Ratten, das von der internationalen Richtlinie anerkannte Testsystem., wurde Terrestral in einer Limitdosis von 2000 mg/kg KG per Schlundsonde appliziert. Bei Behandlung waren die männlichen Ratten 8 (193-205 g), die weiblichen Ratten 10 Wochen alt (165-172 g). Nach einer veterinärmedizinischen Grunduntersuchung wurden die Tiere unter Laborbedingungen für eine Woche akklimatisiert. Nur äußerlich gesunde Tiere wurden in der Studie verwendet.
Versuchsdurchführung: Die Testsubstanz wurde in Polyethylenglykol 400 als Vehikel in einer Konzentration von 0,2 g/ml und einem Gesamtvolumen von 10 ml/kg per Schlundsonde appliziert. Innerhalb der ersten 24 Stunden wurden die Tiere viermal auf klinische Befunde untersucht, jeweils einmal in den folgenden 2-15 Tagen. Todesfälle und Allgemeinbefinden wie Atmung, Augen-, Nasen- und Hautzustand, Bewegungsverhalten und Haltung wurden parallel ermittelt. Die Körpergewichte wurden einen Tag vor der Dosierung und an den Tagen 8 und 15 bestimmt. Alle Tiere wurden am Ende der Beobachtungszeit getötet und auf makroskopische Auffälligkeiten pathologisch untersucht.
2.1.2 Akute dermale Toxizität
Da dermaler Kontakt für die Humanexposition während Herstellung und Verwendung relevant ist, wurde in der gesetzlich vorgeschriebenen zweiten Prüfling auf akute Toxizität die dermale Route gewählt.
(10-12 Wochen, 186-195 g) Hanibm:WIST (SPF) Ratten wurden mit einer dermalen Dosis von 2000 mg/kg Terrestral behandelt. Die Testsubstanz wurde in Polyethylenglykol (PEG 300) als Vehikel in einer Konzentration von 0,5 g/ml gelöst und als 4 ml/kg Aliquot appliziert. Alle Tiere wurden am ersten Tag viermal auf klinische Symptome untersucht, an den Tagen 2-15 jeweils einmal. Sterblichkeit und allgemeine Befindlichkeit wurden parallel hierzu notiert. Das Körpergewicht wurde einen Tag vor der Behandlung und an den Tagen 8 und 15 bestimmt. Am Ende der Nachbeobachtungsperiode wurden die Tiere getötet und einer makroskopisch-pathologischen Untersuchung unterzogen.
Versuchsdurchführung'. Einen Tag vor der Behandlung wurde der Rücken elektrisch geschoren und etwa 10% der Körperoberfläche freigelegt. Nur Tiere, die die Vorbehandlung ohne Hautirritation und Verletzungen überstanden, wurden für die Folgebehandlung zugelassen. 24 Stunden später wurde die Testsubstanz in einer Konzentration von 2000 mg/kg KG gleichmäßig über die geschorene Hautpartie verteilt und mit einem semiokklusiven Verband bedeckt. Das Applikationsvolumen betrug 4 ml/kg KG. 24 Stunden nach der Applikation wurde der Verband entfernt und die behandelte Hautregion mit warmem Wasser gespült. Anschließend wurde die Stelle begutachtet.
2.2 in-vitro Photohämolyse
Eine in-vitro Screening zur Photohämolyse ist sowohl zur Bestimmung allgemeiner zytotoxischer Eigenschaften wie auch der Phototoxizität in einem breiten Wellenlängenbereich geeignet. Nur Stoffe, die im UV-Bereich absorbieren, sind potentiell geeignet, eine phototoxische Wirkung auszuüben, weshalb vor einer Prüfung auf Photohämolyse grundsätzlich ein UV-Spektrum der Testsubstanz aufgenommen wird. Da Terrestral im Wellenlängenbereich von 295-400 nm absorbiert, ist es potentiell phototoxisch und wurde entsprechend untersucht.
Das hier gewählte Testsystem ermittelt die spezifische Zerstörung von Erythrozytenmembranen mit und ohne UV Bestrahlung.
Versuchsdurchführung: EDTA-Humanblut wurde für drei Minuten zentrifügiert (10 °C, ca. 1800g) und die Erythrozyten abgetrennt. Das Plasma wurde dekantiert und die resultierenden Pellets 3-4 mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Pellets wurden zum Schluß in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und als Initiallösung verwendet. Bei 4°C ist diese Lösung etwa eine Woche haltbar. Vor der eigentlichen
photometrisch bestimmt. 980 ul Terrestral und 20 jil Erythrozytenlösung wurden auf einer 24iger-Mikrotiterplatte gemischt und sowohl mit als auch ohne UV-Bestrahlung für 150 Minuten inkubiert. Die verwendeten UV-Dosen waren 15 J UVA/cm2 bei einem absoluten UVB-Anteil von ca. l J/cm2. Der Wellenlängenbereich betrug 295-400 nm. Nach Zentrifugation (ca. 700 g, 3 Min.) wurden den Kavitäten 200 ul entnommen und bei 525 nm photometrisch vermessen. Chlorpromazin diente als Positivkontrolle.
2.3 Akute Reizwirkungen
Testsysteme zur Untersuchung von Haut- und Augenreizung bestimmen reversible und irreversible Entzündungsprozesse und deren Folgen nach Applikation einer Testsubstanz.
Internationale Standard-Testmethode ist OECD-Richtlinie No. 404 für die Hautreizung (identisch mit EU-Richtlinie 67/548/EG Annex V B4) und OECD 405 für Augenreizung (67/548/EG Annex V B5).
Versuchstiere: Je drei weibliche SPF Albinokaninchen (2.5-2.6 kg KG) der Rasse Mol:Russian von Mollegaard Breeding and Research Centre A/S, Ejby, wurden für die Untersuchungen verwendet. Ohrmarken dienten zur individuellen Identifizierung. Die Studien wurden in klimatisierten Räumen bei 20°C ± 3°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 ± 15% und 10 Luftwechseln pro Stunde durchgeführt. Ein Heil-Dunkel-Zyklus von je 12 Stunden wurde eingehalten. Die Tiere wurden eine Woche vor Beginn der Untersuchungen akklimatisiert. Pelletiertes Futter und mit Salzsäure auf pH 2,5 eingestelltes Trinkwasser standen ad libitum zur Verfügung. Analysen auf mögliche Kontaminationen wurden regelmäßig durchgeführt.
2.3.1 Hautreizung
Versuchsdurchführung: Die Versuchstiere wurden fixiert und die geschorene Hautpartie in vier Sektoren unterteilt. Die beiden hinteren Flächen wurden mit der Testsubstanz behandelt, die vorderen dienten als Kontrollflächen für das Vehikel. 0,5 ml der Substanz wurden auf Verbandsgaze aufgetragen und diese auf der Testfläche fixiert.
Nach 4 Stunden wurde der Verband entfernt, die Applikationsstelle markiert und mit warmem Seifenwasser abgespült. Hautreaktionen wurden l Stunde, 24, 48 und 72 Stunden nach Abnahme der Verbände bewertet. Zur Nachbeobachtung wurde ebenfalls nach 7, 14 und 21
bewertet. Die Werte der 24, 48 und 72 Stunden-Ablesung wurden gemittelt und primär zur Bewertung herangezogen. Die Nachbeobachtungszeit diente der Überprüfung möglicher irreversibler Effekte.
2.3.2 Augenreizung
Versuchsdurchfiihnmg: Am Tag vor der Prüfung wurden beide Augen des Versuchstiers mit der Spaltlampe unter Normal- und UV-Licht auf pathologische Befunde untersucht. Die Untersuchung wurde unter Zugabe von Fluorescein wiederholt. Während das rechte Auge als Kontrolle diente, wurde in den Spalt zwischen Augapfel und unterem Augenlid des linken die Menge von 0,1 ml Prüfsubstanz gegeben. Danach wurden die Augenlider für eine Sekunde zusammengedrückt. Eine und 24 Stunden nach der Behandlung wurden die Augen untersucht und Chemosis, Oedem- und Erythembildung von Konjunktiva, Cornea und Iris nach dem Draize-Schema bewertet. Nach der 24-Stunden-Ablesung wurde in das Auge Fluorescein instilliert. Nach Spülen mit 20 ml einer 0.9 % Natriumchlorid-Lösung wurden die Augen unter der UV-Lampe erneut untersucht, um die flächenmäßige Ausdehnung eventueller Schädigungen zu ermitteln. Die Untersuchung wurde nach 48 und 72 Stunden sowie nach 7 Tagen wiederholt, um die Reversibilität der Effekte zu dokumentieren.
2.4 Hautsensibilisierung
Hautsensibilisierung (Allergische Kontaktdermatitis) ist eine Immunreaktion vom Typ IV, die üblicherweise durch wiederholten Hautkontakt mit einem Allergen ausgelöst wird. Die überschießende Immunantwort führt beim Menschen typischerweise zu Urticaria, Pruritis, Erythem- und Oedembildung mit Entwicklung von Vesikeln oder Papeln. Das für die Neustoffanmeldung noch vorgeschriebene Testsystem bedient sich Meerschweinchen, jedoch bieten modernere Protokolle, die die Zellproliferation in den aurikularen Lymphknoten von Mäusen nach topischer Applikation der Testsubstanz messen, experimentelle Vorteile (5). Aus den genannten regulatorischen Gründen haben wir die Methode nach OECD-Richtlinie No. 406 (identisch mit EU-Richtlinie 67/548/EC Annex V B6) unter Anwendung des Bühler-Protokols herangezogen.
5 Gerberick, GF; Ryan, CA; Kimber, I; Dearman, RJ; Lea, LJ; Basketter, DA. Am J Contact Dermatitis, H, 3-18 (2000)
Versuchstiere: Vierzig weibliche SPF Albinomeerschweinchen, Stamm Dunkin Hartley wurden von der Tierzucht Schonwalde GmbH, D-163 52 Schonwalde bezogen. Zu Beginn der Studie wogen die Tiere zwischen 255 und 379 g. Vor der eigentlichen Prüfung wurden die Tiere mindestens 6 Tage akklimatisiert. An zwei weiteren Tieren wurden die Voruntersuchungen zur Ermittlung der Reizschwelle durchgeführt. Der Haltungsraum wurde mit gefilterter Luft der Temperatur 2FC ± 3°C und der relativen Luftfeuchtigkeit 55% ± 15%
versorgt (10 Luftwechsel/Stunde). Ein künstlicher Hell-Dunkel-Zyklus von je 12 Stunden wurde eingerichtet. Je zwei bis drei Tiere wurden in einem Makrolonkäfig der Abmessung 1800 cm2 gehalten. Futter und Trinkwasser, zu denen freier Zugang bestand, wurden regelmäßig auf Kontaminationen bzw. den Nährstoffgehalt untersucht. Das Trinkwasser war Vitamin C-angereichtert und mit Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt, um mikrobielle Kontamination zu verhindern. Die Tiere wurden statistisch auf drei Gruppen verteilt und markiert.
Versuchsdurchführimg: Zwei Tiere wurden mit 25 %, 50 %, 75 % und unverdünntem Terrestral topisch behandelt, um die Reizschwelle für die Induktions- und Auslösebehandlung zur ermitteln. Nur leichte Rötungen (Erythem Grad 1) wurden in der höchsten Dosisgruppe beobachtet. Folglich wurde unverdünntes Terrestral für die erste Induktionsbehandlung verwendet. Für die zweite und dritte Induktionsbehandlung wurde die Konzentration auf 75 % gesenkt. Die Auslösebehandlung wurde mit 40%iger Lösung durchgeführt. Eine anschließend wiederholte Auslösebehandlung erfolgte mit l%iger und 10%iger Lösung. Induktion: Am Tag vor der Induktionsbehandlung wurde eine Fläche von 4 x 6 cm geschoren. Zur Induktionsbehandlung wurde ein Filterpapier (Whatman No. 3M, 2.5 x 2.5 cm) mit etwa 0,2 ml der Testsubstanz getränkt und dieses okklusiv mit einem Klebestreifen auf dem Hautareal befestigt (Blenderm, 5x5 cm). Der Rumpf wurde mit einem Verband umwickelt und die Testsubstanz für 6 Stunden dort belassen. Die Prozedur wurde an den Tagen 7 und 15 mit den o. g. Konzentrationen wiederholt. 24 Stunden nach Entfernen des Verbandes wurden die Applikationsstellen untersucht und bewertet. Die Kontrolltiere wurden nur mit dem Vehikel behandelt.
Auslösebehandlung: Vier Wochen nach der ersten Induktion (Tag 28) wurde die Auslösebehandlung eingeleitet. An Tag 27 wurde eine 4x6 cm große Fläche auf der linken Flanke geschoren. Einen Tag später wurde nach dem für die Induktion beschriebenen Verfahren 0,2 ml einer 40%igen Lösung von Terrestral appliziert. Neben dieser Applikationsstelle wurde ein Filterpapier mit dem Vehikel appliziert.
Wiederholte Auslösebehandlung: Zur Bestätigung der Ergebnisse aus der Auslösebehandlung wurden nach weiteren zwei Wochen Lösungen der Konzentration 1% und 10% auf den linken Flanken der Versuchstiere aufgetragen.
Auswertungen: 24 und 48 Stunden nach Entfernung des Verbandes wurden die Applikationsstellen untersucht. Das folgende Bewertungsschema wurde herangezogen: Keine sichtbare Veränderung = 0, Leichtes oder diskretes Erythem = l, Mäßiges oder konfluentes Erythem = 2, Starkes Erythem oder Schwellung = 3. Mindestens einmal pro Tag wurden die Tiere auf pathologische Befunde hin untersucht.
2.5 Subchronische Toxizität
Die subchronische Toxizität betrachtet Effekte nach wiederholter Dosierung einer Testsubstanz über einen Zeitraum von maximal 10% der mittleren Lebenserwartung einer Spezies. Gerade für Stoffe, bei denen ein regelmäßiger Kontakt mit dem Menschen beabsichtigt oder unvermeidbar ist, sind Daten zur subchronischen Toxizität besonders bedeutsam, da sie über den Vergleich mit der zu erwartetenden Exposition Risikobewertungen erlauben. Die international anerkannte Testmethode ist OECD-Richtlinie No. 408. Über einen Zeitraum von 90 Tagen wird die Testsubstanz oral mehreren Dosisgruppen verabreicht.
Versuchstiere: Männliche und weibliche WISTAR [Hanibm:WIST] Ratten (6-7 Wochen alt), SPF Qualität, bezogen von RCC Ltd, Schweiz, wurden randomisiert, individuell markiert und in Metabolismuskäfigen in Gruppen zu 5 Tieren gehalten. Die Käfige waren mit Lignocell (Schul AG, Schweiz) ausgelegt und die Tiere hatten ad libitum Zugang zu Provimi Kuba 3433 Rattennahrung (Provimi Kuba, CH) sowie zu unter mikrobiologischer und chemischer Kontrolle stehendem Trinkwasser. Die Haltungsbedingungen waren 22 ± 3 °C, relative Luftfeuchtigkeit zwischen 40-70% und ein 12 Stunden Heil-Dunkel-Zyklus wurde künstlich eingehalten. Vor der Behandlung wurden die Tiere 14 Tage lang akklimatisiert.
Versuchsdurchführung: Die Versuchstiere erhielten Aliquots von 5 ml/kg KG in den Dosierungen 10, 50 und 250 mg/kg KG/Tag Terrestral in PEG 300 als Vehikel. Die Kontrollgruppe erhielt ausschließlich das Vehikel. Die gewählten Dosierungen wurden mit Hilfe einer 14-tägigen Dosisfindungsstudie ermittelt, die vor der eigentlichen Hauptstudie durchgeführt wurde. Tiere, die während der Studie moribund wurden, wurden in extremis
getötet. Zweimal täglich wurden Sterblichkeit und Allgemeinbefinden kontrolliert, während äußere klinische Befunde einmal täglich aufgenommen wurden. Einmal wöchentlich wurde eine ausführliche klinische Untersuchung durchgeführt. Zu Beginn der Dosisfindungsstudie und zu Beginn der Hauptstudie wurden alle verwendeten Tiere einem modifizierten Irwin Screening unterworfen, mit Bestimmung der Griffstärke an Vorder- und Hinterläufen sowie Ermittlung der lokomotorischen Aktivität (functional observation battery, FOB).
Futterverbrauch und Körpergewichtsentwicklung wurden einmal wöchentlich aufgezeichnet.
Alle verbliebenen Dosis- und Kontrolltiere wurden am Ende der Studie getötet und einer vollständigen pathologischen Obduktion unterworfen. Folgende Organe wurden makroskopisch und histologisch untersucht: Nebenniere*, Aorta, Gehirn*, Knochen und Knochenmark, Innereien, Augen incl. Sehnerv, Epididymis (Nebenhoden)*, Herz*, Nieren*, Leber*, Lungen, Lymphknoten, Milchdrüsen, Ovarien bzw. Testis*, Pancreas, Hypophyse, Prostata, Speicheldrüsen, Ischiasnerv, Samenvesikel, Skelettmuskel, Rückenmark, Milz*, Magen, Thyroid*, Thymus, Zunge, Luftröhre, Harnblase, Uterus und Vagina. Von mit einem Stern gekennzeichneten Organen wurden zusätzlich absolute und relative Organgewichte ermittelt. Die Proben wurden nach histologischen Standardverfahren aufgearbeitet, in Paraffinwachs eingebettet, auf eine Dicke von ca. 2-4 um geschnitten und mit Haematoxylin und Eosin angefärbt.
In der hämatologischen Untersuchung wurden folgende Parameter aufgenommen und automatisch mit einem Sysmex (TOA) E-4000 Analysator gemessen: Haemoblobin (Hgb), rote Blutkörperchen (Red Blood Cell Count, RBC), Haematocritwert (Hct), Plättchenzahl (Plt) und weiße Blutkörperchen (White Blood Cell Count, WBC). Normoblasten, Heinz-Körperchen, Leukocyten und Morphologie der roten Blutkörperchen wurden mit einem Leitz Laborlux 12 Mikroskop bestimmt. Die Koagulation wurde mit einem IL ACL Coagulation System ermittelt.
Mit einem Hitachi 917 Discrete Random-Access Analyser wurden folgende klinisch-chemischen Parameter gemessen: Glucose, Harnstoff, Kreatinin, Harnsäure, Bilirubin, Blutfette (Cholesterin, Triglyceride, Phospholipide), Aspartataminotransferase, Alaninaminotransferase, Lactatdehydrogenase, Kreatinkinase, alkalische Phosphatase, gamma-Glutamyltransferase, Gesamtprotein und Plasmaionen (Ca2+, K+, Na+, PO43~,Ci"). Mit der Urinanalyse wurden physikalische Eigenschaften, Proteine, Glucose, Ketone, Bilirubin, Nitrit, Urobilinogen, Urinsediment, Blutbestandteile und kristalline Rückstände untersucht.
90-Tage Hauptstudie: 10 Tiere pro Geschlechtsgruppe wurden täglich für 91 (Männchen) bzw. 92 Tage mit Dosen von 0, 10, 50 und 250 mg/kg KG behandelt (Gruppe l bis 4). Die Recovery-Gruppe bestand aus 5 Tieren, die Dosen von 0 and 250 mg/kg KG erhielten. Die Dosierungen der Hauptstudie beruhten auf den Befunden der 14-tägigen Dosisfmdungsstudie.
An Tag 91 bzw. 92 wurden alle Tiere der Gruppen 1-4 getötet und den o. g. Untersuchungen unterzogen.
2.6 Mutagenität
Mutagenität ist die Eigenschaft, Erbmaterial eines Organismus durch chemische oder physikalische Veränderung von Genen (Genmutationen) oder Chromosomen (Chromosomenaberrationen) zu schädigen.
Genmutationen können mit Hilfe verschiedener Testsysteme in-vitro erkannt werden: Im Ames-Test mit Salmonella typhimurium nach OECD-Richtlinie No. 471 (identisch mit EU Richtlinie 67/548/EG Annex V No B14) wird eine selektive Mutation einer histidin-auxotrophen Mutante zur Prototrophie ausgenutzt.
Chromosomenaberrationen werden in-vitro durch den Cytogenetischen Assay mit V79 Lungenfibroblasten erkannt. Gemäß der OECD-Richtlinie No 473 (identisch mit EU Richtlinie 67/548/EG Annex V No. B10) werden Zellen mit und ohne metabolische Aktivierung der Testsubstanz ausgesetzt. Anschließend wird die Zellteilung in der Metaphase arretiert und nach Präparation der Chromosomen lassen sich Mikrokernbildungen, Bizentrismen, Strangbrüche, Translokationen, Inversionen oder Deletionen mikroskopisch identifizieren.
In-vivo können klastogene Eigenschaften mit Hilfe der in OECD-Richtlinie No. 476 beschriebenen Methode in Knochenmarkszellen der Maus ermittelt werden. Nach Behandlung der Versuchstiere mit der Testsubstanz werden Knochenmarkszellen isoliert, präpariert und mikroskopisch auf Mikrokerne und andere Aberrationen untersucht.
2.6.1 in-vitro Bakterienmutagenität (Ames Test)
Versuchsdurchführung: Terrestral wurde in folgenden Konzentrationen in DMSO gelöst: 0,8;
40; 200; 1000 und 5000 jig/plate (1. Experiment) sowie 50, 100, 200, 400 und 600 jig/Platte (2. Experiment). Das Lösungsmittel DMSO wurde mit der frischen Zellsuspension als Negativkontrolle geführt. Als Positivkontrolle diente Natriumazid in den Teststämmen
TA 100 und TA 1535, 9-Aminoacridin im Teststamm TA 1537 und 4-Nitro-o-phenylendiarain in den Teststämmen TA 98 und TA 1538, jeweils ohne metabolische Aktivierung durch S9-mix. Die Enzymaktivität des Phenobarbital/ß-Naphthoflavon-indizierten S9-Mixes wurde durch Positiv-Prüfung mit 2-Aminoanthracen in allen Stämmen getestet. Der S9-Mix wurde zusätzlich auf Sterilität geprüft. 0,5 ml der Stammkulturen wurden in 20 ml Standard I Nährlösung überfuhrt, vorsichtig gemischt und im Schüttler für 12 Stunden über Nacht bei 37°C und einer Schüttelfrequenz von 90 min"1 inkubiert. Die Bakteriensuspension hatte einen Zelltiter von ca. 3.2 x 108 - 1.5 x 109 lebenden Zellen/ml. Die frisch hergestellten Zellsuspensionen wurden bei 4°C aufbewahrt.
Media: Nährlösung: Standard I Nährlösung für Mikrobiologie (Merck art. no. 7882). 25 g/l wurden in destilliertem Wasser aufgenommen und im Autoklaven sterilisiert (20 min. bei 121 °C). Deckagar: 9 g Bacto Agar (Difco) und 5 g/l NaCl (Merck art. no. 6404) wurden am Tag der Prüfung in Wasser gelöst und autoklaviert (20 min. bei 121 °C). Nach Sterilisierung wurde das Medium bei 40°C gelagert. Petrischalen: 9 cm Petrischalen wurden mit 30 ml Glucose-Minimalmedium befüllt (1.5 % Bacto Agar in Vogel-Bonner-Medium mit 2 % Glucose) und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Lebermiki'osomenfraktion (S9-mix): Der S9 Mix wurde als fertiges Produkt von CCR (D-64380 Roßdorf/Darmstadt, West Germany) bezogen. Es wurde folgendermaßen hergestellt: Männliche Wistar-Ratten erhielten dreimal Dosen von 80 mg/kg KG Phenobarbital intraperitoneal und ß-Naphthoflavon oral an aufeinanderfolgenden Tagen. Die Leber wurde 24 Stunden später sektioniert und unter aseptischen Bedingungen mit Kaliumchlorid-Lösung homogenisiert. Nach Zentrifugation bei 9000 g wurde das Überstehende als S9-Fraktion isoliert. Nicht sofort verwendete S9-Fraktion wurde bei -80°C gelagert. Die Mikrosomenaktivität wurde mit Salmonella typhimurium Stamm TA 98 durch Prüfung an 2-Aminoanthracen and Benzo(a)pyren ermittelt.
Zusammensetzung von l ml S9-mix: S9-Fraktion 0,1 ml, MgCh 8 umol, KC1 33 umol, NADP 4 umol, Glucose-6-phosphat 5 umol, Natriumphosphatpuffer 100 umol (pH 7,4).
Versuchsdurchführung'. 10 ml einer sterilen 0,5 mM-Histidin-0.5 mM-Biotin-Lösung pro 100 ml Agar wurden miteinander gemischt. 2 ml dieses Weichagar wurden in sterile Reagenzgläser gefüllt und jeweils 0,1 ml des Teststammes und 0,1 ml Testsubstanz wurden zugegeben. Bei Prüfungen mit S9-Mix wurden 0,5 ml S9-Mix zur Lösung gegeben, bei Prüfungen ohne S9 Mix 0,5 ml Pufferlösung. Nach Durchmischung wurde die Lösung auf die sterilen Agra-Böden gegossen. In beiden Testserien mit und ohne S9 Mix wurden jeweils 5 Konzentrationen der Testsubstanz verwendet. Nach Aushärten der Agarplatten wurden die Petrischalen über Kopf bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Die entwickelten
Revertantenkolonien wurden automatisch ausgezählt. Die im Diskussionsteil genannten Werte sind Mittelwerte von drei Paralleluntersuchungen der jeweiligen Prüfkonzentration.
2.6.2 in-vitro HPRT Assay in Säugerzellen
Methodenbeschreibung: Dieser in-vitro Assay mit einer SäugerZellinie wurde gemäß der OECD-Richtlinie 476 durchgeführt. Der HPRT-Test nutzt Mutationen im Gen für Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) in Gegenwart und Abwesenheit metabolischer Aktivierung. Das Testsystem bestimmt sowohl Basenaustausche als auch Rasterschub-Mutationen. Die V79-Chinesische Hamster Zellinie ist für diese Untersuchung etabliert. Die Zellinie hat eine hohe Proliferationsrate und eine hohe Plattierungseffizienz von mehr als 50%. Die Zellinie hat einen stabilen Karyotyp und eine geringe natürliche Polyploidierate (Lieferant: Bayer AG, Deutschland).
Media: Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) 960 ml, L-Glutamin 10 ml, Penicillin/Streptomycin (5000iU/ml/5000ug/ml) 20 ml, nicht essentielle Aminosäuren l ml.
Für die Herstellung des fötalen Kälberserum-Mediums (PCS) wurden 100 ml EMEM durch PCS ersetzt. Als Positivkontrolle ohne metabolische Aktivierung diente Ethylmethansulfonat (EMS). (EMS gelöst in Nährmedium in der Konzentration 4 mM; Sigma Chemie, D-8024 Deisenhofen, Germany), Dimethylbenzanthracen (DMBA) diente als Positivkontrolle im Experiment unter metabolischer Aktivierung (DMBA gelöst in DMSO/Nährmedium in der Konzentration 2,5 |J.g/ml). Aus den Vorratskulturen wurden zusammen mit zusätzlichen 15 ml Kulturmedium etwa 500 000 Zellen pro Kolben übertragen (Minimal Essential Medium, MEM, Zusatz von 10% PCS). Die Kultur wurde bei 37°C in angefeuchteter 5%-CO2
Atmosphäre inkubiert.
Versuchsdurchführung: Die Zytotoxizität wurde in einem Vorversuch ermittelt. Dabei diente die relative Plattierungseffizienz (RPE) als Maß für die Toxizität. Semi- bis subkonfluente Kulturen in logarhythmischem Wachstum wurden trypsinisiert und eine Einzelzellsuspension wurde hergestellt. Der Zelltiter wurde ermittelt und 200 Zellen pro Kolben (25 cm2, 5 ml zusätzliches Kulturmedium) ausgesät. Nach einem Tag wurde das Kulturmedium durch serumfreies MEM ersetzt. Die Testsubstanz wurde in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, im Metabolismus-Experiment wurde S9-Mix zugefügt. Nach 4 Stunden Kulturzeit wurde das Medium verworfen und nach zweimaliger Spülung mit Kochsalzlösung durch
Versuchsdurchführung: Die Zytotoxizität wurde in einem Vorversuch ermittelt. Dabei diente die relative Plattierungseffizienz (RPE) als Maß für die Toxizität. Semi- bis subkonfluente Kulturen in logarhythmischem Wachstum wurden trypsinisiert und eine Einzelzellsuspension wurde hergestellt. Der Zelltiter wurde ermittelt und 200 Zellen pro Kolben (25 cm2, 5 ml zusätzliches Kulturmedium) ausgesät. Nach einem Tag wurde das Kulturmedium durch serumfreies MEM ersetzt. Die Testsubstanz wurde in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, im Metabolismus-Experiment wurde S9-Mix zugefügt. Nach 4 Stunden Kulturzeit wurde das Medium verworfen und nach zweimaliger Spülung mit Kochsalzlösung durch