in-vitro Chromosomenaberration mit V 79 Zellinie

Versuchsdurchführimg: Allgemeiner Hintergrund: Strukturelle Chromosomenaberrationen werden normalerweise im ersten Mitosezyklus nach der Behandlung mit einer Testsubstanz festgestellt. Bei der Behandlung müssen sich die Zellen in allen Zellstadien befinden, weshalb

die Zellen zu diesem Zeitpunkt in exponentiellem Wachstum sein sollen (asynchrone Population). Da der normale Zellzyklus 12 h beträgt und nach der Richtlinie die Fixierzeit etwa das 1,5-fache der Reproduktionszeit betragen sollte, sind 18 h Fixierzeit angebracht. Da einige Chemikalien eine Mitoseverzögerung auslösen und andere Chemikalien besonders in einem bestimmten Zellstadium ihre Wirkung zeigen, ist es ratsam, eine weitere Probe nach etwa 28 h zu untersuchen. Aufgrund unzureichenden metabolischen Kompetenz der V79-Zellinie wurde ein exogenes System zur Metabolisierung verwendet.

Vergleichende Negativ- und Lösungsmittelkontrollen (DMSO) wurden mitgefühlt. Als Positivkontrolle diente Ethylmethansulfonat (EMS) von Merck-Schuchardt (600 ug/ml) im Experiment ohne Metabolisierung während Cyclophosphamid (CPA) von Aldrich (0.71 ug/ml) bei metabolischer Aktivierung verwendet wurde.

Zellkultur: Die V79 Zellinie (Labor für Mutagenitätsprüfung, LMP, Technische Universität Darmstadt) wurde in flüssigem Stickstoff gelagert. Vor dem Einfrieren wurden alle Chargen auf Mykoplasmakontamination und Karyotypstabilität geprüft. Aufgetaute Kulturen wurden bei 37° C in 80 cm Plastikkolben (GREINER) vermehrt. Etwa 5 x 10⁵ Zellen per Kolben wurden auf 15 ml MEM (Minimal Essential Medium; SEROMED), supplementiert mit 10%

fötalem Kälberserum (PCS; Boehringer Mannheim), ausgebracht. Subkulturen wurden zweimal wöchentlich angelegt. Die Zellkulturen wurden bei 37° C in angefeuchteter Atmosphäre mit 4,5 % Kohlendioxid (95,5 % Luft) inkubiert. Der S9-Mix wurde wie unter 6.2 beschrieben hergestellt.

Ein Vortest auf Wachstumsinhibition durch die Testsubstanz wurde zu den Entnahmezeitpunkten 4 und 24 Stunden durchgeführt. Die Prüfkonzentrationen wurden im Abstand von Faktor 2-3,33 gewählt. Die Testbedingungen für den Vortest auf Zytotoxizität waren identisch mit denen der Hauptstudie. Exponentiell wachsende Kulturen (14200 Zellen/Objektträger, bezogen auf 72 h Kulturzeit) wurden mit der Testsubstanz behandelt.

Eine qualitative Bewertung der Zellzahl und -morphologie wurde nach 4 Stunden vorgenommen. 24 Stunden nach der Behandlung wurde die Kultur angefärbt und die Zellen ausgezählt (2 Proben pro Konzentration). Die Zellzahl der behandelten Gruppen wird in % der Zellzahl im Verhältnis zur Zellzahl der Kontrolle angegeben. Da bei 200 ug/ml eine deutliche Toxizität erwartet wurde, wurden Prüfkonzentrationen zwischen 3,9 und 500 ug/ml (mit und ohne S9-Mix) zur Prüfung auf Zytotoxizität augewählt. Eine um 50% reduzierte Zellzahl wurde bei einer Konzentration von 31,3 ug/ml ohne S9-Mix und 250 ug/ml in Gegenwart von S9-Mix festgestellt. Unter Berücksichtigung der im Vorexperiment ermittelten

Zytotoxizität wurde das Hauptexperiment mit Konzentrationen zwischen 80 ug/ml (ohne S9-Mix) und 225 ug/ml (mit S9-mix) durchgeführt. Da im ersten Hauptexperiment weiterhin toxische Effekte beobachtet wurden, wurde die Konzentration im zweiten Hauptexperiment noch einmal reduziert. Alle Konzentrationen sind in Tabelle l zusammengefasst. Aufgrund leichter klastogener Effekte in Experiment III wurden zur Bestätigung noch die Experimente IV und V durchgeführt.

Tabelle 1: Verwendete Dosierung im Chromosomenaberrations-Assay mit Terrestral Preparations

* aufgrund stark reduzierten Zellwachstums konnten nicht die von der Richtlinie geforderten zwei Konzentrationen ausgewertet werden. Das Experiment wurde deshalb wiederholt.

** Da die Positivkontrolle in diesem Experiment nicht reagierte, wurde dieser Teil der Untersuchungen nicht ausgewertet sondern wiederholt.

Kulturansatz'. Mehr als 50%ig konfluente Kulturen in exponentiellem Wachstum wurden bei 37° C für 5 Minuten mit Trypsin behandelt. Dann wurde die enzymatische Spaltung durch Zugabe von Kulturmedium gestoppt und eine Einzelzellsuspension erhalten. Die Trypsin-Konzentration betrug 0,2 % in Ca-Mg-freier Salzlösung (Trypsin: Difco Laboratories, Detroit, USA).

Die Ca-Mg-freie Salzlösung setzte sich wie folgt zusammen: NaCl 8000 mg/1, KC1 400 mg/1, Glucose 1000 mg/1, NaHC03 350 mg/l.

Vor der Trypsinbehandlung wurden die Zellen mit Ca-Mg-freier Salzlösung gespült, die mit 200 mg/1 EDTA versetzt war. Die Zellen wurden in mit Objektträgern ausgestatteten Quadriperm-Schalen ausgesät (Heraeus, mindestens zwei Kammern pro Gruppe und Schale).

In jeder Kammer wurden Ix l O⁴ -6 x l O⁴ Zellen ausgesät. Als Medium diente MEM + 10 % PCS (,Vollmedium').

Behandlung:

Expositionszeit 4 Stunden: Das Medium der in exponentiellem Wachstum befindlichen Kultur wurde durch serumfreies Medium (mit S9 Mix) bzw. Vollmedium mit 10% PCS (ohne S9 Mix) ersetzt. Die Medien enthielten jeweils auch die Prüfsubstanz. Für die Behandlung unter metabolischer Aktivierung wurden 50 ul S9-Mix pro ml Kulturmedium zugefügt.

Vergleichende Negativ-, Lösungsmittel- und Positivkontrollen wurden mitgeführt. Nach 4 Stunden wurden die Kulturen mit "Saline G"-Lösung gewaschen und anschließend in Vollmedium für die restliche Kulturzeit gehalten. Die "Saline G"-Lösung hatte folgende Zusammensetzung: NaCl 8000 mg/1, KC1 400 mg/1, Glucose 1100 mg/1, Na2HP04x7H20 290 mg/1, KH2P04150mg/l. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt.

Expositionszeit 18 und 28 Stunden: Das Medium der in exponentiellem Wachstum befindlichen Kultur wurde durch Vollmedium mit 10% PCS jedoch ohne S9 Mix ersetzt. Die Lösungen enthielten unterschiedliche Konzentrationen der Prüfsubstanz. Das Kulturmedium wurde bis zum Ende der Kulturzeit nicht gewechselt. Alle Kulturen wurden bei 37° C in angefeuchteter Atmosphäre unter 4,5 % CO2 (95,5 % Luft) gehalten.

Kulturansatz: 16 bzw. 26 Stunden nach Beginn der Behandlung wurde Colcemid zum Ansatz hinzugefügt (0,2 |J.g/ml Kulturmedium). Zwei Stunden später wurden die Zellen auf den Objektträgern mit hypotonischer Salzlösung für 20 Minuten bei 37°C gewaschen (0,4 % KC1). Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 3 + 1 (Methanol + Eisessig) fixiert. Es wurden beide Objektträger pro Dosisgruppe behandelt. Die Zellen wurden mit Giemsa angefärbt (E. Merck, D-64293 Darmstadt).

Zusätzlich wurden pro Dosisgruppe zwei parallele Kulturen mitgeführt, die nicht mit Colcemid behandelt wurden. Diese Kulturen wurden ebenfalls gefärbt um die Zellzahl pro 10 Felder auszuzählen. Die Toxizität der Testsubstanz ist definiert als prozentualer Rückgang der Zellzahl im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle.

Analyse der Metaphase-Zellen: Die Prüfung der Kulturen erfolgte gemäß dem Standardprotokoll der "Arbeitsgruppe der Industrie, Cytogenetik" mit Hilfe eines NIKON Microskops mit 1OO x Ölimmersionsobjektiv. Strangbrüche, Mikrokerne, Deletionen, Chromosomenaustausch und -desintegrationen wurden als Chromosomenaberrationen

bewertet. Gap-Bildung wurde registriert, jedoch nicht in die Kalkulation der Aberrationen einbezogen. Je 100 gut ausgebreitete Metaphasen pro Kultur wurden auf zytogenetische Schäden hin untersucht. Nur Metaphase-Zellen mit der charakteristischen Chromosomenzahl 22 (+1) wurden bei der Analyse berücksichtigt. Zur Beschreibung zytotoxischer Eigenschaften wurde der Mitose-Index (% Zellen in Mitose) bestimmt. Zusätzlich wurde die Zahl der polyploiden Zellen bestimmt (% polyploide Metaphasen).