Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim malignen Lymphom des Hundes

Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim malignen Lymphom des Hundes

THESE

Zur Erlangung des Grades eines Philosophical Doctor

-Ph.D.- im Fachgebiet Kleintierkrankheiten

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Katja Culmsee

aus Köln

Hannover 2004

Supervisor: Univ.-Prof. Dr. I. Nolte

Betreuungsgruppe: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek Univ.-Prof. Dr. W. Löscher Univ.-Prof. Dr. I. Nolte

1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek, Zentrum für Humangenetik,

Universität Bremen

Univ.-Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie, Tierärztliche Hochschule Hannover

Univ.-Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für kleine Haustiere, Tierärztliche Hochschule Hannover

2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. M. Reinacher, Institut für Veterinärpathologie, Justus Liebig Universität Giessen

Tag der mündlichen Prüfung: 10. November 2004

M

E

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ... 11

2 LITERATURÜBERSICHT... 13

2.1 MALIGNES LYMPHOM DES HUNDES... 13

2.2 P-GLYKOPROTEIN... 16

2.3 MULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEIN (MRP) ... 21

2.3.1 MRP1... 21

2.3.2 MRP2... 22

2.4 APOPTOSE UND ZYTOSTATIKARESISTENZEN... 23

2.4.1 Survivin... 24

2.5 WEITERE MECHANISMEN... 26

3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ... 27

3.1 TIERE... 27

3.2 DIAGNOSE UND KLINISCHE STADIENEINTEILUNG... 29

3.3 CHEMOTHERAPIE... 30

3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges ... 32

3.4 ENTNAHME UND LAGERUNG DER PROBEN... 33

3.5 IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG... 33

3.6 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON P-GLYKOPROTEIN... 35

3.7 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN... 37

3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA... 37

3.7.2 DNase-Behandlung ... 38

3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA ... 38

3.7.4 Reverse Transkription (RT)... 39

3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression ... 40

3.7.6 Nachweis von Survivin mRNA in kaninem Gewebe ... 45

3.8 STATISTISCHE AUSWERTUNG... 46

3.9 REAGENZIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN... 47

3.9.1 Probenentnahme und Lagerung ... 47

3.9.2 Immunphänotypisierung... 47

3.9.3 Immunhistochemische Untersuchung... 48

3.9.4 Molekularbiologische Untersuchungen ... 49

4 ERGEBNISSE ... 50

4.1 ALLGEMEINE PATIENTENCHARAKTERISTIKA... 50

4.2 KLINISCHE STADIENEINTEILUNG... 51

4.3 IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG... 52

4.4 KALZIUMPLASMASPIEGEL... 52

4.5 CHEMOTHERAPIE... 53

4.5.1 Initiale Chemotherapie... 53

4.5.2 Zweite Chemotherapie... 55

4.6 REAL-TIME RT-QPCR... 56

4.6.1 Sensitivität der qPCR ... 56

4.6.2 MDR1-Genexpression ... 57

4.6.3 MRP1- und MRP2-Genexpression ... 67

4.7 RT-PCR ZUM NACHWEIS VON SURVIVIN MRNA... 76

4.8 IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNG DER P-GLYKOPROTEINEXPRESSION... 77

5 DISKUSSION ... 79

6 ZUSAMMENFASSUNG ... 88

7 SUMMARY... 90

8 LITERATURVERZEICHNIS ... 92

9 ANHANG ... 126

9.1 RASSE UND ALTER DER AN LYMPHOM ERKRANKTEN HUNDE... 126

9.2 REZEPTUREN DER VERWENDETEN LÖSUNGEN UND GELE... 128

9.3 VERWENDETE FORMELN UND GLEICHUNGEN... 129

9.4 ERGEBNISSE DER RT-QPCR-MESSDURCHGÄNGE... 130

Abkürzungsverzeichnis

® ...eingetragenes Warenzeichen A ...Adenin

ADM ...Doxorubicin AP ...Antisense-Primer Art.-Nr. ...Artikelnummer bp ...Basenpaare C ...Cytosin ca ...kanine

CD ...cluster of differentiation cDNA ...komplementäre DNA CR ...komplette Remission Ct ...cycle threshold CTX ...Cyclophosphamid CV ...Variationskoeffizient DAB ...3,3 Diaminobenzidin DEPC ...Diethylpyrocarbonat dest. ...destilliert

DNA ...Deoxyribonukleinsäure DNase ...Deoxyribonuclease

dNTP ...Desoxynucleotidtriphosphat

dR ...Grundlinien korrigierte Fluoreszenz

dRn ...Grundlinien korrigierte normalisierte Fluoreszenz dt...deutscher

DTT ...Dithiothreitol Fa. ...Firma

FAM ...6-Carboxy-Fluorescein FITC ...Fluoreszeinisothiocyanat FNA ...Feinnadelaspirat

g ...Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec²)

G ...Guanin GSH ...Gluthation h ...Stunde

HPRT ...Hypoxanthinphosphoribosyltransferase i.v. ...intravenös

kDa ...Kilodalton kg ...Kilogramm KGW ...Körpergewicht KOF ...Körperoberfläche kum. ...kumulativ

L-Asp ...L-Asparaginase

LCS ...Lymphonodus cerficalis superficialis dexter LCSS ...Lymphonodus cerficalis superficialis sinister LJ ...Lymphonodus jejunalis

LMD ...Lymphonodus mandibularis dexter LMS ...Lymphonodus mandibularis sinister LPD ...Lymphonodus popliteus dexter LPS ...Lymphonodus popliteus sinister MDR ...multidrug resistance

mg ...Milligramm

MGB ...minor groove binder

MRP ...Multidrug Resistance Associated Protein MTX ...Methotrexat

MW ...arithmetischer Mittelwert n ...Anzahl an Tieren / Proben Nr. ...Nummer

OD ...optische Dichte

p ...Irrtumswahscheinlichkeit

PBS ...Phosphat gepufferte Kochsalzlösung PCR ...Polymerase-Kettenreaktion

PE ...Phycoerythrin

PerCP ...Peridin-Clorophyll-a-Prpteinkomplex PR ...partielle Remission

Pred ...Prednisolon

qPCR ...quantitative Polymerasekettenreaktion R ...Korrelationskoeffizient nach Pearson

Real-time RT-qPCR ...Real-time Reverse Transcription- quantitative PCR RFI ...rezidivfreies intervall

RNA ...Ribonukleinsäure RNase ...Ribonuclease

ROX ...6-Caboxy-X-Rhodamin RT ...Reverse Transkription s.c. ...subkutan

SD...Standardabweichung SP ...Sense-Primer

T ...Thymin tägl. ...täglich

TAMRA ...6-Carboxy-tetramethylrhodamin Tm ...Schmelzpunkt

™ ...Warenzeichen u ...units

VCR ...Vincristin

WHO ...Weltgesundheitsorganisation

1 EINLEITUNG

Die Chemotherapie ist ein wichtiger Bestandteil der Tumortherapie beim Kleintier. Sie wird mit dem Ziel der Heilung (z.B. beim Stiker-Sarkom des Hundes (CALVERT et al. 1982)), zur Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung des Überlebens (z.B. bei multiplen Myelomen, Mastozytomen oder Lymphomen (MATUS et al. 1986; MCCAW et al. 1997;

LINK u. HIRSCHBERGER 1999; THAMM et al. 1999)) sowie im Anschluss an eine chirurgische Tumortherapie zur Vernichtung okkulter Mikrometastasen und Verbesserung der lokalen Tumorkontrolle (z.B. bei Hunden mit Osteosarkomen (STRAW et al. 1991)) durchgeführt.

Die Wirksamkeit der Chemotherapie wird häufig durch Resistenzen der Tumoren gegen die verfügbaren Zytostatika begrenzt (STEWART u. GORMAN 1991; BERGMAN u. OGILVIE 1995). Grundsätzlich wird in der Onkologie zwischen intrinsischen und erworbenen Zytostatikaresistenzen unterschieden. Tumoren mit intrinsischer Resistenz sind von vornherein chemotherapeutisch nicht beeinflussbar. Als Beispiele hierfür werden beim Kleintier hepatozelluläre und gastrointestinale Karzinome genannt (STEWART u. GORMAN 1991). Tumoren mit erworbener Zytostatikaresistenz reagieren dagegen zunächst auf eine Chemotherapie mit einer Regression. Nach einer gewissen Zeitspanne entwickelt sich jedoch unter der Chemotherapie eine Resistenz gegen die eingesetzten Zytostatika. Es kommt zur Ausbildung eines Rezidivs, und die Tumorzellen werden therapierefraktär (LEHNERT 1996).

Diese erworbene Zytostatikaresistenz treten beim Kleintier vor allem in der Therapie von lymphoproliferativen Neoplasien auf (MADEWELL 1999).

Eine gleichzeitige Resistenz von Tumorzellen gegen verschiedene, strukturell unterschiedliche Chemotherapeutika wird als Vielfachresistenz oder multidrug resistance (MDR) bezeichnet (BIEDLER u. RIEHM, 1970; DANO 1973). In vitro können Vielfachresistenzen durch eine intermittierende oder langanhaltende Exposition von Tumorzellen mit nur einem Zytostatikum induziert werden (TURKER et al. 1991).

Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter Zellmembranproteine, wie zum Beispiel des sogenannten P-Glykoproteins, und einer herabgesetzten Akkumulation der Zytostatika in der Zelle einher (KARTNER et al. 1983). Beim individuellen Patienten können jedoch auch Veränderungen der Pharmakokinetik (Absorption, Verteilung, Metabolisierung

und Elimination) der eingesetzten Zytostatika den Behandlungserfolg beeinträchtigen (BERGMAN u. OGILVIE 1995).

Das maligne Lymphom zählt zu den beim Kleintier am häufigsten chemotherapeutisch behandelten Tumoren. Die überwiegende Mehrheit der an malignem Lymphom erkrankten Hunde entwickelt im Therapieverlauf eine Vielfachresistenz (MADEWELL 1998). In ersten Studien wurde bereits ein Zusammenhang zwischen der Expression von P-Glykoprotein und der Überlebenszeit bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden beschrieben (BERGMAN et al. 1996; Lee et al. 1996). Seit langem ist bekannt, dass neben der Expression von P-Glykoprotein zahlreiche weitere Mechanismen, wie z.B. die Expression von Mitgliedern der Familie der multidrug resistance-associated proteins (MRPs) oder Inhibitoren der Apoptose zur Ausprägung von Vielfachresistenzen in vitro führen können.

Im Gegensatz zu vielfachresistenten Zelllinien exprimieren in vivo viele Tumoren die eine Vielfachresistenz vermittelnden Zellmembranproteine nur verhältnismäßig niedrig (BROXTERMAN et al. 1996). Als sehr sensitives Verfahren zum Nachweis einer Expression von P-Glykoprotein und Mitgliedern der Familie der MRPs auf Nukleinsäureebene wird die Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) angesehen (MURPHY et al.

1990).

Ziel der vorliegenden Studie war es, eine RT-PCR zu entwickeln, mit der P-Glykoprotein, MRP1, MRP2 und Survivin auf Nukleinsäureebene beim Hund sicher quantifiziert werden können, mit diesem Verfahren die Expression der Gene in malignen Lymphomen zu bestimmen sowie den Zusammenhang zwischen der Höhe der jeweiligen Genexpression und der chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit in vivo zu untersuchen.

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Malignes Lymphom des Hundes

Maligne Lymphome sind Tumoren des lymphoretikulären Gewebes und verlaufen fast immer systemisch (ETTINGER 2003). Häufig nehmen sie ihren Ursprung im Lymphknoten, seltener in extranodalen lymphoretikulären Geweben (FAN 2003).

Entsprechend der anatomischen Lokalisation des Lymphoms werden multizentrische (etwa 80% der Fälle beim Hund), gastrointestinale, mediastinale, kutane und sogenannte „sonstige“

Formen unterschieden (OWEN 1980; CROW 1987).

Die Ätiologie ist unbekannt (MADEWELL 1999). In verschiedenen Studien wurde ein Zusammenhang zwischen der Entstehung von Lymphomen beim Hund und einer Infektion mit Retroviren (TOMLEY et al. 1983), Herbizid- (HAYES et al. 1991) oder Magnetfeldexposition (REIF et al. 1995), dem Leben in Industriegebieten (GAVAZZA et al.

2001), Chromosomenaberrationen (HAHN et al. 1994) sowie einer Störung des Immunsystems (WEIDEN et al. 1974; OWEN et al. 1975) vermutet. Jedoch konnte keine der Hypothesen bisher ausreichend bewiesen werden.

Unterbleibt eine adäquate Therapie, ist die Prognose schlecht, die Patienten versterben durchschnittlich vier bis sechs Wochen nach Diagnosestellung (MACEWEN et al. 1981).

Durch hochdosierte Kortikosteroidgaben kann zwar bei etwa 50 % der Patienten ein Tumorrückgang erreicht werden, jedoch rezidivieren die Tumoren zum Großteil innerhalb von 4 bis 8 Wochen (SQUIRE et al. 1973; CROW 1982). Die Therapie der Wahl bei Hunden mit Lymphomen ist heute im allgemeinen die Chemotherapie (ROSENTHAL 1996).

Chemotherapie

Bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden wird die Chemotherapie in erster Linie palliativ zur Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung der Überlebenszeit eingesetzt (CROW 1987; ETTINGER 2003).

Die Zahl der in den letzten 30 Jahren eingesetzten Therapieprotokolle ist relativ beträchtlich (Tabelle 1). Neben der Monochemotherapie mit Doxorubicin haben sich vor allem Kombinationschemotherapien bewährt (ROSENTHAL 1996).

Tabelle 1: Ergebnisse einiger in den letzten Jahrzehnten durchgeführten Studien zur Wirksamkeit verschiedener Chemotherapieprotokolle bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden

Substanzen (Kurzname) n CR PR Remissionsdauer

(Median) Ref.

ASP, CTX, VCR, MTX 59 90% 7% 132 Tage bei CR ¹

77 75% 14% 180 Tage bei CR ²

CTX, VCR, Pred (COP)

20 70% 100 Tage bei CR ³

21 76% 206 Tage bei CR ³

DOX 37 59% 22% 151 Tage bei CR ⁴

VCR, CTX, DOX, Pred

(COPA) 45 84% 7% 210 Tage bei CR ⁵

41 76% 12% 330 Tage bei CR ⁵

112 73% 25% 238 Tage bei CR ⁶ ASP, VCR, CTX, Dox,

Pred (ACOPA)

34 94% - 214 Tage bei CR ⁷

ASP, VCR, CTX, CBL, DOX, MTX, Pred

(Madison-Wisconsin) 55 84% 7% 252 Tage ⁸

Abkürzungen und Fußnoten

ASP: L-Asparaginase ¹ MACEWEN et al. 1981 DOX: Doxorubicin ² COTTER 1983

CBL: Chlorambucil ³ CARTER et al. 1987 CR: komplette Remission ⁴ POSTORINO et al. 1989 CTX: Cyclophosphamid ⁵ STONE et al.1991 MTX: Methotrexat ⁶ GREENLEE et al. 1990 n: Patientenanzahl ⁷ MACEWEN et al. 1992 PR: partielle Remission ⁸ KELLER et al. 1993 Pred: Prednison

Ref.: Referenzen VCR: Vincristin

Je nach verwendetem Chemotherapieprotokoll kann bei bis zu 90% der behandelten Patienten ein Rückgang des Tumors erreicht werden (MACEWEN et al 1981; KELLER et al. 1993;

VALERIUS et al. 1997). Heilungen sind jedoch sehr selten (MADEWELL 1999).

Die Hälfte der Patienten entwickelt innerhalb der ersten sieben bis neun Monate nach Therapiebeginn ein Tumorrezidiv (Tabelle 1). Bei einem Teil der Patienten, die ein Rezidiv entwickeln, kann durch eine Wiederholung der Chemotherapie der Tumor zurückgedrängt und eine erneute Remission induziert werden. Die Dauer der zweiten Remission ist zumeist jedoch deutlich kürzer als die Dauer der ersten Remission. Die Lymphome werden zunehmend gegen die eingesetzten Zytostatika resistent (ETTINGER 2003).

Durch Verwendung von Zytostatika, die nicht Bestandteil der ursprünglichen Chemotherapie waren (sogenannte Rettungsprotokolle), können bestehende Zytostatikaresistenzen teilweise umgangen werden (MADEWELL 1999). Bei fast allen bisher erprobten Rettungsprotokollen liegen die Remissionsraten jedoch unter 50% (26-65%) und die mittlere Remissionsdauer unter vier Monaten (61 bis 126 Tage) (VANVECHTEN et al. 1990; MOORE et al. 1994;

LUCROY et al. 1998; MOORE et al. 1999; RASSNICK et al. 2002).

Letztendlich entsteht bei fast allen Patienten nach einer unterschiedlichen Anzahl an Remissionen eine Vielfachresistenz (multidrug resistance) des Tumors und die Patienten versterben infolge der Lymhomerkrankung (VANVECHTEN et al. 1990). Die 1-Jahres- und 2-Jahres-Überlebensraten liegen bei Hunden mit multizentrischen Lymphomen in der Regel unter 45% bzw. 25% (ETTINGER 2003).

Die zellulären Mechanismen, die zur Ausprägung einer multidrug resistance (MDR) in vitro führen, sind zahlreich. Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter Zellmembranproteine und einer herabgesetzten Akkumulation der Zytostatika in der Zelle einher (KARTNER et al. 1983). Zu den Zellmembranproteinen, die eine MDR vermitteln, zählen u.a. das P-Glykoprotein und Mitglieder der Familie der Multidrug resistance- associated proteins (MRPs). Aufgrund der großen Bedeutung der MDR für den Erfolg chemotherapeutischer Behandlung wurden diese Proteine nach ihrer Erstbeschreibung in zahlreichen Studien untersucht (RAPPA et al. 1999).

2.2 P-Glykoprotein

Der bisher am weitesten erforschte Mechanismus, der zur Ausprägung einer MDR führen kann, ist die Expression eines 170 kDa schweren Zellmembranproteins, des sogenannten P-Glykoproteins (KARTNER et al. 1983; UEDA et al. 1987b; SIKIC 1997). Das P-Glykoprotein wurde erstmals 1976 von Victor Ling und Mitarbeitern in Colchicin- resistenten Ovarzelllinien von Hamstern beschrieben (JULIANO u. LING 1976). Es gehört zur Familie der ABC (adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette) Transporterproteine und ist eine ATP-abhängige Efflux-Pumpe, welche die Substratmoleküle aus dem Zytoplasma hinauspumpt und sie damit wirkungslos macht (OBST 2000; DEAN et al. 2001). Substrate für das P-Glykoprotein sind zahlreiche Substanzen, darunter verschiedene hydrophobe Zytostatika (Tabelle 2).

Tabelle 2: Zytostatika, die beim Menschen durch das P-Glykoprotein transportiert werden (modifiziert nach GOLDSTEIN 1996)

Anthracycline Taxane

Doxorubicin Docetaxel Daunomycin Sonstige

Vinkaalkaloide Actinomycin-D Vincristin Mitoxantron Vinblastin

Epiphylotoxine

Etoposide

Bei Säugetieren wird das P-Glykoprotein von einer kleinen Gen-Familie kodiert (RIORDAN et al. 1985). Bisher sind beim Menschen zwei, beim Hamster, bei der Maus und Ratte drei und beim Schwein fünf Isoformen des P-Glycoproteins beschrieben worden (DG et al. 1989;

DEUCHARS et al. 1992; CHILDS u. LING 1996; DEAN et al. 2001). Die mit der Ausbildung der MDR in Zusammenhang stehende Isoform des P-Glykoproteins wird beim Menschen vom MDR1-Gen kodiert (GROS et al. 1986; UEDA et al. 1987a). Bei Hund und

Katze wurde das MDR1-Gen mittlerweile ebenfalls sequenziert (STEINGOLD et al. 1998;

OKAI et al. 2000). Die Sequenzhomologie zum MDR1-Gen des Menschen beträgt beim Hund 93% (STEINGOLD et al. 1998). Über weitere Isoformen des P-Glykoproteins ist bei diesen Tierarten, soweit aus der Literatur ersichtlich, bisher nichts bekannt.

Physiologische Funktion

Das P-Glykoprotein wird beim Menschein und Hund vor allem in der Leber (Gallengangskanäle), in den Nebennierenrinden, im Pankreas und Kolon, in den Nieren (proximale Tubulusepithelien) und im Gehirn (Kapillarendothelien) exprimiert (FOJO et al.

1987; GINN 1996).

Es wird vermutet, dass das P-Glykoprotein sowohl am Transport exogener als auch endogener Metaboliten, wie zum Beispiel Cortisol, in verschiedenen Geweben beteiligt ist (WOLF u.

HURVITZ 1992; VAN KALKEN et al. 1993; FISHER et al. 1996; LEONARD et al. 2003).

Eine Bedeutung des P-Glykoproteins für die Funktion der Blut-Hirnschranke konnte anhand von mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen nachgewiesen werden (SCHINKEL et al. 1997). Die Mäuse waren vital und fertil, wiesen jedoch eine erhöhte Sensitivität gegen das neurotoxische Pharmakon Ivermectin sowie gegen Vinblastin auf (SCHINKEL et al. 1994).

Ähnliche neurologische Nebenwirkungen wie bei mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen treten nach Gabe von Ivermectin bei etwa 1/3 der Hunde der Rasse Collie auf (PAUL et al. 1987).

In verschiedenen Studien konnte bei Collies mit einer Überempfindlichkeit gegen Ivermectin, Loperamid oder Zytostatika eine Mutation des MDR1-Gens nachgewiesen werden (MEALY et al. 2001; ROULET et al. 2003; MEALEY et al. 2003; SARTOR et al. 2004). Bei der Mutation handelt es sich um eine 4 Basenpaare umfassende Deletion, die zur Verschiebung des Leserasters und vorzeitigem Abbruch der Proteinsynthese führt (MEALY et al. 2001).

Der Anteil an Collies, bei denen beide Allele des MDR1-Gens mutiert sind, liegt in den USA nach einer ersten Studie bei 36% (MEALEY et al. 2002).

Neben seiner Bedeutung für die Funktion der Blut-Hirn-Schranke konnte mittels Knockout- Mäusen auch eine Beteiligung des P-Glykoproteins an der Absorption und Elimination verschiedener Medikamente sowie beim Schutz vom Knochenmark gegen zytotoxische Chemotherapeutika aufgezeigt werden (SCHINKEL et al. 1997).

Modulation der Expression durch Zytostatika und Glukokortikoide

Nach dem derzeitigen Erkenntnisstand ist davon auszugehen, dass die Expression von P- Glykoprotein und anteren Mitgliedern der ABC Transporterfamilie umfangreichen Regulationsmechanismen unterliegt (SCOTTO 2003). Grundsätzlich kann die Genexpression auf verschiedenen Ebenen (Transkrption, RNA posessing, Translation und Proteinaktivität) reguliert werden (PASSARGE 2001).

Schon länger ist bekannt, dass verschiedene Steroidhormone Substrate für das P-Glykopotein sind (UEDA et al. 1992). Auch synthetische Glukokortikoide, wie zum Beispiel Prednisolon und Dexamethason, werden durch das P-Glykoprotein transportiert (UEDA et al. 1992, KARSSEN et al. 2002). Sowohl in vitro als auch in vivo kann in verschiedenen Geweben durch Dexamethason die Höhe der P-Glykoproteinexpression beeinflußt werden (ZHAO et al.

1993, DEMEULE et al. 1999). So führte die Gabe von Dexamethason bei Ratten zu einer Erhöhung der P-Glykoproteinexpression in Leber und Lunge, aber einer Reduktion der Erxpression in den Nieren (DEMEULE et al. 1999).

Auch durch eine Exposition mit Zytostatika kann die Transkription des MDR1-Gens in vitro induzieren werden (SCOTTO 2003). Desweiteren wurde in Leukämiezellen eine MDR1- Überexpression durch mRNA Stabilisierung und Translationsinduktion beschrieben (YAGUE et al. 2003). SCOTTO (2003) vermutet daher die Existenz multipler, in verschiedenen Zellarten vorkommender Mechanismen, welche die MDR1-Genexpression regulieren.

Klinische Relevanz bei Tumorerkrankungen

Eine Expression von P-Glykoprotein wurde beim Menschen und Hund in zahlreichen Tumoren beschrieben (FOJO et al. 1987; GINN 1996). Insbesondere in Tumoren, die von Ursprungsgewebe mit physiologisch hoher P-Glykoproteinexpression abstammen, wie z.B.

Lebertumoren, ist P-Glykoprotein relativ konstant nachweisbar (CHENIVESSE et al. 1993;

ITSUBO et al. 1994; GINN 1996). Bei anderen Tumoren lässt sich P-Glykoprotein immunhistochemisch dagegen nur inkonstant darstellen. Beim Hund werden maligne Lymphome (BERGMAN et al. 1996, GINN 1996, LEE et al. 1996), kutane Mastozytome (MIYOSHI et al. 2002) und Harnblasenkarzinome (ROCHA et al. 2000) zu dieser Gruppe gezählt.

Für zahlreiche Tumoren des Menschen, wie z.B. myeloische Leukämien oder Non-Hodgkin- Lymphome, wurde eine klinische Relevanz der Expression von P-Glykoprotein nachgewiesen (PILERI et al. 1991; YUEN u. SIKIC 1994; KANG 1995; SONNEVELD 2000). So kann eine Expression von P-Glykoprotein in Tumoren mit einer herabgesetzten Anreicherung von verschiedenen Zytostatika in der Zelle und einer erhöhten Chemotherapieresistenz einhergehen (LING, 1989). In ersten Untersuchungen beim Hund konnte ebenfalls ein Zusammenhang zwischen der Expression von P-Glykoprotein im Tumorgewebe und dem Erfolg einer chemotherapeutischen Behandlung aufgezeigt werden (BERGMAN et al. 1996;

LEE et al. 1996).

Therapeutische Beeinflussbarkeit

Seit über 20 Jahren ist bekannt, dass die Transportfunktion des P-Glykoproteins in vitro durch verschiedene Substanzen, darunter viele zugelassene Arzneimittel, nicht-selektiv gehemmt wird (ECKER u. CHIBA 1995). Zu diesen als P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation bezeichneten Substanzen zählen u.a. Verapamil, Ciclosporine und Steroide (TSURO et al.

1981; YANG et al. 1989; TWENTYMAN 1992). Zur Umgehung bestehender Vielfachresistenzen in vivo erwiesen sich die P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation jedoch als wenig geeignet. So liegt die zur Modulation der P-Glykoproteinfunktion erforderliche Plasmakonzentration dieser Substanzen häufig über ihrer therapeutischen Breite (FISHER 1996; SIKIC 1997; COVELLI 1999).

Beim Hund wurde in einer Phase-I Studie die Wirksamkeit von Tamoxifen, einem Antiöstrogen, zur Hemmung der P-Glykoproteinfunktion geprüft (WADDLE et al. 1999).

Plasmakonzentrationen von Tamoxifen, die in vitro zu einer Hemmung der P-Glykoproteinfunktion führen, konnten in der Studie nur bei einer hochdosierten Tamoxifengabe (600 mg/m²) erreicht werden (WADDLE et al. 1999). Bei einer kombinierten Gabe von Tamoxifen (600 mg/m², zweimal täglich per os) und Doxorubicin (1,25 mg/kg i.v.) traten bei Hunden mit verschiedenen Tumoren jedoch bei etwa 50% gastrointestinale Nebenwirkungen auf (WADDLE et al. 1999). In früheren Studien beschriebene östrogenähnliche Nebenwirkungen von Tamoxifen (MORRIS et al. 1993) wurden in der Studie von Waddle und Mitarbeiter (WADDLE et al. 1999) nicht beobachtet.

Im Gegensatz zu den P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation wurden die Antagonisten der 2. Generation, wie z.B. Valspodar (PSC 833), gezielt zur Umgehung von Vielfachresistenzen entwickelt (BOESCHE et al. 1991; LEONARD u. BATES 2003). Es hat sich jedoch gezeigt, dass Valspodar und andere P-Glykoproteinantagonisten der 2. Generation nicht nur die Transportfunktion von P-Glykoprotein sondern auch den Cytochrom P450 3A4 vermittelten Metabolismus vieler Zytostatika hemmen (WANDEL et al. 1999). Aufgrund der verzögerten Elimination der Zytostatika ist bei Gabe von P-Glykoproteinantgonisten der 2.

Generation daher zumeist eine Reduktion der Zytostatikadosis zur Vermeidung schwerer Nebenwirkung erforderlich (DORR et al. 2001).

Im Gegenstaz zu den Antagonisten der 2. Generation hemmen die Antagonisten der 3.

Generation das Cytochrom P450 3A4-Isoenzym nicht (DANTZIG et al. 1999). Zu den P- Glykoproteinantagonisten der 3. Generation zählen Tariquidar und Laniquidar. Sie werden derzeit beim Menschen klinisch erprobt (THOMAS u. COLEY 2003).

Weitere sich in Prüfung befindliche Therapieansätze beruhen auf der nicht kompetitiven Hemmung der P-Glykoproteinfunktion durch monoklonale Antikörper oder der Beeinflussung der MDR1-Genexpression mittels Antisense-MDR1-Oligonukleotiden (WAGNER 1995;

ALAHARI et al. 1996; BOUFFORD et al. 1996).

Gentherapie

Auch für die Gentherapie ist das P-Glykoprotein bzw. das MDR1-Gen von Interesse (SORRENTINO et al. 1995; LICHT et al. 2000). Eine Therapiestrategie ist es Zytostatika- sensitives Gewebe, wie das Knochenmark, durch Gentranfer vor den toxischen Effekten einer Chemotherapie zu schützen und somit die Verträglichkeit der Chemotherapie zu verbessern bzw. die Gabe höherer Zytostatikadosen zu ermöglichen (SORRENTINO et al. 1995).

2.3 Multidrug resistance-associated protein (MRP)

In den Jahren nach der Entdeckung des P-Glykoproteins wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen vielfachresistente Zelllinien, bei denen P-Glykoprotein nicht nachweisbar war, beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Mechanismen, die zur Ausprägung einer MDR führen können, entdeckten Cole und Mitarbeiter 1992 in einer Lungenzelllinie (H69AR) ein weiteres Membrantransporterprotein, das eine Vielfachresistenz gegen Zytostatika vermitteln kann (COLE et al. 1992). Es wurde als multidrug resistance-associated protein (MRP) bezeichnet. Wie das P-Glykoprotein gehört das MRP zur Familie der ABC Transporterproteine und fungiert als Efflux-Pumpe (COLE et al. 1992; ZAMAN et al. 1994, DEAN et al. 2001). Mittlerweile sind beim Menschen sieben (MRP1 bis MRP7) und beim Hund zwei (MRP-1 und MRP-2) Isoformen des MRP beschrieben worden (BORST et al.

2000; CONRAD et al. 2001).

2.3.1 MRP1

Das MRP1 ist ein 190-kDa schweres Zellmembranprotein (KRISHNAMACHARY u.

CENTER 1993). Es wurde erstmals 1992 in vielfachresistenten Lungenzelllinien beschrieben (COLE et al. 1992). Später durchgeführte Transfektionsexperimente belegten, dass eine Überexpression des MRP1 beim Menschen in vitro u.a. eine Resistenz gegen Vincristin, Doxorubicin, Etoposid und Methotrexat vermitteln kann (COLE et al. 1994; GRANT et al.

1994; HOOIJBERG et al. 1999).

Das kanine MRP1-Gen wurde erstmals 2001 sequenziert (CONRAD et al. 2001). Bisher konnte in vitro eine durch canine MRP-1 vermittelte MDR gegen Vincristine und Etoposide, aber im Gegensatz zum Menschen nicht gegen Doxorubicin nachgewiesen werden (MA et al.

2002).

Auch wenn das MRP1 und das P-Glykoprotein zum größten Teil Resistenzen gegen dieselben Zytostatikaklassen vermitteln, unterscheiden sie sich in ihrer Substratspezifität (LOE et al.

1996). Studien belegen, dass durch das MRP1 vor allem Konjugate lipophiler Substanzen mit Gluthation (GSH), Glukuronsäure- und Schwefelsäure transportiert werden (JEDLITSCHKY et al. 1994, LEIER et al. 1994; MÜLLER et al. 1994; ZAMAN et al. 1995; JEDLITSCHKY

et al. 1996). Einige nicht konjugierte hydrophobische Substanzen, wie z.B. Vincristin oder Daunorubicin, scheinen ebenfalls, jedoch nur in Anwesenheit von reduziertem GSH, durch das MRP1 transportiert werden zu können (ZAMAN et al. 1995; RENES et al. 1999).

Beim Menschen und Hund wird MRP1 in zahlreichen Organen und Geweben exprimiert (FLENS et al. 1996; HIPFNER et al. 1999; CONRAD et al. 2001). Die höchsten mRNA-Gehalte werden beim Menschen in der Skelettmuskulatur, dem Herz, den Nieren, der Lunge und den Hoden nachgewiesen.

Studien haben gezeigt, dass verschiedene endogene Substanzen, wie z.B. Leukotrin C4, und Metabolite exogener Substanzen, wie z.B. Aflatoxin B1, durch das MRP1 transportiert werden (JEDLITSCHKY et al. 1994; LEIER et al. 1994; LOE et al. 1996; JEDLITSCHKY et al.

1996; LOE et al. 1997). Zusätzlich zu der Transporterfunktion wird eine Beteiligung des MRP1 an der Regulation verschiedener Ionenkanäle vermutet (LOE et al. 1999). Eine Einschränkung der Vitalität und Fertilität bestand bei mrp(-/-) Knockout-Mäusen, ähnlich wie bei mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen, nicht (RAPPA et al. 1999).

Zwar wurde MRP1 beim Menschen in zahlreichen Tumoren nachgewiesen (FLENS et al.

1996), die klinische Relevanz der Expression ist jedoch noch relativ unbekannt (BORST et al.

2000) Ein Zusammenhang zwischen der Expression und dem Erfolg chemotherapeutischer Behandlung wurde u.a. bei Patienten mit Retinoblastom aufgezeigt. So wiesen Retinoblastome, die trotz der Gabe von Ciclosporin zum Zwecke der Umgehung einer P-Glykoprotein induzierten MDR nicht auf eine Chemotherapie reagierten, eine Expression von MRP1 auf (CHAN et al. 1997).

2.3.2 MRP2

MRP2 wurde aufgrund seiner Funktion als Transporter organischer Anionen in der kanikulären Membran von Hepatozyten ursprünglich als canicular multispecific anion transporter (cMOAT) bezeichnet. 1996 gelang es Paulusma und Mitarbeiter zu zeigen , dass das cMOAT der Ratte dem humanen MRP1 entspricht (PAULUSMA et al. 1996).

Das MRP2 wird beim Menschen und anderen Spezies vor allem in der Leber, in der Niere und im Darm exprimiert (PAULUSMA et al. 1996; BORST et al. 2000). Seine Lokalisation in der Zelle ist apikal (KÖNIG et al. 1999).

Als wichtigste physiologische Funktion des MRP2 wird die hepatobiliäre Exkretion von verschiedenen organischen Anionen angesehen. So führt bei Ratten eine Mutation des MRP2-Gens (TR^- Ratten) zu einem Defekt der hepatobiliären Exkretion verschiedener organischer Anionen und dem klinischen Bild einer chronischen Hyperbilirubinämie (PAULUSMA et al. 1996). In den Nieren ist MRP2 vermutlich an der Exkretion organischer Anionen in den Harn beteiligt (KÖNIG et al. 1999). Im Darm wird aufgrund von Untersuchungen an Ratten eine Rolle des MRP2 bei der Sekretion von Glutathionkonjugaten vermutet (GOTOH et al. 2000).

Die Bedeutung des MRP2 in der Vermittlung von Zytostatikaresistenzen ist noch relativ unbekannt. In Transfektionsexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass MRP2 in Zellkulturen eine Resistenz gegen Methrotrexat, Etoposid, Vincristin, Cisplatin, Doxorubicin und Epirubicin vermitteln kann (CUI et al. 1999, HOOIJBERG et al. 1999). In einer weiteren Studie wiesen Taniguchi und Mitarbeiter in drei Cisplatin-resistenten Tumorzellinien eine vier- bis sechsfach erhöhte Expression des MRP2-Gens nach (TANIGUCHI et al. 1996).

Beim Menschen wurde eine Expression von MRP2 in Nierenkarzinomen, Lungen-, Kolon-, Rektum- und Magentumoren sowie hepatozellulären Karzinomen beschrieben (SCHAUB et al. 1997; NARASAKI et al. 1997). Die klinische Relevanz der Expression ist jedoch unklar.

Beim Hund wurde das MRP2-Gen im Jahre 2001 sequenziert (CONRAD et al. 2001). Die Sequenzhomologie zum Menschen beträgt 83%. Über die Expression von MRP2 in kaninen Tumoren ist, soweit aus der Literatur ersichtlich, nichts bekannt.

2.4 Apoptose und Zytostatikaresistenzen

Als Apoptose wird ein genetisch programmierter, geregelter physiologischer Zelluntergang bezeichnet (HOCKENBERRY 1995). Eine Apoptose kann sowohl durch physiologische Stimuli, exogene Insulte (z.B. DNA-Schädigung durch γ-Strahlen) als auch durch Entzug von Vitalitätsfaktoren ausgelöst werden (REED 1997).

Viele derzeit in der Tumortherapie gängigen Zytostatika lösen durch ihre zellschädigende Wirkung eine Determination der Apoptose aus (REED 1997). Eine herabgesetzte Fähigkeit der Zellen zur Apoptose kann somit die Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika einschränken und zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen. Über die Bedeutung der Apoptose für die chemotherapeutische Beeinflussbarkeit von Lymphomen beim Hund ist wenig bekannt. In

einer 2000 veröffentlichten Studie wiesen Hunde mit einer relativ niedrigen Apoptoserate im Tumor ein etwas längeres rezidivfreies Intervall (Median 202 Tage) auf als die restlichen Patienten (Median 162 Tage). Der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant.

(PHILIPS et al. 2000).

An der Regulation der Apoptose sind verschiedene Gene und Genprodukte beteiligt (REED 1997). Das sogenannte BCL-2-Genprodukt war der erste in Säugetierzellen nachgewiesene Apoptoseinhibitor (TSUJIMOTO et al. 1985) und ist Namensgeber einer Familie strukturell verwandter Proteine, die neben Inhibitoren der Apoptose auch pro-apoptotisch wirkende Proteine beinhalteten (REED 1997). Ein weiteres Mitglied der BCL-2 Familie, das sogenannte BCL-XL Gen, wurde kürzlich beim Hund kloniert und sequenziert (SANO et al.

2003). Das BCL-XL Protein ist wie das BCL-2-Genprodukt ein Apoptoseinhibitor.

Neben der BCL-2 Familie spielt auch das Tumorsuppressorgen P53 bei der Induktion der Apoptose durch DNA schädigende Zytostatika eine Rolle (LOWE et al. 1994; HICKMAN 1996; MANFREDI 2003). Eine erste Studie beim Hund weist darauf hin, dass sowohl germinative als auch somatische Mutationen des P53-Gens bei Hunden mit malignen Lymphomen vorkommen (VELDHOEN et al. 1998).

Weitere bisher bekannte Inhibitoren der Apoptose gehören zur IAP (inhibitor of apoptosis) Familie (LACASSE et al. 1998).

2.4.1 Survivin

1997 wurde von Ambrosini und Mitarbeitern beim Menschen ein bis dahin unbekanntes Anti- Apoptosegen beschrieben (AMBROSINI et al. 1997). Das sogenannte Survivingen gehört zur Familie der Apoptosenhibitoren (inhibitor of apoptosis, IAPs) und besteht aus drei Introns und vier Exons, wobei das 3. Intron und das 4. Exon bei der Maus länger sind als beim Menschen (AMBROSINI et al. 1997). Das zugehörige Protein ist 16,5 kDa schwer (AMBROSINI et al. 1997).

Survivin wird als bifunktionales Protein angesehen, da es sowohl Apoptose unterdrückt als auch bei der Regulierung der Zellteilung beteiligt ist (ALTIERI u. MARCHISIO 1999; REED 2001). Survivin bindet und hemmt die Caspase-3 und Caspase-7, welche Apoptose in Zellen induzieren (TAMM et al. 1998). Es wird während der G2/M-Phase des Zell-Zyklus exprimiert (LI et al. 1998). In Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass Survivin sowohl

einer Apoptose durch Entzug von Vitalitätfaktoren als auch einer durch Fas (CD95), Bax, Etoposid oder UVB-Strahlen induzierten Apoptose entgegenwirkt (AMBROSINI et al. 1997;

TAMM et al. 1998; GROSSMAN et al. 2001).

Survivin wird beim Menschen in den meisten Geweben nur während der Fetalphase exprimiert. Beim erwachsenen Menschen konnte Survivin bisher nur in wenigen Geweben (Thymus, Plazenta, Kolon) nachgewiesen werden (AMBROSINI et al. 1997).

Im Gegensatz zu unveränderten Geweben wurde eine Expression von Survivin beim Menschen bereits in verschiedenen Tumoren nachgewiesen (ALTIERI u. MARCHISIO 1999) (Tabelle 3). In menschlichen Nierenkarzinomzelllinien konnten zwei Splicevarianten identifiziert werden. Der Isoform Survivin-∆Ex3 fehlt das Exon3, wohingegen die Isoform Survivin-2B ein Stück des Intron 2 als kryptisches Exon enthält. Im Gegensatz zur Spilcevarante Survivin-∆Ex3 ist bei der Isoform Survivin2B die antiapoptotische Wirkung reduziert (MAHOTKA et al. 1999). Eine prognostische Relevanz der Expression von Survivin wurde beim Menschen u.a. bei Übergangszellkarzinomen, hepatocellulären Karzinomen und Lungentumoren beschrieben. (MONZO et al. 1999; SWANA et al. 1999;

IKEGUCHI et al. 2002).

Tabelle 3: Häufigkeit der Expression von Survivin in verschiedenen Tumoren beim Menschen (modifiziert und erweitert nach ALTIERI u. MARCHISIO 1999)

Tumor n Methode Survivin

positiv Referenzen Magenkarzinom 174 IHC 34% LU et al. 1998

Kolonkarzinom 171 IHC 53% KAWASAKI et al. 1998 Blasenkarzinom 36 IHC 78% SWANA et al. 1999 Neuroblastom 72 IHC / IB 47% ADIDA et al. 1999 B-Zell-Lymphom 222 IHC 60% ADIDA et al. 2000 Kolonkarzinom 20 IHC 100% GIANINI et al. 2001

Astrozytom 18 70%

Glioblastom 20 RT-PCR

90% KAJIWARA et al. 2003 Mammakarzinom 293 IHC 60% KENNEDY et al. 2003

Abkürzungen:

IB: Immunoblot

IHC: Immunhistochemie

RT-PCR: Reverse Transkription- Polymerasekettenreakton

2.5 Weitere Mechanismen

Neben der Überexpression von P-Glykoprotein und Mitgliedern der MRP-Familie sind weitere zelluläre Mechanismen beschrieben worden, die in vitro eine Zytostatikaresistenz vermitteln können (TEW 1994; NITISS u. BECK 1996; LIST 1997 (Tabelle 4). Die Bedeutung dieser Mechanismen für die Ausprägung von Zytostatikaresistenzen beim Hund ist weitestgehend unbekannt.

Tabelle 4: Mechanismen, die zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen können (modifiziert nach DALTON 1997 und LIST 1997)

Membrantransportmechanismen P-Glykoprotein

multidrug resistance-associated proteins (MRPs) lung-resistance protein (LRP)

protein transporter of antigenic peptides (TAP) DNA-Reparaturmechanismen

Hemmung der Apoptose P53

BCL-2 Survivin

Alteration der Topoisomerasen Topoisomerase I

Topoisomerase II

Metabolische Zytostatika-Detoxifikation Glutathion-S-Transferase-System

3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Tiere

An malignem Lymphom erkrankte Hunde

In die Studie wurden 50 an malignem Lymphom erkrankte Hunde (Tier-Nr. P1 bis P50) aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover aufgenommen. 11 Hunden war im Vorfeld der Studie durch den Haustierarzt eine Behandlung mit Glukokortikoiden erfolgt (Tabelle 5). Keiner der Patienten hatte vor Aufnahme in die Studie Zytostatika erhalten.

Tabelle 5: Mit Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde. Tier-Nr., verabreichter Wirkstoff, Dosis und Behandlungsdauer

Tier-Nr. Wirkstoff Dosis Dauer

P04 Prednisolon unbekannt 2 Tage P07 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW jeden

2. Tag per os unbekannt P10 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW

einmal tägl. per os 4 Tage P16 unbekannt alle drei Tage

parenteral 20 Tage

P27 Dexamethason unbekannt unbekannt P28 Prednisolon unbekannt 7 Tage P29 Prednisolon unbekannt >7 Tage P34 Prednisolon unbekannt 21 Tage P41 Prednisolon 0,05 mg/kg KGW

einmal tägl. per os unbekannt

P44 unbekannt unbekannt unbekannt P48 Prednisolon unbekannt 8 Tage

Kontrolltiere

Als Kontrolltiere standen 9 etwa ein Jahr alte, gesunde Beagle aus dem Institut für Parasitologie (Tier-Nr. K1 bis K9) sowie 10 zwischen 3 Monate und 9 Jahre alte an verschiedenen Krankheiten leidende Hunde aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere (Tier-Nr. K10 bis K19) zur Verfügung. (Tabelle 6). Keiner der Kontrolltiere wies klinische oder anatomisch-pathologische Anzeichen einer Veränderung der Leber bzw. der Lymphknoten auf. Alle Kontrolltiere wurden vor Aufnahme in die Studie aus einem nicht mit der Studie im Zusammenhang stehenden Grund mit Pentobarbital euthanasiert.

Tabelle 6: Kontrolltiere aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere. Tier-Nr., Rasse, Alter, diagnostizierte Erkrankungen und verabreichte Medikamente

Tier-Nr. Rasse Alter Diagnosen Medikamente K10 Neufundländer 4 Jahre Kardiomyopathie -

K11 Boxer 5 Monate Beckenfraktur Antibiotika K12 Dt. Kurzhaar 8 Jahre Nasentumor Antibiotika

K13 Border Collie 9 Jahre Ösophagusdilatation Antibiotika K14 Dt. Schäferhund 4 Jahre Darmdrehung Infusion K15 Rauhaardackel 9 Jahre Mammatumor -

K16 Malteser 6 Jahre Perianalhernie Antibiotika, Caprofen K17 Berner Sennenhund 4 Jahre Niereninsuffizienz Infusion, Furosemid

K18 Dt. Schäferhund 9 Jahre Analfissur -

K19 Bordeuxdogge 3 Monate Darminvagination Infusion

3.2 Diagnose und klinische Stadieneinteilung

Die Diagnose des malignen Lymphoms erfolgte bei 28 der Patienten zytologisch und bei 22 Hunden histopathologisch. Anhand der Befunde der röntgenologischen Untersuchung des Thorax und Abdomens, Blutbildbestimmung, klinisch-chemischer Blutuntersuchung, sonographischer Untersuchung des Abdomens und Knochenmarkuntersuchung wurden die anatomische Form und der Ausbreitungsgrad der Erkrankung bestimmt.

Bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom wurde das klinische Erkrankungsstadium entsprechend der TNM-Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) (OWEN, 1980) (Tabelle 7) beurteilt. Zusätzlich wurde bei allen Patienten das klinische Substadium bestimmt. Dabei wurden Patienten mit einer Hyperkalzämie, Fieber, Hyphema, Uveitis, gastrointestinalen und / oder respiratorischen Symptomen in Anlehnung an die Studie von Moore und Koautoren (MOORE et al. 2001) dem klinischen Substadium b zugeordnet.

Tabelle 7: Klinische Stadieneinteilung beim malignen Lymphom des Hundes nach WHO (OWEN, 1980)

Stadium Definition

I Befall nur eines Lymphknotens oder Organs (mit Ausnahme des Knochenmarks)

II Befall zahlreicher Lymphknoten einer Körperregion (± Tonsillen)

III generalisierter Lymphknotenbefall IV Befall von Milz und/oder Leber (± Stadium III)

V Befall von Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Organsystemen (± Stadium I-IV)

Substadium a ohne Allgemeinsymptome Substadium b mit Allgemeinsymptomen

3.3 Chemotherapie

Eine Chemotherapie erfolgte bei 25 der an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Initial wurde bei allen Patienten eine Kurzzeit-Kombinationtherapie (Tabelle 8) durchgeführt. Von den Hunden, die im Verlauf der Studie ein Tumorrezidiv entwickelten, wurden 7 erneut chemotherapeutisch behandelt. 3 Patienten erhielten eine Kurzzeit-, 3 eine Langzeit- Kombinationschemotherapie (Tabelle 9, Seite 31) und ein Hund Cytarabin und Carboplatin.

Tabelle 8: Kurzzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)

Woche L-Asp¹ VCR CTX² ADM^{1, 3} Pred

1 X X X

2 X X

3 X X

4 X X

5 X X

6 X X

7 X X

8 X X

9 X X

10 X X

11 X X

12 X X

ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v.

L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c.

CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v.

Pred: Prednisolon; 50 mg/m² KOF, einmal täglich per os über drei Tage VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v.

1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg/kg KGW i.v.

2 in Kombination mit Mesna (40% der Cyclophosphamid-Einzeldosis; 0, 4 und 8 h nach Gabe von Cyclophosphamid, einmalig per os)

3 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.

Tabelle 9: Langzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)

Woche L-Asp¹ VCR CTX ADM^{1, 2} MTX Pred Induktion

1 X X X

2 X X

3 X X

4 X

5 X

6 X

Erhaltung: Zyklus 1

8 X

10 X

12 X

14 X

Zyklus 2: Zyklus 1 bis Woche 52 wiederholen

Zyklus 3: Zyklus 1 im 3-Wochen-Abstand bis Woche 104 wiederholen Zyklus 4: Zyklus 1 im 4-Wochen-Abstand bis Woche 130 wiederholen ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v.

L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c.

CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v.

Pred: Prednisolon; Woche 1: 30 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 2: 20 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 3: 10 mg/m² KOF, einmal täglich per os VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v.

MTX Methotrexat: 0,7 mg/kg KGW i.v., maximale Gesamtdosis 25 mg

1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg / kg KGW i.v.

2 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer

Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 mg/m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.

3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges

Therapieantwort

Die Therapieantwort wurde als komplette Remission (CR), partielle Remission (PR) oder keine Remission (stationäres Tumorverhalten oder Progression) beurteilt (Tabelle 10). Zur Bewertung der Therapieantwort wurde bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom eine Palpation der oberflächlichen Körperlymphknoten, bei Patienten mit einem gastrointestinalen Lymphom zusätzlich eine sonographische Untersuchung des Abdomens durchgeführt.

Tabelle 10: Schema und Kriterien zur Beurteilung der Therapieantwort (modifiziert nach WILMANNS 2001)

Therapieantwort Definition

Komplette Remission (CR) Vollständiger Rückgang aller Tumorzeichen. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.

Partielle Remission (PR)

Rückgang aller Tumorparameter um mindestens 50%

der initialen Größe. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.

Stationäres Tumorverhalten Tumorrückgang um weniger als 50 % oder Zunahme um weniger als 25 %. Keine neuen

Tumormanifestationen.

Progression Tumorzunahme um über 25 % oder Auftreten neuer Tumormanifestationen.

Rezidivfreies Intervall (RFI)

Bei Patienten mit einer kompletten oder partiellen Remission wurde das rezidivfreie Intervall (RFI) als Zeitspanne zwischen dem Tag der ersten chemotherapeutischen Behandlung und der Diagnose eines Tumorrezidivs bestimmt.

3.4 Entnahme und Lagerung der Proben

Die Entnahme der Proben für die Untersuchung der Genexpression erfolgte unter sterilen Kautelen mittels Feinnadelaspiration oder mittels Inzisionsbiopsie unter Allgemeinanästhesie (Tier-Nr. P19 und P20) bzw. nach Euthanasie mit Pentobarbital (Tier-Nr. K1 bis K20, P02 bis P06, P21 und P25). Bei den Kontrolltieren und den Lymphompatienten P02 bis P06, P21 und P25 wurden die Gewebeproben innerhalb von 20 min nach Eintritt des Todes im Rahmen einer Sektion entnommen. Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme in 1,5 ml Kryoröhrchen überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren Bearbeitung bei -80 °C gelagert.

Für die Immunphänotypisierung der Lymphome wurden Feinnadelaspirate entnommen, umgehend in 1 ml RPMI suspendiert und bei Raumtemperatur gelagert.

Die Entnahme der Proben für die histologische und immunhistologische Untersuchung erfolgte mittels Tru-cut-Biopsie bzw. Inzisionsbiopsie im Rahmen der initialen Diagnostik.

Die Proben wurden in 10 %igem, neutral gepuffertem Formalin (Rezeptur siehe Anhang S.

128) fixiert. Die Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Paraffineinbettung erfolgte automatisiert. Die Paraffinblöcke wurden bis zur weiteren Bearbeitung bei Raumtemperatur gelagert.

3.5 Immunphänotypisierung

Zur Immunphänotypisierung der Lymphome wurden hundespezifische Antikörper gegen verschiedene T-Lymphozytenantigene (CD3, CD4, CD5, CD8) sowie hundespezifische B- Lymphozytenmarker (anti B-cells, anti IgM) verwendet. Die Tumorzellen wurden in drei verschiedenen Ansätzen (zwei Doppel-, eine Dreifachfärbung) gefärbt (Tabelle 11).

Pro Färbeansatz wurden 100 µl der Probensuspension (5 bis 10 x 10⁵ Zellen) mit jeweils 5 µl der unverdünnten Primärantikörper für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in einem Plastikzentrifugenglas inkubiert. Die Proben wurden mit 1 ml Cellwash® (Fa. Becton Dickinson) für 5 min bei 300 x g gewaschen. Der Ansatz der Dreifachfärbung wurde anschließend mit 5 µl des unverdünnten Sekundärantikörpers (PerCP-konjugiertes anti Maus IgG1) für 15 min im Dunklen inkubiert. Etwaige Erythrozyten wurden mittels einfachkonzentrierter FACS Lysing Solution® (Fa. Becton Dickenson) für 10 min lysiert.

Die Proben wurden für 5 min bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen einmal mit 1 ml Cellwash® gewaschen. Die Zellen wurden in 250 µl 1x CellFix™ (Fa.

Becton Dickinson) fixiert. Pro Ansatz wurden mindestens 5.000 Zellen analysiert (FACSCalibur®, Fa. Becton Dickinson).

Die Messdaten wurden mit Hilfe der Software Cellquest® (Fa. Becton Dickinson) ausgewertet. Zunächst wurden die Zellen anhand der gemessenen Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtintensitäten als Punkthistogramm (Streulichtdiagramm) dargestellt.

Anschließend wurde ein Auswertungsfenster (engl. gate) um die Zellen gelegt (Ausschluss von Zelltrümmern). Anhand der mitgeführten Negativkontrolle (Ansatz 1) wurde die Autofluoreszenz bzw. die durch unspezifische Bindung verursachte Fluoreszenz der Zellen bestimmt. Bei der Auswertung der nachfolgenden Färbungen (Ansatz 2 bis 4) wurden alle Zellen mit einer höheren Fluoreszenzintensität als der in der Negativkontrolle gemessenen Intensität (Ansatz 1) als positiv bewertet. Lymphome, bei denen über 80 % der Zellen mit Antikörpern gegen caCD3, caCD4, caCD8 und /oder caCD5 reagierten, wurden der T-Zell- Linie zugeordnet. Als B-Zell-Lymphome wurden Tumoren klassifiziert, bei denen über 80 % der Zellen mit Antikörpern gegen kanine B-Zellen und / oder IgM reagierten.

Tabelle 11: Durchgeführte Färbungen zur Immunphänotypiesierung der Lymphome Ansatz Antikörperspezifität Fluorochrom

1 Maus IgG1 PerCP

caCD45 PE

2 caIgM FITC

caCD4 FITC caCD8 PE 3

caCD3 PerCP caCD5 FITC 4 caB cells PE

Abkürzungen:

ca: kanine PE: Phycoerythrin

CD: cluster of differentiation PerCP: Peridin-Clorophyll-a-Proteinkomplex FITC: Fluoreszeinisothyocyanat

3.6 Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein

Probenaufbereitung

Das Schneiden der in Paraffin eingebetteten Gewebeproben erfolgte mit einem Schlittenmikrotom (Mikrotom HM400, Fa. Microm) bei einer eingestellten Schnittdicke von 2 µm. Die Paraffinschnitte wurden in 40 °C warmem, destilliertem Wasser gestreckt (Paraffin Streckbad TFB45, Fa. Medite Medizintechnik), auf Objektträger (Superfrost® Plus, Fa.

Menzel-Gläser) aufgezogen und für 60 min bei 65 °C im Trockenschrank getrocknet.

Immunhistochemische Färbung

Die getrockneten Schnitte wurden dreimal für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) entparaffiniert, in einer absteigenden Alkoholreihe (5 min in 100%igem Isopropanol, je 2 bis 3 min in 96%igem Ethanol und 70%igem Ethanol) rehydriert und in 0,05 molarer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Herstellung und Zusammensetzung siehe Anhang, Seite 128) dreimal für 5 min gewaschen.

Zur Antigendemaskierung wurden die Schnitte 10 min in Citratpuffer (0,01 molar, pH-Wert 6,0) bei 600 Watt in einem Mikrowellenherd gekocht. Nach einer Abkühlungszeit von 15 min bei Raumtemperatur wurden die Schnitte dreimal in PBS für 5 min gewaschen. Zur Hemmung der endogenen Peroxidase wurden die Schnitte für 30 min in 1,5%igem Wasserstoffperoxid in Methanol (≤99,8%) inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte dreimal für 5 min in PBS gewaschen, in Coverplates (Fa. Shandon) überführt und für 20 min bei Raumtemperatur mit 1:5 mit PBS verdünntem Ziegennormalserum überschichtet.

Die Inkubation der Schnittpräparate mit dem Primärantikörper erfolgte über Nacht (12 - 18 h) bei 4 °C. Als Primärantikörper zum Nachweis von P-Glykoprotein wurde ein monoklonaler Antikörper gegen menschliches P-Glykoprotein (Klon C219) verwendet. Seine Anwendung zum P-Glykoproteinnachweis beim Hund wurde erstmals von GINN 1996 beschrieben. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 eingesetzt. Als Verdünnungsmedium wurde PBS plus 0,05 % Tween-20 plus 1 % bovines Serumalbumin (BSA) verwendet. Am nächsten Tag wurden die Schnittpräparate dreimal für 5 min in PBS plus 0,05 % Tween-20 gewaschen

und mit dem biotinylierten Sekundärantikörper (Ziege anti Maus IgG, Fa. Vektor Laboratories; 1:200 mit PBS verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Schnitte erneut dreimal für 5 min in PBS gewaschen.

Die Ansetzung des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes (Fa. Vector Laboratories) erfolgte nach Herstellerangaben (siehe Anhang, Seite 128). Die Schnitte wurden 30 min bei Raumtemperatur mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex inkubiert, dreimal für 5 min in PBS gewaschen und in Küvetten überführt.

Als Chromogen wurde 3,3 Diaminobenzidin (DAB) verwendet. Die Schnitte wurden in 0,05%iger Diaminobenzidin-Lösung mit Wasserstoffperoxid als Katalysator (Rezeptur siehe Anhang, Seite 128) für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und mindestens 20 min unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte anschließend 5 min in Hämalaun nach MEYER (Rezeptur siehe Anhang, Seite 128) eingestellt und 10 min unter fließendem Leitungswasser gebläut. Zuletzt wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%iges Ethanol, 96%iges Ethanol, 100%iges Isopropanol) dehydriert, dreimal für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) eingestellt und mit Roti® Histokitt (Fa. Roth) eingedeckt.

Kontrollen

Als positive Gewebekontrolle wurde in jeder Serie unverändertes Lebergewebe mitgeführt.

Zur Überprüfung unspezifischer Reaktionen wurde der Primärantikörper durch eine negative Reagenzienkontrolle (Maus IgG2a) ersetzt.

Lichtmikroskopische Beurteilung

Die Auswertung der immunhistochemischen Reaktionsergebnisse erfolgte mit einem Standard-Binokular-Lichtmikroskop bei 100-, 200- und 400-facher Vergrößerung.

3.7 Molekularbiologische Untersuchungen 3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA

Inzisionsbiopsien

Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Inzisionsbiopsien wurde das Verfahren der Phenol- Chloroform-Extraktion verwendet. Etwa 100 mg der Gewebeprobe wurden in einem Porzellantiegel in flüssigem Stickstoff mit einem Pistill zerrieben und in 2 ml TRIzol®

Reagent (Fa. Invitrogen) suspendiert. Zum Scheren der DNA wurde die Gewebesuspension zehnmal durch eine 18’Einmalkanüle in eine Einmalspritze aufgezogen. 1 ml des Homogenisates wurde mit 0,2 ml Chloroform (99%) in einem 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt, für 3 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde unter Vermeidung der Interphase in ein neues 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml Isopropanol (≥99,7%) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Das RNA- Pellet wurde in 75%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 µl DEPC behandeltem destilliertem Wasser (siehe Anhang S. 129) für 2 min im Wasserbad bei 70 °C gelöst. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bei -80 °C gelagert.

Feinnadelaspirate (FNA)

Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Feinnadelaspiraten wurde ein von der Firma Qiagen entwickelter Kit (RNeasy® Mini Kit) verwendet. Die FNA wurden in 600 µl Buffer RLT (RNeasy® Mini Kit) suspendiert. Die Probensuspension wurde auf eine QIAshredder™- Spinsäule pipettiert und für 3 min bei 10.000 x g in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das Lysat wurde mit 600 µl 70%igem Ethanol in einem 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt. 700 µl der Probe wurden auf eine Rneasy®-Spinsäule (RNeasy® Mini Kit) pipettiert und bei 10.000 x g 15 sec bei Raumtemperatur in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das Lysat wurde verworfen und der Vorgang mit dem restlichen Probenvolumen wiederholt.

Die Säule wurde in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und nacheinander mit 700 µl RW1 Puffer (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec, mit 500 µl RPE Puffer (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec und mit 500 µl RPE Puffer für 2 min bei 10.000 x g gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde das Mikrozentrifugenröhrchen gewechselt. Anschließend wurde die Säule für 1 min bei 10.000 x g getrocknet. Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC behandeltes destilliertes Wasser auf die Säule pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Das Eluat wurde in ein 0,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.

Bestimmung der Konzentration an Gesamt-RNA

Die Bestimmung der Gesamt-RNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie (siehe Anhang, Seite 129).

3.7.2 DNase-Behandlung

20 µg Gesamt-RNA wurden mit 10 Units DNase (RQ1 RNase-Free DNase®, Fa. Promega) und 10 µl RQ1 DNase 10 x Reaction Buffer (Bestandteil des RQ1 RNase-Free DNase®-Kits) in einem Reaktionsvolumen von 100 µl für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl RQ1 DNase Stop Solution (Bestandteil des RQ1 RNase-Free DNase®-Kits) beendet und die DNase durch Inkubation der Proben für 10 min bei 65 °C inaktiviert.

3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA

Die Reinigung der Gesamt-RNA erfolgte mittels RNeasy® Mini Kit (Fa. Qiagen). 100 µl der RNA-Lösung wurden mit 350 µl Buffer RLT (RNeasy® Mini Kit) und 250 µl 96%igem Ethanol vermischt, in eine RNeasy®-Spinsäule überführt und bei 10.000 x g für 15 sec in einem 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Die Säule wurde mit je 500 µl Buffer RPE (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec bzw. 2 min bei 10.000 x g gewaschen und anschließend für 1 min bei 10.000 x g getrocknet.

Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC behandeltes destilliertes Wasser auf die Säulenmembran pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Das Eluat wurde in ein 0,5 ml-Mikroreaktionsgefäß überführt und umgehend in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Die Gesamt-RNA-Konzentration (siehe Anhang, Seite 129) wurde über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrometrie bestimmt. Die Lagerung der isolierten Gesamt-RNA erfolgte bei - 80 °C.

3.7.4 Reverse Transkription (RT)

Die gereinigte Gesamt-RNA wurde in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Als Reverse Transkriptase wurde bis November 2001 Superscript II™ Reverse Transcriptase (Fa. Invitrogen) und anschließend Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa. Qiagen) verwendet.

Sofern ausreichende Mengen Gesamt-RNA nach der Isolierung vorlagen, wurden pro 20 µl-Reaktionsvolumen 1 µg Gesamt-RNA umgeschrieben. Bei sechs Feinnadelaspiraten lagen die isolierten Gesamt-RNA-Mengen unter 0,1 µg/µl bzw. 0,05 µg/µl. Bei diesen Proben wurden 0,5 µg (Tier-Nr. P18, P24, P41 bei Diagnose) bzw. 0,4 µg Gesamt-RNA (Tier-Nr.

P08, P13, P14 bei Diagnose und P09 beim 1. Rezidiv) als Template für die RT eingesetzt.

Für die RT mittels Superscript II Reverse Transcriptase® wurde 1 µg Gesamt-RNA mit destilliertem Wasser auf 11 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml) für 10 min bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß wurde auf Eis gestellt, 4 µl 5x First Strand Buffer, 2 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl) und 1 µl 10 mM dNTP zugegeben und für 2 min bei 42 °C inkubiert. Nach der Zugabe von 1 µl Superscript II™ Reverse Transcriptase erfolgte eine weitere Inkubation für 50 min bei 42 °C. Anschließend wurde die Reverse Transkriptase für 15 min bei 70 °C inaktiviert.

Für die RT mittels Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa.Qiagen) wurde 1 µg Gesamt-RNA mit destilliertem Wasser auf 13 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml), 2 µl 10x First Strand Buffer, 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl), 2 µl 5 dNTP und 1 µl Omniscript™ Reverse Transkriptase für 10 min bei 25 °C und anschließend für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reverse Transkriptase wurde für 5 min bei 93 °C inaktiviert. Die cDNA wurde bei -20 °C gelagert.

3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression

Die Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression erfolgte mittels real-time RT-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Als Housekeeping-Gen wurde Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT) verwendet.

3.7.5.1 Primer- und Sondendesign

Die Primer und Sonden für die RT-qPCR wurden mit Hilfe der Software ABI PRISM®

Primer Express (Fa. PE Applied Biosystems) ausgewählt (Tabelle 12).

Tabelle 12: Sequenzen und Schmelztemperaturen (Tm) der Primer und Sonden für die RT-qPCR

Abkürzungen und Fußnoten:

AP: Antisense-Primer FAM: 6-Carboxyfluorescein

SP: Sense-Primer TAMRA: 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin

* bei 100 mM Na⁺ MGB: Minor-groove-binder

Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Tm* MDR1 Sonde FAM-CCAGAAAAGGCCGGACTACCATTGTGA-TAMRA 77,1 °C

MDR1 SP CAGTGGTTCAGGTGGCCCCT 68,5 °C

MDR1 AP CGAACTGTAGACAAACGATGAGCT’ 67,0 °C

MRP1 Sonde FAM-AGAAAGAGGCTCCCTGGCAAATCCA– TAMRA 75,7 °C

MRP1 SP TGGAGAGGCTGAAGGAGTAT 61,5 °C

MRP1 AP CGTTGATGGTGATGTTGATGT 64,3 °C

MRP2 Sonde FAM-ATTCACGGCCTCATTT-MGB 56,8 °C

MRP2 SP AAGATGCCTCCTCAAATAATCCAT 66,3 °C

MRP2 AP TCATACCAACTAAACGTAATGCTACTCA 68,1 °C HPRT Sonde FAM-CTTGATTGGTTGAAGATCTCATTGACACAGGCA-TAMRA 76,9 °C HPRT SP GAGATGACCTCTCAACTTTAACTGAAAA 66,5 °C

HPRT AP GGGAAGCAAGGTTTGCATTG 69,9 °C

Die mRNA-Sequenzen wurden der Genbank entnommen (kanines HPRT: Genbank-Nr.

CFU16661; kanines MDR1: Genbank-Nr. AF045016; kanines MRP1: Genbank-Nr.

AF403241 und kanines MRP2: Genbank-Nr. CFA18220). Für die Messung der MDR-, MRP1- und HPRT-Genexpression wurden TaqMan®-Sonden, für den Nachweis von MRP2 Minor groove binder-Sonden eingesetzt. Als Reporterfarbstoff wurde 6-Carboxyfluorescein (FAM), als Quencherfarbstoff 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMRA) verwendet. Die Amplikonlänge betrug für den Nachweis von HPRT 89 bp, für MDR1 79 bp, für MRP1 174 bp und für MRP2 70 bp. Alle Sonden und Primer wurden über die Firma Applied Biosystems bezogen.

3.7.5.2 Herstellung der Standards für die qPCR

Die Herstellung der Standards für die qPCR erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion. Die erforderlichen Primer (Tabelle 13) wurden so konstruiert, dass die Sequenz des jeweiligen PCR-Produktes die Zielsequenz der jeweiligen qPCR einschloss. Die PCR-Produkte waren 123 bp (HPRT), 224 bp (MDR1), 369 bp (MRP1) und 616 bp (MRP2) lang.

Tabelle 13: Sequenzen und Schmelztemperatur (Tm) bei 100 mM Na⁺ der Primer (AP:

Antisense-Primer; SP: Sense-Primer) für die Herstellung der Standards für die RT-qPCR

Primer Sequenz (5’→ 3’) Tm*

Standard MDR1 SP CCACAATGACTCCATCATC 62,4 °C Standard MDR1 AP CAGAGAATCGCCATTGCT 59,4 °C

Standard MRP1 SP AGTGTGTGGGCAACTGCAT 67,2 °C Standard MRP1 AP CCACGATGCCCACCTTT 65,5 °C

Standard MRP2 SP CCTTGGGTTTCCTTTGGC 65,4 °C

Standard MRP2 AP AACTTGCTGACCAGTGCCTTG 67,7 °C Standard HPRT SP ATAAAAGTAATTGGTGGAGATG 57,8 °C

Standard HPRT AP ATTATACTGCGCGACCAAG 61,5 °C