Untersuchung der High-Mobility-Group A (HMGA) Genexpression und Durchflusszytometrie beim Lymphom des Hundes

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Untersuchung der High-Mobility-Group A ( HMGA ) Genexpression und Durchflusszytometrie beim Lymphom des Hundes

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Alexa Elena Jötzke

Henstedt-Ulzburg

Hannover 2011

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Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte

2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Wolfgang Baumgärtner

Tag der mündlichen Prüfung: 18. Mai 2011

Gefördert durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes.

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II. Publikationen ... 6

1. Expression of the high mobility group A1 (HMGA1) and A2 (HMGA2) genes in canine lymphoma: Analysis of 23 cases and comparison to control cases 2. Flow cytometric evaluation of different sites in canine lymphoma patients: Analysis of 44 cases and comparison to control cases III. Übergreifende Diskussion ... 7

IV. Zusammenfassung (deutsch) ... 17

V. Zusammenfassung (englisch) ... 19

VI. Schrifttumsverzeichnis ... 21

VII. Tabellarischer Anhang zu Kapitel II.2. ... 33

VIII. Abkürzungsverzeichnis ... 53

IX. Danksagung ... 54

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I. Einleitung

Das maligne Lymphom gehört mit einer jährlichen Inzidenz von bis zu 114 Erkrankungsfällen pro 100.000 Hunde (DORN et al. 1968; DORN et al. 1970;

DOBSON et al. 2002) zu den häufigsten Neoplasien des Hundes. Seine klinische Bedeutung resultiert zum einen aus dieser Häufigkeit, zum anderen handelt es sich um eine Tumorerkrankung, die regelmäßig erfolgreich chemotherapeutisch behandelt wird (MACEWEN et al. 1987; GREENLEE et al. 1990; STONE et al. 1991;

KELLER et al. 1993; MYERS et al. 1997; VALERIUS et al. 1997; KHANNA et al.

1998; ZEMANN et al. 1998; BOYCE u. KITCHELL 2000; GARRETT et al. 2002;

MACDONALD et al. 2005; SIMON et al. 2006; KAISER et al. 2007; SIMON et al.

2008; DATERS et al. 2010). Des Weiteren zeigt das Lymphom des Hundes viele Gemeinsamkeiten mit dem Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen (NHL), wie auch viele andere Tumorerkrankungen, z.B. Osteosarkome, Mammakarzinome, orale Melanome und Lungenkarzinome, Ähnlichkeiten mit den entsprechenden Neoplasien des Menschen aufweisen (MACEWEN 1990). Die Ähnlichkeiten sowohl im biologischen Verhalten der Erkrankungen wie auch in den Lebensumständen dieser beiden Spezies führen dazu, dass dem Hund eine wichtige Rolle als Modellorganismus zugeschrieben wird (HAHN et al. 1994; VAIL u. MACEWEN 2000). Die Erforschung von diagnostischen Verfahren, prognostischen Faktoren und therapeutischen Angriffspunkten beim Lymphom des Hundes ist daher von Interesse sowohl für die veterinärmedizinische als auch für die vergleichende onkologische Forschung.

Eine Voraussetzung für vergleichende Studien zur Erforschung des genetischen Hintergrundes von Erkrankungen sind Untersuchungen am Hund, um die entsprechenden Gene und ihre Expression bei dieser Spezies zu charakterisieren (OSTRANDER et al. 2000).

Bei den High-Mobility-Group A (HMGA)-Proteinen handelt es sich um kleine, hoch- konservierte, Chromatin-assoziierte Nicht-Histon-Proteine (MURUA ESCOBAR et al.

2005), die aufgrund ihrer Wirkungsweise als architektonische Transkriptionsfaktoren bezeichnet werden. Sie bewirken Konformationsänderungen der genomischen DNA,

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beeinflussen so die Bindung verschiedenster Transkriptionsfaktoren und haben damit einen indirekten Effekt auf die Transkriptionsregulation (BUSTIN u. REEVES 1996).

Die Familie der HMGA-Proteine besteht aus drei Mitgliedern: HMGA1a, HMGA1b und HMGA2, welche von zwei verschiedenen Genen kodiert werden (HMGA1 und HMGA2). Es konnte gezeigt werden, dass diese Gene während der Embryonalentwicklung stark exprimiert werden, ihre Expression in ausdifferenzierten und sich nicht teilenden adulten Zellen jedoch nur sehr gering oder sogar überhaupt nicht nachweisbar ist (CHIAPPETTA et al. 1996; ROGALLA et al. 1996).

Im Gegensatz zu dieser physiologischerweise niedrigen bis nicht nachweisbaren Expression in adulten Zellen wurde in verschiedenen neoplastisch veränderten Geweben eine verstärkte Expression der HMGA-Gene nachgewiesen. Dieser Nachweis wurde sowohl für HMGA1 als auch für HMGA2 in verschiedenen benignen und malignen Tumoren geführt, wobei bei benignen Tumoren vor allem Chromosomenaberrationen als Ursache festgestellt wurden (SCHOENMAKERS et al. 1995), während bei malignen Tumoren Genregulationsmechanismen beteiligt zu sein scheinen (TALLINI u. DAL CIN 1999).

Bei der Untersuchung der HMGA-Genexpression in malignen Tumoren des Menschen wurde eine Überexpression von HMGA1 bisher z.B. in Schilddrüsenkarzinomen, Lungenkarzinomen, Prostatakarzinomen, kolorektalen Karzinomen, sowie auch bei Leukämien und Lymphomen nachgewiesen (BUSSEMAKERS et al. 1991; CHIAPPETTA et al. 1998; ABE et al. 1999;

PIERANTONI et al. 2003a; EK et al. 2004; XU et al. 2004; GLAS et al. 2005;

SARHADI et al. 2006). Eine HMGA2-Überexpression konnte z.B. bei Leukämien, Mammakarzinomen, nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen, oralen Plattenepithelkarzinomen und Schilddrüsenkarzinomen festgestellt werden (ROGALLA et al. 1997; ROMMEL et al. 1997; MIYAZAWA et al. 2004; MEYER et al.

2007b; BELGE et al. 2008). Bei vielen dieser Tumoren zeigte sich, dass die HMGA- Überexpression mit einem aggressiveren biologischen Verhalten des Tumors einhergeht (BUSSEMAKERS et al. 1991; ROGALLA et al. 1997; ABE et al. 1999; EK et al. 2004; MIYAZAWA et al. 2004; GLAS et al. 2005; SARHADI et al. 2006).

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Der Nachweis einer HMGA2-Überexpression in Prostatakarzinomgewebe von Hunden lässt die Vermutung zu, dass HMGA auch bei malignen Tumoren dieser Spezies von Bedeutung sein könnte (WINKLER et al. 2007).

Mehrere HMG-Gene wurden beim Hund bereits charakterisiert und vergleichend mit ihren humanen Gegenstücken analysiert. Dabei zeigt sich der hohe Grad der Gemeinsamkeiten beispielsweise darin, dass das canine HMGA1 auf Proteinebene vollständige Homologie mit dem entsprechenden humanen Protein besitzt (MURUA ESCOBAR et al. 2005).

Wie oben beschrieben, konnte eine bedeutende Rolle der HMGA-Expression bei malignen Tumoren des Menschen gezeigt werden. Daher wird angenommen, dass es sich um einen molekularen Marker mit bedeutender diagnostischer und prognostischer Aussagekraft, sowie ein potentielles Ziel für neue therapeutische Ansätze handelt (FUSCO u. FEDELE 2007). Da zur Nutzung dieses Potentials zunächst die Charakterisierung der Expression im betreffenden neoplastischen Gewebe erforderlich ist, war es ein Ziel der hier vorliegenden Arbeit, die HMGA1- und HMGA2-Expression in Lymphknoten von Hunden mit Lymphom zu untersuchen.

Als Vergleich diente die Expression in gesunden Lymphknoten einer Kontrollgruppe.

Die Durchflusszytometrie ist eine auf optischen Messungen basierende Technik, die Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften einzelner in Flüssigkeit transportierter Partikel erfasst (NIGEL u. ORMEROD 2000). Sie erlaubt die zeitgleiche Analyse großer Zellzahlen, während dabei die Eigenschaften jeder einzelnen Zelle erfasst werden. Eine wichtige Anwendung im medizinischen Bereich ist die Immunphänotypisierung von Leukozyten. Im Rahmen der Diagnostik von Leukämien und malignen Lymphomen hat die Durchflusszytometrie daher in der Humanmedizin eine wichtige Bedeutung erlangt (CRAIG u. FOON 2008).

Heutige Anwendungsgebiete in der Kleintiermedizin werden von Tarrant (2005) zusammenfassend dargestellt. Danach findet die Technik Anwendung bei der automatisierten Blutzellzählung, der Retikulozytenzählung sowie der Zählung von Thrombozyten und ihren Vorstufen. Die weiterführende Diagnostik von Leukämien und Lymphomen (Immunphänotypisierung), immunmediierten Anämien und

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Thrombozytopenien sowie von Granulozytopathien und Thrombopathien zählen außerdem zu ihren Einsatzgebieten. Weiterhin sind Zellploidie- und Zellzyklusdiagnostik und die Analyse von Lymphozytensubpopulationen im Rahmen der Untersuchung des zellulären Immunsystems wichtige Anwendungen der Durchflusszytometrie (TARRANT 2005). Chabanne et al. (2000) beschreiben darüber hinaus Anwendungsgebiete in der Virologie, Parasitologie, Bakteriologie und Serologie.

Die Anzahl der verfügbaren, gegen kanine lymphozytäre Antigene gerichteten bzw.

mit diesen kreuzreagierenden, monoklonalen Antikörper ist in den letzten Jahrzehnten deutlich gestiegen (GREENLEE et al. 1987; GEBHARD u. CARTER 1992; CHABANNE et al. 1994; COBBOLD u. METCALFE 1994; FALDYNA et al.

2007; WILLMANN et al. 2009; BALHORN et al. 2010). Damit einhergehend verbessern sich auch die Möglichkeiten und das Interesse an der Anwendung der Durchflusszytometrie in der Leukämie- und Lymphomdiagnostik beim Hund. So hat sich die Technik im Lauf der Zeit als Methode zur Bestimmung des Immunphänotyps beim kaninen Lymphom etabliert. Lymphknotenmaterial von Hunden wurde in verschiedenen Studien mit dieser Methode untersucht (GREENLEE et al. 1990;

CULMSEE et al. 2001; GIBSON et al. 2004; SÖZMEN et al. 2005; WILKERSON et al. 2005). Auch Blut und Knochenmark von Hunden mit Lymphomen und Leukämien werden bereits seit einiger Zeit durchflusszytometrisch untersucht (GRINDEM et al.

1998; WINNICKA et al. 2002; COMAZZI et al. 2011). Während im Zusammenhang mit der Lymphomdiagnostik am Menschen auch durchflusszytometrische Untersuchungen von Leber- (SANTOS et al. 2003) und Milzproben (ZEPPA et al.

2003; RAMDALL et al. 2006) durchgeführt werden, lassen sich in der zugänglichen Literatur keine Berichte über derartige Anwendungen beim Hund finden. Somit war bisher unklar, ob diese Methode zu einem über den Immunphänotyp hinausgehenden Informationsgewinn hinsichtlich der Ausbreitung des Lymphoms führen kann. Besonders im Hinblick auf eine mögliche Beteiligung der inneren Organe liegen bisher keine Daten vor. Daher sollte in der hier vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob die Durchflusszytometrie ein geeignetes Verfahren ist, um bei

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Hunden eine Infiltration verschiedener extranodaler Gewebe mit Lymphomzellen nachzuweisen.

In bisher durchgeführten durchflusszytometrischen Studien an Leber- und Milzproben von Hunden kam Material zum Einsatz, welches mittels Biopsie oder bei Sektionen entnommen wurde (SAKAI et al. 2003; FALDYNA et al. 2005; GUERRA et al. 2009).

Im Gegensatz zu diesen Methoden kann eine Probennahme mittels Feinnadelaspiration minimal invasiv am lebenden Tier zumeist ohne Narkose durchgeführt werden und würde daher eine routinemäßige Untersuchung von Patientenproben ermöglichen. Daher war ein weiteres Ziel der Untersuchungen, die Eignung mittels Feinnadelaspiration gewonnener Leber- und Milzproben für die durchflusszytometrische Analyse festzustellen.

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II. Publikationen

1. JOETZKE, A. E., K. A. STERENCZAK, N. EBERLE, S. WAGNER, J. T. SOLLER, I. NOLTE, J. BULLERDIEK, H. MURUA ESCOBAR u. D. SIMON (2010):

Expression of the high mobility group A1 (HMGA1) and A2 (HMGA2) genes in canine lymphoma: analysis of 23 cases and comparison to control cases.

Vet Comp Oncol 8, 87-95

Der selbständige Anteil an dieser Publikation bestand in der Probenentnahme, der Assistenz bei der Durchführung der RT-PCR-Analyse, der Auswertung der Ergebnisse, der Literaturrecherche und im Verfassen des Manuskriptes als Hauptautor.

2. JOETZKE, A. E., N. EBERLE, I. NOLTE, R. MISCHKE u. D. SIMON:

Flow cytometric evaluation of different sites in canine lymphoma patients:

Analysis of 44 cases and comparison to control cases.

Angenommen zur Veröffentlichung im American Journal of Veterinary Research im Mai 2011

Der selbständige Anteil an dieser Publikation bestand in der Entnahme eines Teils der Proben, der Durchführung der durchflusszytometrischen Untersuchungen, der Auswertung der Ergebnisse, der Literaturrecherche und im Verfassen des Manuskriptes als Hauptautor.

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III. Übergreifende Diskussion

Ziel der hier vorliegenden Arbeit war eine Charakterisierung des kaninen Lymphoms mittels genetischer und durchflusszytometrischer Untersuchungen.

Es konnte teilweise eine Überexpression von HMGA1 und HMGA2 in Lymphknotenproben nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Eignung der Durchflusszytometrie für die Analyse von Proben verschiedener Lokalisationen von kaninen Lymphompatienten gezeigt.

In der zugänglichen Literatur existieren bisher keine vergleichbaren Untersuchungen zur HMG-Genexpression bei Hunden mit hämatopoetischen Neoplasien. Im Vergleich zu Kontrollhunden konnte bei der hier untersuchten Patientengruppe eine Überexpression von HMGA1 festgestellt werden. Auch bestimmte Subtypen des humanen NHL zeigen Abweichungen in der HMGA1-Expression. Beispielsweise besteht eine höhere Expression von HMGA1 in der aggressiven Phase des follikulären Lymphoms im Vergleich zur indolenten Phase (GLAS et al. 2005).

Humane Mantelzell-Lymphome mit einem hohen proliferativen Index zeigten eine mehr als dreifach höhere HMGA1-Expression als solche mit einem niedrigen proliferativen Index (EK et al. 2004). Weiterhin wurde eine gesteigerte HMGA1- Proteinexpresion in Burkitt-Lymphom-Zelllinien mit erhöhtem c-Myc-Protein beschrieben (WOOD et al. 2000). Eine HMGA1-Überexpression konnte ebenso in humanen lymphoiden und myeloiden Leukämien nachgewiesen werden (PIERANTONI et al. 2003a; XU et al. 2004). Beobachtungen an Mäusen unterstreichen die Bedeutung von HMGA1 bei hämatopoetischen Neoplasien. So war die Induktion einer HMGA1-Überexpression in transgenen Mäusen mit einer Entwicklung von NK-Zell-Lymphomen assoziiert (FEDELE et al. 2005). Jedoch bringt auch der Verlust der HMGA1-Genfunktion signifikante pathogene Effekte mit sich:

Heterozygote und homozygote HMGA1-knock-out-Mäuse entwickeln eine kardiale Hypertrophie. Diese tritt wiederum kombiniert mit hämatopoetischen Neoplasien wie z.B. B-Zell-Lymphom und myeloider granuloerythroblastischer Leukämie auf (FEDELE et al. 2006).

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Im Gegensatz zu HMGA1 konnten keine signifikanten Unterschiede im HMGA2- Expressionslevel zwischen den Patienten und den Kontrollhunden festgestellt werden. Bei humanen hämatopoetischen Neoplasien lymphoider und myeloider Herkunft sind aberrante Expressionen und chromosomale Umordnungen im Bereich des HMGA2-Gens beschrieben (SANTULLI et al. 2000; PIERANTONI et al. 2003b;

ODERO et al. 2005; PATEL et al. 2005). Auch entwickeln transgene Mäuse mit verkürztem HMGA2-Gen sehr häufig NK-Zell-Lymphome (BALDASSARRE et al.

2001). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass HMGA2 ebenfalls bei hämatopoetischen Neoplasien eine Rolle spielt. Während allerdings erhöhte HMGA2-Expressionslevel eine Rolle bei verschiedenen humanen myeloiden Neoplasien spielen (ROMMEL et al. 1997; ODERO et al. 2005; MEYER et al.

2007a), sind die Daten zu lymphoiden Neoplasien heterogener. Zum Beispiel wurden im Knochenmark bei Menschen mit akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) signifikant niedrigere HMGA2-Expressionslevel im Vergleich zu gesunden Proben gemessen (PATEL et al. 2005). Im Gegensatz dazu beschreibt ein Fallbericht einen ALL-Patienten mit einer Umordnung am HMGA2-Locus, die mit Überexpression einer veränderten HMGA2-mRNA einhergeht (PIERANTONI et al. 2003b). In einem Bericht über eine chronische lymphozytäre Leukämie mit Richter Transformation zeigten die Knochmarkblasten ebenfalls eine HMGA2-Proteinexpression. Diese war mit einer chromosomalen Translokation assoziiert, die HMGA2 und andere Gene betraf (SANTULLI et al. 2000).

Auch wenn in den hier durchgeführten Untersuchungen keine signifikanten Unterschiede zwischen den an einem Lymphom erkrankten Hunden und den Kontrolltieren festgestellt werden konnten, so lag doch eine weite Streuung der HMGA2-Expressionslevel in den Lymphomproben vor. Es lässt sich daher vermuten, dass Veränderungen der HMGA2-Expression auch beim kaninen Lymphom von Bedeutung sein könnten. Diese scheinen jedoch nicht in Form einer konstant feststellbaren Überexpression aufzutreten. In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass HMGA2 in T- signifikant höher als in B-Zell-Lymphomen exprimiert war. T-Zell-Lymphome sind beim Hund seltener als der B-Zell-Phänotyp (GREENLEE et al. 1990; TESKE et al. 1994; CULMSEE et al. 2001). Möglicherweise

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war daher der Anteil der T-Zell-Lymphome zu gering, um einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Lymphompatienten und Kontrolltieren aufzuzeigen. Auch die HMGA1-Expression unterschied sich signifikant zwischen B- und T-Zell-Lymphomen, wobei hier die B-Zell-Lymphome die höhere Expression zeigten. Beim Lymphom des Hundes wurde wiederholt ein Zusammenhang zwischen Immunphänotyp und Prognose nachgewiesen (GREENLEE et al. 1990; TESKE et al.

1994; VAIL et al. 1996). In verschiedenen malignen Tumorerkrankungen des Menschen konnte eine prognostische Bedeutung für die HMGA-Expression gezeigt werden (BUSSEMAKERS et al. 1991; ROGALLA et al. 1997; ABE et al. 1999;

MIYAZAWA et al. 2004; SARHADI et al. 2006). Aufgrund dieser bekannten prognostischen Zusammenhänge bei beiden Spezies und der hier festgestellten unterschiedliche Expression von HMGA1 und HMGA2 lässt sich vermuten, dass HMGA auch beim kaninen Lymphom prognostische Relevanz besitzen könnte.

Interessant erscheint dabei auch, dass die HMGA1-Expression bei jenen Patienten niedriger ist, die in ihren Lymphknoten eine signifikant höhere HMGA2-Expression zeigen (T-Zell-Lymphome) und umgekehrt (B-Zell-Lymphome). In der verfügbaren Literatur über HMGA-Expression in Tumoren des Menschen zeigen manche Tumorarten eine gleichzeitige Überexpression von HMGA1 und HMGA2 (SARHADI et al. 2006) andere hingegen die Überexpression von HMGA1 oder HMGA2 (HUI et al. 2005; FRANCO et al. 2008). Das HMGA-Proteinexpressionsprofil hat sich bei bestimmten Tumorarten sogar als hilfreiches diagnostisches Instrument zur Unterscheidung histologisch ähnlicher Entitäten erwiesen (HUI et al. 2005; FRANCO et al. 2008). Eine mögliche Erklärung für unterschiedliche Expressionen von HMGA1 und HMGA2 ist, dass sie unterschiedliche Rollen bei der Gewebedifferenzierung und Tumorpathogenese spielen. Ob ihr Expressionsmuster auch bei Tumoren des Hundes und speziell beim Lymphom diagnostische oder prognostische Relevanz besitzt, müssen zukünftige Studien weitergehend charakterisieren.

Die vorliegenden Untersuchungen weisen einige Limitationen auf. Die Gruppen der multizentrischen T-Zell-Lymphome und der intestinalen Lymphome waren relativ klein. Dies spiegelt die epidemiologische Situation in der kaninen Population wider, führt jedoch zu einer geringeren Aussagekraft der statistischen Analysen. Ebenso

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kann die kleine Zahl von Kontrollhunden als Limitation angesehen werden. Bei diesen Hunden lagen keine hämatopoetischen Neoplasien vor und ihre peripheren Lymphknoten waren klinisch unauffällig. Andere neoplastische und nicht- neoplastische Erkrankungen waren jedoch nicht ausgeschlossen, da es sich um Tiere handelte, die aus Krankheitsgründen, nicht aber zu Studienzwecken euthanasiert wurden. Es ist daher möglich, dass vorliegende Erkrankungen oder die postmortale Probennahme das HMGA-Expressionslevel in den klinisch unveränderten peripheren Lymphknoten beeinflusst haben könnten.

Die in der vorgelegten Arbeit festgestellten Unterschiede in der HMGA- Genexpression lassen eine Bedeutung dieser Gene in der Pathogenese des kaninen Lymphoms vermuten. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stellen die Basis für zukünftige veterinärmedizinische und vergleichende Studien zur diagnostischen, prognostischen und therapeutischen Bedeutung von HMGA1 und HMGA2 bei hämatopoetischen Neoplasien dar.

Die hier dargestellten durchflusszytometrischen Untersuchungen sind in der zugänglichen Literatur der erste Bericht über Durchflusszytometrie an Leber- und Milzproben von Hunden mit Lymphom.

In den bisherigen Studien, die kanine Lymphozyten aus Leber und Milz durchflusszytometrisch untersuchten, lag der Fokus der Untersuchungen beispielsweise auf der Lymphozytenentwicklung in lymphatischen Organen (FALDYNA et al. 2005) oder der Untersuchung von Lymphozyten aus unverändertem Lebergewebe (SAKAI et al. 2003). Die Analyse von T-Lymphozytensubpopulationen in verschiedenen Organen (Lymphknoten, Milz, Knochenmark, Thymus, Blut) gesunder Hunde unter Verwendung neu entwickelter monoklonaler Antikörper war das Studienfeld von Gebhard und Carter (1992). Eine weitere Studie aus diesem Bereich untersuchte mononukleäre Zellen in der Milz von Leishmania infantum- infizierten Hunden (GUERRA et al. 2009). Beim Vergleich der Daten, die in der hier vorliegenden Arbeit von gesunden Kontrolltieren erhoben wurden, mit der vorgenannten Literatur, lassen sich Gemeinsamkeiten feststellen. Faldyna et al.

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(2005) stellten in der Milz dreier gesunder, erwachsener Hunde (Beagle) ein mittleres (=medianes) CD3/21-Verhältnis von 2,1 fest, welches nahezu identisch erscheint mit dem mittleren (medianen) T/B-Verhältnis von 2,3 (2,0) in den hier vorliegenden Untersuchungen. Der Vergleich des mittleren T/B-Verhältnisses in den Leberproben von elf Hunden (Beagle) (SAKAI et al. 2003) mit einem auf die gleiche Weise errechneten Mittelwert aus den Kontroll-Leberproben der hier vorliegenden Arbeit ergibt, dass diese mit 11,7 bzw. 10,6 ebenfalls nah beieinander liegen.

Keine der bisherigen durchflusszytometrischen Studien zu kaninen Leber- und Milzproben nutzte Material, das von lebenden Hunden mittels Feinnadelaspiration gewonnen wurde. Für die Probengewinnung von Lymphknoten für die Durchflusszytometrie - sowohl von gesunden Hunden als auch von kaninen Lymphompatienten - ist diese Technik hingegen etabliert (CULMSEE et al. 2001;

GIBSON et al. 2004; SÖZMEN et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit wurden alle Lymphknoten-, Knochenmark-, Leber- und Milzproben mittels Feinnadelaspiration gewonnen. Lediglich fünf Prozent aller Proben wurden aufgrund zu geringer Zellularität ausgeschlossen. Daher kann diese Methode als geeignet angesehen werden.

In der Humanmedizin ist die Probenentnahme aus abdominalen Organen mittels Feinnadelaspiration mit anschließender durchflusszytometrischer Untersuchung eine etablierte Methode in der Diagnostik von NHL-Patienten (JOHNSON et al. 1987;

ZEPPA et al. 2003; ZEPPA et al. 2004; ELOUBEIDI et al. 2006). Wie auch in der vorliegenden Arbeit, ist dabei die Knappheit an Probenmaterial ein bekanntes Problem (JOHNSON et al. 1987; YOUNG et al. 1998; ZEPPA et al. 2004). Die meisten Proben, die in der vorliegenden Untersuchung aufgrund zu geringer Zellularität ausgeschlossen wurden, wurden innerhalb der ersten Hälfte des Studienzeitraumes gewonnen. Daher kann ein Lerneffekt in der Probennahmetechnik angenommen werden. Ein ähnlicher Effekt wurde auch in einer humanen Durchflusszytometriestudie aufgezeigt (ZEPPA et al. 2004).

In diesem Zusammenhang konnte des Weiteren festgestellt werden, dass trotz gleicher Probennahmetechnik die Zellularität der Leberproben der Lymphompatienten im Durchschnitt höher lag als die der Kontrollhunde. Eine

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mögliche Erklärung dafür ist, dass lymphominfiltriertes Gewebe einen höheren Anteil leicht exfoliierbarer Zellen (die Lymphomzellen) enthält als gesundes Lebergewebe.

Die Durchflusszytometrie hat heute eine bedeutende Rolle in der Diagnostik von Menschen mit hämatopoetischen Neoplasien erreicht (DAVIS et al. 2007; CRAIG u.

FOON 2008). Sie ist als ergänzendes Verfahren für das Staging von NHL-Patienten etabliert, da gezeigt werden konnte, dass sich damit zusätzliche Informationen hinsichtlich der Ausbreitung der Lymphomzellen gewinnen lassen (JOHNSON et al.

1987; FINN et al. 1998; DUGGAN et al. 2000). Ein großer Vorteil der Durchflusszytometrie bei humanen gegenüber kaninen B-Zell-Lymphomen liegt in der Möglichkeit einer Erkennung neoplastischer Zellen mittels Klonalitätsanalyse. Da mit der Immunglobulin-Leichtkettenrestriktion ein Indikator für Klonalität gefunden wurde, können auch kleine Populationen neoplastischer Zellen in verschiedenen Proben nachgewiesen werden (JOHNSON et al. 1987). Die Situation bei humanen T- Zell-Lymphomen stellt sich im Vergleich dazu komplizierter dar. Die Identifikation neoplastischer T-Zellen mittels Durchflusszytometrie basiert auf aberranten Antigen- Expressionsmustern, die unter Anwendung großer Antikörperpanels festgestellt werden. Diese aberrante Antigenexpression wird als Marker für Pseudoklonalität bezeichnet (JAMAL et al. 2001).

Bei Hunden ist die durchflusszytometrische Erfassung neoplastischer Lymphozyten deutlich schwieriger als beim Menschen. Durchflusszytometrische Klonalitätstestung mithilfe der Leichtkettenrestriktion ist nicht möglich, da beim Hund ein weiteres kappa/lambda-Verhältnis besteht (ARUN et al. 1996). Studien, die aberrante Antigenexpressionen bei kaninen B- und T-Zell-Lymphomen nachweisen konnten, haben eine Möglichkeit zur Erkennung von Pseudoklonalität auch beim Hund aufgezeigt (WILKERSON et al. 2005; GELAIN et al. 2008). In der vorliegenden Arbeit wurde zur Unterscheidung von gesundem und lymphomzellinfiltriertem Gewebe das (logarithmisch transformierte) Verhältnis von T- zu B-Lymphozyten benutzt. Kleine Mengen infiltrierender Zellen sind mit dieser Methode nicht detektierbar. Andererseits könnten nicht-neoplastische, pathologische Prozesse in dem entsprechenden Gewebe die Verhältnisse der Lymphozytensubpopulationen zueinander verändern.

Dies führt möglicherweise zu falsch-positiven Bewertungen. In den

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durchflusszytometrischen Punktediagrammen vieler extranodaler Gewebe von B- Zell-Lymphompatienten konnten lymphomverdächtige Populationen identifiziert werden. Dies basierte auf der Ähnlichkeit ihrer Lichtstreu- und Antikörperbindungseigenschaften mit denen der neoplastischen Zellen im Lymphknoten des jeweiligen Patienten. Da jedoch spezifische Antigene fehlen, können darauf basierende Schlussfolgerungen zur Infiltration des entsprechenden Gewebes nur Vermutungen sein. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass es sich bei diesen Zellen um Lymphozytensubpopulationen handelt, die physiologischerweise oder aufgrund anderer, nicht-neoplastischer, pathologischer Verhältnisse in dem betreffenden Gewebe vorkommen. Ein Beispiel für derartige Subpopulationen mit sich unterscheidenden immunphänotypischen und Lichtstreueigenschaften sind die CD21^high- und CD21^low-Populationen, die in den Milzproben der Kontrollhunde und mehrerer T-Zell-Lymphompatienten beobachtet werden konnten. In der zugänglichen Literatur über die durchflusszytometrische Milzuntersuchung von Hunden, sind keine Hinweise auf derartige unterschiedliche CD21-positive Zellen zu finden. Aufgrund des höheren Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtes der CD21^high- im Vergleich zur CD21^low-Population ist aber anzunehmen, dass es sich bei den höher CD21 exprimierenden Zellen um morphologisch abweichende bzw. größere B-Lymphozyten handelt, die physiologischerweise in der Milz vorkommen. Weitere durchflusszytometrische Studien mit größeren Antikörperpanels oder immunhistochemische Untersuchungen könnten zu einer detaillierteren Charakterisierung der verschiedenen CD21-positiven Zellen in der Milz beitragen. In jedem Fall können aber Lymphozytensubpopulationen wie diese Schwierigkeiten bei der Identifikation neoplastischer Zellen in extranodalen Lokalisationen verursachen.

In der vorliegenden Arbeit wurden bei vielen B-Zell-Lymphompopulationen Abweichungen der CD21-Fluoreszenzintensität in Form einer erhöhten Expression festgestellt. Die T-Lymphomzellen wiesen hingegen keine Abweichungen der CD3- Expression auf. Gelain et al. (2008) zeigten mit einem semiquantitativen Ansatz nur bei einem von 31 B-Zell-Lymphomen eine erhöhte CD21-Expression. Bei zwei Patienten wurde hingegen eine verminderte CD21-Expression festgestellt (GELAIN

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et al. 2008), was in den vorliegenden Untersuchungen nicht zu beobachten war. Von den 16 T-Zell-Lymphomen der genannten Studie zeigte eines eine verminderte CD3- Expression, während bei zweien keine Expression von CD3 nachgewiesen werden konnte. Die Unterschiede zwischen diesen und den hier vorliegenden Ergebnissen könnten zum einen in Ungleichheiten der untersuchten Patientenpopulationen begründet liegen. Eine andere mögliche Ursache besteht in dem semiquantitativen Verfahren, welches Gelain et al. angewendet haben. Es kann jedoch auch ein Vorteil der hier vorliegenden Untersuchungen bei der Erkennung abweichender Fluoreszenzintensitäten angenommen werden, da Proben unterschiedlicher Lokalisationen desselben Patienten zur Beurteilung herangezogen werden konnten.

Signifikante Unterschiede des log(T/B) zwischen B- und T-Zell-Lymphomen sowie zwischen Patienten und Kontrolltieren wurden in den meisten untersuchten Lokalisationen gefunden. Das Fehlen signifikanter Unterschiede zwischen T-Zell- Lymphomen und Kontrollen in Blut- und Leberproben ist zum Teil mit der Dominanz der CD3- über die CD21-positiven Lymphozyten zu erklären. Diese herrscht in den meisten Geweben unter physiologischen Bedingungen vor, was sowohl in der vorliegenden als auch in früheren Studien gezeigt wurde (SAKAI et al. 2003;

FALDYNA et al. 2005). Dieser Umstand könnte des Weiteren zu einer Unterschätzung der positiven extranodalen Proben bei T-Zell-Lymphomen geführt haben. Andererseits tragen die Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen zu der Vermutung bei, dass die in dieser Studie untersuchten T-Zell-Lymphompatienten seltener eine Infiltration extranodaler Lokalisationen aufwiesen als die Patienten des B-Zell-Immunphänotypes. Dieses kann ebenso zu dem Fehlen signifikanter Unterschiede beigetragen haben. Eine weitere interessante Beobachtung hinsichtlich der T/B-Verhältnisse in den Patientenproben ist ihre breite Variation. Ob die Höhe des T/B-Verhältnisses als Indikator für den Grad der Lymphominfiltration einen eigenständigen prognostischen Marker darstellen könnte, ist ein interessanter Aspekt, der in künftigen Studien untersucht werden sollte.

Der Vergleich durchflusszytometrischer und zytologischer Untersuchung zeigte übereinstimmende Ergebnisse in 83% der extranodalen Proben. Die 17% Nicht- Übereinstimmungen waren nicht gleichmäßig zwischen den verschiedenen

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extranodalen Lokalisationen verteilt. Ein Grund für den höheren Anteil nicht- übereinstimmender Ergebnisse in den Knochenmarkproben ist wahrscheinlich die höhere Variation des log(T/B) der Knochenmark-Kontrollproben. Bei diesen lag innerhalb der Kontrollen der verschiedenen Lokalisationen die höchste Standardabweichung des log(T/B) vor. Dies kann zu einer höheren Anzahl falsch- negativer Beurteilungen der Knochenmarkproben von Lymphompatienten geführt und damit auch die Anzahl der Nicht-Übereinstimmungen zwischen durchflusszytometrischer und zytologischer Untersuchung erhöht haben. Diese Vermutung wird dadurch unterstrichen, dass 13 der 17 Nicht-Übereinstimmungen bei Knochenmarkproben negativ in der Durchflusszytometrie und positiv oder verdächtig in der Zytologie bewertet wurden.

Die Limitationen der durchgeführten durchflusszytometrischen Untersuchungen sollen hier Erwähnung finden. Die Anzahl der Kontrollhunde war relativ gering. Mit einer größeren Anzahl wären verlässlichere Grenzwerte zur Klassifikation der extranodalen Proben von Lymphompatienten zu erstellen gewesen, jedoch sollte die Zahl der verwendeten gesunden Tiere möglichst gering gehalten werden. Des Weiteren wurde ein relativ kleines Panel von drei Antikörpern gegen verschiedene Oberflächenantigene für die durchflusszytometrische Untersuchung verwendet. Ein größeres Panel könnte spezifischere Informationen über die neoplastischen Zellen und die Verteilung der Lymphozytensubpopulationen bei Hunden mit Lymphom liefern. Hier erscheinen weiterführende Studien sinnvoll.

Ein weiterer Aspekt, der bei der Untersuchung von Organproben berücksichtigt werden muss, ist die Kontamination mit Blut. Diese kann zu falschen Klassifikationen sowohl bei der durchflusszytometrischen als auch bei der zytologische Untersuchung führen. Wenn im Blut des betreffenden Patienten Lymphomzellen vorhanden sind, kann nicht ausgeschlossen werden, dass in einer anderen Lokalisation festgestellte neoplastische Zellen aus dem kontaminierenden Blut stammen. Im Hinblick auf das WHO-Staging-System für kanine Lymphompatienten (OWEN 1980) würden derartige Fehlklassifikation allerdings nicht zur Änderung des Stadiums des jeweiligen Patienten führen, da eine Beteiligung von Blut oder Knochenmark automatisch zur Einteilung in das höchste Stadium (V) führt. Es bleibt zu untersuchen, ob das

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Hinzufügen der Durchflusszytometrie zu den bisher angewandten diagnostischen Techniken zu einer signifikanten „stage migration“ führt. Darunter ist die Einteilung einer signifikanten Anzahl von Patienten in ein höheres WHO-Stadium zu verstehen, wie Flory et al. (2007) es für andere diagnostische Verfahren bei Hunden mit Lymphom zeigen konnten. Inwiefern außerdem das Auffinden bis dahin okkulter Lymphomzellinfiltration in bestimmten extranodalen Lokalisationen von klinischer Relevanz ist, unter Umständen sogar als unabhängiger prognostischer Marker, sollte ebenfalls in weiterführenden Studien ermittelt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Eignung von Feinnadelaspiraten von Leber und Milz kaniner Patienten für durchflusszytometrische Untersuchungen nachgewiesen.

Unter Berücksichtigung der vorgenannten Limitationen erscheint die Diagnose einer Lymphomzellinfiltration in extranodalen Lokalisationen, basierend auf durchflusszytometrisch gewonnenen Daten über das Verhältnis der Lymphozytensubpopulationen zueinander, möglich. Dabei stellt die definitive durchflusszytometrische Identifikation von caninen Lymphomzellen noch immer eine Herausforderung dar. Dies sind ermutigende Ergebnisse, die weiterführende Studien auf diesem Gebiet unterstützen.

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IV. Zusammenfassung (deutsch)

Alexa Elena Jötzke (2011):

Untersuchung der High-Mobility-Group A (HMGA) Genexpression und Durchflusszytometrie beim Lymphom des Hundes

Das Lymphom ist eine der häufigsten Tumorerkrankungen des Hundes und zeigt außerdem viele Gemeinsamkeiten mit dem humanen Non-Hodgkin-Lymphom. Daher ist die Erforschung von diagnostischen Verfahren, prognostischen Faktoren und potentiellen therapeutischen Angriffspunkten sowohl für die tiermedizinische als auch für die vergleichende onkologische Forschung von Bedeutung.

Die Überexpression von High-Mobility-Group A (HMGA) Genen wurde als prognostischer Marker bei verschiedenen humanen malignen Tumorerkrankungen gezeigt, während ihre Bedeutung bei kaninen hämatopoetischen Neoplasien bisher ungeklärt war. Ziel der ersten Studie war es daher, die Expression von HMGA1 und HMGA2 in Lymphknoten kaniner Lymphompatienten zu bestimmen. Hierfür wurde die Genexpression in Lymphknotenproben von 23 Hunden mit Lymphom und drei Kontrollhunden mittels relativer quantitativer real-time RT-PCR untersucht. Die relative HMGA1-Expression war in den Lymphomproben signifikant höher als in den Kontrollproben. Die Expression von HMGA2 zeigte hingegen keine signifikanten Unterschiede zwischen Lymphompatienten und Kontrolltieren. Unterschiede der HMGA-Expression im Hinblick auf Faktoren der Erkrankung konnten nur zwischen den verschiedenen Immunphänotypen festgestellt werden. Die relative HMGA1- Expression in den Lymphknoten von Hunden mit B-Zell-Lymphom war signifikant höher als bei denen mit T-Zell-Lymphom, während die Patienten mit T-Zell-Lymphom HMGA2 signifikant höher exprimierten als jene mit B-Zell-Lymphom.

Durchflusszytometrie ist ein Verfahren, das bei der Untersuchung von Lymphknoten, Blut und Knochenmark von Hunden mit hämatopoetischen Neoplasien etabliert ist.

Andere extranodale Lokalisationen wurden aber bei kaninen Lymphompatienten bisher nicht mit dieser Technik untersucht. Das Ziel der zweiten Studie war es zu untersuchen, ob die Ausbreitung der Erkrankung beim kaninen Lymphom mithilfe der Durchflusszytometrie bestimmt werden kann. Blut und Feinnadelaspirate von

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Lymphknoten, Leber, Milz und Knochenmark von 44 Hunden mit multizentrischem Lymphom und fünf gesunden Kontrollhunden wurden durchflusszytometrisch analysiert. In allen untersuchten Lokalisationen war das logarithmisch transformierte Verhältnis von T- zu B-Lymphozyten der B-Zell-Lymphompatienten signifikant niedriger als bei den T-Zell-Lymphompatienten und den Kontrollhunden. Siebzig Prozent der extranodalen Proben von Lymphompatienten wurden in der durchflusszytometrischen Untersuchung als positiv (lymphominfiltriert) bewertet.

Zwölf Proben (5%) wurden aufgrund zu geringer Zellularität ausgeschlossen.

Aufgrund der Ergebnisse der hier vorgelegten Arbeit kann eine Bedeutung der HMGA-Gene bei Hunden mit Lymphom angenommen werden, womit eine Basis für zukünftige Studien über den diagnostischen, prognostischen und therapeutischen Nutzen dieser Gene beim kaninen Lymphom und im Vergleich zum humanen Non- Hodgkin-Lymphom geschaffen wurde. Die durchflusszytometrischen Untersuchungen zeigen, dass mit dieser Technik trotz einiger Einschränkungen verschiedene Lokalisationen von kaninen Lymphompatienten analysiert werden können und deuten auf eine vielversprechende Rolle der Durchflusszytometrie in der weiterführenden Diagnostik dieser Patienten hin.

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V. Zusammenfassung (englisch)

Alexa Elena Jötzke (2011):

High Mobility Group A (HMGA) gene expression analysis and flow cytometry in dogs with lymphoma

Lymphoma is one of the most common neoplastic diseases in dogs and shares many similarities with human non-Hodgkin´s lymphoma. Therefore, investigating diagnostic procedures, prognostic markers, and potential therapeutic targets is of growing interest for veterinary medicine as well as for comparative oncology.

Overexpression of high mobility group A (HMGA) genes was described as a prognostic marker in different human malignancies, but its role in canine hematopoietic malignancies was unknown so far. Therefore, the objective of the first study was to analyze HMGA1 and HMGA2 gene expression in lymph nodes of canine lymphoma patients. The expression of HMGA1 and HMGA2 was analyzed in lymph node samples of 23 dogs with lymphoma and three control dogs using relative quantitative real-time RT-PCR. Relative quantity of HMGA1 was significantly higher in dogs with lymphoma compared with reference samples. HMGA2 expression did not differ between lymphoma and control dogs. With the exception of immunophenotype, comparison of disease parameters did not display any differences in HMGA1 and HMGA2 expression. When comparing B- and T-cell lymphoma samples the relative HMGA1-Expressionlevel was significantly higher in lymph nodes from dogs with B-cell lymphoma, whereas T-cell lymphoma samples showed significantly higher expression of HMGA2.

Flow cytometry has widely been performed on lymph nodes, blood, and bone marrow of dogs with hematopoietic neoplasia. In canine lymphoma patients, other extranodal sites have not yet been evaluated. Therefore, the objective of the second study was to evaluate whether the extent of disease in canine lymphoma can be determined via flow cytometry. Peripheral blood and fine needle aspirates from lymph node, liver, spleen, and bone marrow of 44 dogs with multicentric lymphoma and five healthy control dogs were examined flow cytometrically. In all tissues, the logarithmically transformed T-cell/B-cell-ratio of the B-cell lymphoma samples was significantly lower

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than that of T-cell lymphoma and control samples. Seventy percent of extranodal samples of lymphoma patients were judged positive for lymphoma involvement.

Twelve samples (5%) were excluded due to scant cellularity.

The findings of the present studies indicate a role of HMGA genes in canine lymphoma and therefore represent the basis for future veterinary and comparative studies dealing with their diagnostic, prognostic and therapeutic values. Since it was demonstrated, that flow cytometry is valuable for analyzing different sites of canine lymphoma patients, a promising role of flow cytometry in the future diagnostic work- up of canine lymphoma patients can be assumed.

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VII. Tabellarischer Anhang zu Kapitel II.2.

Tabelle 1: Epidemiologische Daten der Patienten mit multizentrischem Lymphom Pat.

Nr.

Kl.-Nr. Rasse Geschlecht Alter [Jahre]

KGW [kg]

Immun- phänotyp

WHO Stad.

WHO Sstad.

1 152945 Mischling männlich- kastriert

9 31 T 4 b

2 149659 Dackel weiblich 2 10 T 4 b

3 149075 Boxer männlich 2 32 T 4 b

4 154757 Mischling männlich 8 37 T 5 b

5 149603 Boxer männlich 6 38 T 5 b

6 145118 Hovawart männlich 10 33 T 5 b

7 88299 Mischling weiblich 7 21 T 5 b

6 40 T 4 b

9 150365 Hovawart weiblich- kastriert

7 30 T 4 b

10 117065 Cocker Spaniel

weiblich 16 15 B 5 b

8 18 B 4 b

12 150650 Boxer weiblich 6 28 B 5 a

13 151427 Bracco Italiano

weiblich 7 27 B 5 b

7 27 B 3 a

15 145637 Mischling weiblich- kastriert

8 10 B 5 a

(38)

Fortsetzung Tabelle 1

Pat.

Nr.

KGW [kg]

Immun- phänotyp

WHO Stad.

WHO Sstad.

11 33 B 4 a

17 145296 Rottweiler männlich 7 52 B 4 b

18 151357 Beagle männlich 10 25 B 5 b

19 117948 Labrador männlich 10 34 B 3 a

20 108262 Rottweiler männlich 5 48 B 5 a

21 150895 Berner Sennenhund

männlich 4 42 B 5 a

22 152151 Golden Retriever

männlich- kastriert

8 42 B 4 a

23 148282 Mischling männlich 5 33 B 5 a

24 154109 Malinois männlich 6 38 B 5 a

25 131968 kl. Münster- länder

weiblich- kastriert

12 21 B 4 a

26 147683 Berner Sennenhund

27 144985 Rottweiler weiblich- kastriert

6 38 B 5 b

28 144979 Rottweiler männlich 9 35 B 5 b

29 153615 Cocker Spaniel

weiblich- kastriert

9 21 B 4 a

30 144638 Jagdterrier weiblich 9 9 B 4 b

31 150736 Zwerg- schnauzer

männlich- kastriert

7 8 B 3 a

(39)

Fortsetzung Tabelle 1

Pat.

Nr.

KGW [kg]

Immun- phänotyp

WHO Stad.

WHO Sstad.

32 114611 Dackel männlich- kastriert

6 10 B 3 a

33 148332 Irish Terrier männlich 6 21 B 5 b

34 155148 Golden Retriever

männlich 11 38 B 5 b

35 155483 DSH weiblich- kastriert

7 28 B 5 b

36 65919 Rottweiler männlich 12 34 B 4 a

10 16 B 5 b

38 154837 Bullmastiff weiblich 11 38 B 5 a

39 150220 Mischling weiblich- kastriert

7 26 B 5 b

40 147977 Norwich Terrier

männlich 8 13 B 5 b

41 145973 Pitbull Terrier männlich- kastriert

10 31 B 5 a

42 151985 kl. Münster- länder

5 39 B 4 a

44 151778 Shetland Sheepdog

weiblich 8 13 B 4 a

(40)

Tabelle 2: Epidemiologische Daten der verwendeten Kontrollhunde

Hd. Nr. Rasse Geschlecht Alter [Jahre]

KGW [kg]

K1 Beagle weiblich-kastriert 7 16 K2 Beagle weiblich-kastriert 7 17 K3 Beagle männlich-kastriert 7 20 K4 Beagle männlich-kastriert 9 20 K5 Beagle männlich-kastriert 7 19

(41)

Tabelle 3a: Lymphknotenproben der Kontrollhunde. Dargestellt sind die Anzahl der in die Analyse einbezogenen mononukleären Leukozyten (mon. L.), die Anteile der CD3- und CD21-positiven Zellen an den mononukleären Leukozyten (% CD3+ bzw.

CD21+ Zellen), deren Quotient (CD3/CD21) und der aus diesem generierte dekadische Logarithmus (log(T/B)).

Hd. Nr. mon. L. % CD3+

Zellen

% CD21+

Zellen

CD3/CD21 log(T/B)

K1 9.449 71,24 23,19 3,07 0,49

K2 9.089 63,20 33,49 1,89 0,28

K3 9.330 78,15 18,38 4,25 0,63

K4 9.111 58,54 36,27 1,61 0,21

K5 9.557 77,46 17,77 4,36 0,64