4.6 R EAL - TIME RT- Q PCR
4.6.2 MDR1-Genexpression
4.6.2.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere
In allen unveränderten Leber- (n=14) und Lymphknotenproben (21 Proben von 15 Hunden) war mittels der etablierten RT-qPCR eine Expression des MDR1-Gens nachweisbar.
Im Lebergewebe (n=14) waren durchschnittlich 147 (Spannweite 69 bis 246) und im Lymphknotengewebe (15 Proben von 15 Hunden) 14 (Spannweite 5 bis 28) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie nachweisbar. Der Unterschied in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den beiden Geweben erwies sich im t-Test nach Student als hoch signifikant (p<0,001).
Zwischen den Klinikpatienten und den Beaglen unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression im Leber- und im Lymphknotengewebe dagegen nur unwesentlich (Leber:
p=0,956; Lymphknoten: p=0,22) (Abbildung 1).
Lymphknoten Leber
Gewebe 0
50 100 150 200
MDR1 Kopien pro HPRT Kopie
A B
A B
"Sonstige"
Beagle
Beagle "Sonstige"
Abbildung 1: MDR1-Genexpression (arithmetischer Mittelwert und Standardabweichung der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie) im unveränderten Lymphknoten- und Lebergewebe gesunder Beagle (Leber n=6; Lymphknoten n=9) und Hunde aus der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)
Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression im Lebergewebe und im Lymphknotengewebe bestand bei Hunden, bei denen Proben aus beiden Geweben untersucht wurden (n=10), nicht (Korrelationskoeffizient nach Pearson (R) =0,056 p=0,88).
MDR1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten 30 20
10 0
MDR1 Kopien pro HPRT Kopie / Leber
300
200
100
0
Abbildung 2: Korrelation der Höhe der MDR1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=0,056, p=0,88)
Zum Ausschluss einer relevanten Schwankung in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen Lymphknoten verschiedener Körperregionen wurde bei einem Beagle (Tier-Nr. K9) die Höhe der MDR1 Geneexpression in sieben verschiedenen Lymphknoten (ein Popliteal- sowie je zwei Zervikal-, Mandibular- und Darmlymphknoten) bestimmt. Die gemessene MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie in den sieben Biopsien schwankte zwischen 12 und 28 und variierte weniger als zwischen Biopsien aus den Popliteallymphknoten von 9 verschiedenen Beaglen (Spannweite 5 bis 28).
4.6.2.2 Maligne Lymphome
Bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden war bei Diagnosestellung eine Expression des MDR1-Gens im Tumorgewebe mittels der etablierten RT-q PCR nachweisbar.
Die Höhe der gemessenen MDR1-Genexpression variierte zwischen den Patienten und reichte von 0,1 bis 369 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie.
Die Mehrheit der untersuchten Lymphome wies bei Diagnosestellung eine relativ niedrige MDR1-Genexpression auf (Median 1,7 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie). Nur bei drei Lymphomen war die MDR1-Genexpression höher als im unveränderten Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (Abbildung 3). Bei zehn Hunden lag die Höhe der MDR1-Geneexpression innerhalb des im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen Wertebereiches. Bei den restlichen 37 Patienten war die MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere.
< Ln. = Ln. > Ln.
MDR1-Genexpression bei Diagnose 0
10 20 30
Anzahl an Patienten
n=37 n=10 n=3
Abbildung 3:MDR1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom
erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15)
Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen
Von den 50 untersuchten Patienten wiesen 44 ein multizentrisches und 6 ein gastrointestinales Lymphom auf. Bei den Patienten mit einem multizentrischen Lymphom waren durchschnittlich (Median) 1,4 (Spannweite 0,1 bis 369), bei den Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom durchschnittlich 11,4 (Spannweite 2,4 bis 50) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung nachweisbar (Abbildung 4). Im Mittelwertvergleich (U-Test nach Mann und Whitney) erwies sich der beobachtete Unterschied in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den beiden anatomischen Lymphomformen als signifikant (p=0,002).
multizentrisch gastrointestinal
MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie
R
Abbildung 4: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6).
(U-Test von Mann und Whitney: p=0,002)
Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen
Zwischen den Patienten mit einem multizentrischem T-Zell-Lymphom (n=8) und den Hunden mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=18) unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung dagegen nicht deutlich (U-Test von Mann und Whitney p=0,54).
Durchschnittlich (Median) waren bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Hunden im Tumorgewebe 2,8 (Spannweite 0,1 bis 132) und bei den an einem B-Zell-Lymphom erkrankten Patienten 1,2 (Spannweite 0,2 bis 10) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie nachweisbar (Abbildung 5).
B-Zell-Lymphom T-Zell-Lymphom
MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie
R
Abbildung 5: Vergleich der MDR1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,54)
Einfluss von Glukokortikoiden auf die MDR1-Genexpression
Ein Einfluss einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Höhe der MDR1-Geneexpression war anhand der vorliegenden Daten nicht nachweisbar (U-Test von Mann und Whitney p=0,52). Der Median der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie betrug bei den 11 vorbehandelten Hunden 2,6 (Spannweite 0,2 bis 132) und bei den 33 nicht vorbehandelten Hunden 1,3 (Spannweite 0,1 bis 369) (Abbildung 6).
ja nein
MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie
R
Abbildung 6: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=11), und von an malignem Lymphom erkrankten Hunden, bei denen keine
Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=33) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,521)
Einfluss der MDR1-Genexpression auf die Therapieantwort
Von 3 Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumorgewebe höher als im unveränderten Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (>Ln.), reagierte keiner auf die Chemotherapie mit einer Vollremission (CR). Bei einem Hund honnte eine Teilremission (PR), bei den anderen beiden Hunden kein Rückgang des Tumors (NC) erreicht werden. Im Vergleich dazu reagierten 27 von 29 Hunden, bei denen die MDR1-Genexpression gegenüber dem Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war (≤ Ln.), auf die Chemotherapie mit einer kompletten Remission (Abbildung 7).
Die Überprüfung des beobachteten Zusammenhangs zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression (> Ln. gegenüber ≤ Ln.) und der Therapieantwort (CR gegenüber PR oder NC) auf statistische Signifikanz ergab eine deutliche Assoziation zwischen dem Fortbestehen klinischer Anzeichen einer Tumorerkrankung (PR oder NC) und einer erhöhten MDR1-Genexpression im Tumorgewebe vor Therapiebeginn (Fishers exakter Test; p= 0.002)
MDR1 Genexpression vor Therapiebeginn
> Ln.
= Ln.
< Ln.
Anzahl an Patienten
30
20
10
0
NC PR
2 CR
4 23
Abbildung 7: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe an malignem Lymphom erkrankter Hunde vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und jeweilige Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NC: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission
Einfluss der MDR1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall
Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien wurden nur Hunde mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten RFIs in der Analyse berücksichtigt.
Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden wiesen 16 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unverändertem Lymphknotengewebe erniedrigte MDR1-Genexpression auf (Gruppe IIb). Bei den restlichen 3 Hunden entsprach die Höhe der MDR1-Genexpression den in den Lymphknoten der Kontrolltiere gemessenen Werten (Gruppe IIa). Die Spannweite des ersten RFI reichte in der Gruppe IIa von 30 bis 93 Tagen und in der Gruppe IIb von 126 bis 511 Tagen. Der Log-Rang-Test ergab einen p-Wert von 0,0001 (Abbildung 8).
RFI in Tagen
600 400
200 0
Kum. rezidivfreies Überleben
1,0
,8 ,6 ,4
,2 0,0
Abbildung 8: Dauer des ersten rezidivfreien Intervalls (RFI) der Hunde mit multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=19) als Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve. Gestrichelte Linie:
Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumor niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (Gruppe IIb, n=16). Durchgezogene Linie:
Hunde, bei denen die Höhe der MDR1-Genexpression im Tumor den in den Lymphknoten der Kontrolltiere gemessenen Werten entsprach (Gruppe IIa; n=3)
MDR1-Genexpresssion in Tumorrezidiven
Bei 12 Hunden konnte sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten Tumorrezidivs eine Gewebeprobe entnommen werden.
Ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv war bei 7 Hunden nachweisbar (Tabelle 22). Bei einem Hund wurde ein undeutlicher Anstieg (Faktor 1,8), bei 4 Patienten keine nennenswerte Änderung (Faktor 0,6 bis 1,1) der MDR1-Genexpression vermerkt.
Im Wilcoxon-Test erwies sich der Anstieg der MDR1-Genexpression zum Zeitpunkt des ersten Rezidivs als signifikant (p=0,032).
Tabelle 22: MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden (n=12) bei Diagnosestellung und bei Ausbildung des ersten Tumorrezidivs sowie der errechnete Anstiegsfaktor (1.Rezidiv/Diagnose)
MDR1 Kopien pro HPRT Kopie Tier-Nr.
Diagnose 1. Rezidiv Faktor
P07 0,4 0,3 0,8
P09 1,3 0,8 0,6
P11 1,7 3,6 2,1
P12 2,6 2,9 1,1
P22 1,8 1,7 0,9
P26 0,5 5,7 11,4
P28 4,6 8,1 1,8
P30 0,4 1,1 2,8
P32 1,5 7,3 4,9
P39 1,0 2,0 2,0
P42 0,3 0,6 2,0
P46 5,2 39,4 7,6
Beim Vergleich der Länge des ersten RFIs von Patienten mit und ohne Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv zeigten sich deutliche Unterschiede. Die mittlere Dauer des ersten RFI war bei den 8 Patienten, bei denen eine gesteigerte (≥ Faktor 1,8) MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv nachweisbar war, deutlich kürzer (Median 133 Tage, 95% Konfidenzintervall 90 bis 176 Tage) als bei den 4 Hunden ohne einem Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv (Median 312 Tage, 95% Konfidenzintervall 216 bis 408 Tage). Im Log-Rang-Test erwies sich der Unterschied als signifikant (p=0,012).
RFI in Tagen
600 400
200 0
Kum. rezidivfreies Überleben
1,0
,8 ,6
,4
,2 0,0
Abbildung 9: Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve des rezidivfreien Intervalls (RFI), getrennt für Hunde mit einem Anstieg (≥ Faktor 1,8) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (durchgezogene Linie) und für Hunde ohne einem deutlichen Anstieg (< Faktor 1,1) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (gestrichelte Linie)