3.7 M OLEKULARBIOLOGISCHE U NTERSUCHUNGEN
3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression
Die Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression erfolgte mittels real-time RT-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Als Housekeeping-Gen wurde Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT) verwendet.
3.7.5.1 Primer- und Sondendesign
Die Primer und Sonden für die RT-qPCR wurden mit Hilfe der Software ABI PRISM®
Primer Express (Fa. PE Applied Biosystems) ausgewählt (Tabelle 12).
Tabelle 12: Sequenzen und Schmelztemperaturen (Tm) der Primer und Sonden für die RT-qPCR
Abkürzungen und Fußnoten:
AP: Antisense-Primer FAM: 6-Carboxyfluorescein
SP: Sense-Primer TAMRA: 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin
* bei 100 mM Na+ MGB: Minor-groove-binder
Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Tm* MDR1 Sonde FAM-CCAGAAAAGGCCGGACTACCATTGTGA-TAMRA 77,1 °C
MDR1 SP CAGTGGTTCAGGTGGCCCCT 68,5 °C
MDR1 AP CGAACTGTAGACAAACGATGAGCT’ 67,0 °C
MRP1 Sonde FAM-AGAAAGAGGCTCCCTGGCAAATCCA– TAMRA 75,7 °C
MRP1 SP TGGAGAGGCTGAAGGAGTAT 61,5 °C
MRP1 AP CGTTGATGGTGATGTTGATGT 64,3 °C
MRP2 Sonde FAM-ATTCACGGCCTCATTT-MGB 56,8 °C
MRP2 SP AAGATGCCTCCTCAAATAATCCAT 66,3 °C
MRP2 AP TCATACCAACTAAACGTAATGCTACTCA 68,1 °C HPRT Sonde FAM-CTTGATTGGTTGAAGATCTCATTGACACAGGCA-TAMRA 76,9 °C HPRT SP GAGATGACCTCTCAACTTTAACTGAAAA 66,5 °C
HPRT AP GGGAAGCAAGGTTTGCATTG 69,9 °C
Die mRNA-Sequenzen wurden der Genbank entnommen (kanines HPRT: Genbank-Nr.
CFU16661; kanines MDR1: Genbank-Nr. AF045016; kanines MRP1: Genbank-Nr.
AF403241 und kanines MRP2: Genbank-Nr. CFA18220). Für die Messung der MDR-, MRP1- und HPRT-Genexpression wurden TaqMan®-Sonden, für den Nachweis von MRP2 Minor groove binder-Sonden eingesetzt. Als Reporterfarbstoff wurde 6-Carboxyfluorescein (FAM), als Quencherfarbstoff 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMRA) verwendet. Die Amplikonlänge betrug für den Nachweis von HPRT 89 bp, für MDR1 79 bp, für MRP1 174 bp und für MRP2 70 bp. Alle Sonden und Primer wurden über die Firma Applied Biosystems bezogen.
3.7.5.2 Herstellung der Standards für die qPCR
Die Herstellung der Standards für die qPCR erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion. Die erforderlichen Primer (Tabelle 13) wurden so konstruiert, dass die Sequenz des jeweiligen PCR-Produktes die Zielsequenz der jeweiligen qPCR einschloss. Die PCR-Produkte waren 123 bp (HPRT), 224 bp (MDR1), 369 bp (MRP1) und 616 bp (MRP2) lang.
Tabelle 13: Sequenzen und Schmelztemperatur (Tm) bei 100 mM Na+ der Primer (AP:
Antisense-Primer; SP: Sense-Primer) für die Herstellung der Standards für die RT-qPCR
Primer Sequenz (5’→ 3’) Tm*
Standard MDR1 SP CCACAATGACTCCATCATC 62,4 °C Standard MDR1 AP CAGAGAATCGCCATTGCT 59,4 °C
Standard MRP1 SP AGTGTGTGGGCAACTGCAT 67,2 °C Standard MRP1 AP CCACGATGCCCACCTTT 65,5 °C
Standard MRP2 SP CCTTGGGTTTCCTTTGGC 65,4 °C
Standard MRP2 AP AACTTGCTGACCAGTGCCTTG 67,7 °C Standard HPRT SP ATAAAAGTAATTGGTGGAGATG 57,8 °C
Standard HPRT AP ATTATACTGCGCGACCAAG 61,5 °C
Die PCR-Reaktion erfolgte für jeden Standard in zehnfachem Ansatz (inklusive Negativkontrollen). Als Template wurde aus Lebergewebe gesunder Hunde isolierte cDNA verwendet. In jedem Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen Templates und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase (Fa.
Promega) zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec bei 94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C, Elongation für 2 sec im ersten Zyklus zuzüglich 2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR wurde mit einer Elongation (10 min bei 72 °C) beendet.
200 µl des jeweiligen PCR-Produktes wurden mit 20 µl 3 M Natriumacetat (pH-Wert 7) und 550 µl Ethanol (>99,8 %, -20 °C) über Nacht bei -20 °C inkubiert. Anschließend wurde die Probe für 10 min bei 12.000 x g zentrifugiert und das Pellet in 35 µl autoklaviertem dest.
Wasser gelöst. Die elektrophoretische Auftrennung des PCR-Produkts erfolgte in einem 1%igen Agarosegel (Herstellung des Gels siehe Anhang Seite 129). Die gewünschte DNA-Bande wurde unter UV-Lichtexposition mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Etwa 100 g des ausgeschnittenen Gelstücks wurden mit 300 µl Buffer QG (QIAqick® Gel Extraction Kit) für 10 min bei 50 °C unter gelegentlichem Mischen in einem Wasserbad inkubiert. Die Probelösung wurde mit 100 µl Isopropanol (≥99,7%) vermengt, in eine Glasmilchsäule (QIAquick® Gel Extraction Kit) überführt und für 1 min bei 10.000 x g in einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule je einmal mit 500 µl Buffer QB und 750 µl Buffer PE (QIAqick Gel Extraction Kit®) für 1 min bei 10.000 x g gewaschen. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule für 1 min bei 10.000 x g getrocknet. Die Säule wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Zur Elution der DNA wurden 50 µl autoklaviertes dest. Wasser auf die Säulenmembran pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert.
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie. Aus der DNA-Konzentration wurde die Anzahl an PCR-Produkten errechnet (Formel siehe Anhang Seite 129). Für jedes Gen wurden Standardverdünnungsreihen um den Faktor 10 mit einer Kopienzahl von100 bis 108 Kopien pro µl erstellt. Die internen Standards wurden aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
3.7.5.3 Durchführung der RT-qPCR
Die real-time RT-qPCR wurde mittels Mx4000™ Multiplex Quantitative PCR System der Fa.
Stratagene durchgeführt. Zusätzlich zur Expression des jeweiligen Gens wurde in jedem Lauf die Expression des Housekeeping-Gens HPRT in den Proben gemessen.
In jedem PCR-Lauf wurden Standardverdünnungsreihen für das jeweilige Gen und für HPRT (MDR1, MRP1 und HPRT: 103 bis 108 Kopien; MRP2: 101 bis 106) mitgeführt. Die Proben und die Negativkontrollen wurden in jedem Lauf in Dreifach-Ansätzen, die Standardverdünnungen in Zweifach-Ansätzen gemessen. Alle Messungen wurden einmal wiederholt.
Als Reaktionsgefäß wurden MicroAmp Optical 96-well plates (Fa. Stratagene) verwendet, die mit MicroAmp Optical caps (Fa. Stratagene) verschlossen wurden.
Die Komponenten für den Reaktionsansatz wurden einem entsprechenden Kit (Brilliant™
Quantitative PCR Core Reagent Kit, Fa. Stratagene) entnommen. In einem PCR-Reaktionsvolumen von 25 µl waren 80 µM dNTP mix, 5 mM MgCl2, 300 nM der jeweiligen Primer, 100 nM der jeweiligen Sonde, 75 nM 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) als Referenzfarbstoff und 0,025 units / µl SureStart™ Taq DNA Polymerase in 1x PCR-Puffer enthalten.
An eine initiale Denaturation über 10 min bei 95 °C schlossen sich 40 PCR-Zyklen mit 15 sec bei 95 °C (Denaturation) und 1 min bei 61 °C (MDR1) bzw. 60 °C (MRP2) oder 59 °C (MRP1) an (Anlagerung und Verlängerung).
3.7.5.4 Auswertung der RT-qPCR
Die Auswertung erfolgte für jeden PCR-Lauf separat unter Verwendung der dem Gerät zugehörigen Software.
Zunächst wurde aus den in den ersten PCR-Läufen erhobenen Messdaten für jeden Ansatz eine Grundlinie (baseline) bestimmt. Die Festlegung der Spannweite der PCR-Zyklen für die Erstellung der baseline erfolgte Software-gesteuert (Software-Einstellung: adaptive baseline).
Durch Subtraktion des Wertes der Gradenfunktion der baseline von den in den Ansätzen in den PCR-Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten wurden die baseline korrigierte Fluoreszenz (dR) und hinterher als Quotient der dR von Reporterfarbstoff und Referenzfarbstoff (ROX) das sogenannte normalisierte baseline-korrigierte Reportersignal (dRn) berechnet.
Anschließend wurde anhand der in fünf der ersten zehn PCR-Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten (Hintergrundfluoreszenz) der sogenannte Grenzwert (Threshold) bestimmt und für jeden Ansatz der Threshold Cycle (Ct-Wert), d.h. der PCR-Zyklus, bei dem die dRn den Grenzwert erstmals übersteigt, ermittelt.
Zur Bestimmung der Ausgangskopienzahl in den Proben wurde mittels der Software eine Standardkurve erstellt. Die Ct-Werte der jeweiligen Standardverdünnungen wurden gegen die logarithmierte Kopienzahl aufgetragen und die Standardkurve algorithmisch generiert. Aus der Gradengleichung wurden die Effizienz der Amplifikation und die Ausgangskopienzahl in den Proben durch Interpolation bestimmt.
Aus den in der gleichen Probe (dreifacher Ansatz) im selben Lauf ermittelten Ct-Werten bzw.
cDNA Kopienzahlen wurden der arithmetischer Mittelwert (MW) und die Standardabweichung (SD) berechnet. Die mittlere Kopienzahlen des jeweiligen Gens wurden durch die im selben Lauf in der gleichen Probe ermittelten Kopienzahlen des Housekeeping-Gens (HPRT) geteilt. Zuletzt wurde aus den in zwei separaten Läufen ermittelten normalisierten Kopienzahlen für MDR1, MRP1 bzw.MRP2 der MW und die SD berechnet.