Neben der Überexpression von P-Glykoprotein und Mitgliedern der MRP-Familie sind weitere zelluläre Mechanismen beschrieben worden, die in vitro eine Zytostatikaresistenz vermitteln können (TEW 1994; NITISS u. BECK 1996; LIST 1997 (Tabelle 4). Die Bedeutung dieser Mechanismen für die Ausprägung von Zytostatikaresistenzen beim Hund ist weitestgehend unbekannt.
Tabelle 4: Mechanismen, die zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen können (modifiziert nach DALTON 1997 und LIST 1997)
Membrantransportmechanismen P-Glykoprotein
multidrug resistance-associated proteins (MRPs) lung-resistance protein (LRP)
protein transporter of antigenic peptides (TAP) DNA-Reparaturmechanismen
Hemmung der Apoptose P53
BCL-2 Survivin
Alteration der Topoisomerasen Topoisomerase I
Topoisomerase II
Metabolische Zytostatika-Detoxifikation Glutathion-S-Transferase-System
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Tiere
An malignem Lymphom erkrankte Hunde
In die Studie wurden 50 an malignem Lymphom erkrankte Hunde (Tier-Nr. P1 bis P50) aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover aufgenommen. 11 Hunden war im Vorfeld der Studie durch den Haustierarzt eine Behandlung mit Glukokortikoiden erfolgt (Tabelle 5). Keiner der Patienten hatte vor Aufnahme in die Studie Zytostatika erhalten.
Tabelle 5: Mit Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde. Tier-Nr., verabreichter Wirkstoff, Dosis und Behandlungsdauer
Tier-Nr. Wirkstoff Dosis Dauer
P04 Prednisolon unbekannt 2 Tage P07 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW jeden
2. Tag per os unbekannt P10 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW
einmal tägl. per os 4 Tage P16 unbekannt alle drei Tage
parenteral 20 Tage
P27 Dexamethason unbekannt unbekannt P28 Prednisolon unbekannt 7 Tage P29 Prednisolon unbekannt >7 Tage P34 Prednisolon unbekannt 21 Tage P41 Prednisolon 0,05 mg/kg KGW
einmal tägl. per os unbekannt
P44 unbekannt unbekannt unbekannt P48 Prednisolon unbekannt 8 Tage
Kontrolltiere
Als Kontrolltiere standen 9 etwa ein Jahr alte, gesunde Beagle aus dem Institut für Parasitologie (Tier-Nr. K1 bis K9) sowie 10 zwischen 3 Monate und 9 Jahre alte an verschiedenen Krankheiten leidende Hunde aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere (Tier-Nr. K10 bis K19) zur Verfügung. (Tabelle 6). Keiner der Kontrolltiere wies klinische oder anatomisch-pathologische Anzeichen einer Veränderung der Leber bzw. der Lymphknoten auf. Alle Kontrolltiere wurden vor Aufnahme in die Studie aus einem nicht mit der Studie im Zusammenhang stehenden Grund mit Pentobarbital euthanasiert.
Tabelle 6: Kontrolltiere aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere. Tier-Nr., Rasse, Alter, diagnostizierte Erkrankungen und verabreichte Medikamente
Tier-Nr. Rasse Alter Diagnosen Medikamente K10 Neufundländer 4 Jahre Kardiomyopathie -
K11 Boxer 5 Monate Beckenfraktur Antibiotika K12 Dt. Kurzhaar 8 Jahre Nasentumor Antibiotika
K13 Border Collie 9 Jahre Ösophagusdilatation Antibiotika K14 Dt. Schäferhund 4 Jahre Darmdrehung Infusion K15 Rauhaardackel 9 Jahre Mammatumor -
K16 Malteser 6 Jahre Perianalhernie Antibiotika, Caprofen K17 Berner Sennenhund 4 Jahre Niereninsuffizienz Infusion, Furosemid
K18 Dt. Schäferhund 9 Jahre Analfissur -
K19 Bordeuxdogge 3 Monate Darminvagination Infusion
3.2 Diagnose und klinische Stadieneinteilung
Die Diagnose des malignen Lymphoms erfolgte bei 28 der Patienten zytologisch und bei 22 Hunden histopathologisch. Anhand der Befunde der röntgenologischen Untersuchung des Thorax und Abdomens, Blutbildbestimmung, klinisch-chemischer Blutuntersuchung, sonographischer Untersuchung des Abdomens und Knochenmarkuntersuchung wurden die anatomische Form und der Ausbreitungsgrad der Erkrankung bestimmt.
Bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom wurde das klinische Erkrankungsstadium entsprechend der TNM-Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) (OWEN, 1980) (Tabelle 7) beurteilt. Zusätzlich wurde bei allen Patienten das klinische Substadium bestimmt. Dabei wurden Patienten mit einer Hyperkalzämie, Fieber, Hyphema, Uveitis, gastrointestinalen und / oder respiratorischen Symptomen in Anlehnung an die Studie von Moore und Koautoren (MOORE et al. 2001) dem klinischen Substadium b zugeordnet.
Tabelle 7: Klinische Stadieneinteilung beim malignen Lymphom des Hundes nach WHO (OWEN, 1980)
Stadium Definition
I Befall nur eines Lymphknotens oder Organs (mit Ausnahme des Knochenmarks)
II Befall zahlreicher Lymphknoten einer Körperregion (± Tonsillen)
III generalisierter Lymphknotenbefall IV Befall von Milz und/oder Leber (± Stadium III)
V Befall von Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Organsystemen (± Stadium I-IV)
Substadium a ohne Allgemeinsymptome Substadium b mit Allgemeinsymptomen
3.3 Chemotherapie
Eine Chemotherapie erfolgte bei 25 der an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Initial wurde bei allen Patienten eine Kurzzeit-Kombinationtherapie (Tabelle 8) durchgeführt. Von den Hunden, die im Verlauf der Studie ein Tumorrezidiv entwickelten, wurden 7 erneut chemotherapeutisch behandelt. 3 Patienten erhielten eine Kurzzeit-, 3 eine Langzeit-Kombinationschemotherapie (Tabelle 9, Seite 31) und ein Hund Cytarabin und Carboplatin.
Tabelle 8: Kurzzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)
ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v.
L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c.
CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v.
Pred: Prednisolon; 50 mg/m² KOF, einmal täglich per os über drei Tage VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v.
1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg/kg KGW i.v.
2 in Kombination mit Mesna (40% der Cyclophosphamid-Einzeldosis; 0, 4 und 8 h nach Gabe von Cyclophosphamid, einmalig per os)
3 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.
Tabelle 9: Langzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)
Woche L-Asp1 VCR CTX ADM1, 2 MTX Pred Induktion
1 X X X
2 X X
3 X X
4 X
5 X
6 X
Erhaltung: Zyklus 1
8 X
10 X
12 X
14 X
Zyklus 2: Zyklus 1 bis Woche 52 wiederholen
Zyklus 3: Zyklus 1 im 3-Wochen-Abstand bis Woche 104 wiederholen Zyklus 4: Zyklus 1 im 4-Wochen-Abstand bis Woche 130 wiederholen ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v.
L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c.
CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v.
Pred: Prednisolon; Woche 1: 30 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 2: 20 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 3: 10 mg/m² KOF, einmal täglich per os VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v.
MTX Methotrexat: 0,7 mg/kg KGW i.v., maximale Gesamtdosis 25 mg
1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg / kg KGW i.v.
2 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer
Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 mg/m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.
3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges
Therapieantwort
Die Therapieantwort wurde als komplette Remission (CR), partielle Remission (PR) oder keine Remission (stationäres Tumorverhalten oder Progression) beurteilt (Tabelle 10). Zur Bewertung der Therapieantwort wurde bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom eine Palpation der oberflächlichen Körperlymphknoten, bei Patienten mit einem gastrointestinalen Lymphom zusätzlich eine sonographische Untersuchung des Abdomens durchgeführt.
Tabelle 10: Schema und Kriterien zur Beurteilung der Therapieantwort (modifiziert nach WILMANNS 2001)
Therapieantwort Definition
Komplette Remission (CR) Vollständiger Rückgang aller Tumorzeichen. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.
Partielle Remission (PR)
Rückgang aller Tumorparameter um mindestens 50%
der initialen Größe. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.
Stationäres Tumorverhalten Tumorrückgang um weniger als 50 % oder Zunahme um weniger als 25 %. Keine neuen
Tumormanifestationen.
Progression Tumorzunahme um über 25 % oder Auftreten neuer Tumormanifestationen.
Rezidivfreies Intervall (RFI)
Bei Patienten mit einer kompletten oder partiellen Remission wurde das rezidivfreie Intervall (RFI) als Zeitspanne zwischen dem Tag der ersten chemotherapeutischen Behandlung und der Diagnose eines Tumorrezidivs bestimmt.
3.4 Entnahme und Lagerung der Proben
Die Entnahme der Proben für die Untersuchung der Genexpression erfolgte unter sterilen Kautelen mittels Feinnadelaspiration oder mittels Inzisionsbiopsie unter Allgemeinanästhesie (Tier-Nr. P19 und P20) bzw. nach Euthanasie mit Pentobarbital (Tier-Nr. K1 bis K20, P02 bis P06, P21 und P25). Bei den Kontrolltieren und den Lymphompatienten P02 bis P06, P21 und P25 wurden die Gewebeproben innerhalb von 20 min nach Eintritt des Todes im Rahmen einer Sektion entnommen. Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme in 1,5 ml Kryoröhrchen überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren Bearbeitung bei -80 °C gelagert.
Für die Immunphänotypisierung der Lymphome wurden Feinnadelaspirate entnommen, umgehend in 1 ml RPMI suspendiert und bei Raumtemperatur gelagert.
Die Entnahme der Proben für die histologische und immunhistologische Untersuchung erfolgte mittels Tru-cut-Biopsie bzw. Inzisionsbiopsie im Rahmen der initialen Diagnostik.
Die Proben wurden in 10 %igem, neutral gepuffertem Formalin (Rezeptur siehe Anhang S.
128) fixiert. Die Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Paraffineinbettung erfolgte automatisiert. Die Paraffinblöcke wurden bis zur weiteren Bearbeitung bei Raumtemperatur gelagert.
3.5 Immunphänotypisierung
Zur Immunphänotypisierung der Lymphome wurden hundespezifische Antikörper gegen verschiedene T-Lymphozytenantigene (CD3, CD4, CD5, CD8) sowie hundespezifische B-Lymphozytenmarker (anti B-cells, anti IgM) verwendet. Die Tumorzellen wurden in drei verschiedenen Ansätzen (zwei Doppel-, eine Dreifachfärbung) gefärbt (Tabelle 11).
Pro Färbeansatz wurden 100 µl der Probensuspension (5 bis 10 x 105 Zellen) mit jeweils 5 µl der unverdünnten Primärantikörper für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in einem Plastikzentrifugenglas inkubiert. Die Proben wurden mit 1 ml Cellwash® (Fa. Becton Dickinson) für 5 min bei 300 x g gewaschen. Der Ansatz der Dreifachfärbung wurde anschließend mit 5 µl des unverdünnten Sekundärantikörpers (PerCP-konjugiertes anti Maus IgG1) für 15 min im Dunklen inkubiert. Etwaige Erythrozyten wurden mittels einfachkonzentrierter FACS Lysing Solution® (Fa. Becton Dickenson) für 10 min lysiert.
Die Proben wurden für 5 min bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen einmal mit 1 ml Cellwash® gewaschen. Die Zellen wurden in 250 µl 1x CellFix™ (Fa.
Becton Dickinson) fixiert. Pro Ansatz wurden mindestens 5.000 Zellen analysiert (FACSCalibur®, Fa. Becton Dickinson).
Die Messdaten wurden mit Hilfe der Software Cellquest® (Fa. Becton Dickinson) ausgewertet. Zunächst wurden die Zellen anhand der gemessenen Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtintensitäten als Punkthistogramm (Streulichtdiagramm) dargestellt.
Anschließend wurde ein Auswertungsfenster (engl. gate) um die Zellen gelegt (Ausschluss von Zelltrümmern). Anhand der mitgeführten Negativkontrolle (Ansatz 1) wurde die Autofluoreszenz bzw. die durch unspezifische Bindung verursachte Fluoreszenz der Zellen bestimmt. Bei der Auswertung der nachfolgenden Färbungen (Ansatz 2 bis 4) wurden alle Zellen mit einer höheren Fluoreszenzintensität als der in der Negativkontrolle gemessenen Intensität (Ansatz 1) als positiv bewertet. Lymphome, bei denen über 80 % der Zellen mit Antikörpern gegen caCD3, caCD4, caCD8 und /oder caCD5 reagierten, wurden der T-Zell-Linie zugeordnet. Als B-Zell-Lymphome wurden Tumoren klassifiziert, bei denen über 80 % der Zellen mit Antikörpern gegen kanine B-Zellen und / oder IgM reagierten.
Tabelle 11: Durchgeführte Färbungen zur Immunphänotypiesierung der Lymphome Ansatz Antikörperspezifität Fluorochrom
1 Maus IgG1 PerCP
caCD45 PE
2 caIgM FITC
caCD4 FITC caCD8 PE 3
caCD3 PerCP caCD5 FITC 4 caB cells PE
Abkürzungen:
ca: kanine PE: Phycoerythrin
CD: cluster of differentiation PerCP: Peridin-Clorophyll-a-Proteinkomplex FITC: Fluoreszeinisothyocyanat
3.6 Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein
Probenaufbereitung
Das Schneiden der in Paraffin eingebetteten Gewebeproben erfolgte mit einem Schlittenmikrotom (Mikrotom HM400, Fa. Microm) bei einer eingestellten Schnittdicke von 2 µm. Die Paraffinschnitte wurden in 40 °C warmem, destilliertem Wasser gestreckt (Paraffin Streckbad TFB45, Fa. Medite Medizintechnik), auf Objektträger (Superfrost® Plus, Fa.
Menzel-Gläser) aufgezogen und für 60 min bei 65 °C im Trockenschrank getrocknet.
Immunhistochemische Färbung
Die getrockneten Schnitte wurden dreimal für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) entparaffiniert, in einer absteigenden Alkoholreihe (5 min in 100%igem Isopropanol, je 2 bis 3 min in 96%igem Ethanol und 70%igem Ethanol) rehydriert und in 0,05 molarer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Herstellung und Zusammensetzung siehe Anhang, Seite 128) dreimal für 5 min gewaschen.
Zur Antigendemaskierung wurden die Schnitte 10 min in Citratpuffer (0,01 molar, pH-Wert 6,0) bei 600 Watt in einem Mikrowellenherd gekocht. Nach einer Abkühlungszeit von 15 min bei Raumtemperatur wurden die Schnitte dreimal in PBS für 5 min gewaschen. Zur Hemmung der endogenen Peroxidase wurden die Schnitte für 30 min in 1,5%igem Wasserstoffperoxid in Methanol (≤99,8%) inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte dreimal für 5 min in PBS gewaschen, in Coverplates (Fa. Shandon) überführt und für 20 min bei Raumtemperatur mit 1:5 mit PBS verdünntem Ziegennormalserum überschichtet.
Die Inkubation der Schnittpräparate mit dem Primärantikörper erfolgte über Nacht (12 - 18 h) bei 4 °C. Als Primärantikörper zum Nachweis von P-Glykoprotein wurde ein monoklonaler Antikörper gegen menschliches P-Glykoprotein (Klon C219) verwendet. Seine Anwendung zum P-Glykoproteinnachweis beim Hund wurde erstmals von GINN 1996 beschrieben. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 eingesetzt. Als Verdünnungsmedium wurde PBS plus 0,05 % Tween-20 plus 1 % bovines Serumalbumin (BSA) verwendet. Am nächsten Tag wurden die Schnittpräparate dreimal für 5 min in PBS plus 0,05 % Tween-20 gewaschen
und mit dem biotinylierten Sekundärantikörper (Ziege anti Maus IgG, Fa. Vektor Laboratories; 1:200 mit PBS verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Schnitte erneut dreimal für 5 min in PBS gewaschen.
Die Ansetzung des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes (Fa. Vector Laboratories) erfolgte nach Herstellerangaben (siehe Anhang, Seite 128). Die Schnitte wurden 30 min bei Raumtemperatur mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex inkubiert, dreimal für 5 min in PBS gewaschen und in Küvetten überführt.
Als Chromogen wurde 3,3 Diaminobenzidin (DAB) verwendet. Die Schnitte wurden in 0,05%iger Diaminobenzidin-Lösung mit Wasserstoffperoxid als Katalysator (Rezeptur siehe Anhang, Seite 128) für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und mindestens 20 min unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte anschließend 5 min in Hämalaun nach MEYER (Rezeptur siehe Anhang, Seite 128) eingestellt und 10 min unter fließendem Leitungswasser gebläut. Zuletzt wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%iges Ethanol, 96%iges Ethanol, 100%iges Isopropanol) dehydriert, dreimal für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) eingestellt und mit Roti® Histokitt (Fa. Roth) eingedeckt.
Kontrollen
Als positive Gewebekontrolle wurde in jeder Serie unverändertes Lebergewebe mitgeführt.
Zur Überprüfung unspezifischer Reaktionen wurde der Primärantikörper durch eine negative Reagenzienkontrolle (Maus IgG2a) ersetzt.
Lichtmikroskopische Beurteilung
Die Auswertung der immunhistochemischen Reaktionsergebnisse erfolgte mit einem Standard-Binokular-Lichtmikroskop bei 100-, 200- und 400-facher Vergrößerung.
3.7 Molekularbiologische Untersuchungen 3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA
Inzisionsbiopsien
Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Inzisionsbiopsien wurde das Verfahren der Phenol-Chloroform-Extraktion verwendet. Etwa 100 mg der Gewebeprobe wurden in einem Porzellantiegel in flüssigem Stickstoff mit einem Pistill zerrieben und in 2 ml TRIzol®
Reagent (Fa. Invitrogen) suspendiert. Zum Scheren der DNA wurde die Gewebesuspension zehnmal durch eine 18’Einmalkanüle in eine Einmalspritze aufgezogen. 1 ml des Homogenisates wurde mit 0,2 ml Chloroform (99%) in einem 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt, für 3 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde unter Vermeidung der Interphase in ein neues 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml Isopropanol (≥99,7%) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde in 75%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 µl DEPC behandeltem destilliertem Wasser (siehe Anhang S. 129) für 2 min im Wasserbad bei 70 °C gelöst. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bei -80 °C gelagert.
Feinnadelaspirate (FNA)
Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Feinnadelaspiraten wurde ein von der Firma Qiagen entwickelter Kit (RNeasy® Mini Kit) verwendet. Die FNA wurden in 600 µl Buffer RLT (RNeasy® Mini Kit) suspendiert. Die Probensuspension wurde auf eine QIAshredder™-Spinsäule pipettiert und für 3 min bei 10.000 x g in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das Lysat wurde mit 600 µl 70%igem Ethanol in einem 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt. 700 µl der Probe wurden auf eine Rneasy®-Spinsäule (RNeasy® Mini Kit) pipettiert und bei 10.000 x g 15 sec bei Raumtemperatur in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das Lysat wurde verworfen und der Vorgang mit dem restlichen Probenvolumen wiederholt.
Die Säule wurde in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und nacheinander mit 700 µl RW1 Puffer (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec, mit 500 µl RPE Puffer (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec und mit 500 µl RPE Puffer für 2 min bei 10.000 x g gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde das Mikrozentrifugenröhrchen gewechselt. Anschließend wurde die Säule für 1 min bei 10.000 x g getrocknet. Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC behandeltes destilliertes Wasser auf die Säule pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Das Eluat wurde in ein 0,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
Bestimmung der Konzentration an Gesamt-RNA
Die Bestimmung der Gesamt-RNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie (siehe Anhang, Seite 129).
3.7.2 DNase-Behandlung
20 µg Gesamt-RNA wurden mit 10 Units DNase (RQ1 RNase-Free DNase®, Fa. Promega) und 10 µl RQ1 DNase 10 x Reaction Buffer (Bestandteil des RQ1 RNase-Free DNase®-Kits) in einem Reaktionsvolumen von 100 µl für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl RQ1 DNase Stop Solution (Bestandteil des RQ1 RNase-Free DNase®-Kits) beendet und die DNase durch Inkubation der Proben für 10 min bei 65 °C inaktiviert.
3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA
Die Reinigung der Gesamt-RNA erfolgte mittels RNeasy® Mini Kit (Fa. Qiagen). 100 µl der RNA-Lösung wurden mit 350 µl Buffer RLT (RNeasy® Mini Kit) und 250 µl 96%igem Ethanol vermischt, in eine RNeasy®-Spinsäule überführt und bei 10.000 x g für 15 sec in einem 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Die Säule wurde mit je 500 µl Buffer RPE (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec bzw. 2 min bei 10.000 x g gewaschen und anschließend für 1 min bei 10.000 x g getrocknet.
Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC behandeltes destilliertes Wasser auf die Säulenmembran pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Das Eluat wurde in ein 0,5 ml-Mikroreaktionsgefäß überführt und umgehend in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Die Gesamt-RNA-Konzentration (siehe Anhang, Seite 129) wurde über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrometrie bestimmt. Die Lagerung der isolierten GesamtRNA erfolgte bei -80 °C.
3.7.4 Reverse Transkription (RT)
Die gereinigte Gesamt-RNA wurde in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Als Reverse Transkriptase wurde bis November 2001 Superscript II™ Reverse Transcriptase (Fa. Invitrogen) und anschließend Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa. Qiagen) verwendet.
Sofern ausreichende Mengen Gesamt-RNA nach der Isolierung vorlagen, wurden pro 20 µl-Reaktionsvolumen 1 µg Gesamt-RNA umgeschrieben. Bei sechs Feinnadelaspiraten lagen die isolierten Gesamt-RNA-Mengen unter 0,1 µg/µl bzw. 0,05 µg/µl. Bei diesen Proben wurden 0,5 µg (Tier-Nr. P18, P24, P41 bei Diagnose) bzw. 0,4 µg Gesamt-RNA (Tier-Nr.
P08, P13, P14 bei Diagnose und P09 beim 1. Rezidiv) als Template für die RT eingesetzt.
Für die RT mittels Superscript II Reverse Transcriptase® wurde 1 µg Gesamt-RNA mit destilliertem Wasser auf 11 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml) für 10 min bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß wurde auf Eis gestellt, 4 µl 5x First Strand Buffer, 2 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl) und 1 µl 10 mM dNTP zugegeben und für 2 min bei 42 °C inkubiert. Nach der Zugabe von 1 µl Superscript II™ Reverse Transcriptase erfolgte eine weitere Inkubation für 50 min bei 42 °C. Anschließend wurde die Reverse Transkriptase für 15 min bei 70 °C inaktiviert.
Für die RT mittels Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa.Qiagen) wurde 1 µg Gesamt-RNA mit destilliertem Wasser auf 13 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml), 2 µl 10x First Strand Buffer, 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl), 2 µl 5 dNTP und 1 µl Omniscript™ Reverse Transkriptase für 10 min bei 25 °C und anschließend für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reverse Transkriptase wurde für 5 min bei 93 °C inaktiviert. Die cDNA wurde bei -20 °C gelagert.
3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression
Die Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression erfolgte mittels real-time RT-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Als Housekeeping-Gen wurde Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT) verwendet.
3.7.5.1 Primer- und Sondendesign
Die Primer und Sonden für die RT-qPCR wurden mit Hilfe der Software ABI PRISM®
Primer Express (Fa. PE Applied Biosystems) ausgewählt (Tabelle 12).
Tabelle 12: Sequenzen und Schmelztemperaturen (Tm) der Primer und Sonden für die RT-qPCR
Abkürzungen und Fußnoten:
AP: Antisense-Primer FAM: 6-Carboxyfluorescein
SP: Sense-Primer TAMRA: 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin
* bei 100 mM Na+ MGB: Minor-groove-binder
Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Tm* MDR1 Sonde FAM-CCAGAAAAGGCCGGACTACCATTGTGA-TAMRA 77,1 °C
MDR1 SP CAGTGGTTCAGGTGGCCCCT 68,5 °C
MDR1 AP CGAACTGTAGACAAACGATGAGCT’ 67,0 °C
MRP1 Sonde FAM-AGAAAGAGGCTCCCTGGCAAATCCA– TAMRA 75,7 °C
MRP1 SP TGGAGAGGCTGAAGGAGTAT 61,5 °C
MRP1 AP CGTTGATGGTGATGTTGATGT 64,3 °C
MRP2 Sonde FAM-ATTCACGGCCTCATTT-MGB 56,8 °C
MRP2 SP AAGATGCCTCCTCAAATAATCCAT 66,3 °C
MRP2 AP TCATACCAACTAAACGTAATGCTACTCA 68,1 °C HPRT Sonde FAM-CTTGATTGGTTGAAGATCTCATTGACACAGGCA-TAMRA 76,9 °C HPRT SP GAGATGACCTCTCAACTTTAACTGAAAA 66,5 °C
HPRT AP GGGAAGCAAGGTTTGCATTG 69,9 °C
Die mRNA-Sequenzen wurden der Genbank entnommen (kanines HPRT: Genbank-Nr.
CFU16661; kanines MDR1: Genbank-Nr. AF045016; kanines MRP1: Genbank-Nr.
AF403241 und kanines MRP2: Genbank-Nr. CFA18220). Für die Messung der MDR-, MRP1- und HPRT-Genexpression wurden TaqMan®-Sonden, für den Nachweis von MRP2 Minor groove binder-Sonden eingesetzt. Als Reporterfarbstoff wurde 6-Carboxyfluorescein (FAM), als Quencherfarbstoff 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMRA) verwendet. Die Amplikonlänge betrug für den Nachweis von HPRT 89 bp, für MDR1 79 bp, für MRP1 174 bp und für MRP2 70 bp. Alle Sonden und Primer wurden über die Firma Applied Biosystems bezogen.
3.7.5.2 Herstellung der Standards für die qPCR
Die Herstellung der Standards für die qPCR erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion. Die erforderlichen Primer (Tabelle 13) wurden so konstruiert, dass die Sequenz des jeweiligen PCR-Produktes die Zielsequenz der jeweiligen qPCR einschloss. Die PCR-Produkte waren 123 bp (HPRT), 224 bp (MDR1), 369 bp (MRP1) und 616 bp (MRP2) lang.
Tabelle 13: Sequenzen und Schmelztemperatur (Tm) bei 100 mM Na+ der Primer (AP:
Antisense-Primer; SP: Sense-Primer) für die Herstellung der Standards für die RT-qPCR
Primer Sequenz (5’→ 3’) Tm*
Standard MDR1 SP CCACAATGACTCCATCATC 62,4 °C Standard MDR1 AP CAGAGAATCGCCATTGCT 59,4 °C
Standard MRP1 SP AGTGTGTGGGCAACTGCAT 67,2 °C Standard MRP1 AP CCACGATGCCCACCTTT 65,5 °C
Standard MRP2 SP CCTTGGGTTTCCTTTGGC 65,4 °C
Standard MRP2 AP AACTTGCTGACCAGTGCCTTG 67,7 °C Standard HPRT SP ATAAAAGTAATTGGTGGAGATG 57,8 °C
Standard HPRT AP ATTATACTGCGCGACCAAG 61,5 °C
Die PCR-Reaktion erfolgte für jeden Standard in zehnfachem Ansatz (inklusive Negativkontrollen). Als Template wurde aus Lebergewebe gesunder Hunde isolierte cDNA verwendet. In jedem Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen Templates und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase (Fa.
Promega) zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec bei 94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C, Elongation für 2 sec im ersten Zyklus zuzüglich 2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR wurde mit einer Elongation (10 min bei 72 °C) beendet.
200 µl des jeweiligen PCR-Produktes wurden mit 20 µl 3 M Natriumacetat (pH-Wert 7) und 550 µl Ethanol (>99,8 %, -20 °C) über Nacht bei -20 °C inkubiert. Anschließend wurde die Probe für 10 min bei 12.000 x g zentrifugiert und das Pellet in 35 µl autoklaviertem dest.
Wasser gelöst. Die elektrophoretische Auftrennung des PCR-Produkts erfolgte in einem 1%igen Agarosegel (Herstellung des Gels siehe Anhang Seite 129). Die gewünschte DNA-Bande wurde unter UV-Lichtexposition mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Etwa 100 g des ausgeschnittenen Gelstücks wurden mit 300 µl Buffer QG (QIAqick® Gel Extraction Kit) für 10 min bei 50 °C unter gelegentlichem Mischen in einem Wasserbad inkubiert. Die Probelösung wurde mit 100 µl Isopropanol (≥99,7%) vermengt, in eine Glasmilchsäule (QIAquick® Gel Extraction Kit) überführt und für 1 min bei 10.000 x g in einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule
Wasser gelöst. Die elektrophoretische Auftrennung des PCR-Produkts erfolgte in einem 1%igen Agarosegel (Herstellung des Gels siehe Anhang Seite 129). Die gewünschte DNA-Bande wurde unter UV-Lichtexposition mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Etwa 100 g des ausgeschnittenen Gelstücks wurden mit 300 µl Buffer QG (QIAqick® Gel Extraction Kit) für 10 min bei 50 °C unter gelegentlichem Mischen in einem Wasserbad inkubiert. Die Probelösung wurde mit 100 µl Isopropanol (≥99,7%) vermengt, in eine Glasmilchsäule (QIAquick® Gel Extraction Kit) überführt und für 1 min bei 10.000 x g in einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule