der Medizinischen Hochschule Hannover
Charakterisierung Natürlicher Killerzellen nach humaner allogener
Stammzelltransplantation
THESE
zur Erlangung des Grades eines
PHILOSOPHICAL DOCTOR - Ph.D. -
im Fachgebiet Immunologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Gabriele Hintzen
aus Herford Hannover 2002
gefördert durch den Sonderforschungsbereich 265:
„Immunreaktionen und Pathomechanismen bei Organtransplantationen“
der Medizinischen Hochschule Hannover
Charakterisierung Natürlicher Killerzellen nach humaner allogener
Stammzelltransplantation
THESE
zur Erlangung des Grades eines
PHILOSOPHICAL DOCTOR - Ph.D. -
im Fachgebiet Immunologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Gabriele Hintzen
aus Herford Hannover 2002
gefördert durch den Sonderforschungsbereich 265:
„Immunreaktionen und Pathomechanismen bei Organtransplantationen“
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. Ludwig Haas
Prof. Dr.Hans Jürgen Schlitt
1. Gutachten: Prof. Dr. Reinhold Ernst Schmidt Klinische Immunologie
Zentrum Innere Medizin
Medizinische Hochschule Hannover Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Ludwig Haas Institut für Virologie
Tierärztliche Hochschule Hannover Prof. Dr. Hans Jürgen Schlitt
Klinik für Abdominal- und Transplantationschirurgie Medizinische Hochschule Hannover
2.Gutachten: Prof. Dr. Gottfried Alber Institut für Immunologie
Veterinärmedizinische Fakultät Universität Leipzig
Datum der mündlichen Prüfung: 03.06.2002
1 Einleitung ... 1
1.1 NK-Zellen...1
1.1.1 Entwicklung ...2
1.1.2 Effektormechanismen...2
1.2 Rezeptoren auf NK-Zellen...4
1.2.1 CD16 ...5
1.2.2 MHC-spezifische Rezeptoren...5
1.2.3 Dipeptidylpeptidase IV...11
1.2.4 Aktivierungsmarker auf NK-Zellen ...12
1.2.5 NK-Zellen und Transplantation ...13
1.2.6 Veränderung der NK-Zell-Rezeptorexpression nach allogener KMT...14
1.3 Zielsetzung der Arbeit...16
2 Material und Methoden ... 17
2.1 Material...17
2.1.1 Chemikalien:...17
2.1.2 Verbrauchsmaterial ...18
2.1.3 Geräte ...18
2.1.4 Puffer und Medien ...19
2.1.5 Antikörper ...20
2.1.6 Reagentien für die Molekularbiologie ...21
2.1.7 Zelllinien ...23
2.1.8 Blutproben... 23
2.2 Methoden...25
2.2.1 Isolierung von Lymphozyten ... 25
2.2.2 Zellzählung... 25
2.2.3 Durchflusszytometrie ... 26
2.2.4 Zytotoxizitätstest ... 29
2.2.5 Aufreinigung von NK-Zellen über MACS... 30
2.2.6 Generierung von NK-Zellklonen... 31
2.2.7 Koinkubation von NK-Zellklonen mit L721.221-Zellen ... 32
2.2.8 Kreuzvernetzung von CD26 ... 32
2.2.9 Isolation von RNA aus PBMC ... 34
2.2.10 RNA-Konzentrationsbestimmung... 34
2.2.11 RT-PCR ... 35
3 Ergebnisse ... 37
3.1 Rekonstitution der Lymphozytenpopulationen...37
3.2 Rekonstitution der NK-Zellrezeptoren...39
3.2.1 Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren... 39
3.2.2 Lektin-ähnliche Rezeptoren ... 45
3.3 Einfluss der HLA-Expression auf die NK-Zellrezeptorexpression...48
3.3.1 Einfluss der HLA-Expression von Spender und Empfängerzellen auf die Rekonstitution der NK-Zellrezeptoren ... 48 3.3.2 Kokultivierung von NK-Zell-Klonen mit Zelllinien mit definierter HLA-
3.4 Expression der NK-Zellrezeptoren auf T-Zellen...57
3.5 Charakterisierung von NK-Zell-Subpopulationen...60
3.5.1 Expression MHC-I-spezifischer Rezeptoren...61
3.5.2 Konjugatbildung mit Zielzellen...62
3.5.3 Produktion lytischer Substanzen ...63
3.5.4 Zytokinproduktion ...64
3.6 CD26 auf NK-Zellen...66
3.6.1 Expression von CD26 nach allogener Stammzelltransplantation ...67
3.6.2 Funktionelle Beeinflussung von NK-Zellen durch Kreuzvernetzung von CD26 ...68
4 Diskussion ... 73
5 Zusammenfassung / Summary ... 83
5.1 Zusammenfassung...83
5.2 Summary...85
Literaturverzeichnis... 87
Abkürzungen... 103
Publikationsliste ... 105
Danksagung ... 107
1.1 NK-Zellen
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) nehmen unter den Lymphozyten eine Sonderstel- lung ein. Aufgrund ihrer Morphologie als große granuläre Lymphozyten wurden sie zunächst als LGL (engl.: large granular lymphocytes) bezeichnet [1]. Im Gegensatz zu den B- und T-Zellen, die zum adaptiven Immunsystem gerechnet werden, sind NK-Zellen Effektoren des angeborenen Immunsystems. Zu den Zellen der angebo- renen Immunität gehören darüber hinaus die myeloiden Zellen wie Granulozyten, Monozyten und Makrophagen. NK-Zellen zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, Zielzellen ohne antigene Aktivierung lysieren zu können. Auf diese Weise können sie unmittelbar Tumorzellen sowie virusinfizierte Zellen abtöten und diese kontrollieren, bis das spezifische Immunsystem adäquat reagieren kann. Daher wurden sie bald als „natürliche“ Killerzellen bezeichnet [2;3]. Über das Vermögen zur Antikörper- abhängigen zellulären Zytotoxizität (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity – ADCC), bei der die NK-Zellen Antikörper-opsonierte Zielzellen über den Fcγ- Rezeptor III (CD16) binden und abtöten, haben sie auch eine Funktion im Rahmen der erworbenen Immunabwehr [4].
Aufmerksam wurde man auf diese Zellpopulation bei dem Versuch, bei Tumorpati- enten spezifische Abwehrzellen gegen deren Tumoren nachzuweisen. Dabei stellte sich heraus, dass auch Lymphozyten von tumorfreien gesunden Kontrollen ohne vorherige Immunisierung in der Lage waren, bestimmte Tumorzellen ohne MHC- Restriktion abzutöten [5].
Der Phänotyp der humanen NK-Zellen wird definiert über die Expression des FcγRIII (CD16), des CD56-Moleküls und, zur Abgrenzung von T-Zellen, die fehlende Ex- pression von CD3.
In Normalkontrollen sind etwa 5-15% der peripheren Blutlymphozyten NK-Zellen.
Auch in Milz, Lunge, Gastrointestinaltrakt und Leber wurden sie beschrieben, wobei in der Leber zu einem großen Teil NKT-Zellen zu finden sind [6-9]. In Thymus und Lymphknoten gibt es dagegen nur sehr wenige NK-Zellen [10;11]. Im Uterus kommt es besonders während der Schwangerschaft zu einer deutlichen Zunahme von NK- Zellen. Es wird davon ausgegangen, dass sie hier eine Funktion als Barriere zwi- schen Mutter und Fetus und bei der Toleranzentwicklung haben, das plazentare Wachstum beeinflussen oder eine Rolle beim Abort spielen [12].
1.1.1 Entwicklung
NK-Zellen entwickeln sich aus einer fetalen FcγRIII+ CD90+ CD117+ Thymozytenpo- pulation [13]. Damit haben sie den gleichen Progenitor wie auch T-Zellen. Die Rei- fung der NK-Zellen erfolgt aber, im Gegensatz zu den T-Zellen, außerhalb des Thy- mus. Stromazellen im Knochenmark bilden IL-15, welches ein wichtiger Stimulus für die NK-Zellentwicklung ist [14]. Die NK-Zellen sind in ihrer Entwicklung also abhängig vom Knochenmark.
1.1.2 Effektormechanismen
Natürliche Zytotoxizität und ADCC der NK-Zellen bedienen sich der gleichen zytolyti- schen Mechanismen [15]. Die azurophilen Granula der NK-Zellen entsprechen modi- fizierten Lysosomen, die proteolytische Substanzen enthalten [16]. Bei Kontakt mit einer Zielzelle bindet die NK-Zelle über das LFA-1 (engl.: leucocyte function asso- ciated antigen 1) an Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche der Zielzelle [17]. Dar- aufhin werden die Granula zunächst in Richtung der Kontaktfläche konzentriert. Über einen kalziumabhängigen Mechanismus wird Perforin freigesetzt, ein Protein, das
Poren können Granzym A und B eindringen. Dies sind Serinproteasen, die den Ver- dauungsenzymen Trypsin und Chymotrypsin ähnlich sind und in der Zielzelle Apop- tose auslösen können. Auf diesem Mechanismus beruht der Hauptteil der Zytotoxi- zität der NK-Zellen. Darüber hinaus können die Zellen nach Aktivierung Fas-Ligand an der Oberfläche exprimieren und an CD95 (Fas)+ binden. Durch die Interaktion von Fas und Fas-Ligand wird in der Zielzelle unabhängig von Perforin Apoptose ausge- löst [19]. Fas gehört zur Familie der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Rezeptoren, der auch weitere Rezeptoren angehören, die Death-Domänen enthalten, an die von NK- Zellen exprimiertes TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) binden kann [20]:
ein weiterer Weg, der zum Tod der Zielzelle durch Apoptose führt.
Eine weitere wichtige Funktion der NK-Zellen ist die Regulation der Immunantwort durch die Bildung verschiedener Mediatoren. Bei Aktivierung bilden NK-Zellen proin- flammatorische Zytokine, wie Interferon (IFN)γ [21] und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)α [22] aber auch IL-5 [23], Lymphotoxin (LT/TNF)β [24], Interleukin (IL)-10 [25]
und IL-13 [26]. Über GM-CSF nehmen NK-Zellen Einfluss auf die Hämatopoese [27].
Auch Chemokine, wie Lymphotactin, MIP-1α, MIP-1β [28], Rantes und IL-8 [29] kön- nen von NK-Zellen gebildet werden.
1.2 Rezeptoren auf NK-Zellen
Die Aktivität der NK-Zellen wird über verschiedene Rezeptoren, die die Zellen positiv und negativ beeinflussen, reguliert. Die Expression dieser Rezeptoren, die nicht auf allen NK-Zellen gleich ist, erlaubt eine Einteilung in verschiedene Subpopulationen.
Dies unterstreicht, dass natürliche Killerzellen keine homogene Zellpopulation dar- stellen, sondern vielleicht sogar der jeweiligen Situation angepasst spezifisch reagieren können. Das Zusammenspiel aktivierender und inhibierender Rezeptoren würde so ein „fine tuning” der NK-Zell-Funktion bewirken.
CD16 Ly49 CD94 KIR2DL KIR3DL KIR2DS
+DAP12 KIR2DL
Abb. 1: Darstellung der NK-Zellrezeptoren und CD16: Dargestellt sind neben dem CD16, Lektin-ähnliche Rezeptoren (Ly49 und CD94) und Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren (KIR) der NK-Zellen. Aktivierende Motive (ITAMs) sind gelb dargestellt, inhibierende Motive (ITIMs) rot.
1.2.1 CD16
Als Effektoren der angeborenen Immunität exprimieren die NK-Zellen keinen anti- genspezifischen Rezeptor, wie die B- und T-Zellen, tragen auf ihrer Oberfläche aber den Fcγ-Rezeptor III (CD16) (Abb. 1). Dieser Rezeptor bindet niedrigaffin an den Fc- Teil von Immunglobulin G (IgG). Die Bindung dieser Rezeptoren an das IgG einer opsonierten Zielzelle führt auf der NK-Zelle zur Kreuzvernetzung der CD16 Moleküle, was über „immunoreceptor tyrosin-based activating motifs“ (ITAMs) zu einer Aktivie- rung der NK-Zelle und damit zur Lyse der Zielzelle führt [4]. Über diese Mechanis- men kann die NK-Zelle auch an antigenspezifischen Abwehrprozessen teilnehmen, ohne dass sie selbst Spezifität für das Antigen besitzt.
1.2.2 MHC-spezifische Rezeptoren
NK-Zellen exprimieren Rezeptoren, die jeweils spezifisch an bestimmte MHC-Klasse- I-Moleküle auf Zielzellen binden. Auch auf Untergruppen von T-Zellen wurden diese Rezeptoren entdeckt.
Die MHC-Antigene des Menschen heißen HLA-Moleküle (Human leukocyte anti- gens). Innerhalb des HLA-I-Komplexes werden die Antigene A, B, C, E und G unter- schieden. HLA-I-Moleküle werden von jeder kernhaltigen Zelle des Körpers expri- miert. Sie sind Alloantigene bei Transfusionen und Transplantationen und werden daher auch Gewebeverträglichkeitsmerkmale genannt. Es besteht ein ausgeprägter Polymorphismus bei den Genloci von HLA-A, -B und -C, deren Determinanten aber zu kreuzreagierenden Gruppen zusammengefasst werden können. Die MHC-I- spezifischen Rezeptoren binden zum einen an die klassischen HLA-Moleküle HLA-A, HLA-B und HLA-C und zum anderen an nicht-klassische HLA, wie HLA-E und HLA- G. Die HLA-E-Expression ist assoziiert mit der Expression klassischer HLA-I- Moleküle. HLA-E wird daher von allen HLA-I-exprimierenden Zellen getragen. HLA-G
wird auf Zellen des Trophoblasten exprimiert und schützt durch Bindung von inhibie- renden NK-Zellrezeptoren den Foetus vor maternalen NK-Zellen [12].
Der überwiegende Teil der MHC-Rezeptoren vermittelt über diese Interaktion eine Inhibition der NK-Zelle, was zur Entwicklung der „missing self“-Hypothese führte.
Diese besagt, dass eine NK-Zelle solange aktiv ist und bereit andere Zellen zu lysie- ren, bis sie durch Bindung von bekanntem, eigenen MHC-I an hemmende Rezepto- ren daran gehindert wird [30]. Da Tumorzellen und virusinfizierte Zellen oft ihre MHC-I-Expression vermindern oder einstellen, können sie von NK-Zellen ohne weite- re Aktivierung lysiert werden [31;32]. Jedes Individuum exprimiert ein eigenes NK- Zellrezeptor-Repertoire, das MHC-I-spezifische Rezeptoren für eigene, aber auch für fremde MHC-I-Moleküle enthält. Jede humane NK-Zelle exprimiert mindestens einen spezifischen Rezeptor für eigenes MHC-I („at least one“-Theorie) [33].
Im Maussystem konnte nachgewiesen werden, dass die NK-Zellen ihre Rezeptorex- pression dem MHC-I-Muster des Wirtes anpassen, nachdem sie vorher zufällig ver- teilt wurden [34]. Der Rezeptor wird in höherer Dichte und auf mehr Zellen exprimiert, wenn im Wirt kein Ligand vorhanden ist und vermindert, wenn die Zellen für den Re- zeptor passendes MHC-I exprimieren (Kalibrationsmodell) [35;36].
1.2.2.1 Rezeptorfamilien
Die MHC-I-spezifischen Rezeptoren lassen sich nach ihrer Substanzklasse in zwei Gruppen einteilen: Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren und C-Typ-Lektin-ähnliche Rezeptoren. Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren konnten bisher nur bei Primaten gefunden werden [37]. Zu den Lektin-ähnlichen Rezeptoren gehört zum einen die Ly49-Rezeptorfamilie, deren einzelne Isotypen und deren Expressionsmuster bei der Maus genau beschrieben wurden, die im Menschen jedoch nicht vorkommen (Abb.
2). Im Menschen existiert ein Ly49 L-Gen, das in vivo aber nicht transkribiert wird
Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren im Menschen dar. Lektin-ähnliche CD94/NKG2-Rezeptoren kommen sowohl im humanen, als auch im murinen System vor.
MHC-I-spezifische NK- Zellrezeptoren
Immunglobulin-ähnlich C-Typ-Lektin-ähnlich
Ly49-Rezeptoren Maus
CD94/NKG2 Maus und Mensch
KIR Mensch
Abb. 2: Einteilung der Familien der MHC-I-spezifischen NK-Zellrezeptoren bei Maus und Mensch
1.2.2.2 Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren
Die „killer cell immunoglobulin-like receptors“ oder auch KIRs sind codiert auf dem humanen Chromosom 19q13.42 im sogenannten Leukozyten-Rezeptor-Komplex (leucocyte receptor complex) [39]. Jeder humane NK-Zellklon exprimiert durch- schnittlich 5-6 HLA-I spezifische Rezeptoren (CD94-NKG2 und/oder KIRs) [33]. Un- terschieden werden die KIRs durch die Anzahl ihrer extrazellulären Immunglobulin- domänen (D) und die Länge ihres intrazellulären Anteils (S=short, L=long) (Abb. 1).
Die Rezeptoren mit einem langen intrazellulären Anteil (KIR2DL 1-5 und KIR3DL 1, 2, 7) enthalten 1-2 ITIMs („immunoreceptor tyrosin-based inhibitory motifs“), welche
über SH2-enthaltende Tyrosin-Phosphatasen eine Hemmung der NK-Zelle vermitteln [40]. Die kurzen, aktivierenden Isoformen dieser Rezeptoren (KIR2DS 1-6 und KIR3DS1+2) besitzen in ihrer transmembranen Domäne eine positiv geladene Ami- nosäure (Arginin oder Lysin), über die sie mit einem DAP12-Protein oder auch „killer cell activating receptor-associated protein“ (KARAP) interagieren. Dieses Protein enthält ITAMs, die über die Protein-Tyrosin-Kinasen Syk und ZAP70 eine Aktivierung der Zelle vermitteln [41]. KIRs besitzen eine sehr hohe Spezifität für ihre Liganden, bei denen es sich in der Regel um klassische HLA-I-Moleküle handelt (Tabelle 1).
CD158a (KIR2DL1) und CD158b (KIR2DL2/3) binden spezifisch an HLA-C. Die Spe- zifität dieser Rezeptoren überschneidet sich jedoch nicht, da die allelen Formen des HLA-C in zwei Gruppen aufgeteilt werden können. Gruppe 1 (z.B. HLA-Cw2,-Cw4, - Cw5, -Cw6, -Cw15) bindet an CD158a und Gruppe 2 (z.B. HLA-Cw1, -Cw3, -Cw7, - Cw8) an CD158b. Diese beiden Gruppen unterscheiden sich nur in zwei Aminosäu- ren an den Stellen 77 und 80, dennoch gibt es keine Kreuzreaktivität zu den beiden Rezeptoren [42]. Ein weiterer Rezeptor, NKB1 (KIR3DL1), bindet spezifisch an De- terminanten von HLA-Bw4. Die inhibierenden und aktivierenden Isoformen eines Re- zeptors besitzen die gleiche Spezifität, die Affinität zum Liganden ist aber bei den inhibierenden Isoformen höher [43]. NK-Zellen, die aktivierende Rezeptoren tragen, welche spezifisch für eigenes MHC-I sind, werden nicht eliminiert. Dies spricht dafür, dass die inhibierenden Rezeptoren die NK-Zellen unter Kontrolle halten [44]. Die Ex- pression dieser Rezeptoren ist genetisch determiniert. Unabhängig davon, ob der Spender einen oder mehrere Liganden für einen Rezeptor exprimiert, kann die Ex- pression des Rezeptors auf sehr vielen oder nur wenigen NK-Zellen existent sein.
[33].
Bezeichnung Funktion Molekülbezeichnung Spezifität
KIR2DL KIR2DL1 inhibierend CD158a, p58.1 HLA-Cw2, Cw4, Cw5, Cw6, Cw15 KIR2DL2 inhibierend CD158b, p58.2 HLA-Cw1, Cw3, Cw7, Cw8 KIR2DL3 inhibierend CD158b, p58.2 HLA-Cw1, Cw3, Cw7, Cw8
KIR2DL4 HLA-G
KIR2DS KIR2DS1 aktivierend CD158a, p50.1 HLA-Cw4 (schwach) KIR2DS2 aktivierend CD158b, p50.2 HLA-C (möglicherweise) KIR2DS3
KIR2DS4 aktivierend PAX, p50.3 HLA-C (möglicherweise) KIR2DS5
KIR3DL KIR3DL1 inhibierend p70, NKB1 HLA-Bw4
KIR3DL2 (inhibierend) p140 HLA-A (möglicherweise)
KIR3DS KIR3DS1 HLA-B (möglicherweise)
Tabelle 1: Vertreter der Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR) und ihre Liganden: Dargestellt sind die im Menschen bisher bekannten KIR mit ihrer Funkti- on, alternativen Namen und spezifischen HLA-I-Liganden.
1.2.2.3 Lektin-ähnliche Rezeptoren
Die Lektin-ähnlichen Rezeptoren unterscheiden sich in Struktur und Spezifität von den KIRs, hemmen NK-Zellen aber in gleicher Weise. Sie gleichen in ihrer Struktur den kalziumabhängigen Lektinen (Abb. 1). Im humanen System sind die Heterodime- re aus CD94 und NKG2-Molekülen die wohl wichtigsten Vertreter dieser Familie [45].
Die Funktion des Rezeptors hängt von dem assoziierten NKG2-Molekül ab. NKG2A trägt intrazelluläre ITIMs und vermittelt daher eine Hemmung der Zelle. NKG2C, E und H sind, wie die aktivierenden Isoformen der Immunglobulin-ähnlichen NK- Zellrezeptoren, mit dem aktivierenden DAP12-Molekül assoziiert und vermitteln eine Aktivierung der NK-Zelle über die Rekrutierung von Tyrosin-Kinasen. Diese Rezepto- ren binden HLA-E, ein nicht-klassisches HLA-Molekül, das als Peptid Leader- Sequenzen anderer HLA-I-Moleküle trägt. Dadurch ergibt sich ein breites Bindungs-
spektrum für diesen Rezeptor [46]. Die Lektin-ähnlichen Rezeptoren des Menschen sind, zusammen mit CD69 und dem Gen für Ly49L, auf dem humanen Chromosom 12p12.3-p13 im sogenannten NK-Komplex codiert [47].
NKG2D nimmt eine Sonderstellung unter den NKG2-Molekülen ein. Es bildet kein Heterodimer mit CD94 und ist mit dem DAP10-Protein assoziiert, einem dem DAP12 ähnlichen Protein, das auch über ITAMs eine Aktivierung der Zelle bewirkt. Die Li- ganden sind MICA und MICB, stressinduzierte Moleküle, die in virusinfizierten und maligne entarteten Zellen hochreguliert werden [48]. Die Gene für DAP10 und DAP12 liegen angrenzend auf dem humanen Chromosom 19q13.1 [49].
Ein weiterer Lektin-ähnlicher Rezeptor beim Menschen ist NKR-P1A oder CD161 [50]. CD161 enthält kein ITIM und keinen transmembranen Aminosäurerest, scheint aber inhibitorische Signale über andere, derzeit noch nicht entdeckte Mechanismen zu vermitteln. Der Ligand ist bisher unbekannt.
1.2.2.4 Expression MHC-I-spezifischer Rezeptoren auf T-Zellen
MHC-I-spezifische NK-Zellrezeptoren werden auch von einem Teil der T-Zellen ex- primiert. T-Zellen werden spezifisch über ihren T-Zellrezeptor (TCR) in Verbindung mit Korezeptoren bei Präsentation des passenden Antigens durch MHC-I antigen- präsentierender Zellen aktiviert. Ist das Antigen, für das die T-Zelle spezifisch ist, nicht vorhanden, so wird die Zelle auch nicht aktiv und benötigt keine weitere Inhibiti- on. Die Expression der KIR wird in T-Zellen über Stimulation des TCR reguliert. Er- hält der TCR kein spezifisches Signal, so werden speziell die inhibierenden Isofor- men der Rezeptoren in ihrer Expression herunterreguliert, vermutlich damit die T- Zelle vollständig erregbar bleibt, auch wenn für die NK-Zellrezeptoren passendes MHC-I anwesend ist. Wird der TCR der gleichen Zelle hingegen kontinuierlich durch hohe Antigenkonzentrationen (z.B. persistierendes Antigen oder Selbst-Antigen) ak-
auf den T-Zellen exprimiert. Dieses geschieht möglicherweise, um eine Erschöpfung durch Überstimulation zu verhindern und den Zellen damit einen selektiven Vorteil während Bildung des immunologischen Gedächtnisses zu schaffen [51]. Diese Be- einflussung der Expression auf T-Zellen findet sich nicht bei dem Lektin-ähnlichen Rezeptor CD94. CD94 wird stabil exprimiert und ist unabhängig von zellulärer Akti- vierung [52].
1.2.3 Dipeptidylpeptidase IV
Die Dipeptidylpeptidase IV (CD26) ist ein transmembranes Glycoprotein vom Typ II mit Exopeptidaseaktivität, das von aktivierten B- und T-Zellen sowie Makrophagen, aber auch von einer Subgruppe der NK-Zellen exprimiert wird. Der natürliche Ligand dieses Rezeptors wurde noch nicht gefunden. Zusammen mit dem T-Zell-Rezeptor bzw. CD45 spielt CD26 bei der T-Zellaktivierung und -proliferation eine Rolle [53].
Die Expression von CD26 kann durch Aktivierung der Zellen (T-Zellen mit anti-CD3, T- und NK-Zellen mit Il-2) hochreguliert werden [54]. Die enzymatische Aktivität von CD26 ist weder für die direkte Signaltransduktion von CD26 nach Kreuzvernetzung durch Antikörper, noch für seine kostimulatorische Funktion neben dem TCR erfor- derlich [55]. Antikörperinduzierte Kreuzvernetzung von CD26 auf der Oberfläche von Zellen führt zur Phosphorylierung intrazellulärer Proteine, wie p56lck, p59fyn, ZAP70 und anderen, die auch nach CD3/TCR-Stimulation in T-Zellen phosphoryliert werden [56]. Für T-Zellen ist bekannt, dass die Kreuzvernetzung von CD26 die Expression der stimulatorischen Zytokine IFNγ, TNFα und GM-CSF reduziert. Im Gegensatz da- zu wird die Sekretion des immunsupprimierenden Zytokins TGFβ durch Kreuzvernet- zung von CD26 induziert [57].
1.2.4 Aktivierungsmarker auf NK-Zellen
1.2.4.1 IL-2-Rezeptor
IL-2 ist das wichtigste Zytokin für NK-Zellen. Ruhende NK- und T-Zellen exprimieren einen niedrigaffinen IL-2-Rezeptor, der aus einer β- und einer γ-Kette besteht. Bei Aktivierung wird zusätzlich eine α-Untereinheit (CD25) exprimiert, mit der die Affinität des IL-2-Rezeptors stark ansteigt. Bindung von IL-2 löst Proliferation der Zellen aus [58]. Die α-Untereinheit des IL-2-Rezeptors ist also ein Marker für den Aktivierungs- zustand der Zelle.
1.2.4.2 CD69
CD69 ist ein Aktivierungsmarker auf B- und T-Zellen, Makrophagen und NK-Zellen.
Es ist ein C-Typ-Lektin-Homodimer, das, wie auch die Lektin-ähnlichen NK- Zellrezeptoren, auf dem NK-Komplex auf Chromosom 12 codiert wird. CD69 wird besonders früh nach Aktivierung der Zellen exprimiert und heißt daher auch frühes Aktivierungs-Antigen („early activation antigen“ oder „activation inducer molecule“
AIM).
1.2.4.3 HLA-DR
HLA-DR gehört zu den HLA-Antigenen der Klasse II. Diese sind verantwortlich für die Prozessierung und Präsentation von Antigenen und werden in erster Linie von pro- fessionellen antigenpräsentierenden Zellen exprimiert. Im Falle der Aktivierung wer- den sie auch von einem Teil der NK-Zellen getragen, die damit auch zur Antigenprä-
1.2.5 NK-Zellen und Transplantation
NK-Zellen haben eine zentrale Bedeutung bei Transplantationen. Bei der Trans- plantation allogener, solider Organe schienen sie zunächst eine untergeordnete Rolle zu spielen. Bei CD28-defizienten (KO) Mäusen, deren T-Zellen somit kein kostimu- latorisches Signal erhielten, erreichte man erst durch Depletion der NK-Zellen eine Akzeptanz des transplantierten Organs [60]. NK-Zellen infiltrieren das transplantierte Organ, wurden nicht von MHC-I gehemmt und vermittelten eine Abstoßung des Or- gans, unabhängig von T-Zellen. Somit wird die Abstoßung allogener Transplantate also gemeinsam von angeborenen und adaptiven Immunmechanismen vermittelt.
Eine besondere Rolle spielen NK-Zellen im Rahmen der Stammzelltransplantation (SCTX). So sind sie die ersten nachweisbaren Lymphozyten in der frühen Rekonsti- tutionsphase und in wesentlich höherem Anteil vertreten als bei Normalkontrollen [61]. Damit stellen sie als „first line of defense“ die größte und wichtigste lymphozytä- re Zellpopulation des rekonstituierenden Immunsystems in den ersten Wochen nach Transplantation dar.
Bei der Stammzelltransplantation werden die hämatopoetischen Zellen eines Orga- nismus durch pharmakologische oder auch physikalische Therapie zerstört und ein neues hämatopoetisches System in Form von Stammzellen eines anderen Organis- mus in den Körper transplantiert. So entsteht ein System, in dem Zellen von zwei Organismen dauerhaft koexistieren (Chimärismus).
Im murinen System wurde ein NK-Zell-vermitteltes Phänomen bei der Stammzell- transplantation, die F1-Hybridresistenz, beschrieben. In heterozygoten Rezipienten der ersten (F1) Generation wird parentales homozygotes Knochenmark abgestoßen [62]. Dieses geschieht aufgrund der Fähigkeit der NK-Zellen „selbst“ von „nicht- selbst“ zu unterscheiden. Die Expression des vollständigen eigenen MHC-I-Musters des Knochenmarks gewährleistet eine ausreichende Inhibition der NK-Zellen. Das
Knochenmark eines Elternteils exprimiert aber nur einen Teil des bekannten MHC, wodurch keine ausreichende Hemmung der NK-Zellen über ihre MHC-I-spezifischen Rezeptoren vermittelt und damit eine Abstoßung des Transplantats provoziert wird.
Eine entscheidende positive Funktion bei der Stammzelltransplantation haben NK- Zellen durch den Graft-versus-Leukemia (GvL) –Effekt. Dieser wurde aufgrund der Beobachtung postuliert, dass mit dem Auftreten einer Graft-versus-Host Disease (GvHD) nach allogener SCTX eine höhere Wahrscheinlichkeit für den Patienten be- steht, rezidivfrei zu bleiben. Dieser Effekt wird über NK-Zellen vermittelt, die im Kör- per des Patienten verbliebene Tumorzellen aufgrund ihres unbekannten oder verän- derten MHC-I-Musters nicht erkennen, keine Inhibition erfahren und damit die Zellen lysieren. Bei syngenen Transplantaten besteht daher ein erhöhtes Rezidivrisiko, an- dererseits eine entsprechend geringe Gefahr für das Auftreten einer GvH- Erkrankung. Die GvHD gilt primär als T-Zell-vermittelt. Durch Depletion der T-Zellen im Transplantat ist es also möglich, die Gefahr der GvHD zu vermindern und die po- sitive Wirkung des GvL-Effekts trotzdem zu nutzen [63].
Nach Xenotransplantation, wenn Gewebe einer anderen Spezies als der des Emfän- gers transplantiert wird, reagieren NK-Zellen als starke Effektoren, da sie überhaupt nicht über MHC-I-spezifische Rezeptoren gebremst werden, welche keine Kreuzre- aktivität zwischen den Spezies aufweisen [63]. So provoziert besonders xenogenes Knochenmark eine massive Abstoßung [27].
1.2.6 Veränderung der NK-Zellrezeptorexpression nach allogener KMT
Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe im murinen System zeigten, dass sich die Expres- sion der MHC-I-spezifischen Rezeptoren der Ly49-Familie nach allogener Knochen- marktransplantation in Abhängigkeit des im Empfänger exprimierten MHC-I-Musters ändern kann [36] [64]. Die Expression der zur Familie der C-Typ-Lektine gehörenden
tion im neuen Wirt in Abhängigkeit des dort exprimierten MHC-I-Musters signifikant verändert. Der Kontakt zu einem neuen korrespondierenden Liganden nach Trans- plantation resultierte in einer Reduktion der Expression. Der Verlust eines entspre- chenden Liganden dagegen führte zur Hochregulation des jeweiligen Rezeptors. Die Expression der Ly49-Rezeptoren scheint also direkt mit der Anwesenheit des pas- senden Antigens zu korrelieren. Diese Entwicklung konnte sowohl bei inhibierenden als auch bei aktivierenden Rezeptoren beobachtet werden. Eine solche Anpassung führt zur Entwicklung von Toleranz der NK-Zellen gegenüber ihrer neuen Umgebung.
1.3 Zielsetzung der Arbeit
Ziel dieser Arbeit ist es, zu untersuchen, ob auch im Menschen das MHC-I-Muster von Spender und Empfänger im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantation einen Einfluss auf die Rekonstitution der NK-Zellrezeptoren hat. Dazu sollen NK- und T-Zellen von stammzelltransplantierten Menschen als Verlaufskontrolle phänotypisch untersucht werden. Weitere Parameter, die Einfluss auf die NK-Zellfunktion und Ent- wicklung haben, sollen genauer analysiert werden. Die NK-Zellen sollen so im Rah- men der allogenen Stammzelltransplantation und auch in gesunden Kontrollen cha- rakterisiert werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, Subpopulationen zu definieren, die sich in der Expression von Oberflächenmolekülen unterscheiden. Die- se NK-Zellpopulationen werden hinsichtlich funktioneller Unterschiede untersucht und so die unterschiedliche Regulation von Zytotoxizität und regulativen Funktionen, wie der Zytokinbildung, analysiert. Weiterhin sollen diese Subpopulationen selektiv beeinflusst werden und auf Veränderung des Phänotyps, Aktivierungszustandes und auch der Funktion untersucht werden.
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien:
Agarose Fa. Gibco, Eggestein
Brefeldin A Fa. Sigma-Aldrich, München
BSA Fa. Behring, Marburg
Dimethylsulfoxid Fa. Sigma-Aldrich, München Desoxynucleosidtriphosphate (dNTP) Fa. Promega, Madison, WI, USA EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Fa. Sigma-Aldrich, München
Essigsäure Fa. Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Fa. Sigma-Aldrich, München
Ethylendiamidtetraacetat (EDTA) Fa. Sigma-Aldrich, München FCS (fetal calf serum) Fa. PAA, Linz, Österreich
Ficoll Fa. Biochrom, Berlin
Humanes AB-Serum Blutbank, MHH, Hannover
L-Glutamin Fa. Gibco, Eggestein
Heparin-Natrium (Liquemin) Fa. Roche, Grenzach-Whylen
Ionomycin Fa. Sigma-Aldrich, München
β-Mercaptoethanol Fa. Merck, Darmstadt
Na2-51CrO4 Fa. Amersham, Braunschweig
Natriumpyruvat Fa. Gibco, Eggestein
Paraffin Fa. Sigma-Aldrich, München
PBS Fa. Gibco, Eggestein
Penicillin-Streptomycin Fa. Biochrom, Berlin
PMA Fa. Sigma-Aldrich, München
Rekombinantes IL-2 Fa. Cetus, Emeryville, USA
RPMI 1640 Fa. Biochrom, Berlin
Sheath-Lösung (Isoton-II) Fa. Beckman-Coulter, Krefeld
Triton-X-100 Fa. Merck, Darmstadt
Trypanblau Fa. Merck, Darmstadt
2.1.2 Verbrauchsmaterial
15ml, 50ml Röhrchen Fa. Greiner, Frickenhausen 50ml, 250ml Zellkulturflaschen Fa. Greiner, Frickenhausen 96-Well Rundbodenplatten Fa. Greiner, Frickenhausen
96-Well Spitzbodenplatten Fa. ICN Biomedicals, Aurora, USA 24-Well-Zellkulturplatten Fa. Greiner, Frickenhausen
Klebefolien für 96-well-Platten Fa. Nunc, Wiesbaden PS (Polystyrol)-Röhrchen (0,6ml) Fa. Greiner, Frickenhausen Säulen zur negativen Depletion (AS)
mittels magnetischer Verfahren Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach Sterilfilter (EasyflowTM) Fa. Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA
2.1.3 Geräte
Brutschrank (CO2-Auto-Zero) Fa. Heraeus, Osterode
Cäsiumquelle (GammaCell2000) Fa. Mølsgaard Medical, Dänemark Durchflusszytometer (FACScalibur) Fa. Becton Dickinson, San Jose, USA
Gamma-Counter Fa. Berthold, Isernhagen
Gelelektrophoresekammer Fa. Bio-Rad, München Heizblock, Modell 5436 Fa. Eppendorf, Hamburg
Photometer (UV-Meter 1202) Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan
Sterilbank (Lamina Air Flow) Fa. Heraeus, Osterode
Zentrifuge (J-6B) Fa. Beckman, München
Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS) Fa. Heraeus, Osterode Zentrifuge (Biofuge pico) Fa. Heraeus, Osterode
2.1.4 Puffer und Medien
Kulturmedium für NK-Zellen: 16,5% humanes AB-Serum 1,0% Penicillin-Streptomycin 1,0% L-Glutamin
1,0% Na-Pyruvat in RPMI 1640
10%iges FCS-Medium (R10): 10,0% FCS
1,0% Penicillin-Streptomycin 1,0% L-Glutamin
1,0% Na-Pyruvat in RPMI 1640
PBS-BSA-Puffer: 0,1% Rinderserum-Albumin (BSA) in PBS-Puffer
Formalin-Puffer: 4% Paraformaldehyd
in PBS
Saponin-Puffer: 0,1% Saponin
in PBS
MACS-Puffer: 0,5% BSA, 2mM EDTA
in PBS-Puffer
Einfriermedium: 20% DMSO in FCS
TAE-Puffer : 40mM Tris-Acetat
1mM EDTA in H2O
2.1.5 Antikörper
2.1.5.1 Antikörper für die Durchflusszytometrie
CD2-FITC RPA-2.10 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
CD3-APC UCHT1 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
CD16-FITC DJ130c (IgG1) DAKO, Hamburg
CD25-FITC ACT-1 (IgG1) DAKO, Hamburg
CD26-FITC CLB-22C3 (IgG1) Caltag, Hamburg
CD56-FITC NCAM1.2 (IgG1) Becton Dickinson, Heidelberg
CD56-PE My31 (IgG1) Becton Dickinson, Heidelberg
CD94-PE HP-3D9 (IgG1) DAKO, Hamburg
CD158a-PE EB6 (IgG1) Immunotech, Krefeld
CD158b-PE GL183 (IgG1) Immunotech, Krefeld
CD161-FITC DX12 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
IFNγ-FITC 4S.B3 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
NKB1-PE Z27.3.7 (IgG1) Immunotech, Krefeld
p50.3-PE FES172 (IgG2a) Immunotech, Krefeld
TNFα-FITC MAb11 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
HLA-DR-PE Immu-357 (IgG1) Immunotech, Krefeld
2.1.5.2 Antikörper für die Zellseparation
NK-Zell-Isolationskit Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach Reagenz A: Hapten-konjugierte Antikörper gegen:
CD3 CD14 CD19 CD36 IgE
Reagenz B: MACS Anti-Hapten MicroBeads
2.1.6 Reagentien für die Molekularbiologie
2.1.6.1 RNeasy Mini Kit, RNA-Isolationskit Fa. Qiagen, Hilden RLT-Puffer mit 1% β-Mercaptoethanol
RW1-Puffer RPE-Puffer
RNase-freies Wasser QIAshredder-Säulen RNeasy-Minispin Säulen
2.1.6.2 Enzyme
Taq-Polymerase AmpliTaqGold Fa. PE Applied Biosystems, CA,USA OmniscriptRT, Reverse Transkriptase Fa. Qiagen, Hilden
2.1.6.3 Oligonukleotide (Primer) Fa. MWG Biotech
CD94 sense GCA GTG TTT AAG ACC ACT CT
antisense CTG TTG CTT ACA GAT ATA ACG Länge: 527 Basenpaare
NKG2A sense CCA GAG AAG CTC ATT GTT G
antisense CCA ATC CAT GAG GAT GGT G Länge: 325 Basenpaare
NKG2C sense GGA AAT ATT CCA AGT AGA ATT AAA T antisense CTG ATG CAC TGT AAA CGC AAA T Länge: 619 Basenpaare
NKG2D sense CTG GGA GAT GAG TGA ATT TCA TA antisense GAC TTC ACC AGT TTA AGT AAA TC Länge: 416 Basenpaare
NKG2E sense CTG TGC TTC AAA GAA CTC TTC T
antisense CTG GTC TGA TAT AAG TCC ACG T Länge: 225 Basenpaare
Standard 350bp β-Actin Primer
2.1.7 Zelllinien
K562 Erythromyeloide Linie von einem Patienten mit
chronisch-myeloischer Leukämie
L721.221 Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierte B-
lymphoblastoide Linie mit fehlender MHC-I- Expression
L721.221 Transfektanten L721.221-Zellen mit transfizierter Expression von HLA-B27, -Cw6, -Cw7 (Ursprungslinie und Trans- fektanten wurden uns von Dolores Schendel, GSF, München, zur Verfügung gestellt)
2.1.8 Blutproben
Das Blut von Normalspendern wurde in der Blutbank der Medizinischen Hochschule in Einwegspritzen mit etwa 500 I.E. Liquemin pro 10ml abgenommen.
Bei den hier untersuchten 43 Patienten handelte es sich um Erwachsene mit Indika- tion zur Knochenmarktransplantation. Das Studiendesign wurde von der Ethikkomis- sion genehmigt. Die Grunderkrankungen der Patienten setzten sich zusammen aus 18 akuten myeloischen Leukämien, 13 chronisch-myeloischen Leukämien, fünf aku- ten lymphatischen Leukämien, zwei myelodysplastischen Syndromen, zwei aplasti- schen Anämien, einem Mantelzell-Lymphom, einem Non-Hodgkin-Lymphom und ei- nem Plasmozytom. Das mittlere Alter der Patienten betrug 39,6 Jahre (13-60).
Das Prinzip der Knochenmarktransplantation besteht darin, das entartete hämato- poetische System im Patienten zu zerstören und durch gesunde Stammzellen zu er-
setzen, welche im Knochenmark des Patienten anwachsen und neue, reife Zellen hervorbringen. Die Konditionierung vor der Transplantation bestand aus der Gabe von Zytostatika aus der Familie der Alkylantien, wie Cyclophosphamid, Busulfan oder Melphalan. Dazu kam in einigen Fällen eine Ganzkörperbestrahlung und auch die Verabreichung von Anti-Thymozyten-Globulin (ATG), welches gegen frühe T-Zellen gerichtet ist. Das Transplantat bestand durchschnittlich aus 6x106 CD34+ Zellen pro kg Körpergewicht und war in der Regel nicht T-Zell-depletiert. Es stammte von Fremdspendern oder Geschwistern der Patienten und war HLA-identisch. Nach der Transplantation erhielten die Patienten eine immunsuppressive Behandlung zur Pro- phylaxe der GvHD bestehend aus Ciclosporin A und Methotrexat.
Blutproben wurden zu vier Zeitpunkten gewonnen. Die erste Blutprobe stammte von dem Empfänger vor Transplantation, vor Beginn der Konditionierung. Nach Trans- plantation wurde die erste Blutprobe etwa zum Zeitpunkt des Engraftments abge- nommen. Das ist der Zeitpunkt zu dem die fremden Stammzellen im Körper des Pa- tienten anwachsen und erste neu gebildete Lymphozyten im Blut zu finden sind. Die weiteren Zeitpunkte schlossen sich an Tag 50 und an Tag 100 nach Transplantation an. An den gleichen Untersuchungszeitpunkten nach Transplantation wurde der Chimärismus der Patienten bestimmt um zu überwachen, ob die Tansplantation er- folgreich war und ob die neugebildeten Zellen ausschließlich vom Empfänger stam- men.
2.2 Methoden
2.2.1 Isolierung von Lymphozyten
Die Isolierung von Lymphozyten aus Blut von gesunden Spendern oder Patientenblut erfolgte über eine Dichtegradientenzentrifugation. 10 bzw. 20 ml heparinisiertes Voll- blut wurde zunächst 1:2 mit PBS-Puffer verdünnt und dann mit 10ml Ficoll- Trennlösung, Dichte 1,077, in 50ml-Röhrchen unterschichtet. Nach 20min Zentrifu- gation bei 1000g wurde die Interphase, die die mononukleären Zellen als Ring über der Ficoll-Lösung enthielt, abgenommen. Die so isolierte Fraktion wurde daraufhin in 50ml PBS-Puffer bei 1000g und anschließend mit 10ml PBS-Puffer bei 300g gewa- schen. Abschließend wurden die Zellen in 2ml PBS-Puffer resuspendiert und gezählt.
2.2.2 Zellzählung
20µl der Zellsuspension wurden mit 380µl 3%iger Essigsäure verdünnt. Diese Sus- pension wurde in eine Neubauer-Zählkammer (Kammertiefe 0,1mm) pipettiert. Unter dem Mikroskop wurden zwei diagonal gegenüberliegende Eckquadrate (2 x 1mm2) ausgezählt und das Endergebnis aus der Berechnung (siehe Formel) zur Ermittlung der Zellzahl pro Milliliter mit 103 multipliziert.
Anzahl Zellen
Ausgezählte Fläche (mm ) x Kammertiefe (mm) x Verdünnung
2
= Zellen pro 1 µl Blut
Die Vitalitätsbestimmung erfolgte über die Verdünnung eines Zellaliquots mit phy- siologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Trypanblau. Der Anteil der blaugefärbten toten Zellen wurde als Prozentsatz der insgesamt gezählten Zellen errechnet.
2.2.3 Durchflusszytometrie
2.2.3.1 Phänotypische Analyse von Oberflächenmarkern
In der FACS-Analyse („fluorescent activated cell sorting“) wird die Expression von Proteinen auf der Oberfläche von Zellen gemessen. Dabei werden die Zellen mit spezifischen Antikörpern gegen das zu untersuchende Antigen inkubiert. Die Analy- sen wurden mit FITC-, PE- oder APC-konjugierten Antikörpern als direkte Zwei- oder Dreifarbenfluoreszenzen durchgeführt.
Pro Ansatz wurden in einer 96-well-Rundbodenplatte etwa 3x105 isolierte periphere mononukleäre Zellen (peripheral blood mononuclear cells – PBMC), isolierte NK- Zellen oder Klone pro Well in etwa 50µl PBS pipettiert. Zur Blockade unspezifischer Bindungen der Antikörper an Fcγ-Rezeptoren der Zellen wurden 10µl einer Immung- lobulin G-Suspension (Gammagard) pro Ansatz zugegeben. Anschließend wurden die mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierten Antikörper in der vom Hersteller emp- fohlenen Dosierung zugegeben. Als Verdunstungsschutz wurden die Platten mit ei- ner Klebefolie verschlossen und 30min bei 4°C inkubiert. Nach dreimaligem Wa- schen mit je 150µl PBS/BSA-Puffer wurden die Zellen in 200-300µl PBS/BSA-Puffer in PS-Röhrchen überführt und im FACS analysiert.
2.2.3.2 Intrazelluläre Zytokinbestimmung
Die Expression von Proteinen, die nicht auf der Oberfläche von Zellen exprimiert werden, kann durch eine intrazelluläre FACS-Analyse („intracellular cytokine stai- ning“ – ICS) analysiert werden. Die intrazelluläre Anfärbung von Zytokinen mit fluo- reszierenden Antikörpern erfordert zunächst eine Stimulation der peripheren Blut- lymphozyten bzw. isolierter NK-Zellen durch PMA und Ionomycin. Die zu untersuchenden Zellen wurden in R10 suspendiert und in 5ml-Röhrchen gegeben.
20µl PMA (2,5%) und anschließend 20µl Ionomycin (0,025%) wurden in jeden Ansatz pipettiert und bei 37°C eine Stunde im Brutschrank inkubiert. 20µl Brefeldin A (0,5%) wurden zugegeben, um den intrazellulären Transport über den Golgi-Apparat in der Zelle zu unterbinden und damit eine Sekretion der gebildeten Zytokine zu verhindern.
Vier Stunden nach Stimulation mit PMA/Ionomycin wurden die Zellen zweimal mit PBS/BSA-Puffer gewaschen.
Zur Färbung der Zytokine in Kombination mit Oberflächenmolekülen wurden die Zel- len auf Vertiefungen einer 96-well-Rundbodenplatte verteilt, die unspezifischen Bin- dungen mit IgG blockiert und die Antikörper gegen die zu untersuchenden Oberflä- chenmoleküle zugegeben. Nach 30min Inkubation bei 4°C und einmaligem Waschen wurden die Zellen in 100µl 4%igem Paraformaldehyd resuspendiert und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die fixierten Zellen dann in 50µl Saponin-Puffer resuspendiert, einem Detergenz, das die Zellmembran permeabilisiert, so dass die gegen die Zytokine gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper eindringen konnten. Diese Antikörper wurden in der empfohlenen Dosie- rung zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei 4°C und dreimaligem Waschen konn- ten die Zellen im FACS gemessen werden.
2.2.3.3 Durchflußzytometrie
Die Immunfluoreszenzen wurden mit einem Zytofluorometer (FACS, engl.: Fluo- rescence-activated Cell Sorter) ausgewertet. Hierbei werden die Zellen über ein Schlauchsystem aufgesaugt und mit Druck in einen sogenannten Mantelstrahl (Sheath) injiziert. Die Zellen werden so beschleunigt und hintereinander aufgereiht, dass sie einzeln in die Meßkammer gelangen. Dort wird jede Zelle vom Laserstrahl getroffen. Das gestreute Licht wird bei 180° (FSC = forward light scatter) und 90°
(SSC = sideward light scatter) gemessen. Die entstehende Streuung ist zelltypspezi- fisch und abhängig von der Größe der Zellen (FSC) sowie deren Granularität (SSC).
So entstehen in der Dot Plot Grafik abgegrenzte Punktwolken für Granulozyten, Mo- nozyten, Lymphozyten und Erythrozyten. Die Lymphozyten werden über ein „Gate“
eingegrenzt und somit von den anderen Zelltypen für die Analyse getrennt.
Je Ansatz wurden 20000 bis 50000 Lymphozyten ausgewertet. Bei der Fluoreszenz- analyse werden die einzelnen Zellen durch einen Laser angeregt und an elektroni- schen Detektoren vorbeigeführt, die die Fluoreszenzintensität der Zelle registrieren.
Die Autofluoreszenz wurde durch Negativkontrollen bestimmt und am Computer mit Hilfe von CellQuest-Software diskriminiert. Die prozentuale Verteilung negativer und positiver Zellen wurde dann im Dot Plot ermittelt. Die Expressionsdichte des entspre- chenden Antigens wird durch die Höhe der Fluoreszenzintensität (MFI = mittlere Fluoreszenzintensität) repräsentiert. Bei der Auswertung mit entsprechenden Com- puterprogrammen (CELLQuest oder WinMDI) wurde der Dot Plot in Quadranten unterteilt sowie die Verteilung der Zellen und die MFI des jeweiligen Quadranten er- mittelt.
Um bei der Analyse von NK-Zellen aus peripheren Blutlymphozyten die T-Zellen auszugrenzen, wurde bei der Auswertung ein zusätzliches „Gate“ um die CD3+- Zellen konstruiert und diese Zellen von der Analyse der CD56+-Zellen ausgeschlos- sen.
2.2.4 Zytotoxizitätstest
Die Zytotoxizität von Lymphozyten und aufgereinigten NK-Zellen wurde in einem standardisierten 51Chrom-Freisetzungstest ermittelt. Alle Werte wurden in Dreifach- messungen bestimmt. 1-2 x 106 Zielzellen (K562) wurden eine Stunde bei 37°C in 100µCi Na251CrO4 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal in RPMI 1640 mit 5% FCS gewaschen und in einer Konzentration von 5000 Zellen in 100µl in die Wells einer 96-Well Spitzbodenplatte pipettiert. Die Effektoren wurden in verschiede- nen Effektor : Target Verhältnissen in 50µl RPMI 1640 mit 5% FCS zugegeben. Die spontane Freisetzung wurde durch Zugabe von reinem Medium statt der Effektoren, die maximale Freisetzung durch Inkubation der Targetzellen mit 1% Triton-X-100 be- stimmt. Nach Zentrifugation bei 150g über 5min wurden die Ansätze bei 37°C inku- biert. Nach 4 Stunden wurden die Platten bei 300g für fünf Minuten zentrifugiert und 75µl des Überstandes aus den Wells in 0,6ml PS-Röhrchen überführt. Nach dem Verschließen der Röhrchen mit heissem Paraffin wurde die freigesetzte Radioaktivi- tät in einem Gamma-Counter gemessen. Die spezifische Lyse wurde wie folgt be- rechnet:
spezifische Freisetzung - spontane Freisetzung maximale Freisetzung - spontane Freisetzung
x 100 = spezifische Lyse
2.2.5 Aufreinigung von NK-Zellen über MACS
Zur Aufreinigung von NK-Zellen aus peripheren Blutlymphozyten wurde das Verfah- ren der negativen Selektion über Antikörper, die an magnetische Beads gekoppelt sind, angewendet. Bei der negativen Depletion werden Antikörper gewählt, die an die zu depletierenden, unerwünschten Zellen binden. Verwendet wurde das NK-Zell- Isolationskit von Miltenyi Biotec. In dem Hapten-Antikörper Cocktail sind monoklonale Antikörper gegen CD3, CD14, CD19, CD36 und IgE enthalten. Damit werden T- Zellen, B-Zellen, Monozyten, Makrophagen, Thrombozyten, Basophile, dendritische Zellen und frühe erythroide Zellen gebunden, an die magnetischen Beads gekoppelt und mittels eines Magneten aus der Zellsuspension entfernt.
Die 1x107 PBMC wurden in einem 5ml Röhrchen in 80µl MACS-Puffer aufgenom- men. Dazu wurden 20µl des Hapten-Antikörper Cocktail pipettiert und dann im Dunklen bei 4°C für 15min inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal mit 2ml MACS-Puffer gewaschen und anschließend in 80µl Puffer resuspendiert. 20µl der Anti-Hapten MicroBeads wurden zugegeben und bei 4°C für 15min inkubiert. Die Zellen wurden dann einmal mit 2ml MACS-Puffer gewaschen und in 500µl MACS- Puffer resuspendiert. Eine Säule vom Typ AS wurde vorbereitend mit einem 3-Wege- Hahn und darüber mit einer mit MACS-Puffer gefüllten Spritze und einer Kanüle zur Begrenzung der Durchflussrate versehen. Über die Spritze wurde die Säule mit dem fünffachen Säulenvolumen von unten gespült. Unter der Kanüle wurde zum Auffan- gen der Fraktion ein 5ml-Röhrchen plaziert. Anschließend wurde auf die vorbereitete Säule die Zellsuspension pipettiert und die Säule mit 5ml Puffer von unten gespült.
Die aufgefangene Fraktion enthielt die aufgereinigten NK-Zellen.
2.2.6 Generierung von NK-Zellklonen
Das Prinzip der Klonierung beruht darauf, Zellen durch Verdünnung der Zellsuspen- sion zu vereinzeln und die Einzelzelle dann durch optimale Bedingungen zur Ver- mehrung anzuregen.
Isolierte NK-Zellen wurden auf eine Verdünnung von 102 Zellen/15ml Kulturmedium für NK-Zellen mit 300 I.E. IL-2 eingestellt. Zusätzlich befanden sich in der Suspen- sion je 3x106 bei 50Gy bestrahlte, allogene PBMC und L721.221-Zellen als Feeder- zellen. Diese ca. 100 NK-Zellen enthaltende Suspension wurde auf die Vertiefungen einer 96-Well-Spitzbodenplatte verteilt. Dadurch befand sich theoretisch in jedem Well eine proliferationsfähige Einzelzelle. Alle drei Tage wurde etwa die Hälfte des Überstandes abgesaugt und durch Kulturmedium für NK-Zellen mit 600 I.E. IL-2 auf- gefüllt. Ungefähr an Tag 11 waren die proliferierenden Zellen soweit expandiert, dass sie makroskopisch als Zellpellet in den Plattenvertiefungen erkennbar waren. Ein kleiner Teil dieser Zellen wurde zur durchflusszytometrischen Phänotypisierung ent- nommen. Die nachgewiesen CD56+CD3- Zellen einer Vertiefung wurden abermals mit bestrahlten Feederzellen in Kulturmedium für NK-Zellen mit IL-2 auf 96-Well- Spitzbodenplatten verteilt. Nach erneuter Expansion der Zellen wurden die gewon- nenen NK-Zellklone in Kulturflaschen in einer Konzentration von 2x106 Zellen pro Milliliter Medium überführt. Alle zwei Tage erfolgte eine Zugabe von 300 I.E. IL-2 pro Milliliter Medium. Der Phänotyp der Zellen wurde regelmäßig durchflusszytometrisch kontrolliert.
2.2.7 Koinkubation von NK-Zellklonen mit L721.221-Zellen
NK-Zellklone wurden auf eine Konzentration von 1x106 Zellen/ml in Kulturmedium für NK-Zellen eingestellt. Je zwei Millilitern dieser Zellsuspension wurden 1x106 Zellen der Zelllinie L721.221 und ihrer Transfektanten zugegeben und diese in die Einheiten einer 24-Well-Zellkulturplatte pipettiert. Die mit den NK-Zellen kokultivierten Zellen exprimierten im Fall der Ursprungszelllinie kein HLA-I (721.221-WT). Die weiteren Ansätze enhielten Transfektanten dieser Zellen, die entweder HLA-Cw6, HLA-Cw7 oder HLA-Bw4 exprimierten.
Die NK-Zellklone wurden direkt vor der Koinkubation und von da an alle 24 Stunden aus den verschiedenen Ansätzen über fünf Tage auf die Expression der NK- Zellrezeptoren CD94, CD158a, CD158b, NKB1 und p50.3 phänotypisch untersucht.
2.2.8 Kreuzvernetzung von CD26
Um den Einfluß der Kreuzvernetzung von CD26-Molekülen auf der Oberfläche von NK-Zellen auf die Funktion und den Phänotyp der Zellen zu untersuchen, wurde ein unmarkierter Antikörper des Klones BA5 gegen die Dipeptidylpeptidase IV (CD26) verwendet.
2.2.8.1 Zytokinproduktion
Die Wirkung dieses Antikörpers auf die Zytokinbildung wurde so bestimmt, dass ein Teil der Zellen mit 20µl eines Kontrollantikörpers, 5E5, die übrigen Zellen in steigen- der Konzentration (1, 2, 10 und 20µl) mit dem BA5-Antikörper bei 37°C im Brut- schrank für 20min inkubiert wurden. Anschließend erfolgte die Stimulation mit PMA/Ionomycin und die intrazelluläre Bestimmung der Zytokine wie oben beschrie-
2.2.8.2 Zytotoxizität
Zur Bestimmung des Einflusses der Kreuzvernetzung von CD26 auf die Zytotoxizität wurden NK-Zellen aus peripheren Blutlymphozyten über den MACS, wie beschrie- ben, isoliert. Die erhaltenen NK-Zellen wurden in Kulturmedium für NK-Zellen aufge- nommen und mit 1000 I.E. IL-2 für fünf Tage bei 37°C im Brutschrank gehalten. An- schließend wurde die induzierte Expression von CD26 auf der Oberfläche der Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. Etwa eine Stunde vor Beginn des 51Cr-Release- Assays wurden 20µl BA5-Antikörper pro 1x105 Zellen auf die eine Hälfte der Zellen gegeben. Als Kontrolle erhielt die andere Hälfte der Zellen den Kontrollantikörper 5E5. Die Zytotoxizität wurde, wie oben beschrieben, bestimmt.
2.2.8.3 Aktivierungsmarker
Isolierte NK-Zellen wurden entsprechend dem vorher beschriebenen Zytotoxizitäts- versuch isoliert und mit IL-2 stimuliert. Der Antikörper gegen CD26 bzw. 5E5 wurde zugegeben und nach vierstündiger Inkubation die Expression der Aktivierungsmarker CD16, CD25, CD69 und HLA-DR durchflusszytometrisch bestimmt.
2.2.9 Isolation von RNA aus PBMC
Zur Isolation von RNA aus peripheren Blutlymphozyten von Patienten und Normal- spendern wurde der RNeasy Mini Kit von Qiagen verwendet. 1x107 Ficoll-isolierte PBMC wurden durch Zugabe von 600µl RLT-Puffer mit 1% β-Mercaptoethanol und mehrmaligem Resuspendieren denaturiert. Dieser Puffer enthält Guanidin- Isothiocyanat, das neben der Zerstörung der Zellen auch eine Inaktivierung des RNA-zerstörenden Enzyms RNase bewirkt. Das Zell-Lysat wurde auf eine QIAshred- der-Säule in einem 2ml-Sammelröhrchen gegeben und bei 13000rpm für drei Mi- nuten zentrifugiert. Die Säule, die die groben Zelltrümmer enthielt, wurde verworfen, 600µl 70%iger Ethanol in das Sammelröhrchen pipettiert und vorsichtig suspendiert.
Maximal 700µl der Probe wurde auf eine RNeasy-Minispin-Säule gegeben und eine Minute bei 10000rpm zentrifugiert. Der Unterstand wurde verworfen, die Säule mit dem Rest der Probe beladen und noch einmal bei 10000rpm für eine Minute zentri- fugiert. Die noch mit Zellbestandteilen kontaminierte RNA wurde in weiteren Schritten gereinigt. Dazu wurden 700µl RW1-Puffer auf die Säule gegeben und nach einminü- tiger Zentrifugation bei 10000rpm der Unterstand verworfen. In einem neuen Sam- melröhrchen wurde die Säule noch zweimal mit 500µl RPE-Puffer gewaschen: Das erste Mal mit einminütiger Zentrifugation bei 10000rpm und das zweite Mal bei ma- ximaler Geschwindigkeit (13000rpm) für drei Minuten. Zur Elution der RNA wurden in einem 1,5ml Eppendorf-Gefäß zweimal je 30µl RNase-freies Wasser auf die Säule gegeben und diese bei 10000rpm für je 10min zentrifugiert. Die gewonnene RNA konnte dann bei -80°C eingefroren werden.
2.2.10 RNA-Konzentrationsbestimmung
In einem Eppendorf-Gefäß wurde die RNA in einem Konzentrationsverhältnis von 1:100 in Wasser verdünnt (2µl RNA + 198µl Wasser). Diese Probe wurde im Photo-
lesene Wert ist die optische Dichte (OD) der RNA in dieser Probe. Daraus konnte wie folgt die RNA-Konzentration berechnet werden:
RNA-Konzentration [ng/µl] = OD260 x 40 x Verdünnung
Zur Kontrolle der gewonnenen RNA wurde diese mit Hilfe der Gelelektrophorese aufgetrennt. Dazu wurden 0,8g Agarose in 100ml TAE-Puffer kurz aufgekocht und nach Abkühlung auf etwa 50°C 5µl Ethidiumbromid zugegeben. Ethidiumbromid in- terkaliert in DNA- und RNA-Stränge und macht sie damit in UV-Licht sichtbar. Die Lösung wurde in eine vorbereitete Gelkammer gegossen. Als Laufpuffer diente ebenfalls TAE-Puffer. 5µl der RNA-Probe wurden mit 2µl Ladepuffer versetzt und in die eine der Geltaschen pipettiert. Bei einer angelegten Spannung von 80 Volt in der Elektrophoresekammer wandern die negativ geladenen Nukleinsäuren von der Ka- thode zur Anode und werden der Göße nach im Gel aufgetrennt.
2.2.11 RT-PCR
Die Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR „reverse transcrip- tase polymerase chain reaction“) dient zur spezifischen Amplifikation von Nuclein- säureabschnitten der cDNA, die durch das Enzym Reverse-Transkriptase aus mRNA gebildet wurde. Die cDNA wird zunächst durch Erhitzen zu Einzelsträngen denatu- riert. Kurze sequenzspezifische DNA-Einzelstränge lagern sich an (Primer- Annealing) und die zwischen den angelagerten Primern liegenden cDNA-Stränge werden durch das Enzym Taq-Polymerase amplifiziert.
Für die RT-Reaktion wurden 1µg der RNA mit 2µl OligodT-Primern vermischt und mit Wasser auf 30µl Gesamtmenge aufgefüllt. Das Annealing der OligodT-Primer er- folgte in 10min bei 65°C. Die Probe wurde anschließend auf Eis gestellt und 2µl dNTP-Mix, 2µl-10fach-Puffer und 0,5µl RNasin vermischt und die Reaktion durch
Zugabe von 1µl des Enzyms OmniskriptRT gestartet. Nach einer Stunde Inkubati- on bei 37°C ist die mRNA in komplementäre cDNA umgeschrieben.
Für die darauffolgende Polymerase-Kettenreaktion wurden in PCR-Tubes 2,5µl der cDNA mit 1µl dNTP-Mix, 1,5µl MgCl2, 1µl 10fach-Puffer und 15,5µl Wasser gemischt.
Zugegeben wurden je 4µl Sense-Primer und 4µl des entsprechenden Antisense- Primers und abschließend 0,5µl der Polymerase Ampli-Taq-Gold. Die Tubes wur- den in einem Thermocycler nach folgendem Programm behandelt:
10 min 94°C 1 min 94°C 1 min 56°C 1 min 72°C 5 min 72°C 4°C
Schritt 2-4 wurden 25 mal wiederholt, bevor Schritt 5 gestartet wurde.
Die erhaltenen Amplifikate wurden auf ein 1,2%iges Ethidiumbromid-Agarosegel auf- getragen und, wie oben beschrieben, elektrophoretisch aufgetrennt.
3.1 Rekonstitution der Lymphozytenpopulationen
Nach Transplantation sind die NK-Zellen die ersten rekonstituierenden Lymphozyten.
Damit stellen sie früh in der Rekonstitution, mit durchschnittlich 36% bei den hier untersuchten Patienten, eine dominierende Lymphozytenpopulation dar (Abb.1). Die Population der T-Zellen ist mit 42,6% nach Transplantation zunächst im Vergleich zu Normalspendern deutlich vermindert und steigt erst im Verlauf der Rekonstitution wieder an, während die relative Anzahl der NK-Zellen abnimmt (an Tag 100 24%
CD56+, 61% CD3+).
Abb. 1
vor TX d 25 d 50 d 100 0
20 40 60
Zeitpunkt
% CD56+
vor TX d 25 d 50 d 100 0
25 50 75 100
Zeitpunkt
% CD3+
A B
Abb. 1: Rekonstitution von NK-Zellen und T-Zellen nach allogener Stammzell- transplantation (SCTX): Die NK-Zellen (A) sind im Vergleich zum Ausgangswert nach SCTX erhöht und nehmen bis Tag 100 relativ zur Lymphozytenzahl wieder ab.
Die T-Zellen (B) sind an Tag 25 noch relativ vermindert und rekonstituieren erst zum Tag 100 vollständig. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von 43 Patienten.
Die Leukozytenzahlen und auch die Lymphozytenzahlen zeigen nach der Trans- plantation eine Zunahme bis zu Tag 50 und anschließend wieder eine leichte Ab- nahme zu Tag 100 (Tabelle 1). Der hohe Leukozytenwert vor der Transplantation ergibt sich durch die meist leukämischen Grunderkrankungen der Patienten.
vor
Transplantation Tag 25 Tag 50 Tag 100 Lymphozyten 1108 ± 165 677,5 ± 127 1641 ± 306 1348 ± 184
Leukozyten 8707 ± 2170 4698 ± 486 6465 ± 517 5685 ± 719
Tabelle 1: Rekonstitution von Leukozyten- und Lymhozytenzahlen nach alloge- ner Stammzelltransplantation: Nach der Transplantation nehmen die Lympho- zytenzahlen und die Leukozytenzahlen bis zum Tag 50 zunächst zu und bis Tag 100 wieder leicht ab.
3.2 Rekonstitution der NK-Zellrezeptoren
Jede NK-Zelle exprimiert mindestens einen Vertreter der inhibitorischen NK- Zellrezeptoren, die meisten auch mehrere. Nahezu jede NK-Zelle exprimiert den Lektin-ähnlichen Rezeptor CD94 in hoher Dichte. Stellvertretend für die Immunglobu- lin-ähnlichen Rezeptoren wurden CD158a, CD158b, NKB1 und p50.3 untersucht.
Im Folgenden werden die Daten dargestellt als relativer Anteil rezeptorexprimieren- der NK- bzw. T-Zellen an der Gesamtpopulation der NK- bzw. T-Zellen und auch die jeweilige Expressionsdichte, da die absoluten Zahlen durch rekonstitutionsbedingte Schwankungen der Lymphozytenzahlen beeinflusst werden können. Zusätzlich wer- den die Zellzahlen auch durch Medikamente beeinflusst, die zur Prophylaxe der Graft-versus-Host Erkrankung, Infektionsprophylaxe und –behandlung und auch zur Begünstigung des neuen Zellwachstums den Patienten in unterschiedlicher Kombi- nation verabreicht wurden.
Die angegebenen Durchschnittswerte ergeben sich aus den Werten vor Transplanta- tion und von Tag 100 nach Transplantation, da an diesen Zeitpunkten vollständig ausdifferenzierte NK-Zellen zu erwarten sind.
3.2.1 Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren
Auf den unreifen NK-Zellen direkt nach der Stammzelltransplantation (SCTX) werden Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren nur zu einem geringen Anteil exprimiert. Zu die- sem Zeitpunkt des Engraftments beginnen die transplantierten Donor-Stammzellen in der neuen Umgebung zu reifen. Mit der Reifung der NK-Zellen nimmt die Expression der Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren tendenziell zu, ist aber bei vielen Patienten noch Schwankungen unterworfen. Die bei reifen NK-Zellen erreichte Expressionsfre- quenz und Dichte bleibt dann weiterhin stabil.
3.2.1.1 CD158a
Der Antikörper gegen CD158a (EB6) erkennt die beiden Isoformen KIR2DL1 (inhibie- rend) und KIR2DS1 (aktivierend). Dieser Rezeptor wird auf durchschnittlich 17,8 (±15,7)% der NK-Zellen in einer durchschnittlichen Dichte von 175,8 (±136,4) MFI exprimiert. Die spezifischen Liganden sind HLA-C-Moleküle der Gruppe 1. Die Mit- telwerte dieses Rezeptors erreichen im Verlauf der Rekonstitution an Tag 100 (Zeit- punkt 4) etwa den Wert, der vor der Transplantation gemessen wurde und der der durchschnittlichen Expression dieses Rezeptors entspricht (Abb. 2A). Der Rezeptor CD158a wird vor und nach der Transplantation in ähnlicher Dichte exprimiert. An Tag 100 ist die Expressionsdichte etwa 20% höher als zu den anderen Untersuchungs- zeitpunkten (Abb. 2B).
vor TX d 25 d 50 d 100 0
10 20 30 40
Zeitpunkt
% CD158a+/CD56+ CD3-
vor Tx d 25 d 50 d100 0
100 200 300 400
Zeitpunkt
MFI
A B
Abb. 2: Rekonstitution von CD158a+ NK-Zellen nach allogener Stammzelltrans- plantation: Die relative Anzahl CD158a+ NK-Zellen (A) ist an Tag 25 noch niedriger als zu den anderen Untersuchungszeitpunkten. Die Zellen rekonstituieren bis zum Tag 100 vollständig. Die Expressionsdichte (B) verändert sich nach SCTX bis auf eine leichte Zunahme an Tag 100 nur wenig. Gezeigt sind Mittelwerte und Standard- abweichungen von 43 Patienten.
3.2.1.2 CD158b
GL183, der monoklonale Antikörper gegen CD158b, bindet an die inhibierenden KIR2DL2/3 und den aktivierenden KIR2DS2. 28 (±12,8)% der NK-Zellen exprimieren CD158b mit einer MFI von 778,2 (±339,5). Die Liganden dieses Rezeptors sind HLA- C-Moleküle der Gruppe 2. Das Rekonstitutionsmuster der NK-Zellen, die diesen Re- zeptor exprimieren, stellt sich in einem flacheren Verlauf dar und der durchschnittli- che Wert der Expression liegt an Tag 100 bei 25,5%, unterscheidet sich aber nicht signifikant von dem Ausgangswert vor Transplantation (31,2%) (Abb. 3A). Die Ex- pressionsdichte dieses Rezeptors ist während der vier Untersuchungspunkte nahezu unverändert (Abb. 3B).
vor TX d 25 d 50 d 100 0
10 20 30 40 50
Zeitpunkt vor Tx d 25 d 50 d 100
0 500 1000 1500
Zeitpunkt
MFI
A B
% CD158b+/CD56+ CD3-
Abb. 3: Rekonstitution von CD158b+ NK-Zellen nach allogener Stammzelltrans- plantation: Die relative Anzahl CD158b+ NK-Zellen (A) ist an Tag 25 nur leicht ver- mindert. Diese Zellen rekonstituieren bis zum Tag 100 vollständig. Die Expressions- dichte (B) bleibt nach SCTX gleich. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von 43 Patienten.
3.2.1.3 NKB1
NKB1 ist ein immunglobulin-ähnlicher Rezeptor mit den Isoformen KIR3DL1 und KIR3DS1, die von 17,5 (±13)% der untersuchten NK-Zellen mit einer durchschnittli- chen Fluoreszenzintensität von 346,5 (±275,1) exprimiert werden. Der Antikörper ist Z27.3.7. HLA-Moleküle der Gruppe Bw4 binden an diesen Rezeptor. Die Mittelwerte für NKB1 zeigen keine gerichtete Entwicklung nach Transplantation. Zu den vier Zeitpunkten sind die erhaltenen Werte auf einem ähnlichen Level, der vor Trans- plantation leicht erhöht ist (18,7%) und zum Tag 100 nach KMT tendenziell abnimmt (16,1%) (Abb. 4A). Die Expressionsdichte dieses Rezeptors auf NK-Zellen nimmt dagegen von einem relativ niedrigen Wert vor Transplantation (MFI=260,4) im Ver- lauf der Rekonstitution leicht zu (MFI=402,2 an Tag 100) (Abb. 4B).
vorTX d25 d50 d100 0
10 20 30 40
Zeitpunkt vor Tx d 25 d 50 d 100
0 250 500 750
Zeitpunkt
MFI
A B
% NKB1+/CD56+ CD3-
Abb. 4: Rekonstitution von NKB1+ NK-Zellen nach allogener Stammzelltrans- plantation: Die relative Anzahl NKB1+ NK-Zellen (A) verändert sich zu den Unter- suchungszeitpunkten kaum. Die Expressionsdichte dieses Rezeptors (B) nimmt nach SCTX zu jedem der Untersuchungszeitpunkte leicht zu. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von 43 Patienten.
3.2.1.4 p50.3
Der monoklonale Antikörper FES172 ist der einzige Antikörper gegen einen Im- munglobulin-ähnlichen NK-Zellrezeptor, der ausschließlich an eine aktivierende Iso- form (KIR2DS4) bindet. Eine weitere Besonderheit im Vergleich zu den anderen Re- zeptoren ist, dass dieser nur von 40% der untersuchten Patienten exprimiert wird.
Die durchschnittliche Anzahl p50.3+ NK-Zellen beträgt 33,4 (±20,5)% der Lympho- zyten. NK-Zellen exprimieren diesen Rezeptor in einer durchschnittlichen Dichte von 377 (±402.3) MFI. Der Ligand für diesen Rezeptor ist nicht genau identifiziert, gehört aber vermutlich ebenfalls zu den HLA-C-Molekülen.
vor Tx d 25 d 50 d 100 0
25 50 75
Zeitpunkt vor Tx d 25 d 50 d 100
0 250 500 750 1000
Zeitpunkt
MFI
A B
% p50.3+/CD56+ CD3-
Abb. 5: Rekonstitution von p50.3+ NK-Zellen nach allogener Stammzelltrans- plantation: Die relative Anzahl p50.3+ NK-Zellen (A) nimmt bis zu Tag 50 nach SCTX zu und zu Tag 100 wieder leicht ab. Die Expressionsdichte (B) verändert sich nach SCTX bis auf einen leicht erniedrigten Wert direkt nach der Transplantation nur wenig. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von 22 Patienten.
Das Rekonstitutionsmuster der NK-Zellen, die diesen Rezeptor tragen, zeigt einen Maximalwert an Tag 50 nach Transplantation von 38,4% p50.3+ NK-Zellen. Später in
der Rekonstitution (Tag 100) wird dieser aktivierende Rezeptor wieder von weniger NK-Zellen exprimiert (Abb. 5A). Die Expressionsdichte bleibt während der Rekonsti- tution auf durchschnittlichem Niveau und ist auch direkt nach Transplantation mit ei- ner MFI von 327,4 nur etwas erniedrigt (Abb. 5B).
3.2.1.5 KIR-Rekonstitution auf CD56dim-NK-Zellen
Innerhalb des NK-Zellkompartiments werden die Immunglobulin-ähnlichen Rezepto- ren nur von den CD56dim-NK-Zellen exprimiert (siehe 3.5.1). Das Verhältnis der bei- den NK-Zell-Subpopulationen (CD56dim vs. CD56bright) verschiebt sich in der Rekon- stitution nach Stammzelltransplantation insofern, als dass die CD56bright NK-Zellen direkt nach Transplantation zunächst stärker als in Normalkontrollen vertreten sind (Abb.18) und diese Population in der Regel während der Rekonstitution wieder zu- gunsten der CD56dim-NK-Zellen abnimmt. Wird die Rekonstitution der KIR- exprimierenden NK-Zellen ausschließlich in Relation zu den CD56dim NK-Zellen be- obachtet indem die CD56bright Zellen ausgeschlossen werden, um den Einfluss dieser Schwankung zu verhindern, zeigt sich das gleiche Rekonstitutionsmuster mit ent- sprechenden Standardabweichungen wie in der üblichen Auswertung bezogen auf alle NK-Zellen (nicht dargestellt).
