2.1.1 Chemikalien:
Agarose Fa. Gibco, Eggestein
Brefeldin A Fa. Sigma-Aldrich, München
BSA Fa. Behring, Marburg
Dimethylsulfoxid Fa. Sigma-Aldrich, München Desoxynucleosidtriphosphate (dNTP) Fa. Promega, Madison, WI, USA EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Fa. Sigma-Aldrich, München
Essigsäure Fa. Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Fa. Sigma-Aldrich, München
Ethylendiamidtetraacetat (EDTA) Fa. Sigma-Aldrich, München FCS (fetal calf serum) Fa. PAA, Linz, Österreich
Ficoll Fa. Biochrom, Berlin
Humanes AB-Serum Blutbank, MHH, Hannover
L-Glutamin Fa. Gibco, Eggestein
Heparin-Natrium (Liquemin) Fa. Roche, Grenzach-Whylen
Ionomycin Fa. Sigma-Aldrich, München
β-Mercaptoethanol Fa. Merck, Darmstadt
Na2-51CrO4 Fa. Amersham, Braunschweig
Natriumpyruvat Fa. Gibco, Eggestein
Paraffin Fa. Sigma-Aldrich, München
PBS Fa. Gibco, Eggestein
Penicillin-Streptomycin Fa. Biochrom, Berlin
PMA Fa. Sigma-Aldrich, München
Rekombinantes IL-2 Fa. Cetus, Emeryville, USA
RPMI 1640 Fa. Biochrom, Berlin
Sheath-Lösung (Isoton-II) Fa. Beckman-Coulter, Krefeld
Triton-X-100 Fa. Merck, Darmstadt
Trypanblau Fa. Merck, Darmstadt
2.1.2 Verbrauchsmaterial
15ml, 50ml Röhrchen Fa. Greiner, Frickenhausen 50ml, 250ml Zellkulturflaschen Fa. Greiner, Frickenhausen 96-Well Rundbodenplatten Fa. Greiner, Frickenhausen
96-Well Spitzbodenplatten Fa. ICN Biomedicals, Aurora, USA 24-Well-Zellkulturplatten Fa. Greiner, Frickenhausen
Klebefolien für 96-well-Platten Fa. Nunc, Wiesbaden PS (Polystyrol)-Röhrchen (0,6ml) Fa. Greiner, Frickenhausen Säulen zur negativen Depletion (AS)
mittels magnetischer Verfahren Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach Sterilfilter (EasyflowTM) Fa. Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA
2.1.3 Geräte
Brutschrank (CO2-Auto-Zero) Fa. Heraeus, Osterode
Cäsiumquelle (GammaCell2000) Fa. Mølsgaard Medical, Dänemark Durchflusszytometer (FACScalibur) Fa. Becton Dickinson, San Jose, USA
Gamma-Counter Fa. Berthold, Isernhagen
Gelelektrophoresekammer Fa. Bio-Rad, München Heizblock, Modell 5436 Fa. Eppendorf, Hamburg
Photometer (UV-Meter 1202) Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan
Sterilbank (Lamina Air Flow) Fa. Heraeus, Osterode
Zentrifuge (J-6B) Fa. Beckman, München
Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS) Fa. Heraeus, Osterode Zentrifuge (Biofuge pico) Fa. Heraeus, Osterode
2.1.4 Puffer und Medien
Kulturmedium für NK-Zellen: 16,5% humanes AB-Serum 1,0% Penicillin-Streptomycin 1,0% L-Glutamin
1,0% Na-Pyruvat in RPMI 1640
10%iges FCS-Medium (R10): 10,0% FCS
1,0% Penicillin-Streptomycin 1,0% L-Glutamin
1,0% Na-Pyruvat in RPMI 1640
PBS-BSA-Puffer: 0,1% Rinderserum-Albumin (BSA) in PBS-Puffer
Formalin-Puffer: 4% Paraformaldehyd
in PBS
Saponin-Puffer: 0,1% Saponin
in PBS
MACS-Puffer: 0,5% BSA, 2mM EDTA
in PBS-Puffer
Einfriermedium: 20% DMSO in FCS
TAE-Puffer : 40mM Tris-Acetat
1mM EDTA in H2O
2.1.5 Antikörper
2.1.5.1 Antikörper für die Durchflusszytometrie
CD2-FITC RPA-2.10 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
CD3-APC UCHT1 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
CD16-FITC DJ130c (IgG1) DAKO, Hamburg
CD25-FITC ACT-1 (IgG1) DAKO, Hamburg
CD26-FITC CLB-22C3 (IgG1) Caltag, Hamburg
CD56-FITC NCAM1.2 (IgG1) Becton Dickinson, Heidelberg
CD56-PE My31 (IgG1) Becton Dickinson, Heidelberg
CD94-PE HP-3D9 (IgG1) DAKO, Hamburg
CD158a-PE EB6 (IgG1) Immunotech, Krefeld
CD158b-PE GL183 (IgG1) Immunotech, Krefeld
CD161-FITC DX12 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
IFNγ-FITC 4S.B3 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
NKB1-PE Z27.3.7 (IgG1) Immunotech, Krefeld
p50.3-PE FES172 (IgG2a) Immunotech, Krefeld
TNFα-FITC MAb11 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg
HLA-DR-PE Immu-357 (IgG1) Immunotech, Krefeld
2.1.5.2 Antikörper für die Zellseparation
NK-Zell-Isolationskit Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach Reagenz A: Hapten-konjugierte Antikörper gegen:
CD3 CD14 CD19 CD36 IgE
Reagenz B: MACS Anti-Hapten MicroBeads
2.1.6 Reagentien für die Molekularbiologie
2.1.6.1 RNeasy Mini Kit, RNA-Isolationskit Fa. Qiagen, Hilden RLT-Puffer mit 1% β-Mercaptoethanol
RW1-Puffer RPE-Puffer
RNase-freies Wasser QIAshredder-Säulen RNeasy-Minispin Säulen
2.1.6.2 Enzyme
Taq-Polymerase AmpliTaqGold Fa. PE Applied Biosystems, CA,USA OmniscriptRT, Reverse Transkriptase Fa. Qiagen, Hilden
2.1.6.3 Oligonukleotide (Primer) Fa. MWG Biotech
CD94 sense GCA GTG TTT AAG ACC ACT CT
antisense CTG TTG CTT ACA GAT ATA ACG Länge: 527 Basenpaare
NKG2A sense CCA GAG AAG CTC ATT GTT G
antisense CCA ATC CAT GAG GAT GGT G Länge: 325 Basenpaare
NKG2C sense GGA AAT ATT CCA AGT AGA ATT AAA T antisense CTG ATG CAC TGT AAA CGC AAA T Länge: 619 Basenpaare
NKG2D sense CTG GGA GAT GAG TGA ATT TCA TA antisense GAC TTC ACC AGT TTA AGT AAA TC Länge: 416 Basenpaare
NKG2E sense CTG TGC TTC AAA GAA CTC TTC T
antisense CTG GTC TGA TAT AAG TCC ACG T Länge: 225 Basenpaare
Standard 350bp β-Actin Primer
2.1.7 Zelllinien
K562 Erythromyeloide Linie von einem Patienten mit
chronisch-myeloischer Leukämie
L721.221 Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierte
B-lymphoblastoide Linie mit fehlender MHC-I-Expression
L721.221 Transfektanten L721.221-Zellen mit transfizierter Expression von HLA-B27, -Cw6, -Cw7 (Ursprungslinie und Trans-fektanten wurden uns von Dolores Schendel, GSF, München, zur Verfügung gestellt)
2.1.8 Blutproben
Das Blut von Normalspendern wurde in der Blutbank der Medizinischen Hochschule in Einwegspritzen mit etwa 500 I.E. Liquemin pro 10ml abgenommen.
Bei den hier untersuchten 43 Patienten handelte es sich um Erwachsene mit Indika-tion zur KnochenmarktransplantaIndika-tion. Das Studiendesign wurde von der Ethikkomis-sion genehmigt. Die Grunderkrankungen der Patienten setzten sich zusammen aus 18 akuten myeloischen Leukämien, 13 chronisch-myeloischen Leukämien, fünf aku-ten lymphatischen Leukämien, zwei myelodysplastischen Syndromen, zwei aplasti-schen Anämien, einem Mantelzell-Lymphom, einem Non-Hodgkin-Lymphom und ei-nem Plasmozytom. Das mittlere Alter der Patienten betrug 39,6 Jahre (13-60).
Das Prinzip der Knochenmarktransplantation besteht darin, das entartete hämato-poetische System im Patienten zu zerstören und durch gesunde Stammzellen zu
er-setzen, welche im Knochenmark des Patienten anwachsen und neue, reife Zellen hervorbringen. Die Konditionierung vor der Transplantation bestand aus der Gabe von Zytostatika aus der Familie der Alkylantien, wie Cyclophosphamid, Busulfan oder Melphalan. Dazu kam in einigen Fällen eine Ganzkörperbestrahlung und auch die Verabreichung von Anti-Thymozyten-Globulin (ATG), welches gegen frühe T-Zellen gerichtet ist. Das Transplantat bestand durchschnittlich aus 6x106 CD34+ Zellen pro kg Körpergewicht und war in der Regel nicht T-Zell-depletiert. Es stammte von Fremdspendern oder Geschwistern der Patienten und war HLA-identisch. Nach der Transplantation erhielten die Patienten eine immunsuppressive Behandlung zur Pro-phylaxe der GvHD bestehend aus Ciclosporin A und Methotrexat.
Blutproben wurden zu vier Zeitpunkten gewonnen. Die erste Blutprobe stammte von dem Empfänger vor Transplantation, vor Beginn der Konditionierung. Nach Trans-plantation wurde die erste Blutprobe etwa zum Zeitpunkt des Engraftments abge-nommen. Das ist der Zeitpunkt zu dem die fremden Stammzellen im Körper des Pa-tienten anwachsen und erste neu gebildete Lymphozyten im Blut zu finden sind. Die weiteren Zeitpunkte schlossen sich an Tag 50 und an Tag 100 nach Transplantation an. An den gleichen Untersuchungszeitpunkten nach Transplantation wurde der Chimärismus der Patienten bestimmt um zu überwachen, ob die Tansplantation er-folgreich war und ob die neugebildeten Zellen ausschließlich vom Empfänger stam-men.