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2.1.1 Chemikalien:

Agarose Fa. Gibco, Eggestein

Brefeldin A Fa. Sigma-Aldrich, München

BSA Fa. Behring, Marburg

Dimethylsulfoxid Fa. Sigma-Aldrich, München Desoxynucleosidtriphosphate (dNTP) Fa. Promega, Madison, WI, USA EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Fa. Sigma-Aldrich, München

Essigsäure Fa. Merck, Darmstadt

Ethidiumbromid Fa. Sigma-Aldrich, München

Ethylendiamidtetraacetat (EDTA) Fa. Sigma-Aldrich, München FCS (fetal calf serum) Fa. PAA, Linz, Österreich

Ficoll Fa. Biochrom, Berlin

Humanes AB-Serum Blutbank, MHH, Hannover

L-Glutamin Fa. Gibco, Eggestein

Heparin-Natrium (Liquemin) Fa. Roche, Grenzach-Whylen

Ionomycin Fa. Sigma-Aldrich, München

β-Mercaptoethanol Fa. Merck, Darmstadt

Na2-51CrO4 Fa. Amersham, Braunschweig

Natriumpyruvat Fa. Gibco, Eggestein

Paraffin Fa. Sigma-Aldrich, München

PBS Fa. Gibco, Eggestein

Penicillin-Streptomycin Fa. Biochrom, Berlin

PMA Fa. Sigma-Aldrich, München

Rekombinantes IL-2 Fa. Cetus, Emeryville, USA

RPMI 1640 Fa. Biochrom, Berlin

Sheath-Lösung (Isoton-II) Fa. Beckman-Coulter, Krefeld

Triton-X-100 Fa. Merck, Darmstadt

Trypanblau Fa. Merck, Darmstadt

2.1.2 Verbrauchsmaterial

15ml, 50ml Röhrchen Fa. Greiner, Frickenhausen 50ml, 250ml Zellkulturflaschen Fa. Greiner, Frickenhausen 96-Well Rundbodenplatten Fa. Greiner, Frickenhausen

96-Well Spitzbodenplatten Fa. ICN Biomedicals, Aurora, USA 24-Well-Zellkulturplatten Fa. Greiner, Frickenhausen

Klebefolien für 96-well-Platten Fa. Nunc, Wiesbaden PS (Polystyrol)-Röhrchen (0,6ml) Fa. Greiner, Frickenhausen Säulen zur negativen Depletion (AS)

mittels magnetischer Verfahren Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach Sterilfilter (EasyflowTM) Fa. Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

2.1.3 Geräte

Brutschrank (CO2-Auto-Zero) Fa. Heraeus, Osterode

Cäsiumquelle (GammaCell2000) Fa. Mølsgaard Medical, Dänemark Durchflusszytometer (FACScalibur) Fa. Becton Dickinson, San Jose, USA

Gamma-Counter Fa. Berthold, Isernhagen

Gelelektrophoresekammer Fa. Bio-Rad, München Heizblock, Modell 5436 Fa. Eppendorf, Hamburg

Photometer (UV-Meter 1202) Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan

Sterilbank (Lamina Air Flow) Fa. Heraeus, Osterode

Zentrifuge (J-6B) Fa. Beckman, München

Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS) Fa. Heraeus, Osterode Zentrifuge (Biofuge pico) Fa. Heraeus, Osterode

2.1.4 Puffer und Medien

Kulturmedium für NK-Zellen: 16,5% humanes AB-Serum 1,0% Penicillin-Streptomycin 1,0% L-Glutamin

1,0% Na-Pyruvat in RPMI 1640

10%iges FCS-Medium (R10): 10,0% FCS

1,0% Penicillin-Streptomycin 1,0% L-Glutamin

1,0% Na-Pyruvat in RPMI 1640

PBS-BSA-Puffer: 0,1% Rinderserum-Albumin (BSA) in PBS-Puffer

Formalin-Puffer: 4% Paraformaldehyd

in PBS

Saponin-Puffer: 0,1% Saponin

in PBS

MACS-Puffer: 0,5% BSA, 2mM EDTA

in PBS-Puffer

Einfriermedium: 20% DMSO in FCS

TAE-Puffer : 40mM Tris-Acetat

1mM EDTA in H2O

2.1.5 Antikörper

2.1.5.1 Antikörper für die Durchflusszytometrie

CD2-FITC RPA-2.10 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg

CD3-APC UCHT1 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg

CD16-FITC DJ130c (IgG1) DAKO, Hamburg

CD25-FITC ACT-1 (IgG1) DAKO, Hamburg

CD26-FITC CLB-22C3 (IgG1) Caltag, Hamburg

CD56-FITC NCAM1.2 (IgG1) Becton Dickinson, Heidelberg

CD56-PE My31 (IgG1) Becton Dickinson, Heidelberg

CD94-PE HP-3D9 (IgG1) DAKO, Hamburg

CD158a-PE EB6 (IgG1) Immunotech, Krefeld

CD158b-PE GL183 (IgG1) Immunotech, Krefeld

CD161-FITC DX12 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg

IFNγ-FITC 4S.B3 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg

NKB1-PE Z27.3.7 (IgG1) Immunotech, Krefeld

p50.3-PE FES172 (IgG2a) Immunotech, Krefeld

TNFα-FITC MAb11 (IgG1) Pharmingen, Heidelberg

HLA-DR-PE Immu-357 (IgG1) Immunotech, Krefeld

2.1.5.2 Antikörper für die Zellseparation

NK-Zell-Isolationskit Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach Reagenz A: Hapten-konjugierte Antikörper gegen:

CD3 CD14 CD19 CD36 IgE

Reagenz B: MACS Anti-Hapten MicroBeads

2.1.6 Reagentien für die Molekularbiologie

2.1.6.1 RNeasy Mini Kit, RNA-Isolationskit Fa. Qiagen, Hilden RLT-Puffer mit 1% β-Mercaptoethanol

RW1-Puffer RPE-Puffer

RNase-freies Wasser QIAshredder-Säulen RNeasy-Minispin Säulen

2.1.6.2 Enzyme

Taq-Polymerase AmpliTaqGold Fa. PE Applied Biosystems, CA,USA OmniscriptRT, Reverse Transkriptase Fa. Qiagen, Hilden

2.1.6.3 Oligonukleotide (Primer) Fa. MWG Biotech

CD94 sense GCA GTG TTT AAG ACC ACT CT

antisense CTG TTG CTT ACA GAT ATA ACG Länge: 527 Basenpaare

NKG2A sense CCA GAG AAG CTC ATT GTT G

antisense CCA ATC CAT GAG GAT GGT G Länge: 325 Basenpaare

NKG2C sense GGA AAT ATT CCA AGT AGA ATT AAA T antisense CTG ATG CAC TGT AAA CGC AAA T Länge: 619 Basenpaare

NKG2D sense CTG GGA GAT GAG TGA ATT TCA TA antisense GAC TTC ACC AGT TTA AGT AAA TC Länge: 416 Basenpaare

NKG2E sense CTG TGC TTC AAA GAA CTC TTC T

antisense CTG GTC TGA TAT AAG TCC ACG T Länge: 225 Basenpaare

Standard 350bp β-Actin Primer

2.1.7 Zelllinien

K562 Erythromyeloide Linie von einem Patienten mit

chronisch-myeloischer Leukämie

L721.221 Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierte

B-lymphoblastoide Linie mit fehlender MHC-I-Expression

L721.221 Transfektanten L721.221-Zellen mit transfizierter Expression von HLA-B27, -Cw6, -Cw7 (Ursprungslinie und Trans-fektanten wurden uns von Dolores Schendel, GSF, München, zur Verfügung gestellt)

2.1.8 Blutproben

Das Blut von Normalspendern wurde in der Blutbank der Medizinischen Hochschule in Einwegspritzen mit etwa 500 I.E. Liquemin pro 10ml abgenommen.

Bei den hier untersuchten 43 Patienten handelte es sich um Erwachsene mit Indika-tion zur KnochenmarktransplantaIndika-tion. Das Studiendesign wurde von der Ethikkomis-sion genehmigt. Die Grunderkrankungen der Patienten setzten sich zusammen aus 18 akuten myeloischen Leukämien, 13 chronisch-myeloischen Leukämien, fünf aku-ten lymphatischen Leukämien, zwei myelodysplastischen Syndromen, zwei aplasti-schen Anämien, einem Mantelzell-Lymphom, einem Non-Hodgkin-Lymphom und ei-nem Plasmozytom. Das mittlere Alter der Patienten betrug 39,6 Jahre (13-60).

Das Prinzip der Knochenmarktransplantation besteht darin, das entartete hämato-poetische System im Patienten zu zerstören und durch gesunde Stammzellen zu

er-setzen, welche im Knochenmark des Patienten anwachsen und neue, reife Zellen hervorbringen. Die Konditionierung vor der Transplantation bestand aus der Gabe von Zytostatika aus der Familie der Alkylantien, wie Cyclophosphamid, Busulfan oder Melphalan. Dazu kam in einigen Fällen eine Ganzkörperbestrahlung und auch die Verabreichung von Anti-Thymozyten-Globulin (ATG), welches gegen frühe T-Zellen gerichtet ist. Das Transplantat bestand durchschnittlich aus 6x106 CD34+ Zellen pro kg Körpergewicht und war in der Regel nicht T-Zell-depletiert. Es stammte von Fremdspendern oder Geschwistern der Patienten und war HLA-identisch. Nach der Transplantation erhielten die Patienten eine immunsuppressive Behandlung zur Pro-phylaxe der GvHD bestehend aus Ciclosporin A und Methotrexat.

Blutproben wurden zu vier Zeitpunkten gewonnen. Die erste Blutprobe stammte von dem Empfänger vor Transplantation, vor Beginn der Konditionierung. Nach Trans-plantation wurde die erste Blutprobe etwa zum Zeitpunkt des Engraftments abge-nommen. Das ist der Zeitpunkt zu dem die fremden Stammzellen im Körper des Pa-tienten anwachsen und erste neu gebildete Lymphozyten im Blut zu finden sind. Die weiteren Zeitpunkte schlossen sich an Tag 50 und an Tag 100 nach Transplantation an. An den gleichen Untersuchungszeitpunkten nach Transplantation wurde der Chimärismus der Patienten bestimmt um zu überwachen, ob die Tansplantation er-folgreich war und ob die neugebildeten Zellen ausschließlich vom Empfänger stam-men.