Einfluss der HLA-Expression von Spender und Empfängerzellen auf

Die komplett HLA-identischen Transplantationen im Menschen erlauben nur selten die Untersuchung der Rekonstitution der NK-Zellrezeptoren in Fällen, bei denen die NK-Zellen nach der Transplantation einen HLA-Liganden präsentiert bekommen, den es im Empfänger nicht gab, beziehungsweise einem Rezeptor sein Ligand nach der Transplantation nicht mehr präsentiert wird. Darüber hinaus existieren in dieser Un-tersuchung für solche Vergleiche keine adäquaten Ausgangswerte, da keine Proben vom Donor verfügbar waren. Wie im Folgenden dargestellt ist es aber möglich zu untersuchen, ob sich das Muster der Rekonstitution unterscheidet, je nachdem ob die Rezeptoren passende Liganden vorfinden oder nicht.

Die Analyse erfolgt für die Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren CD158a und b und NKB1, da diese spezifische Liganden besitzen, die bereits hinreichend definiert sind.

Dementsprechend wurden Rekonstitutionsmuster und Expressionsdichten bei Anwe-senheit bzw. AbweAnwe-senheit korrespondierender HLA-Liganden in ausgewählten re-präsentativen Patienten verglichen.

3.3.1.1 Abwesenheit eines Liganden

Bei Patient E.H. ist für den Rezeptor CD158a weder vor noch nach Transplantation im Empfänger ein passender Ligand vorhanden. Zu beiden Zeitpunkten exprimieren etwa 4% der NK-Zellen diesen Rezeptor. Weniger als 1% der T-Zellen tragen

Die NK-Zellen des Patienten U.P. finden in ihrer Umgebung keinen Liganden für den Rezeptor CD158b. Die Expression dieses Rezeptors ist auf einer durchschnittlichen Anzahl Zellen zu finden (23,9% - 25,8%) und zeigte nach Transplantation keine deut-lichen Abweichungen mehr (Abb. 9B).

A B

% CD158a+/CD56+ CD3- % CD158b+/CD56+ CD3-

CD3-Abb. 9: Rekonstitution der KIR⁺ NK-Zellen in Abwesenheit eines passenden Liganden: Der Patient E.H. (A) zeigt nur auf wenigen NK-Zellen eine Expression von CD158a (▼) und keine Veränderung während der Rekonstitution. Die NK-Zellen des Patienten U.P. exprimieren CD158b (●) auf durchschnittlichem Niveau, aber eben-falls ohne Veränderungen (B).

Patient S.H. hat ebenfalls keinen Liganden für CD158a vor und nach Stammzell-transplantation (Abb. 10A). Die Expression des Rezeptors liegt dennoch vor und nach Transplantation im durchschnittlichen Bereich von 11,8% bis 26,1%. In der frü-hen Phase der Rekonstitution ist die Expression im Vergleich zum Durchschnittswert von 15,3% etwas vermindert (11,8% - 12%), auf reifen NK-Zellen vor und lange nach Transplantation erhöht (24,1% bzw. 26,1%).

Ein anderes Bild zeigt sich bei Patient U.K.. Hier ist kein Ligand für den Rezeptor CD158b vorhanden. Die Expression des Rezeptors nimmt nach anfänglich niedrigem Level (18,8%) bis zu Tag 100 nach Transplantation deutlich zu auf 51,2% (Abb.

10B).

% CD158a+/CD56+ CD3- % CD158b+/CD56+ CD3-

CD3-Abb. 10: Rekonstitution der KIR⁺ NK-Zellen in Abwesenheit eines passenden Liganden: Die Expressionsfrequenz von CD158a (▼) zeigt beim Patienten S.H. eine positive Kinetik während der Rekonstitution (A). Die CD158b-Expression (●) des Pa-tienten U.K. nimmt nach der Transplantation überdurchschnittlich zu (B).

3.3.1.2 Anwesenheit eines oder mehrerer Liganden

Der Patient H.W. exprimiert vor und nach Transplantation einen Liganden für CD158b - HLA-Cw1. Die vor Transplantation überdurchschnittliche Expression die-ses Rezeptors von 42,3% weicht nach Transplantation einer leicht unterdurchschnitt-lichen Expression (19,4% – 22,5%), die offenbar unbeeinflusst auf diesem Niveau bleibt (Abb. 11A).

Die Rezeptoren CD158b und NKB1 des Patienten H.B. finden vor und nach Trans-plantation passende Liganden in ihrer Umgebung vor (Cw5, -Cw7 und HLA-Bw4). NKB1 erfährt nur eine geringe Regulation auf niedrigem Level (2,9% – 12,8%). Dagegen wird der Rezeptor CD158b im Verlauf der Rekonstitution von einer wachsenden Anzahl NK-Zellen exprimiert (42,8% an Tag 100) (Abb. 11B).

H.W.

% CD158b+/CD56+ CD3- % KIR+/CD56+ CD3-

CD3-Abb. 11: Rekonstitution der KIR⁺ NK-Zellen in Anwesenheit eines passenden Liganden: Die NK-Zellen des Patienten H.W. zeigen nach der Transplantation keine Entwicklung der Expressionsfrequenz des CD158b (●) (A). Die Rezeptoren des Pati-enten H.B. zeigen ein unterschiedliches Verhalten während der Rekonstitution:

CD158b (●) weist eine zunehmende Expressionsfrequenz auf, NKB1 (♦) keine deut-liche Veränderung (B).

Im Fall des Patienten E.S. (Abb. 12A) wird die Anzahl der NK-Zellen, die positiv für den Rezeptor CD158b sind, bei Anwesenheit eines Liganden von einem relativ ho-hen Wert von 46,3% CD158b⁺ NK-Zellen vor Transplantation, nach SCTX während der Rekonstitution auf einen unterdurchschnittlichen Wert reguliert (19,8% an Tag 57 bzw. 20,5% an Tag 99 nach Transplantation).

Bei etwa gleichem Ausgangswert (34,6% bzw. 35,6%) der Rezeptoren CD158a und NKB1 vor Transplantation im Patienten H.E. (Abb. 12B) werden diese beiden Re-zeptoren in Anwesenheit ihres Liganden zwar im Verlauf ähnlich reguliert, CD158a jedoch auf durchschnittlichem Niveau (12,8% – 17,4%), NKB1 mit Werten, die über der durchschnittlchen Expression dieses Rezeptors liegen (35,3% – 53,6%).

E.S.

% CD158b+/CD56+ CD3- % KIR+/CD56+ CD3-

CD3-Abb. 12: Rekonstitution der KIR⁺ NK-Zellen in Anwesenheit eines passenden Liganden: Die NK-Zellen des Patienten E.S. (A) regulieren CD158b (●) während der Rekonstitution herunter. Die Rekonstitution der beiden Rezeptoren CD158a (▼) und NKB1 (♦) im Patienten H.E. (B) verläuft ähnlich, jedoch im Falle des Rezeptors NKB1 auf überdurchschnittlichem Niveau.

3.3.1.3 Gesamtdarstellungen

Die KIRs des Patienten M.S. zeigen ein einheitliches Rekonstitutionsmuster mit ei-nem Tiefpunkt an Tag 62 (Abb. 13A). Die Entwicklung Rezeptor-exprimierender Zel-len verläuft annähernd parallel, obwohl für die Rezeptoren NKB1 und CD158a sogar

zwei Liganden vorhanden sind, CD158b allerdings keinen korrespondierenden Li-ganden vorfindet.

Ein entsprechendes Bild findet man bei Patient T.E., der einen Liganden für CD158a aufzuweisen hat. Für CD158b ist dagegen kein Ligand im Empfänger vorhanden.

Dennoch sind Expression und Rekonstitution bei beiden NK-Zellrezeptoren nahezu gleich (Abb. 13B).

% KIR+/CD56+ CD3- % KIR+/CD56+ CD3-

CD3-Abb. 13: Rekonstitution der KIR⁺ NK-Zellen - Gesamtdarstellungen: Beide Pati-enten zeigen einen parallelen Rekonstitutionsverlauf der dargestellten Rezeptoren:

Patient M.S. (A): CD158a: ▼, CD158b: ●, NKB1: ♦; Patient T.E. (B): CD158a: ▼, CD158b: ●.

Bei anderen Patienten (z.B. Patient K.B.; Abb. 14A) ist kein einheitliches Expres-sionsmuster der unterschiedlichen Rezeptoren zu erkennen. Unabhängig von der Expression passender Liganden unterliegt die Rekonstitution Rezeptor-exprimierender Zellen offensichtlich keinem gemeinsamen Einfluss. In der Regel

zei-gen die unterschiedlichen Rezeptoren bei den einzelnen Patienten aber einen über-wiegend parallelen Verlauf (z.B. Patient H.W.; Abb. 14B).

A B

K.B.

-25 0 25 50 75 100 125

0 25 50 75 100

Tag

H.W.

-25 0 25 50 75 100

0 50 100

Tag

% NKR+/CD56+ CD3- % NKR+/CD56+ CD3-

CD3-Abb. 14: Rekonstitution der KIR⁺ NK-Zellen - Gesamtdarstellungen: Rekonstitu-tion aller untersuchten NK-Zellrezeptoren bei Patient K.B. (A) und Patient H.W. (B).

CD94: ■, CD158a: ▼, CD158b: ●, NKB1: ♦, CD161: ▲, p50.3: (

3.3.2 Kokultivierung von NK-Zell-Klonen mit Zelllinien mit definierter HLA-Expression

Durch die in vitro Kokultivierung von NK-Zellklonen mit ihren korrespondierenden Liganden kann das Verhalten der Rezeptorexpression in unterschiedlicher Umge-bung unter standardisierten Bedingungen untersucht werden. Bei den untersuchten Klonen ist die Expression der Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren meistens sehr gering und erfährt auch keine weitere Regulation in Bezug auf Rezeptordichte und relative Anzahl NK-Zellrezeptor-exprimierender Zellen. Die Lektin-ähnlichen Rezep-toren werden in hoher Anzahl exprimiert, zeigen aber ebenfalls keine Beeinflussung durch die Anwesenheit oder Abwesenheit der HLA-I-Moleküle.

CD94

% NKR+/CD56+ % NKR+/CD56+

Abb. 15: Veränderung der Expression der NK-Zellrezeptoren durch Koinkubati-on mit HLA-definierten Zellen: Durch KoinkubatiKoinkubati-on vKoinkubati-on NK-ZellklKoinkubati-onen mit Zellen, die jeweils nur einen Liganden für einen Rezeptor exprimieren, lässt sich die Expres-sion der Rezeptoren nicht verändern. Dargestellt ist stellvertretend für alle unter-suchten Rezeptoren die Frequenz der Expression von CD94 und CD158a.

Der dargestellte NK-Zellklon (Abb.15) exprimierte die Rezeptoren CD158a und CD158b, NKB1 und CD94. Inkubation mit L721.221-Zellen ohne HLA-I-Expression und mit den Transfektanten L721.221-Bw4 (Ligand für NKB1), L721.221-Cw6 (Li-gand für CD158a) und L721.221-Cw7 (Li(Li-gand für CD158b) veränderte in den 5 Ta-gen der Untersuchung nicht spezifisch die Expression eines bestimmten Rezeptors.

Die Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Liganden beeinflusste nicht selektiv den zugehörigen Rezeptor. Dieses gilt für die relative Anzahl Rezeptor-positiver Zellen, die für die verschiedenen Rezeptoren eine nahezu parallele Kinetik zeigt. Die Expressionsdichte der Rezeptoren auf der Oberfläche der NK-Zellen, ge-messen an der mittleren Fluoreszenzintensität des gebundenen Antikörpers, zeigt zwar Schwankungen, ein Zusammenhang mit dem Phänotyp der koinkubierten Zel-len ist jedoch nicht zu erkennen.