Zirkulierende Endothelzellen im Verlauf der allogenen Knochenmark- und Stammzelltransplantation

Medizinischen Hochschule Hannover

Z IRKULIERENDE E NDOTHELZELLEN IM V ERLAUF DER ALLOGENEN K NOCHENMARK - UND

S TAMMZELLTRANSPLANTATION

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von Johanna Scheer aus Schweinfurt

Hannover 2006

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 26.09.2006

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuerin der Arbeit: Prof.’in Dr. Marion Haubitz Referent: Prof.’in Dr. Eva Maria Mischak-Weissinger Korreferent: Prof. Dr. Hans-Heinrich Kreipe

Tag der mündlichen Prüfung: 26.09.2006

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Karl Welte Prof. Dr. Dietrich Peest Prof.’in Dr. Sylvia Glüer

I NHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung...7

1.1 Die allogene Knochenmark- und Stammzelltransplantation ...7

1.1.1 Hintergrund...7

1.1.2 Therapeutisches Prinzip der allogenen Knochenmark- und Stamm- zelltransplantation ...8

1.1.3 Indikationen zur Knochenmark- und Stammzelltransplantation ...9

1.1.4 Durchführung der allogenen Knochenmark- und Stammzelltransplantation ...11

1.1.4.1 Konditionierung ...11

1.1.4.2 GvHD-Prophylaxe ...11

1.1.4.3 Transplantation und supportive Maßnahmen...12

1.1.5 Komplikationen im Verlauf der allogenen Knochenmark- und Stammzelltrans- plantation...13

1.1.5.1 Toxizität und allgemeine Komplikationen...13

1.1.5.2 Graft-versus-host disease (GvHD)...14

1.1.5.3 Hämostaseologische Komplikationen im Verlauf der allogenen Knochen- mark- und Stammzelltransplantation...16

1.1.5.3.1 Blutungskomplikationen nach HSCT ...16

1.1.5.3.2 Thrombotische Komplikationen und endotheliale Schädigung nach HSCT ..17

1.2 Zirkulierende Endothelzellen ...19

1.2.1 Zirkulierende Endothelzellen als Marker für vaskuläre Erkrankungen ...19

1.2.2 Nachweis zirkulierender Endothelzellen ...19

1.2.3 Lösliche Marker der Endothelzellfunktion im Verlauf der HSCT ...20

1.3 Fragestellung...22

2 Patienten, Material und Methoden...23

2.1 Patienten ...23

2.1.1 Einschlusskriterien...23

2.1.2 Alter und Geschlecht ...23

2.1.3 Grunderkrankung und Remissionsstatus ...23

2.1.4 Transplantat- und Spendercharakteristik ...24

2.1.5 Konditionierungsprotokolle ...25

Inhaltsverzeichnis

2.1.5.1 Konventionelle Konditionierung ...25

2.1.5.2 Konditionierung mit reduzierter Intensität ...26

2.1.5.3 Radioimmuntherapie...27

2.1.6 GvHD-Prophylaxe...28

2.1.7 Dokumentation der Komplikationen nach der allogenen HSCT...29

2.1.7.1 Erhobene Daten...29

2.1.7.2 Stadien und Gradeinteilung der akuten und chronischen GvHD...29

2.2 Material...31

2.2.1 Materialliste...31

2.2.2 Erläuterungen zu den verwendeten Materialien...31

2.2.2.1 Dynabeads...31

2.2.2.2 CD 146 ...32

2.2.2.3 Ulex europaeus agglutinin I (UEA I)...33

2.3 Methodik ...34

2.3.1 Isolierung von Endothelzellen...34

2.3.1.1 Prinzip der immunmagnetischen Isolierung von zirkulierenden Endothelzellen aus dem peripheren Blut...34

2.3.1.2 Entwicklung der Methode...35

2.3.1.3 Blutentnahme...35

2.3.1.4 Präparation der immunmagnetischen Partikel (beads) ...36

2.3.1.5 Grundprotokoll für die immunmagnetische Isolierung und die quantitative Erfassung zirkulierender Endothelzellen aus dem peripheren Blut...37

2.3.1.6 Mögliche Fehlerquellen bei der immunmagnetischen Isolierung zirkulierender Endothelzellen...38

2.3.2 Statistik ...38

3 Ergebnisse...39

3.1 Patientendaten...39

3.2 Zirkulierende Endothelzellen ...40

3.2.1 Nachweis zirkulierender Endothelzellen ...40

3.2.2 Zirkulierende Endothelzellen vor Beginn der Konditionierung ...40

3.2.3 Zirkulierende Endothelzellen nach der Konditionierungsphase und nach HSCT42 3.2.4 Zirkulierende Endothelzellen in Abhängigkeit von der Art der Konditionierung...44

3.2.4.1 Ausmaß des Anstiegs der zirkulierenden Endothelzellen ...44

3.2.4.2 Zeitlicher Verlauf des Anstiegs der zirkulierenden Endothelzellen...46

3.2.5 Zirkulierende Endothelzellen in Abhängigkeit von der GvHD-Prophylaxe ...50

3.2.6 Zirkulierende Endothelzellen und transplantationsassoziierte Komplikationen...51

4 Diskussion ...52

4.1 Nachweis zirkulierender Endothelzellen im Verlauf der allogenen Knochen- mark- und Stammzelltransplantation...52

4.2 Mögliche Mechanismen der endothelialen Schädigung im Rahmen der allogenen Knochenmark- und Stammzelltransplantation ...54

4.3 Bisherige Erfahrungen mit zirkulierenden Endothelzellen...60

4.4 Weiterführende Überlegungen zu zirkulierenden Endothelzellen bei knochen- marktransplantierten Patienten...61

4.4.1 Zirkulierende Endothelzellen als Marker für transplantationsassoziierte Komplikationen...61

4.4.2 Qualitative Analyse der zirkulierenden Endothelzellen ...63

5 Zusammenfassung...66

6 Literaturangaben...67

7 Danksagung...74

8 Bisherige Veröffentlichungen...75

9 Lebenslauf...77

10 Erklärung nach § 2, Absatz 2, Nummern 5 und 6 der Promotionsordnung der MHH...78

Verzeichnis der Abkürzungen

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

AML Akute myeloische Leukämie

ALL Akute lymphatische Leukämie

ATG Antithymozytenglobulin

BU Busulfan

CEC circulating endothelial cells (zirkulierende

Endothelzellen)

CML Chronisch myeloische Leukämie

CLS capillary leak syndrome (Kapillarlecksyn-

drom)

CsA Ciclosporin A

CY Cyclophosphamid

EBMT European Bone Marrow Transplantation

Registry (Europäisches Knochenmarktrans- plantationsregister)

FLU Fludarabin

G-CSF granulocyte colony stimulating factor (Granu-

lozytenkolonie-stimulierender Faktor)

GvHD Graft-versus-host disease (Transplantat-

gegen-Wirt-Erkrankung)

aGvHD akute GvHD

cGvHD chronische GvHD

GvL Graft-versus-leukemia effect (Transplantat-

gegen-Leukämie-Effekt)

GvT Graft-versus-tumor effect (Transplantat-

gegen-Tumor-Effekt)

Gy Gray

HSCT haematopoietic stem cell transplantation

(hämatopoetische Stammzelltransplantation)

HUVEC human umbilical vein endothelial cells (Endo-

thelzellen aus menschlichen Nabelschnurve- nen)

IPS Idiopathisches Pneumoniesyndrom

KM Knochenmark

MAHA Mikroangiopathische hämolytische Anämie

MEL Melphalan

MHC major histocompatibility complex (Haupt-

histokompatibilitätskomplex)

MTX Methotrexat

NHL Non-Hodgkin-Lymphom

PAI-1 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1

PNH Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie

RIC reduced intensity conditioning (Kondi-

tionierung reduzierter Intensität)

RIT Radioimmuntherapie

SCID severe combined immunodeficiency

(schwere kombinierte Immundefizienz)

TBI total body irradiation (Ganzkörperbe-

strahlung)

TM Thrombomodulin

TTP Thrombotisch thrombozytopenische Purpura

VEGF vascular endothelial growth factor (Gefäßen-

dothel-Wachstumsfaktor)

VOD Veno-occlusive disease

vWF von Willebrand-Faktor

Einleitung

1 E

1.1 Die allogene Knochenmark- und Stammzelltransplantation 1.1.1 Hintergrund

Bereits in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts wurden erste Versuche unternom- men, im Tierversuch hämatopoetische Stammzellen von einem Individuum auf ein anderes zu übertragen [1].

Über 50 Jahre später ist die Transplantation von Knochenmark und Blutstammzellen (engl. haematopoietic stem cell transplantation, HSCT) längst nicht mehr auf einzel- ne (Tier-) Experimente beschränkt, sondern ist eine allgemein anerkannte Methode zur Behandlung von malignen und nicht-malignen Erkrankungen des hämato- und lymphopoetischen Systems geworden. Für einige Erkrankungen stellt sie die einzige kurative Therapieoption dar.

Im Januar 1986 wurde zum ersten Mal an der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) eine HSCT durchgeführt [2]. Die Zahl der Transplantationen von Knochen- mark und Blutstammzellen pro Jahr an der MHH ist seitdem kontinuierlich von 13 Transplantationen im Jahr 1986 über 55 im Jahr 1995 auf 106 im Jahr 2002 gestie- gen. In ganz Deutschland wurden im Jahre 2003 1407 allogene und 2333 autologe Transplantationen hämatopoetischer Stammzellen durchgeführt [3].

Dabei ist zu beobachten, dass zu Beginn ausschließlich Knochenmark, das von den Spendern nach Punktion des Beckenkamms durch multiple Aspirationen gewonnen wurde, transplantiert wurde. Heute dagegen besteht ein Großteil (im Jahr 2002 ca.

90%) der Transplantate aus peripheren Stammzellen, deren Gewinnung durch Mobi- lisierung mittels hämatopoetischer Wachstumsfaktoren wie G-CSF und anschließen- de Apherese für den Spender weniger belastend ist und zusätzlich den Vorteil einer schnelleren Regeneration der Hämatopoese im Patienten bietet [4].

Im Folgenden werde ich der Einfachheit halber einheitlich den international ge- bräuchlichen Terminus HSCT benutzen, auch wenn es sich um die Transplantation von Knochenmark oder peripheren Stammzellen handelt.

1.1.2 Therapeutisches Prinzip der allogenen Knochenmark- und Stammzell- transplantation

Das Ziel jeder (Radio-) Chemotherapie besteht in der Zerstörung möglichst vieler maligner Zellen. Der Erfolg der Therapie hängt zum einen von der Empfindlichkeit der Zellen gegenüber chemischen oder physikalischen Noxen wie z.B. ionisierender Strahlung ab, eine Größe, die sich nur schwer beeinflussen lässt. Zum anderen hat aber auch die Dosis der Radio- bzw. Chemotherapie erheblichen Einfluss auf das Ausmaß der Zellzerstörung: Im Tierexperiment konnte bei schnell wachsenden Tu- moren eine linear-logarithmische Abhängigkeit zwischen der Dosis des Chemothera- peutikums bzw. der Strahlung und dem Grad der Tumorzellzerstörung nachgewiesen werden, d.h. bei Verdoppelung der Dosis wird die zehnfache Menge an Tumorzellen zerstört [5]. Neben den malignen Zellen, die das eigentliche Ziel der Chemo- bzw.

Radiotherapie darstellen, werden aber auch körpereigene Zellen geschädigt, wobei das Ausmaß dieser Schädigung von der Proliferationsrate der betroffenen Zellen ab- hängig ist. So sind in der konventionellen Onkologie der Steigerung der Dosis des Chemotherapeutikums bzw. der Strahlendosis meist durch die Schädigung der hä- mato- und lymphopoetischen Stammzellen des Knochenmarks Grenzen gesetzt.

Im Rahmen einer HSCT kann jedoch die zytoreduktive Therapie als so genannte Konditionierung in Form einer Hochdosischemotherapie und/oder fraktionierten Ganzkörperbestrahlung in einer Dosierung durchgeführt werden, die sämtliche Zellen des Knochenmarks irreversibel schädigt, also myeloablativ ist. Die daraus resultie- rende Knochenmarksinsuffizienz, die ohne weitere Therapie für den Patienten letal wäre, ist durch die anschließende Transplantation hämatopoetischer Stammzellen zeitlich begrenzt [6].

Mit der HSCT werden also im wesentlichen zwei therapeutische Konzepte verfolgt:

die möglichst effiziente und aggressive Zytoreduktion sowie der Ersatz des kranken, durch die Hochdosistherapie ausgelöschten Knochenmarks durch ein gesundes Knochenmark und Immunsystem [6]. Zusätzlich kommt bei nicht-malignen Erkran- kungen der hämatopoetischen Stammzellen, die zumeist auf angeborenen oder er- worbenen Gendefekten beruhen, der Aspekt hinzu, diese defekten Gene durch intak- te zu ersetzen und somit die Krankheit zu heilen [7].

Je nach Herkunft des Transplantats unterscheidet man die allogene Transplantation, bei der Spender und Empfänger zwei genetisch voneinander verschiedene Individu- en sind, von der autologen Transplantation, bei der dem Patienten zuvor entnomme-

Einleitung

ne und gereinigte eigene Stammzellen nach der zytoreduktiven Therapie refundiert werden.

Nach allogener HSCT treten Rezidive der Grunderkrankung signifikant seltener auf als nach autologer Transplantation [8]. Dies kann zum einen an der möglichen Ver- unreinigung des Transplantats durch maligne Zellen des Patienten liegen [9]. Wahr- scheinlicher ist aber, dass das mit dem Transplantat ebenfalls übertragene Immun- system des Spenders die Zellen des Empfängers als „fremd“ erkennt und angreift.

Dadurch werden die nach der Konditionierung noch verbliebenen malignen Zellen immunologisch beseitigt, was alsGraft-versus-leukemia-Effekt (GvL) bezeichnet wird [8] und durchaus erwünscht ist. Allerdings werden auch gesunde Zellen des Emp- fängers angegriffen, was zu der so genannten Graft-versus-host disease (GvHD) führt [10], einer der Hauptkomplikationen nach HSCT, auf die im Weiteren noch ein- gegangen wird.

1.1.3 Indikationen zur Knochenmark- und Stammzelltransplantation

Die klassische Indikation zur HSCT stellen die akuten myeloischen (AML), die lymphatischen (ALL) und die undifferenzierten Leukämien dar [6]. Während bei Kin- dern die akuten Leukämien häufig durch eine alleinige Chemotherapie geheilt wer- den können, ist dies bei Erwachsenen meist nicht der Fall, so dass hier die Indikation zur HSCT bei geeignetem Allgemeinzustand bereits in der ersten Remission gege- ben ist. Sowohl allogene als auch autologe HSCT sind möglich [11].

Neben den akuten Leukämien sind auch die chronisch myeloische Leukämie (CML) sowie die myelodysplastischen Syndrome häufige Indikationen v.a. für die allogene HSCT, da bei diesen Neoplasien durch konventionelle Chemotherapie keine dauer- haften Remissionen zu erreichen sind. Für die CML stellt die allogene HSCT derzeit den einzigen kurativen Therapieansatz dar [12]. Seit Einführung des Medikaments Imatinib (Glivec ®), einem Tyrosinkinaseinhibitor, der ein für maligne entartete CML- Zellen typisches Enzym und damit die übermäßige Proliferation der Zellen hemmt [13], wird bei Patienten mit CML allerdings wesentlich seltener die Indikation zur HSCT gestellt [14-16].

In die Liste der Indikationen zur HSCT gehören neben weiteren Neoplasien wie hochmalignen Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL), für die sich vor allem die autologe HSCT anbietet, auch nicht-maligne Erkrankungen des hämato- bzw. lymphopoeti- schen Systems. Dazu zählen Erkrankungen der hämatopoetischen Stammzellen wie

schwere angeborene Immundefekte im Kindesalter (schwere kombinierte Immundefi- zienz, SCID), Autoimmunerkrankungen, die Thalassämie, die aplastische Anämie und die paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) [14]. Aus ersichtlichem Grund kommt bei letzteren Erkrankungen nur die allogene HSCT in Frage, da die Retrans- fusion der eigenen gendefekten Stammzellen keinen therapeutischen Nutzen hätte.

Die (meist autologe) HSCT zur Ermöglichung der Hochdosistherapie bei Tumoren mit extra- und intramedullärem Wachstum und bei soliden Tumoren, die sich durch ein gutes Ansprechen auf eine Chemotherapie auszeichnen, welche aber durch die Knochenmarksinsuffizienz limitiert ist, wurde wegen enttäuschender Ergebnisse wie- der weitgehend verlassen [14].

Abbildung 1.1 gibt einen Überblick über die Indikationen zur allogenen HSCT in Deutschland im Jahre 2003.

Abb.1.1: Indikationen zur allogenen HSCT in Deutschland 2003 (Quelle: Deutsches Register für Stammzelltransplantation [3])

AML 38%

ALL 19%

CML 11%

MDS/MPS 11%

CLL 2%

Plasmozytom 3%

M. Hodgkin 1%

NHL 6%

solide Tumoren 1%

andere 0%

nicht-maligne Erkrankungen 8%

AML 38%

ALL 19%

CML 11%

MDS/MPS 11%

CLL 2%

Plasmozytom 3%

M. Hodgkin 1%

NHL 6%

solide Tumoren 1%

andere 0%

nicht-maligne Erkrankungen 8%

Einleitung

1.1.4 Durchführung der allogenen Knochenmark- und Stammzelltransplantation 1.1.4.1 Konditionierung

Bevor dem Patienten das Spenderknochenmark transplantiert werden kann, muss zunächst das patienteneigene Knochenmark durch die so genannte Konditionierung vollständig beseitigt werden. Zu diesem Zweck wird der Patient mit einer Hochdosis- therapie behandelt, die entweder aus einer alleinigen Chemotherapie (gängige Che- motherapeutika sind hier Cyclophosphamid (Endoxan ®) und Busulfan (Myleran ®)) oder aus einer Chemotherapie in Kombination mit einer fraktionierten Ganzkörperbe- strahlung (total body irradiation, TBI) besteht [17].

Zusätzlich gibt es seit kurzem auch die Möglichkeit, diese beiden Therapieformen mit einer weiteren, der so genannten Radioimmuntherapie (RIT), zu kombinieren und dadurch zu intensivieren [18]. Hierbei werden radioaktiv-markierte Antikörper gegen Oberflächenantigene (CD 66) von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark einge- setzt, die sich dort anreichern und so die Strahlung direkt im Knochenmark, wo sich die malignen Zellen befinden, erhöhen, während die restlichen Körperzellen der Strahlung weit weniger ausgesetzt sind [19].

Des Weiteren besteht die Möglichkeit, das Knochenmark durch die Konditionierung nicht vollständig zu entfernen, also eine nicht-myeloablative Chemotherapie einzu- setzen. Dabei wird das Knochenmark und somit das Immunsystem des Empfängers nur soweit unterdrückt, dass nach Transplantation der Spenderzellen ein Anwachsen (engraftment) des Transplantats ohne Abstoßungsreaktion möglich ist [7, 20]. Die im Zuge der reduzierten Konditionierungstherapie nicht zerstörten malignen Zellen wer- den nach der HSCT weitgehend durch den bereits erwähnten GvL-Effekt vernichtet.

Der Vorteil dieser Behandlungsmethode liegt in der geringeren Toxizität und der da- mit verbundenen geringeren Komplikationsrate nach HSCT, wodurch sich diese Me- thode v.a. für ältere und somit für Komplikationen anfälligere Patienten anbietet [7].

Die Konditionierung wird je nach Protokoll ca. eine Woche (Tag –7) vor der geplan- ten HSCT (Tag 0) begonnen.

1.1.4.2 GvHD-Prophylaxe

Um im Anschluss an die HSCT das Auftreten einer GvHD zu vermeiden, müssen prophylaktische Maßnahmen getroffen werden.

Diese GvHD-Prophylaxe besteht heute in den meisten Fällen aus einer medikamen- tösen Therapie mit Calcineurin-Inhibitoren wie Ciclosporin A (CsA, Sandimmun ®) zum Teil in Verbindung mit zusätzlichen immunsuppressiven Medikamenten wie Ste- roiden oder Methotrexat (MTX). Die Therapie wird bereits einen Tag vor der HSCT (Tag –1) begonnen [21].

Diese Medikamente vermögen in gewissem Ausmaß das Auftreten einer GvHD zu verhindern, ziehen jedoch selbst zum Teil schwerwiegende Komplikationen in Form von unerwünschten Arzneimittelwirkungen nach sich. So kann durch CsA die Nieren- funktion erheblich beeinträchtigt werden [22], während MTX schwere Mukositiden verursacht [23], die teilweise zum Abbruch der Therapie zwingen.

Diese Komplikationen können durch den Einsatz einer nicht-medikamentösen GvHD- Prophylaxe in Form einer T-Zell-Depletion vermieden werden.

Bei der T-Zell-Depletion werden immunkompetente T-Lymphozyten des Spenders, die nach heutigen Kenntnisstand Verursacher der GvHD sind [24], aus dem Trans- plantat entfernt. Dies kann bereits vor der Transplantation - also in vitro - geschehen oder im Körper des Patienten (in vivo) durch den Einsatz von Antikörpern gegen T- Zell-Oberflächenantigene wie z.B. Antithymozytenglobulin (ATG) [25] oder den Anti- körper Campath-1 gegen das Lymphozyten-Oberfllächenantigen CD52 [26]. Hinsicht- lich der Vermeidung der GvHD ist die T-Zell-Depletion der medikamentösen Prophy- laxe weit überlegen [26]. Allerdings wird dieser Vorteil durch eine höhere Rate von infektiösen Komplikationen nach HSCT [27] sowie das häufigere Auftreten von Transplantatabstoßung [28] und Rezidiven der Grunderkrankung (evtl. aufgrund des fehlenden GvL-Effekts) [8] weitgehend nivelliert.

1.1.4.3 Transplantation und supportive Maßnahmen

Nach Abschluss der Konditionierung wird an Tag 0 die Transplantation der hämato- poetischen Stammzellen durchgeführt. Nach den Leitlinien der Europäischen Gruppe für Blut- und Knochenmarktransplantationen (European Group for Blood and Marrow Transplantation, EBMT) ist die Transplantation als Infusion von hämatopoetischen Stammzellen nach einer Konditionierungstherapie definiert, die das Ziel hat, die exis- tierende Hämatopoese durch die injizierten Stammzellen zu ersetzen [15].

Im Rahmen der Transplantation werden eine Reihe supportiver Maßnahmen getrof- fen [29]. Dazu zählt die Umstellung auf parenterale Ernährung [30] ebenso wie eine breite antibiotische Abdeckung zur Infektprophylaxe und die Gabe von Erythrozyten-

Einleitung

und Thrombozytenkonzentraten in der Phase der Aplasie nach der HSCT, bis die transplantierten Stammzellen in der Lage ist, selbst ausreichend Zellen zu bilden.

Abbildung 1.2 zeigt noch einmal den zeitlichen Ablauf einer allogenen HSCT im Überblick.

7 Tage vorher Beginn der Konditionierung

Tag 0

Stammzell- bzw.

Knochenmarktransplantation

28 Tage (oder später) nach Transplantation Entlassung

Isolation und Dekontamination

GvHD-Prophylaxe

Supportive Maßnahmen Spender

Stammzellentnahme aus dem Blut bzw.

Knochenmark

ggf. Zellseparation

Patient

Transplantation

7 Tage vorher Beginn der Konditionierung

Tag 0

Stammzell- bzw.

Knochenmarktransplantation

28 Tage (oder später) nach Transplantation Entlassung

Isolation und Dekontamination

GvHD-Prophylaxe

Supportive Maßnahmen Spender

Stammzellentnahme aus dem Blut bzw.

Knochenmark

ggf. Zellseparation

Patient

Transplantation

Abb. 1.2: Zeitlicher Ablauf einer allogenen HSCT (Zeitangaben sind Richtwerte, nach [29])

1.1.5 Komplikationen im Verlauf der allogenen Knochenmark- und Stammzell- transplantation

1.1.5.1 Toxizität und allgemeine Komplikationen

Die konditionierende Therapie kann je nach Protokoll zu ausgeprägten toxischen Schäden an verschiedenen Organsystemen führen, die häufig die Höhe der appli- zierbaren Dosen der Strahlen- bzw. Chemotherapie limitieren.

In diesem Zusammenhang wird die therapiebedingte Toxizität (Schäden, die durch die myeloablative bzw. konditionierende Therapie verursacht werden) von der trans- plantationsassoziierten Toxizität unterschieden, die zusätzlich Nebenwirkungen pro-

phylaktischer Maßnahmen, die Panzytopenie, die GvHD und die Transplantatabsto- ßung umfasst [9].

In der Praxis lassen sich allerdings viele Komplikationen wie z.B. schwere Mukositi- den, die im Verlauf der allogenen HSCT auftreten, nicht eindeutig einem der beiden Begriffe zuordnen, da häufig erst das Zusammenspiel der verschiedenen Faktoren zum Auftreten der Nebenwirkung am Körper des Patienten führt.

Neben Rezidiven und Transplantatabstoßungsreaktionen stellen v.a. bakterielle, vira- le und Pilzinfektionen ein großes Problem in der Behandlung von Patienten nach HSCT da [31]. Opportunistische Infektionen sowohl in der frühen Aplasiephase als auch im weiteren Verlauf nach allogener HSCT gehören nach wie vor zu den wich- tigsten Ursachen der Morbidität und Mortalität nach HSCT [32].

Hierauf soll an dieser Stelle jedoch nicht weiter eingegangen werden.

1.1.5.2 Graft-versus-host disease (GvHD)

Eine der Hauptkomplikationen nach allogener HSCT neben Infektionen ist die so ge- nannte Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft-versus-host disease, GvHD), bei der immunkompetente Zellen aus dem Transplantat das Empfängergewebe als fremd erkennen, dessen Zellen angreifen und große Teile von ihnen schädigen oder zerstören.

Bereits 1966 erkannte Billingham die drei wesentlichen Voraussetzungen für die Ent- stehung der GvHD: Unterschiede zwischen Spender- und Empfängergewebe, das Vorhandensein von immunkompetenten Zellen im Transplantat und die Unfähigkeit des Empfängers, das Transplantat abzustoßen [33]. All diese Voraussetzungen sind im Rahmen einer allogenen HSCT gegeben: Trotz des Versuches, möglichst HLA- kompatibel zu transplantieren, d.h. eine möglichst vollständige Übereinstimmung zwischen den Haupttransplantationsantigenen (major histocompatibility complex, MHC bzw. human leucocyte antigens, HLA) von Spender und Empfänger zu erzie- len, bleiben auch zwischen MHC-identischen Individuen immer Unterschiede in Un- tergruppen dieser Transplantationsantigenen, den so genannten minor histocompati- bility complexes, bestehen [34, 35].

Da bei der Transplantation nicht nur die Hämatopoese des Empfängers durch die des Spenders ersetzt wird, sondern auch dessen vollständiges Immunsystem inklu- sive des Makrophagensystems mittransplantiert wird, greifen Effektorzellen aus dem Transplantat Zellen, die diese fremden Antigene tragen, an. Bei diesen Effektorzellen

Einleitung

handelt es sich vor allem um zytotoxische T-Lymphozyten (CD 8+) und natürliche Killerzellen [24, 35]. Über die Aktivierung von inflammatorischen Effektorzellen und eine in Gang gesetzte Zytokinkaskade, in der v.a. Interleukin-1 (IL-1) und Tumor- nekrosefaktor-(TNF-) eine große Rolle spielen [24, 36], werden bestimmte Gewe- bestrukturen des Empfängers stark geschädigt (vgl. 4.2 und Abbildung 4.1).

Im Rahmen der akuten GvHD (aGvHD), die definitionsgemäß in den ersten 100 Ta- gen nach HSCT auftritt [34] und nach dem Ausmaß des Organschadens in die Schweregrade I bis IV eingeteilt wird (vgl. 2.1.7.2), sind v.a. die Haut, der Darm und die Leber, insbesondere deren Epithelien, Ziel der T-Lymphozyten [24]. Zudem kön- nen auch das Immunsystem und die Lunge in erheblichem Maße geschädigt werden.

Das klinische Bild der aGvHD ist durch Exantheme, Bilirubinerhöhung und Diarrhöen in Kombination mit einer Reduktion des Allgemeinzustands des Patienten gekenn- zeichnet [29], vgl. Tabelle 1.1.

Tab.1.1: Organmanifestation und klinisches Bild der aGvHD (nach [29]) ORGANMANIFESTATION SYMPTOME/ KLINISCHESBILD

Haut nicht juckendes makulopapulöses Exanthem, Erythroder- mie, zum Teil mit Blasenbildung und Desquamation

Leber Erhöhung von Bilirubin und GOT

Darm Diarrhoe (teilweise blutig), zum Teil starke Bauchschmer- zen mit und ohne Ileus

Die chronische GvHD (cGvHD), die erst nach den ersten 100 Tagen nach HSCT auf- tritt und nach ihrem Ausprägungsgrad als limited oder extensive diseasebezeichnet wird (vgl. 2.1.7.2), gleicht in ihrem Erscheinungsbild einer Autoimmunerkrankung. Die Patienten leiden häufig unter Sklerodermie-ähnlichen Veränderung der Haut, Alope- zie, einem Sicca-Syndrom und einer Polyserositis [34]. Des Weiteren können eine hepatische und/oder pulmonale Dysfunktion sowie eine Knochenmarksinsuffizienz mit Thrombo- und Leukopenie auftreten [29, 37].

Da die Mortalität der GvHD auch heute noch bis zu 50% beträgt [34], sollte ihr Auftre- ten im Anschluss an eine HSCT möglichst verhindert werden. Hierzu kommt einer- seits die bereits erwähnte GvHD-Prophylaxe zum Einsatz (vgl. 1.1.4.2). Andererseits

müssen mögliche Risikofaktoren im Vorfeld der HSCT berücksichtigt werden. Vgl.

hierzu Tabelle 1.2

Tab. 1.2: Risikofaktoren für die Entwicklung einer GvHD (nach [29])

AKUTEGVHD CHRONISCHEGVHD

- HLA-mismatch oder Geschlechtsdifferenz zwischen Spender und Empfänger

- anderer Familienspender als HLA- identischer Geschwisterspender oder nichtverwandter Spender

- Alloimmunisierung des Spenders durch Transfusionen oder Schwangerschaft - höheres Alter

- positiver CMV-Serostatus - schlechter Allgemeinzustand

- vorausgegangene akute GvHD Grad II-IV

- HLA-mismatch zwischen Spender und Empfänger

- nichtverwandter Spender

- weibliche Spender für männliche Empfänger

- höheres Alter

1.1.5.3 Hämostaseologische Komplikationen im Verlauf der allogenen Kno- chenmark- und Stammzelltransplantation

1.1.5.3.1 Blutungskomplikationen nach HSCT

Hämostaseologische Probleme treten bei Patienten, die sich einer HSCT unterzie- hen, sehr häufig auf. Prinzipiell können dabei hämorrhagische Komplikationen von thrombotischen Komplikationen unterschieden werden [38].

Bei den hämorrhagischen Komplikationen handelt es sich zumeist um weniger schwerwiegende Haut- und Schleimhautblutungen, die vermehrt in den ersten vier Wochen nach HSCT auftreten. Jedoch sind auch gravierende Hämorrhagien wie gastrointestinale oder intrazerebrale Blutungen im Anschluss an eine HSCT keine Seltenheit [39].

Als Hauptfaktor hämorrhagischer Komplikationen ist die Thrombozytopenie anzuse- hen, die Folge der Knochenmarkaplasie nach myeloablativer Chemotherapie ist.

Nach Transplantation des Spenderknochenmarks ist mit einem Wiederanstieg der Leukozyten innerhalb von ca. 15 Tagen zu rechnen, während die Rekonstitution der Thrombozyten erst nach ca. vier Wochen erfolgt. Besondere Probleme entstehen vor allem dann, wenn diese Phase der initialen Thrombozytopenie durch bestimmte Fak- toren verlängert wird. Als solche Faktoren können z.B. die fehlende Annahme des Transplantats und die damit ausbleibende hämatologische Rekonstitution genauso

Einleitung

wie eine medikamentös induzierte Verminderung der Thrombozyten (z.B. durch Anti- biotika und/oder CsA) oder Virusinfekte wirken [38]. Es konnte gezeigt werden, dass besonders schwerwiegende Blutungen mit einer solchen Verlängerung der thrombo- zytopenischen Phase sowie mit dem Auftreten einer GvHD assoziiert sind [39].

1.1.5.3.2 Thrombotische Komplikationen und endotheliale Schädigung nach HSCT

Neben den hämorrhagischen Komplikationen treten eine Reihe thrombotischer Er- eignisse bei Patienten nach HSCT signifikant häufiger auf als beispielsweise bei Pa- tienten, die ausschließlich eine Chemotherapie ohne nachfolgende HSCT (z.B. im Rahmen einer Remissionsinduktion) erhielten. Dazu gehören die Lebervenenver- schlusskrankheit (veno-occlusive disease, VOD) [40] und die thrombotisch thrombo- zytopenische Purpura (TTP) [41], eine mikroangiopathische hämolytische Anämie (MAHA) [39] mit thrombotischer Komponente [42].

Obwohl die histopathologischen Charakteristika sowie die klinische Manifestation dieser Erkrankungen bereits mehrfach ausführlich beschrieben wurden [43, 44], ist ihre Pathogenese noch nicht vollständig geklärt. Wahrscheinlich ist aber, dass ihnen initial ein durch verschiedene Mechanismen ausgelöster Gefäßendothelschaden zugrunde liegt [42, 45, 46], weshalb sie von einigen Autoren zusammen mit dem idi- opathischen Pneumoniesyndrom (IPS) [47, 48] und dem Kapillarlecksyndrom (capil- lary leak syndrome, CLS) [49], Erkrankungen, die ebenfalls v.a. nach HSCT auftre- ten, alsendothelial damage syndromesbezeichnet werden [50] (vgl. Abbildung 1.3).

Auf den Endothelschaden weisen z.B. die im Plasma von HSCT-Patienten erhöhten Werte der löslichen endothelialen Proteine von Willebrand-Faktor (vWF) [51], Throm- bomodulin (TM) [52] und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) [53] hin, die Mar- ker für die Aktivierung bzw. die Schädigung des Endothels darstellen [54]. Man geht davon aus, dass durch verschiedene schädigende Einflussgrößen wie z.B. eine Ra- diochemotherapie, diverse Medikamente oder bakterielle Toxine die Anlagerung von Fibrin und somit die Thrombenbildung am Endothel gefördert wird [40], wobei auch die Expression von Tissue factor durch aktivierte Endothelzellen eine Rolle spielt.

Abb. 1.3: Einflussfaktoren und Folgeschäden am Endothel im Verlauf der HSCT Die erwähnten Krankheitsbilder treten im Anschluss an eine Hochdosischemo- bzw.

-radiochemotherapie mit einer Häufigkeit von 10-60% (VOD) [45, 55] bzw. 5-70%

(TTP) [41] auf und sind somit keineswegs Raritäten in der langen Liste der Komplika- tionen nach HSCT. Die Mortalität im Falle einer schweren Erkrankung liegt dabei 100 Tage nach der Transplantation jeweils bei nahezu 100% [41, 56]. Die großen Schwankungen bei den Angaben zur Inzidenz dieser Erkrankungen spiegeln bereits die erheblichen Probleme bei der Diagnosestellung wieder. Zum jetzigen Zeitpunkt werden hierfür vor allem klinische Parameter herangezogen, verlässliche Laborpa- rameter, die die Diagnosestellung erleichtern könnten, sind bisher nicht verfügbar.

Ähnlich problematisch gestaltet sich auch die Therapie dieser Erkrankungen. Versu- che einer medikamentösen thrombolytischen und antikoagulatorischen Therapie bei VOD oder des Plasmaaustausches bei TTP zeigten bei einigen Patienten Erfolge;

aufgrund des häufig zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits fortgeschrittenen Stadiums der Erkrankung bleibt aber gerade im Falle der VOD oft nur noch die Anla- ge portokavaler Shunts oder die Durchführung einer Lebertransplantation als ultima ratio [40]. Einen weiteren Ansatz in der Behandlung sowohl der VOD als auch der TTP könnte der Einsatz des Medikaments Defibrotide darstellen [55, 56] (vgl. 4.4.1).

Trotz allem führt aber nach wie vor auch die Ausschöpfung aller therapeutischen Möglichkeiten keineswegs zu akzeptablen oder gar zufrieden stellenden Ergebnis- sen.

Endothelzellschaden Konditionierungs-

therapie

GvHD-Prophylaxe

GvHD weitere Faktoren

(Infektionen etc.)

VODTTP

capillary leak syndrome idiopathisches Pneumoniesyndrom

GvHD

Endothelzellschaden Konditionierungs-

therapie

GvHD-Prophylaxe

GvHD weitere Faktoren

(Infektionen etc.)

VODTTP

capillary leak syndrome idiopathisches Pneumoniesyndrom

GvHD

Einleitung

1.2 Zirkulierende Endothelzellen

1.2.1 Zirkulierende Endothelzellen als Marker für vaskuläre Erkrankungen

In der Pathogenese verschiedenster Erkrankungen des Gefäßsystems nimmt die Schädigung endothelialer Zellen eine zentrale Stellung ein.

Ausgehend von der Annahme, dass sich durch unterschiedliche Noxen geschädigte Endothelzellen aus dem Zellverband lösen und anschließend im peripheren Blut zir- kulieren [57], versuchte man bereits in den 70er Jahren diese zirkulierenden Endo- thelzellen (circulating endothelial cells, CEC) zu isolieren und anhand der Konzentra- tion der CEC im Blut das Ausmaß des Gefäßschadens zu quantifizieren [58].

Tatsächlich konnten zirkulierende Endothelzellen inzwischen bei einer Reihe vasku- lärer Erkrankungen im Blut der betroffenen Patienten nachgewiesen werden, so z.B.

im Rahmen von ANCA-assoziierten Vaskulitiden [59], bei Sichelzellanämie [60], Ri- ckettsiose [61], koronarer Herzkrankheit [62] und thrombotisch thrombozytopenischer Purpura (TTP) [63]. Bei den Patienten mit ANCA-assoziierten Vaskulitiden fand sich dabei eine positive Korrelation zwischen der Konzentration der CEC und der Krank- heitsaktivität. Des Weiteren war es möglich anhand der CEC-Konzentration zwischen einer erhöhten Erkrankungsaktivität der Vaskulitis und davon unabhängigen Infekten zu unterscheiden [59]. Auch Patienten, die mit potentiell gefäßschädigenden Medi- kamenten wie Ciclosporin A (CsA) behandelt wurden, zeigten deutlich höhere CEC- Konzentrationen als entsprechende Patienten, die das Medikament nicht erhielten [64]. Zirkulierende Endothelzellen stellen somit einen Marker für einen Endothelzell- schaden dar.

Die Mechanismen der Pathogenese, die hinter diesen Erkrankungen stehen, sind sehr unterschiedlicher Natur, was möglicherweise auch das Auftreten verschiedener Zellphänotypen von fast intakten bis hin zu nekrotisch veränderten CEC erklärt [65].

1.2.2 Nachweis zirkulierender Endothelzellen

Die ersten Versuche, zirkulierende Endothelzellen im peripheren Blut nachzuweisen und ihre Konzentration zu bestimmen, stützten sich auf den histologischen Nachweis im nach May-Grünwald-Giemsa gefärbten Blutausstrich. Anhand bestimmter morpho- logischer Merkmale wie der Größe, der Form und einiger Aspekte des Zytoplasmas wurden die CEC gegenüber anderen Blutzellen abgegrenzt [58].

Spezifischer wurde der Nachweis der Endothelzellen durch den Einsatz immunzyto- chemischer Methoden [60]. In Ausstrichpräparaten konnten die Endothelzellen durch den Einsatz von Antikörpern gegen endotheliale Antigene wie von Willebrand-Faktor und Thrombomodulin eindeutig identifiziert werden, wobei jedoch auch bei dieser Methode Endothelzellen und Endothelzellfragmente, die sich nicht im Ausstrich be- fanden, dem Nachweis und somit auch der quantitativen Erfassung entgingen.

Mit der immunmagnetischen Isolierung, die auch in dieser Studie zum Einsatz kam, steht nun eine einfache Methode zur Verfügung, die sowohl die sichere Identifizie- rung der Endothelzellen als solche als auch die Erfassung weniger CEC in verhält- nismäßig großen Volumina garantiert [65]. Das Prinzip der immunmagnetischen Iso- lierung beruht auf der Bindung von magnetischen Partikeln an die Endothelzellen über spezifische Antikörper und wird in Kapitel 2.3.1.1 eingehend beschrieben.

1.2.3 Lösliche Marker der Endothelzellfunktion im Verlauf der HSCT

Schon seit langem steht fest, dass die Endothelzellschicht der Gefäße keineswegs nur eine begrenzende Funktion hat, sondern aktiv in physiologische Vorgänge wie die Regulierung des Blutdruckes oder des Gerinnungssystems involviert ist [66]. Dies bedeutet jedoch auch, dass eine endotheliale Dysfunktion z.B. durch traumatische Schädigung der Zellschicht eine Reihe von pathologischen Ereignissen zur Folge haben kann, wie die Bildung atheromatöser Plaques oder Thromben. Aus diesem Grund ist man daran interessiert, Marker zu ermitteln, die die Funktionstüchtigkeit bzw. den Zustand der Endothelzellen widerspiegeln. Diese sollen Aufschluss über den Phänotyp der Zellen, der von aktivierter bis zu geschädigter Zelle reichen kann, im Verlauf unterschiedlicher Krankheitsbilder geben und so möglicherweise zur Klä- rung der Rolle des Endothels in der Pathogenese beitragen [54]. Diese Marker soll- ten vor allem in Endothelzellen exprimiert werden, im Blut löslich und leicht messbar sein. Diese Anforderungen erfüllen die Proteine von Willebrand-Faktor (vWF), Thrombomodulin (TM) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) sowie lösliches E-Selectin und das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (intercellular adhesion molecu- le-1, ICAM-1) [51-54].

Dabei scheinen durch die Erhöhung der Konzentrationen der verschiedenen Proteine unterschiedliche Prozesse am Endothel widergespiegelt zu werden: Während die Konzentration für lösliches TM im Blut der Patienten vor allem bei einer (traumati- schen) Schädigung des Endothels anzusteigen scheint, reflektieren erhöhte Werte

Einleitung

für vWF und ICAM-1 offensichtlich auch eine Aktivierung der Zellschicht ohne deren direkte Schädigung [51].

Im Verlauf der allogenen HSCT konnten wiederholt erhöhte Konzentrationen dieser endothelspezifischen Proteine im Blut der Patienten nachgewiesen werden. Zum Teil korrelierte die Höhe des Konzentrationsanstiegs dabei mit der Häufigkeit des Auftre- tens und der Schwere von transplantations-assoziierten Problemen wie der VOD, der TTP, dem CLS, einer GvHD oder einer bakteriellen Sepsis [52, 53, 67].

1.3 Fragestellung

Endotheliale Alterationen sind die pathogenetische Grundlage für eine Vielzahl bis- lang unzureichend verstandener Krankheitsbilder, die vor allem im Verlauf der HSCT auftreten. Diese Krankheitsbilder tragen zu Morbidität und Mortalität dieses Thera- pieverfahrens maßgeblich bei. Gegenwärtig stellen sie sowohl eine diagnostische als auch eine therapeutische Herausforderung dar. Insbesondere sind spezifische La- borparameter zur Frühdiagnose und Verlaufskontrolle bisher nicht verfügbar.

Vor dem Hintergrund der Erfahrung mit zirkulierenden Endothelzellen (CEC) als Mar- ker für die Krankheitsaktivität bei Patienten mit aktiven Vaskulitiden [59] sollte in die- ser Studie geprüft werden, ob dieser Labormarker auch Eingang in die Diagnose und Verlaufskontrolle der angesprochenen Krankheitsbilder bei HSCT-Patienten finden könnte.

Um die Zahl der Einflussfaktoren auf die Höhe der CEC zum Zeitpunkt der Messun- gen zu limitieren, wurde bewusst die Frühphase der HSCT für die Bestimmung die- ses Parameters gewählt.

Folgende Fragen sollten beantwortet werden:

 Kommt es bereits in der Frühphase der allogenen HSCT, d.h. in der Phase der vorbereitenden Konditionierungstherapie und den ersten drei Wochen nach Transplantation, zu einem messbaren Anstieg zirkulierender Endothelzellen und wenn ja, welches Ausmaß hat dieser?

 Gibt es Unterschiede zwischen den verschiedenen Konditionierungstherapien hinsichtlich des Ausmaßes und des Zeitpunktes der Endothelzellschädigung?

 Können während einer Nachbeobachtung der Patienten von mindestens sechs Monaten nach Transplantation aufgetretene transplantationsassoziierte Kom- plikationen zu den Ergebnissen der Endothelzellbestimmung in Beziehung ge- setzt werden?

Patienten, Material und Methoden

2 P

, M

M

2.1 Patienten

2.1.1 Einschlusskriterien

In die Studie aufgenommen wurden Patienten mit malignen und nicht-malignen hä- matologischen Erkrankungen, die sich im Zeitraum von April 2002 bis April 2003 an der Medizinischen Hochschule Hannover einer allogenen Stammzell- oder Kno- chenmarkstransplantation unterzogen.

Alle Patienten erklärten im Rahmen der allgemeinen Aufklärungsmaßnahmen im Vorfeld der Transplantation schriftlich ihr Einverständnis, für wissenschaftliche Zwe- cke Blut und/oder Knochenmark zu spenden. Diese Einverständniserklärung konnte zu jeder Zeit widerrufen werden.

2.1.2 Alter und Geschlecht

Beobachtet wurden 39 Patienten im Alter von 21 bis 62 Jahren (20 Männer und 19 Frauen, medianes Alter 44 Jahre) über einen Zeitraum von einem bis zu achtzehn Monaten (mediane Beobachtungsdauer 10 Monate).

Als Vergleichskollektiv wurde diesen Patienten eine Gruppe altersentsprechender (22-61 Jahre, medianes Alter 42, neun Männer, acht Frauen) gesunder Probanden gegenübergestellt, die sich aus Mitarbeitern der Medizinischen Hochschule und de- ren Angehörigen zusammensetzte, die sich freundlicherweise freiwillig zur Mitarbeit an der Studie bereit erklärt hatten.

2.1.3 Grunderkrankung und Remissionsstatus

Am häufigsten wurde in der Gruppe der beobachteten Patienten die Indikation zur allogenen HSCT aufgrund einer akuten (myeloischen oder lymphatischen) Leukämie gestellt (n = 23,), gefolgt von der chronisch myeloischen Leukämie (CML, n = 10).

Seltenere Indikationen waren myelodysplastische Syndrome (MDS, n = 2), das Plas- mozytom (n = 1), das hochmaligne Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) (n = 1) und die aplastische Anämie (n = 1) (aufgeführt in Tabelle 2.1 unter Sonstiges).

Zum Zeitpunkt der Transplantation befanden sich die Patienten in verschiedenen Er- krankungsstadien (vgl. Tabelle 2.1).

Tab. 2.1: Grunderkrankung und Remissionsstatus bei Transplantation Status der Erkrankung bei

Transplantation

AML (n= 18)

ALL (n= 5)

CML (n= 10)

MDS (n= 2)

Sonstige (n= 4) 1. komplette Remission oder

chronische Phase (CML)

9 (50%)

1 (20%)

8 (80%)

1 (50%)

1 (25%) 2. komplette Remission 5

(27,8%)

3 (60%)

- - -

Partialremission 1

(5,6%)

1 (20%)

- 1

(50%)

2 (50%) Rezidiv oder akzelerierte

Phase/Blastenschub (CML)

3 (16,7%)

- 2

(20%)

- -

Stabile Erkrankung - - - - 1

(25%)

2.1.4 Transplantat- und Spendercharakteristik

Transplantiert wurden in 33 Fällen durch Apherese gewonnene periphere Stammzel- len, sechs Patienten erhielten dagegen Knochenmark, das den Spendern zuvor ope- rativ entnommen worden war.

In 18 Fällen konnten Stammzellen oder Knochenmark von Spendern transplantiert werden, die mit den Patienten verwandt waren. Bei den Spendern handelte es sich dabei fast ausschließlich um Geschwister der Patienten, in einem Fall erhielt ein Pa- tient jedoch auch Knochenmark von seiner Tochter. Von den Transplantaten der 18 Familienspender wies nur eines eine HLA-Inkompatibilität für die Genloci HLA-DRB1 und DQB1 auf, die restlichen Transplantate waren HLA-identisch mit den Empfän- gern.

Für die übrigen 21 Patienten konnte kein Familienspender gefunden werden, so dass Transplantate von Fremdspendern eingesetzt wurden. 17 dieser Transplantate wie- sen keine HLA-Inkompatibilität auf, in vier Fällen gab es jeweils ein HLA-mismatch (zweimal für HLA-DQB1, einmal für HLA-A2 und einmal für HLA-B).

Von den Spendern waren 23 männlichen und 16 weiblichen Geschlechts. Die Ge- schlechterkombination zwischen Spender und Empfänger ist in Tabelle 2.2 darge- stellt.

Patienten, Material und Methoden

Tab. 2.2: Geschlechterkombinationen zwischen Spender und Empfänger

SPENDER

männlich weiblich

männlich 14 (35,9%) 6 (15,4%)

PATIENT

weiblich 9 (23,1%) 10 (25,6%)

2.1.5 Konditionierungsprotokolle

2.1.5.1 Konventionelle Konditionierung

Es existieren zwei Standardprotokolle für die myeloablative Konditionierungstherapie im Vorfeld der allogenen HSCT: Die Hochdosischemotherapie mit den Chemothera- peutika Busulfan (Myleran®) und Cyclophosphamid (Endoxan®) (BU/CY) und die Hochdosischemotherapie mit Cyclophosphamid in Kombination mit einer fraktionier- ten Ganzkörperbestrahlung (TBI/CY).

Diese beiden Therapieprotokolle sind prinzipiell gegeneinander austauschbar.

Von den 39 Patienten dieser Studie erhielten fünf Patienten mit einer AML, vier mit einer ALL, drei mit einer CML und eine Patientin mit einer aplastischen Anämie eine Konditionierung nach dem Protokoll TBI/CY:

Zunächst wurde eine fraktionierte Ganzkörperbestrahlung (total body irradiation, TBI) über drei aufeinander folgende Tage durchgeführt. Die Gesamtstrahlendosis betrug dabei 12 Gy, die Einzeldosen, die zweimal pro Tag verabreicht wurden, betrugen jeweils 2 Gy. Durch eine besondere Abschirmung überschritt die Lungendosis nicht den Wert von 9 Gy. Die sich daran anschließende Chemotherapie bestand aus der Gabe von jeweils 60 mg Cyclophosphamid pro Kilogramm Körpergewicht an zwei aufeinander folgenden Tagen (Gesamtdosis 120 mg/kg KG).

Eine Patientin mit einer ALL erhielt aufgrund eines erhöhten Abstoßungsrisikos bei doppeltem HLA-mismatch zusätzlich zur Ganzkörperbestrahlung und der Cyc- lophosphamidtherapie das Chemotherapeutikum Fludarabin (FLU, Fludara®, 25 mg/m²KOF über fünf aufeinander folgende Tage).

Eine konventionelle Konditionierungstherapie ohne Ganzkörperbestrahlung nach dem Protokoll BU/CY wurde in 14 Fällen durchgeführt: Sieben Patienten mit AML, sechs mit CML und ein Patient mit einem myelodysplastischen Syndrom erhielten

zunächst insgesamt 16 mg Busulfan pro Kilogramm Körpergewicht verteilt über vier aufeinander folgende Tage (pro Tag vier Gaben zu jeweils 1 mg/kg KG). Nach Ab- schluss der Busulfangabe wurde Cyclophosphamid in einer Gesamtdosis von 120 mg pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht, ebenso wie bei dem Protokoll TBI/CY in zwei Einzelgaben zu je 60 mg/kg KG an zwei aufeinander folgenden Tagen. Das Alter der Patienten, die eine konventionelle Konditionierungstherapie erhielten, lag bei HSCT zwischen 21 und 52 Jahren, das mediane Alter betrug 41 Jahre.

2.1.5.2 Konditionierungstherapie mit reduzierter Intensität

Eine konventionelle Therapie wie unter 1.1.4.1 und 2.1.5.1 beschrieben ist aufgrund der hohen Toxizität bei älteren Patienten (> 55 Jahre), bei Patienten mit schwerwie- genden Begleiterkrankungen oder solchen, die in bereits ein autologes oder alloge- nes Stammzelltransplantat erhielten, meist nicht anwendbar.

Für diese Patienten kommt im Vorfeld der allogenen HSCT nur eine Konditionierung mit reduzierter Intensität (reduced-intensity conditioning, RIC) in Frage.

Von den 39 Patienten dieser Studie wurden elf (sechs mit AML, jeweils ein Patient mit CML, NHL, MDS, Plasmozytom und Osteomyelofibrose) nach einem RIC- Protokoll behandelt. Diese Konditionierung wurde mit der Gabe von Fludarabin in einer Gesamtdosierung von 150 mg/m²verteilt auf Einzeldosen zu je 25 mg/m² über sechs aufeinander folgende Tage eingeleitet. Danach wurde bei neun Patienten nach dem Protokoll FLU/BU die Chemotherapie mit der Gabe von insgesamt 8 mg/kg KG Busulfan fortgesetzt, wiederum verteilt auf je vier Einzeldosen pro Tag zu 1 mg/kg KG an zwei aufeinander folgenden Tagen. Bei Konditionierung nach dem Pro- tokoll FLU/MEL (zwei Patienten mit einer AML) wurde das Busulfan durch Melphalan (Alkeran®) ersetzt, welches in einer Gesamtdosierung von 180 mg/kg KG intravenös verabreicht wurde (jeweils 90 mg/kg KG pro Tag an zwei aufeinander folgenden Ta- gen).

Das Alter der Patienten, die eine dosisreduzierte Konditionierung erhielten, lag zwi- schen 32 und 62 Jahren. Das mediane Alter lag mit 54 Jahren deutlich über dem der Patienten, die eine konventionelle Konditionierung erhielten (hier lag das mediane Alter bei 41 Jahren).

Patienten, Material und Methoden

2.1.5.3 Radioimmuntherapie

Seit Kurzem besteht die Möglichkeit, sowohl die konventionelle als auch die reduzier- te Konditionierungstherapie mit einer Radioimmuntherapie (RIT) zu kombinieren und somit durch Erhöhung der Strahlendosis im Knochenmark deren Effekt zu intensivie- ren (vgl. 1.1.4.1).

Zum Einsatz kommt die RIT v.a. bei Patienten, für die ein hohes Rezidivrisiko ihrer Grunderkrankung besteht, z.B. weil sich die Erkrankung bereits in einem fortgeschrit- tenen Stadium (z.B. 2. komplette Remission) befindet oder schlechte Prognosekrite- rien wie ungünstige zytogenetische Veränderungen in den malignen Zellen oder ein schlechtes Ansprechen auf die Induktionschemotherapie vorliegen.

Da es sich bei der RIT um ein aufwändiges und noch nicht standardmäßig etabliertes Verfahren handelt, können noch nicht alle Patienten, auf die die eben genannten Kri- terien zutreffen, eine solche Therapie zusätzlich zur Standardkonditionierung erhal- ten. Ausschlusskriterium für eine RIT ist eine in der prätherapeutisch durchgeführten Ganzkörperszintigraphie sichtbare intensive Anreicherung des Tracers außerhalb des Knochenmarks (v.a. in Leber und Niere). Auch Patienten, deren Grunderkran- kung sich im Rezidivstadium befindet, können von einer RIT nicht profitieren, da sich die mit Rhenium-188 radioaktiv-markierten Antikörper an CD 66b anlagern, ein Anti- gen, das nur auf gesunden hämatopoetischen Zellen zu finden ist. Ist das Knochen- mark von malignen Zellen infiltriert, die dieses Antigen nicht tragen, ist eine Anreiche- rung dort nicht mehr gegeben.

Von den 28 konventionell konditionierten Patienten dieser Studie erhielten sieben eine zusätzliche Radioimmuntherapie (dreimal RIT/TBI/CY, dreimal RIT/BU/CY und einmal RIT/TBI/CY/FLU), von den elf Patienten mit RIC wurden fünf zusätzlich mit RIT behandelt (dreimal RIT/FLU/BU, zweimal RIT/FLU/MEL).

Abbildung 2.1 gibt noch einmal einen Überblick über die Intensitäten der verschiede- nen Konditionierungstherapien.

FLU/BU FLU/MEL

RIT + FLU/BU +FLU/MEL

TBI/CY BU/CY

RIT + TBI/CY + BU/CY

RIT

+ TBI/CY/FLU

Schwere der möglichen Organschäden (Toxizität)

IntensitätderKonditionierung

FLU/BU FLU/MEL

RIT + FLU/BU +FLU/MEL

TBI/CY BU/CY

RIT + TBI/CY + BU/CY

RIT

+ TBI/CY/FLU

Schwere der möglichen Organschäden (Toxizität)

IntensitätderKonditionierung

Abb. 2.1: Beziehung zwischen Intensität und Toxizität bei verschiedenen Konditionie- rungstherapien

2.1.6 GvHD-Prophylaxe

Ein Großteil der Patienten (n = 23, 59%) erhielt eine kombinierte medikamentöse GvHD-Prophylaxe mit Ciclosporin A (CsA) und Methotrexat (MTX). Die Gabe von CsA erfolgte spiegeladaptiert (Zielspiegel: 100-200 ng/ml) ab Tag –1 vor Transplan- tation. MTX wurde als so genannter short coursean den Tagen +1 (15 mg/m² KO), +3 und +6 (jeweils 10 mg/m²KO) nach Transplantation verabreicht.

Aufgrund der Entwicklung einer schweren Mukositis konnte bei neun weiteren Pati- enten (23,1,%) die Gabe von MTX nach der ersten oder zweiten Dosis nicht fortge- setzt werden, so dass bei diesen Patienten ab Tag +7 nach Transplantation in der GvHD-Prophylaxe MTX durch Prednisolon (Decortin H®) ersetzt wurde. Die anfäng- liche Dosierung lag bei 0,5 mg/kg KG, ab Tag +14 bei 1 mg/kg KG. Ab Tag +28 er- folgte eine langsame Dosisreduktion.

Fünf Patienten (12,8 %) erhielten ein T-Zell-depletiertes Transplantat. Der Verzicht auf eine medikamentöse GvHD-Prophylaxe war in vier dieser Fälle nötig, da diese Patienten bereits im Rahmen einer Konditionierungstherapie mit sehr hoher Intensität

Patienten, Material und Methoden

(z.B. RIT in Kombination mit einer konventionellen Konditionierung) einer hohen the- rapiebedingten Toxizität ausgesetzt waren. Erfahrungsgemäß ist in solchen Fällen eine weitere Steigerung der transplantationsassoziierten Toxizität durch eine medi- kamentöse GvHD-Prophylaxe mit massiven und häufig letal endenden Komplikatio- nen vergesellschaftet, weshalb sie durch den Einsatz eines T-Zell-depletierten Transplantates umgangen werden sollte.

Bei jeweils einer Patientin bestand die GvHD-Prophylaxe nur aus CsA (spiegeladap- tiert ab Tag –1) bzw. aus CsA (spiegeladaptiert ab Tag –1) und Steroiden (0,5 mg/kg KG ab Tag +7, 1 mg/kg KG ab Tag +14, langsame Dosisreduktion ab Tag +28).

Acht Patienten erhielten zusätzlich als GvHD-Prophylaxe bereits im Rahmen der Konditionierung Antithymozytenglobulin (ATG, ATG Fresenius®), dreizehn den Anti- körper Campath-1. Indikation für diese zusätzliche in-vivo-T-Zell-Depletion waren das Vorliegen eines HLA-mismatches zwischen Spender und Empfänger oder die Tatsa- che, dass Spender und Empfänger nicht miteinander verwandt waren.

2.1.7 Dokumentation der Komplikationen nach der allogenen HSCT 2.1.7.1 Erhobene Daten

Da die unter 1.1.5 beschriebenen Komplikationen häufig in den ersten sechs Mona- ten nach HSCT auftreten, wurden die 39 Patienten der Studie für mindestens diese Zeitdauer (zwischen sieben und achtzehn Monaten, mediane Beobachtungsdauer zehn Monate) bzw. bis zu ihrem Tod beobachtet und das Auftreten von folgenden Ereignissen dokumentiert:

Auftreten einer akuten (aGvHD) oder chronischen GvHD (cGvHD) (vgl. 2.1.7.2), Auf- treten eines der erwähnten endothelial damage syndromes (VOD, TTP, IPS, CLS), Auftreten eines Rezidivs der Grunderkrankung und Tod.

2.1.7.2 Stadien und Gradeinteilung der akuten und chronischen GvHD

Die Einteilung der akuten und chronischen GvHD erfolgte nach klinischen Parame- tern. Eine histologische Sicherung des Befundes durch Biopsien z.B. der Haut oder der Leber wurde dabei nur in Einzelfällen durchgeführt.

Die klinische Einteilung der aGvHD erfolgte nach der Seattle-Klassifikation [68, 69]

(s. Tabelle 2.3a und b), die der cGvHD nach Shulman et al. [70] (s. Tabelle 2.4).

Tab. 2.3a: Schweregrad der aGvHD an den einzelnen Organen

GRAD 1 2 3 4

HAUT Exanthem

< 25% KO

Exanthem 25-50 % KO

generalisierte Erythrodermie

generalisierte Erythrodermie,

Blasen und Desquamation LEBER

Bilirubin 20-50 µmol/l

Bilirubin 50-100 µmol/l

Bilirubin 100-250 µmol/l

Bilirubin

> 200 µmol/l

DARM Diarrhoe

>500 ml/Tag für≥3 Tage

Diarrhoe

> 1000 ml/Tag für≥3 Tage

Diarrhoe

> 1500 ml/Tag für≥3 Tage oder sichtbares

Blut oder ab- dominelle

Krämpfe

mehr als 2 der Symptome von

Grad 3

Tab. 2.3b: Stadieneinteilung der aGvHD

GRAD I II III IV

HAUT 1-2 1-3 2-3 2-4

DARM 0 1 (+/- Leber) 2-3 (+/- Leber) 2-4

LEBER 0 1 (+/- Darm) 2-3 (+/- Darm) 2-4

keine klinische Beeinträchti-

gung

geringe klini- sche Beein- trächtigung

deutliche klini- sche Beein-

trächtigung

extreme klini- sche Beein-

trächtigung

Tab. 2.4: Stadieneinteilung der cGvHD limitierte cGvHD

(1 von 2 oder beide Kriterien) extensivecGvHD (1 Kriterium ausreichend) 1. lokalisierte Hautbeteiligung 1. generalisierte Hautbeteiligung

2. lokalisierte Hautbeteiligung und/oder Leberdysfunk- tion durch cGvHD und

a. histologisch gesicherte chronisch aktive Hepatitis, Brückennekrosen oder Zirrhoseoder

b. Augenbeteiligung (Schirmertest pathologisch) oder c. Beteiligung der Speicheldrüsen oder der Mundmu-

kosa (bioptisch gesichert)oder 2. Leberdysfunktion als Folge

einer cGvHD

d. Beteiligung irgendeines anderen Organs

Patienten, Material und Methoden

2.2 Material

2.2.1 Materialliste Reagenzien

 Dynabeads M-450 Pan Mouse IgG; Dynal, Hamburg, Germany (Nr. 110.23)

 Octagam IgG human 5%; Octapharma, Langenfeld, Germany (PZN 7708386)

 PBS Dulbeccos, Life Technologies (Nr. 14040091)

 Lectin, FITC-gekoppelt an Ulex europaeus; Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany (Nr. L9006)

Antikörper

 Maus Anti-CD 146; Biocytex, Marseille, France (Nr. 5050_P100T) Lösungen

 PBAZ: PBS-Lösung mit 0,1% BSA, 0,1% Natriumazid, 0,6% Natriumzitrat

 PBS-BSA-A: PBS-Lösung mit 0,1% BSA, 0,1% Natriumazid Geräte und Ausrüstung

 Magnethalterung MPC-L; Dynal, Hamburg, Germany (Nr. 120.21)

 Probenschüttler nach Woywodt [71]

 Zählkammer nach Nageotte; Brand, Wertheim, Germany

 Leiz Laborlux S; Leiz, Germany

 Filterblock M553 n für blau-grün; Leica, Bensheim, Germany

 Fotokamera Nikon FX-35 DX, Nikon

 Fotoaufsatz für Mikroskop Nikon UFX-DX; Nikon

2.2.2 Erläuterungen zu den verwendeten Materialien 2.2.2.1 Dynabeads

Dynabeads sind eisenhaltige Partikel mit einem einheitlichen Durchmesser von 4,5 µm (Typ M-450) bzw. 2,8 µm (Typ M-280). Sie besitzen paramagnetische Eigen- schaften, d.h. sie werden von einem Magneten angezogen, behalten aber außerhalb des Magnetfeldes keinen Restmagnetismus zurück. Ihre einheitliche Größe und Form sowie die besondere chemische Zusammensetzung der Oberfläche ermögli-

chen die Kopplung von Antikörpern an die beads und minimieren deren Agglutination untereinander sowie die unspezifische Bindung an andere Stoffe.

Dynabeads können primär oder sekundär mit Antikörpern beschichtet werden. Bei der primären Beschichtung wird der gegen das Zielantigen gerichtete Primärantikör- per direkt über seinen Fc-Teil mit der Oberfläche der Dynabeads verbunden. Die beads sind in diesem Fall nach der Komplexbildung über nur einen Antikörper mit dem Antigen verbunden.

Bei der sekundären Beschichtung sind die beads dagegen zunächst mit einem so genannten Brückenantikörper beschichtet, der dann wiederum den Fc-Teil der gegen das gewünschte Antigen gerichteten Primärantikörper erkennt und bindet. Durch die- ses Vorgehen können auch Dynabeads für experimentelle Verfahren wie die Isolie- rung von Endothelzellen, für die es noch keine primär beschichteten Partikel gibt, präpariert werden.

2.2.2.2 CD 146

CD 146 auch bekannt als S-Endo 1-Antigen, Mel-CAM oder MUC18 ist ein trans- membranes Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 118 kDa, das in großem Maße fast ausschließlich auf humanen Endothelzellen unabhängig von deren Ur- sprungsgewebe und der Gefäßgröße bzw. des Gefäßtyps exprimiert wird [72].

In niedrigeren Konzentrationen kann CD 146 auch auf der Oberfläche von glatten Muskelzellen, follikulären dendritischen Zellen und Stromazellen nachgewiesen wer- den, ähnlich hohe Konzentrationen wie auf Endothelzellen findet man jedoch nur in bestimmten malignen Zelllinien (v.a. Melanomzelllinien) [72]. Offensichtlich ist in die- sen Zellen die Expression des Antigens auf der Oberfläche mit bestimmten Metasta- sierungseigenschaften des Primärtumors assoziiert [73]. Lokalisiert in der Verbin- dungszone zwischen den Zellen spielt CD 146 eine Rolle in der Kontrolle der Zell- Zell-Interaktionen zwischen den Zellen des endothelialen Monolayers [74, 75].

Zudem konnte in vitro bei Endothelzellen aus Nabelschnurgefäßen (HUVEC = hu- man umbilical vein endothelial cells) gezeigt werden, dass die Aktivierung von CD 146 durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper über eine komplexe intrazel- luläre Signalkaskade zu einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration führt. Dies deutet auf eine Rolle des Antigens bei der Organisation des intrazellulären Aktin-Zytoskeletts hin, wobei ein direkter Effekt noch nicht nachgewiesen werden konnte und die Relevanz in vivo noch ungeklärt bleibt [73].

Patienten, Material und Methoden

Durch Abwesenheit von CD 146 auf Zellen der Hämato-, Lympho- und Granulopoese erfüllt das Antigen eine wichtige Voraussetzung für die Isolation von Endothelzellen aus peripherem Vollblut, da auf diese Weise die Zellen spezifisch von anderen Blut- zellen getrennt werden können.

Ebenso wenig exprimiert wird CD 146 von Endothelprogenitorzellen (EPC) [76]. Da- mit wird eine klare Abgrenzung der reifen Endothelzellen gegenüber ihren Vorläufern möglich, die evtl. bei Schädigung der endothelialen Zellschicht im Blut ebenfalls in erhöhten Konzentrationen zu finden sind, nicht aber das Zielobjekt dieser Studie dar- stellten.

2.2.2.3 Ulex europaeus agglutinin I (UEA I)

Das in dieser Studie zur Färbung der zirkulierenden Endothelzellen verwendete Ulex europaeus agglutinin I (UEA I) ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 63 kDa, das aus den Samen des Stechginsters (Ulex europaeus) gewonnen wird. Es zählt zur Gruppe der Lectine, Proteine pflanzlichen, tierischen und mikrobiellen Ur- sprungs, die an verschiedene, jeweils genau definierte Zuckermolekülstrukturen bin- den.

UEA I bindet spezifisch an -L-Fucose-Reste von Glykoproteinen und Glykolipiden auf der Oberfläche von Zellen endothelialer Herkunft [77] unabhängig von der Größe oder der Lokalisation des Gefäßes, aus dem sie stammen. Die stabile Expression des UEA I- Liganden auf der Endothelzelloberfläche, der auch auf nekrotischen Zel- len noch in für die Färbung ausreichendem Ausmaß vorhanden ist [59], ist ein weite- res Argument für die Verwendung dieser Substanz [78, 79].

Da UEA I jedoch auch an -L-Fucose-Strukturen auf der Oberfläche von Erythrozy- ten bindet, verbietet sich die Anwendung des Stoffes für eine Anfärbung von zirkulie- renden Endothelzellen in Vollblut.

2.3 Methodik

2.3.1 Isolierung von Endothelzellen

2.3.1.1 Prinzip der immunmagnetischen Isolierung von zirkulierenden Endo- thelzellen aus dem peripheren Blut

Zirkulierende Endothelzellen sind im Blut nur in sehr geringer Konzentration zu fin- den. Um diese Zellen gezielt zu isolieren und quantitativ erfassen zu können, wurde in dieser Studie die Methode der immunmagnetischen Isolierung angewandt.

Paramagnetische Partikel (Dynabeads), die mit Antikörpern gegen das Zielantigen CD 146 auf der Oberfläche von Endothelzellen beschichtet sind, werden mit dem Zellgemisch inkubiert und binden über die Antikörper an die zu isolierenden Zellen.

Lässt man auf das Gefäß mit den so gebundenen Zellen ein Magnetfeld einwirken, werden die Komplexe aus paramagnetischen Partikel und den von ihnen gebunde- nen Zellen an der Gefäßwand festgehalten. Der Überstand kann dekantiert und die an die Partikel gebundenen Zellen in einem Puffer resuspendiert werden (vgl. Abbil- dung 2.2).

Abb. 2.2: Immunmagnetische Isolierung mittels Dynabeads

Patienten, Material und Methoden

2.3.1.2 Entwicklung der Methode

Die endotheliale Herkunft der aus dem Blut isolierten Zellen konnte durch immunzy- tochemische Färbung für die Antigene von Willebrand-Faktor und CD 31 (PECAM) nachgewiesen werden [80].

Eine unspezifische Bindung der Dynabeads an andere Blutzellen wie etwa Leukozy- ten wurde ausgeschlossen. Darüber hinaus zeigte sich bei der Verwendung von CEC aus einer Kultur menschlicher Nabelschnurvenen (HUVEC) kein Einfluss des Isolie- rungsvorgangs auf den Phänotyp der isolierten Zellen.

2.3.1.3 Blutentnahme

Um einen Einfluss der Blutentnahme auf die Zahl der CEC auszuschließen, wurden in unserem Abnahmeprotokoll die ersten 7,5 ml Blut nach der Punktion bzw. beim Abziehen aus einem Katheter verworfen, da sich darin, wie frühere Untersuchungen zeigten, alle durch die Manipulation zusätzlich von der Gefäßwand gelösten Endo- thelzellen befinden sollten [59]. Die zweiten 7,5 ml Blut wurden in einem EDTA- Röhrchen abgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei einer Temperatur von 4°C im Kühlschrank gelagert.

Die Blutentnahme wurde bei jedem der 39 Patienten jeweils fünfmal im Verlauf der allogenen HSCT zu festgesetzten Zeitpunkten durchgeführt (vgl. Abbildung 2.3): un- mittelbar vor Beginn der Konditionierung (Messzeitpunkt 1, zur Vereinfachung im Weiteren als Tag –7 bezeichnet), nach Beendigung der Konditionierung am Tag vor der Transplantation (Tag –1, Messzeitpunkt 2) und dreimal nach der Transplantation im Abstand von jeweils einer Woche an den Tagen +7, +14 und +21 (Messzeitpunkte 3,4 und 5).

GvHD-Prophylaxe

-7 -1 0 7 14 21

Transplantation Transplantation

Konditionie- rung

GvHD-Prophylaxe

-7 -1 0 7 14 21

Transplantation Transplantation

Konditionie- rung

Abb. 2.3: Protokoll für die Entnahme der Blutproben

2.3.1.4 Präparation der immunmagnetischen Partikel (beads)

Da es sich bei der immunmagnetischen Isolation von Endothelzellen um eine expe- rimentelle Methode handelt, für die noch keine primär beschichteten Dynabeads zur Verfügung stehen, mussten vor dem Einsatz Dynabeads nach folgendem Protokoll mit dem Primärantikörper für das Zielantigen auf den zu isolierenden Zellen be- schichtet werden, in unserem Falle mit Antikörpern gegen CD 146 (S-Endo 1).

Die fertigen Dynabeads konnten nach der Beschichtung ca. zwei Monate im Kühl- schrank bei 4°C aufbewahrt werden. Bei Überschreitung einer Lagerungszeit von zwei Monaten, wurde vor Verwendung der beads die Pufferlösung mit Hilfe des Magneten gewechselt („Waschen“), um überschüssige Antikörper, die sich im Laufe der Zeit gelöst hatten, zu entfernen.

Protokoll:

1.) Vorlegen von 350 µl Dynabeads in einem 5 ml-Röhrchen

2.) Waschen im Magneten und Resuspension in 1 ml PBS-BSA-A 2 min 3.) Waschen im Magneten und Resuspension in 350 µl PBS-BSA-A 2 min 4.) Zugabe von 1 ml vorverdünntem S-Endo 1 (25 µg/ml Endkonzentration)

5.) Inkubation im Probenschüttler 2 h

Patienten, Material und Methoden

6.) dreimal Waschen im Magneten mit Resuspension in 1 ml PBS-BSA-A 7.) Lagerung bei 4°C im Kühlschrank

2.3.1.5 Grundprotokoll für die immunmagnetische Isolierung, die Färbung und die quantitative Erfassung zirkulierender Endothelzellen aus dem peripheren Blut

Alle Schritte des nachfolgenden Protokolls wurden auf Eis durchgeführt, um die un- spezifische Bindung von Monozyten und Granulozyten so gering wie möglich zu hal- ten [59]. Dem gleichen Zweck diente die Zugabe von Octagam in Schritt 1 (vgl.

2.3.1.6).

1.) Vorlegen von 1 ml EDTA-Patientenblut, 1 ml PBAZ-Puffer und 20 µl Octagam- Lösung in einem 5 ml-Röhrchen

2.) Zugabe von 50 µl S-Endo 1-beschichteten Dynabeads

3.) Inkubation im Probenschüttler bei einer Raumtemperatur von 4°C 30 min 4.) viermal Waschen im Magneten:

Röhrchen in den Magneten stecken 2 min

Überstand absaugen

Resuspension in 1 ml PBAZ

5.) Zusätzlicher Waschschritt mit anschließender Resuspension in 90 µl PBS-Puffer 6.) Zugabe von 10 µl UEA-1 (Konzentration 1mg/1ml) zur Färbung der Zellen

7.) Inkubation im Dunkeln 60 min

8.) Waschen im Magneten und Resuspension in 1 ml PBAZ-Puffer

9.) Waschen im Magneten und anschließende Resuspension in 200 µl PBAZ-Puffer Im Anschluss an die Isolierung und Färbung der Endothelzellen mit UEA I, wurde eine Nageotte-Kammer mit 100 µl der Suspension bestückt. Die Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt. Eine Zelle in der Kammer entsprach dabei vier zirkulierenden Endothelzellen (circulating endothelial cells, CEC) pro Milliliter Blut.

Die kleinste detektierbare Konzentration der CEC war demnach 4 Zellen/ml Blut.