2.3.1 Isolierung von Endothelzellen
2.3.1.1 Prinzip der immunmagnetischen Isolierung von zirkulierenden Endo-thelzellen aus dem peripheren Blut
Zirkulierende Endothelzellen sind im Blut nur in sehr geringer Konzentration zu fin-den. Um diese Zellen gezielt zu isolieren und quantitativ erfassen zu können, wurde in dieser Studie die Methode der immunmagnetischen Isolierung angewandt.
Paramagnetische Partikel (Dynabeads), die mit Antikörpern gegen das Zielantigen CD 146 auf der Oberfläche von Endothelzellen beschichtet sind, werden mit dem Zellgemisch inkubiert und binden über die Antikörper an die zu isolierenden Zellen.
Lässt man auf das Gefäß mit den so gebundenen Zellen ein Magnetfeld einwirken, werden die Komplexe aus paramagnetischen Partikel und den von ihnen gebunde-nen Zellen an der Gefäßwand festgehalten. Der Überstand kann dekantiert und die an die Partikel gebundenen Zellen in einem Puffer resuspendiert werden (vgl. Abbil-dung 2.2).
Abb. 2.2: Immunmagnetische Isolierung mittels Dynabeads
Patienten, Material und Methoden
2.3.1.2 Entwicklung der Methode
Die endotheliale Herkunft der aus dem Blut isolierten Zellen konnte durch immunzy-tochemische Färbung für die Antigene von Willebrand-Faktor und CD 31 (PECAM) nachgewiesen werden [80].
Eine unspezifische Bindung der Dynabeads an andere Blutzellen wie etwa Leukozy-ten wurde ausgeschlossen. Darüber hinaus zeigte sich bei der Verwendung von CEC aus einer Kultur menschlicher Nabelschnurvenen (HUVEC) kein Einfluss des Isolie-rungsvorgangs auf den Phänotyp der isolierten Zellen.
2.3.1.3 Blutentnahme
Um einen Einfluss der Blutentnahme auf die Zahl der CEC auszuschließen, wurden in unserem Abnahmeprotokoll die ersten 7,5 ml Blut nach der Punktion bzw. beim Abziehen aus einem Katheter verworfen, da sich darin, wie frühere Untersuchungen zeigten, alle durch die Manipulation zusätzlich von der Gefäßwand gelösten Endo-thelzellen befinden sollten [59]. Die zweiten 7,5 ml Blut wurden in einem EDTA-Röhrchen abgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei einer Temperatur von 4°C im Kühlschrank gelagert.
Die Blutentnahme wurde bei jedem der 39 Patienten jeweils fünfmal im Verlauf der allogenen HSCT zu festgesetzten Zeitpunkten durchgeführt (vgl. Abbildung 2.3): un-mittelbar vor Beginn der Konditionierung (Messzeitpunkt 1, zur Vereinfachung im Weiteren als Tag –7 bezeichnet), nach Beendigung der Konditionierung am Tag vor der Transplantation (Tag –1, Messzeitpunkt 2) und dreimal nach der Transplantation im Abstand von jeweils einer Woche an den Tagen +7, +14 und +21 (Messzeitpunkte 3,4 und 5).
GvHD-Prophylaxe
-7 -1 0 7 14 21
Transplantation Transplantation
Konditionie-rung
GvHD-Prophylaxe
-7 -1 0 7 14 21
Transplantation Transplantation
Konditionie-rung
Abb. 2.3: Protokoll für die Entnahme der Blutproben
2.3.1.4 Präparation der immunmagnetischen Partikel (beads)
Da es sich bei der immunmagnetischen Isolation von Endothelzellen um eine expe-rimentelle Methode handelt, für die noch keine primär beschichteten Dynabeads zur Verfügung stehen, mussten vor dem Einsatz Dynabeads nach folgendem Protokoll mit dem Primärantikörper für das Zielantigen auf den zu isolierenden Zellen be-schichtet werden, in unserem Falle mit Antikörpern gegen CD 146 (S-Endo 1).
Die fertigen Dynabeads konnten nach der Beschichtung ca. zwei Monate im Kühl-schrank bei 4°C aufbewahrt werden. Bei Überschreitung einer Lagerungszeit von zwei Monaten, wurde vor Verwendung der beads die Pufferlösung mit Hilfe des Magneten gewechselt („Waschen“), um überschüssige Antikörper, die sich im Laufe der Zeit gelöst hatten, zu entfernen.
Protokoll:
1.) Vorlegen von 350 µl Dynabeads in einem 5 ml-Röhrchen
2.) Waschen im Magneten und Resuspension in 1 ml PBS-BSA-A 2 min 3.) Waschen im Magneten und Resuspension in 350 µl PBS-BSA-A 2 min 4.) Zugabe von 1 ml vorverdünntem S-Endo 1 (25 µg/ml Endkonzentration)
5.) Inkubation im Probenschüttler 2 h
Patienten, Material und Methoden
6.) dreimal Waschen im Magneten mit Resuspension in 1 ml PBS-BSA-A 7.) Lagerung bei 4°C im Kühlschrank
2.3.1.5 Grundprotokoll für die immunmagnetische Isolierung, die Färbung und die quantitative Erfassung zirkulierender Endothelzellen aus dem peripheren Blut
Alle Schritte des nachfolgenden Protokolls wurden auf Eis durchgeführt, um die un-spezifische Bindung von Monozyten und Granulozyten so gering wie möglich zu hal-ten [59]. Dem gleichen Zweck diente die Zugabe von Octagam in Schritt 1 (vgl.
2.3.1.6).
1.) Vorlegen von 1 ml EDTA-Patientenblut, 1 ml PBAZ-Puffer und 20 µl Octagam-Lösung in einem 5 ml-Röhrchen
2.) Zugabe von 50 µl S-Endo 1-beschichteten Dynabeads
3.) Inkubation im Probenschüttler bei einer Raumtemperatur von 4°C 30 min 4.) viermal Waschen im Magneten:
Röhrchen in den Magneten stecken 2 min
Überstand absaugen
Resuspension in 1 ml PBAZ
5.) Zusätzlicher Waschschritt mit anschließender Resuspension in 90 µl PBS-Puffer 6.) Zugabe von 10 µl UEA-1 (Konzentration 1mg/1ml) zur Färbung der Zellen
7.) Inkubation im Dunkeln 60 min
8.) Waschen im Magneten und Resuspension in 1 ml PBAZ-Puffer
9.) Waschen im Magneten und anschließende Resuspension in 200 µl PBAZ-Puffer Im Anschluss an die Isolierung und Färbung der Endothelzellen mit UEA I, wurde eine Nageotte-Kammer mit 100 µl der Suspension bestückt. Die Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt. Eine Zelle in der Kammer entsprach dabei vier zirkulierenden Endothelzellen (circulating endothelial cells, CEC) pro Milliliter Blut.
Die kleinste detektierbare Konzentration der CEC war demnach 4 Zellen/ml Blut.
2.3.1.6 Mögliche Fehlerquellen bei der immunmagnetischen Isolierung zirkulie-render Endothelzellen
Bei der immunmagnetischen Isolierung zirkulierender Endothelzellen liegen mögliche Fehlerquellen in der Wiederablösung bereits gebundener Endothelzellen von den Dynabeads oder in der unspezifischen Bindung von in weitaus größerem Umfang im Blut vorhandenen Zellen wie Leukozyten oder Erythrozyten an die beads, die zuvor mit für Endothelzellen spezifischen Antikörper beschichtet wurden [81]. Vor allem Zellen wie etwa Monozyten oder Granulozyten, die auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für das Fc-Fragment von Immunglobulinen exprimieren, können unspezifische Bin-dungen mit den auf der bead-Oberfläche verankerten Antikörpern eingehen. Durch die Bindung an die magnetischen beads werden dann diese Zellen zusammen mit den eigentlichen Zielzellen, den CEC, isoliert. Um die unspezifische Bindung zwi-schen Fc-Rezeptor und Fc-Fragment der bead-Antikörper zu verhindern und so die gezielte Isolierung von CEC zu gewährleisten, wurde daher dem Ansatz Octagam, ein Gemisch humaner Immunglobuline, zugegeben, das mit den Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche von Granulozyten und Monozyten reagiert und diese somit für weitere Bindungen blockiert.
2.3.2 Statistik
Zur statistischen Auswertung der erhobenen Daten sowie zur Erstellung der Graphi-ken wurde das Programmsystem SPSS für Windows (Version 12.0) verwendet.
Um signifikante Unterschiede zwischen Variablen mehrerer verbundener Stichproben z.B. zwischen den einzelnen Endothelzellkonzentrationen zu verschiedenen Zeit-punkten innerhalb eines bestimmten Patientenkollektivs aufzuzeigen, wurde der Friedman-Test angewendet. Paarvergleiche zwischen diesen Variablen wurden mit dem gepaarten Rangtest nach Wilcoxon durchgeführt. Für die Suche nach signifikan-ten Unterschieden zwischen Variablen mehrerer nicht-verbundener Stichproben z.B.
zwischen dem Ausmaß des Anstiegs der zirkulierenden Endothelzellen in verschie-denen Patientenkollektiven wurde der Kruskal-Wallis-Test herangezogen. Zeigte die-ser signifikante Unterschiede auf, wurden die paarweisen Vergleiche der Variablen mittels des ungepaarten zweiseitigen Rangtests nach Mann-Whitney durchgeführt.
Die Boxplots geben jeweils den Median, das obere und untere Quartil sowie die Streuung der Werte um die Quartile an. Ausreißer werden einzeln als Punkte darge-stellt.
Ergebnisse