Multiparametrische funktionelle Magnetresonanztomografie zur nicht-invasiven Beurteilung von pathologischen Veränderungen der Transplantatniere in Mausmodellen

Aus dem Institut für Diagnostische und Interventionelle Radiologie der Medizinischen Hochschule Hannover

Multiparametrische funktionelle Magnetresonanztomografie zur nicht-invasiven Beurteilung von pathologischen Veränderungen

der Transplantatniere in Mausmodellen

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Johanna Amelie Barrmeyer

aus Braunschweig

Hannover 2017

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 01.11.2018

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum

Betreuerin der Arbeit: PD Dr. med. Katja Hüper

1. Referent: Prof. Dr. med. Gunilla Einecke, PhD 2. Referent: Prof.’in Dr. med. Dr. rer. nat. Xiaoqi Ding Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2018

Prüfungsausschuss:

Vorsitz: Prof. Dr. med. Heinrich Lanfermann

1. Prüfer: Prof. Dr. med. Klaus Friedrich Gratz

2. Prüfer: Prof. Dr. med. Michael Gebel

Inhaltsverzeichnis 1

Inhaltsverzeichnis

Tabellenverzeichnis ... 4

Abbildungsverzeichnis ... 5

Abkürzungsverzeichnis ... 6

1 Einleitung ... 8

1.1 Klinischer Hintergrund: Nierentransplantation ... 8

1.2 Komplikationen nach Nierentransplantation ... 9

1.2.1 Der Ischämie-/Reperfusionsschaden und die DGF ... 9

1.2.2 Die akute Transplantatabstoßung ... 11

1.3 Kleintiermodelle zur Untersuchung akuter Schädigungen der Transplantatniere ... 13

1.3.1 Mausmodell der akuten Nierentransplantatabstoßung und des IR-Schadens ... 14

1.4 Diagnostische Methoden zur Beurteilung von pathologischen Veränderungen der Transplantatniere ... 15

1.4.1 Laborchemische Diagnostik ... 15

1.4.2 Sonografische Diagnostik ... 15

1.4.3 Histologische Diagnostik ... 16

1.5 Multiparametrische funktionelle Magnetresonanztomografie zur Diagnostik von pathologischen Veränderungen der Transplantatniere ... 17

1.5.1 Arterial Spin Labeling zur Bestimmung der renalen Perfusion ... 19

1.5.2 Longitudinale (T1-) und transversale (T2-) Relaxationszeit zur Bestimmung des Gewebeödems ... 20

1.5.3 Diffusionsbildgebung zur Bestimmung inflammatorischer Zellinfiltration und interstitieller Fibrose ... 22

1.6 Zielsetzung ... 23

2 Material und Methoden ... 24

2.1 Liste der Materialien ... 24

2.1.1 Primärantikörper ... 24

2.1.2 Sekundärantikörper ... 24

2.1.3 FACS-Antikörper ... 24

2.1.4 Geräte ... 25

2.1.5 Programme und Softwareprodukte ... 25

2.2 Versuchstiere und Haltung ... 26

2.3 Versuchsplan ... 28

2.4 Modell der akuten Nierentransplantatabstoßung ... 30

2.5 Multiparametrische funktionelle MRT zur Untersuchung akuter Schädigungen der Transplantatniere im Mausmodell ... 31

2.5.1 Multiparametrisches MRT-Protokoll ... 31

Inhaltsverzeichnis 2

2.5.2 Arterial Spin Labeling zur Bestimmung der renalen Perfusion ... 33

2.5.3 Transversale (T2-) Relaxationszeit zur Bestimmung von Inflammation und Gewebeödem ... 34

2.5.4 Longitudinale (T1-) Relaxationszeit zur Bestimmung von Gewebeödem und Mikrostruktur ... 35

2.5.5 Diffusionsbildgebung zur Bestimmung der inflammatorischen Zellinfiltration und interstitiellen Fibrose ... 35

2.5.6 Berechnung der funktionellen Parameter und Auswertung der MRT- Untersuchungen ... 36

2.6 Ex vivo-Analysen ... 38

2.6.1 Organentnahme und Fixierung ... 38

2.6.2 Histologische Untersuchungen ... 38

2.6.3 Immunhistologische Untersuchungen ... 38

2.6.4 FACS-Analyse ... 39

2.7 Statistische Analyse ... 41

3 Ergebnisse... 42

3.1 Erster Versuchsteil: Querschnittsanalyse mit direktem Vergleich zwischen den funktionellen MRT-Parametern und den ex vivo-Analysen ... 42

3.1.1 Ex vivo-Analysen ... 42

3.1.1.1Charakterisierung der Transplantatniere mittels (Immun-)Histologie .... 42

3.1.1.2Charakterisierung der zellulären Infiltrate der Transplantatniere mittels FACS-Analyse ... 44

3.1.2 Charakterisierung der akuten Schädigung der Transplantatniere mittels multiparametrischer funktioneller MRT ... 45

3.1.2.1Arterial Spin Labeling zur Bestimmung der renalen Perfusion ... 45

3.1.2.2T2-Relaxationszeit zur Bestimmung von Inflammation und Gewebeödem ... 46

3.1.2.3T1-Relaxationszeit zur Bestimmung von Mikrostruktur und Gewebeödem ... 47

3.1.2.4Diffusionsbildgebung zur Bestimmung inflammatorischer Zellinfiltration und interstitieller Fibrose ... 48

3.1.3 Multiparametrische funktionelle MRT zur Charakterisierung akuter Schädigungen der Transplantatniere ... 49

3.1.4 Korrelation der funktionellen MRT-Parameter mit den ex vivo-Analysen ... 51

3.2 Zweiter Versuchsteil: Serielle MRT-Untersuchungen zur Charakterisierung der Veränderungen im Modell der akuten Schädigung der Transplantatniere ... 52

3.2.1 Ex vivo-Analysen ... 52

3.2.1.1Charakterisierung der Transplantatniere mittels (Immun-)Histologie .... 52

3.2.1.2FACS-Analyse zur Charakterisierung der Leukozyten-Populationen in den Nierentransplantaten ... 55

3.2.2 Serielle MRT-Messungen zur Charakterisierung akuter Schädigungen der Transplantatniere ... 55

3.2.2.1Arterial Spin Labeling zur Bestimmung der renalen Perfusion ... 55

Inhaltsverzeichnis 3 3.2.2.2Transversale (T2-) Relaxationszeit zur Bestimmung von Inflammation

und Gewebeödem ... 57

3.2.2.3Longitudinale (T1-) Relaxationszeit zur Bestimmung von Fibrosegrad und Gewebeödem ... 59

3.2.2.4Diffusionsbildgebung zur Bestimmung von inflammatorischer Zellinfiltration und interstitieller Fibrose ... 61

3.2.3 Serielle Messung mittels multiparametrischer funktioneller MRT zur Charakterisierung der akuten Schädigungen der Transplantatniere ... 63

4 Diskussion ... 65

4.1 Modell der akuten Nierentransplantatabstoßung ... 66

4.2 Arterial Spin Labeling als Marker für eine renale Perfusionseinschränkung ... 67

4.3 Longitudinale (T1-) Relaxationszeit und transversale (T2-) Relaxationszeit als Marker für Inflammation und Gewebeödem ... 69

4.4 ADC-Diffusionsbildgebung als Marker für Inflammation und Nierentransplantatfibrose ... 71

4.5 Multiparametrische funktionelle MRT zur Untersuchung akuter Schädigungen der Transplantatniere im Mausmodell ... 72

4.6 Klinischer Einsatz der multiparametrischen funktionellen MRT zur Diagnostik von Nierenerkrankungen ... 74

5 Zusammenfassung ... 75

6 Literaturverzeichnis ... 77

Lebenslauf ... 87

Danksagung ... 88

Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 ... 89

Publikationen ... 90

Tabellenverzeichnis 4

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Übersichtstabelle der funktionellen MRT-Techniken und entsprechenden

Biomarker ... 19

Tabelle 2.1: Primärantikörper ... 24

Tabelle 2.2: Sekundärantikörper ... 24

Tabelle 2.3: FACS-Antikörper ... 24

Tabelle 2.4: Verwendete Geräte... 25

Tabelle 2.5: Verwendete Programme und Softwareprodukte ... 25

Tabelle 2.6: Klinische Beurteilung der Versuchstiere ... 27

Tabelle 2.7: Erster Versuchsteil – Querschnittsanalyse mit direktem Vergleich zwischen den funktionellen MRT-Parametern und den ex vivo-Analysen ... 29

Tabelle 2.8: Zweiter Versuchsteil – Serielle MRT-Untersuchungen zur Charakterisierung der Veränderungen im Modell der akuten Schädigung der Transplantatniere... 29

Tabelle 2.9: MRT-Protokoll und Scanparameter am 7 T Bruker Pharmascan ... 32

Tabelle 2.10: Ex vivo-Analysen... 40

Tabelle 3.1: Charakterisierung der Transplantatniere mittels Immunhistologie... 42

Tabelle 3.2: Charakterisierung der zellulären Infiltrate der Transplantatniere mittels FACS-Analyse ... 44

Tabelle 3.3: Multiparametrische funktionelle MRT zur Charakterisierung akuter Schädigungen der Transplantatniere ... 49

Tabelle 3.4: Korrelation der funktionellen MRT-Parameter mit den ex vivo-Analysen .. 51

Tabelle 3.5: Multiparametrische funktionelle MRT zur seriellen Charakterisierung akuter Schädigungen der Transplantatniere ... 63

Abbildungsverzeichnis 5

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2.1: Versuchsablauf zur Untersuchung akuter Schädigungen der

Transplantatniere ... 28

Abbildung 2.2: Modell der Nierentransplantation ... 30

Abbildung 2.3: Schematische Darstellung der Perfusionsmessung mittels ASL ... 33

Abbildung 2.4: Bestimmung der T2-Relaxationszeit des Nierengewebes ... 34

Abbildung 2.5: Anatomie der gesunden Niere und exemplarische Platzierung der ROIs in einer T1-Parameterkarte ... 37

Abbildung 3.1: Charakterisierung der Transplantatniere mittels (Immun-)Histologie ... 43

Abbildung 3.2: Charakterisierung der zellulären Infiltrate der Transplantatniere mittels FACS-Analyse ... 44

Abbildung 3.3: Renale Perfusion an Tag 21 nach allogener und isogener NTx ... 45

Abbildung 3.4: T2-Mapping an Tag 21 nach allogener und isogener NTx ... 46

Abbildung 3.5: T1-Mapping an Tag 21 nach allogener und isogener NTx ... 47

Abbildung 3.6: Diffusionsbildgebung an Tag 21 nach allogener und isogener NTx ... 48

Abbildung 3.7: Multiparametrische funktionelle MRT zur Charakterisierung akuter Schädigungen der Transplantatniere ... 50

Abbildung 3.8: Charakterisierung der Nierentransplantate mittels PAS-/ Lektin-Färbung ... 53

Abbildung 3.9: Charakterisierung der Transplantatniere mittels Immunhistologie ... 54

Abbildung 3.10: Charakterisierung der zellulären Infiltrate der Transplantatniere mittels FACS-Analyse ... 55

Abbildung 3.11: Serielle Charakterisierung akuter Schädigungen nach NTx mittels Arterial Spin Labeling ... 56

Abbildung 3.12: Serielle Charakterisierung akuter Schädigungen nach NTx mittels T2- Mapping ... 58

Abbildung 3.13: Serielle Charakterisierung akuter Schädigungen nach NTx mittels T1- Mapping ... 60

Abbildung 3.14: Serielle Charakterisierung akuter Schädigungen nach NTx mittels Diffusionsbildgebung ... 62

Abbildung 3.15: Serielle Charakterisierung akuter Schädigungen der Transplantatniere mittels multiparametrischer funktioneller MRT ... 64

Abkürzungsverzeichnis 6

Abkürzungsverzeichnis

ABMR Antibody-Mediated Rejection, antikörpervermittelte Abstoßung ADC Apparent Diffusion Coefficient, apparenter Diffusionskoeffizient ANOVA Analysis of Variance, Varianzanalyse

APC Antigen Presenting Cells, antigenpräsentierende Zellen ASL Arterial Spin Labeling, Bestimmung der renalen Perfusion ATP Adenosintriphosphate

B6 C57BL/6J^Han-ztm (H2^b), Versuchstiere BALB/c BALB/c J^Han-ztm (H2^d), Versuchstiere

BD Beckton Dickinson

C Kortex

CD Cluster of Differentiation

DGF Delayed Graft Function, verzögerte Funktionsaufnahme der Transplantatniere

DWI Diffusion Weighted Imaging, Diffusionsbildgebung ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EPI Echo Planar Imaging

FACS Flurescence Activated Cell Sorting

FAIR Flow-sensitive Alternating Inversion Recovery, Technik des Arterial Spin Labeling

FOV Field of View

GFR Glomeruläre Filtrationsrate

HLA Human Leukocyte Antigen

IFTA Interstitielle Fibrose und Tubulusatrophie IR Ischämie- /Reperfusion

ISOM Inner stripe of the outer medulla, innerer Streifen des äußeren Nierenmarks

MHC Major Histocompatibility Complex mRNA Messenger Ribonukleinsäure MRT Magnetresonanztomografie

MW Mittelwert

NTx Nierentransplantation

OM Outer Medulla, äußeres Mark

Abkürzungsverzeichnis 7 OSOM Outer Stripe Of The Outer Medulla, äußerer Streifen des äußeren

Nierenmarks

PAS Periodic Acid-Schiff Reaction, histologische Färbung

PAH Para-Aminohippursäure

PASL Pulsed Arterial Spin Labeling PBS Phosphate Buffered Saline

PFA Paraformaldehyd

pH Potentia hydrogenii

RI Resistance-Index, Widerstandsindex ROI Region Of Interest

SEM Standard Error of the Mean, Standardfehler

T Tesla, Magnetfeldstärke

TCMR T Cell-Mediated Rejection, T-Zell-vermittelte Abstoßung

TCR T-Zell-Rezeptor

TE Echo Time, Echozeit

TI Inversion Time, Inversionszeit TR Repetition Time, Repetitionszeit

TSE Turbo-Spin-Echo

u.a. Unter anderem

vs. Versus

z.B. Zum Beispiel

Einleitung 8

1 Einleitung

1.1 Klinischer Hintergrund: Nierentransplantation

Die Nierentransplantation (NTx) ist als Nierenersatzverfahren die Therapie der Wahl bei der terminalen Niereninsuffizienz. Die NTx bietet für den Patienten die besseren Langzeitergebnisse hinsichtlich Lebenserwartung und Lebensqualität verglichen mit der Hämodialyse oder Peritonealdialyse, welche die Nierenfunktion partiell ersetzen können.^1,2 Auch in Bezug auf das Kosten-Nutzen-Verhältnis ist die NTx der Dialyse vorzuziehen.³ Durch die Verbesserung der immunsuppressiven Therapie konnte inzwischen das Nierentransplantat-Überleben deutlich verbessert werden.^4-6

Zu den häufigsten Diagnosen, die zu einer NTx führen, zählen die adulte polyzystische Nierenkrankheit, Glomerulonephritiden, die hypertensive Nephropathie und die diabetische Nephropathie. In den letzten Jahren ist die Anzahl der dialysepflichtigen Patienten, die auf ein Nierentransplantat warten, stetig gestiegen. Derzeit warten rund 8000 Dialysepatienten in Deutschland auf eine NTx. Die Diskrepanz zwischen der Anzahl der erfolgten Transplantationen und der Anzahl der Patienten, die auf ein Organ warten, ist sehr groß. Im Jahr 2016 wurden 2094 Nierentransplantationen durchgeführt, davon 1497 Nieren nach postmortaler Organspende und 597 nach Lebendspende. Die Wartezeit auf eine Spenderniere beträgt je nach Blutgruppe des Empfängers zwischen sechs und zwölf Jahre in Deutschland.⁷

Einleitung 9

1.2 Komplikationen nach Nierentransplantation

Zu den typischen Frühkomplikationen nach NTx gehört neben Blutungen, Gefäßthrombosen, Ureterstenosen, Lymphozelen und bakteriellen Infektionen auch die Transplantatabstoßung.⁸ In den letzten Jahren ist es gelungen, Komplikationen in der frühen Phase nach NTx durch immer effizientere immunsuppressive Therapiestrategien zu reduzieren. Mit der Einführung moderner, immunsuppressiver Behandlungsmöglichkeiten konnte der Anteil der akuten Abstoßungsreaktionen auf unter 20% gesenkt werden.⁹ Im Gegensatz dazu hat sich das Langzeitüberleben der Nierentransplantate kaum verbessert. Besonders die verzögerte Aufnahme der Transplantatfunktion (Delayed Graft Function, DGF) in der postoperativen Phase stellt noch immer eine Herausforderung dar. Diese ist auf lange Sicht mit einer Einschränkung der Nierenfunktion sowie einem reduzierten Transplantat- und Langzeitüberleben assoziiert. Ein wesentlicher Faktor für das Auftreten einer DGF ist der Ischämie-/ Reperfusionsschaden (IR-Schaden).¹⁰ Es gibt zahlreiche Faktoren, die für eine Beeinträchtigung des langfristigen Überlebens des Spenderorgans und für einen Verlust der Transplantatfunktion verantwortlich sind. Eine wichtige Rolle spielen immunologische Reaktionen, wie die akute und chronische Transplantatabstoßung, und nicht immunologische Faktoren wie der bereits erwähnte IR-Schaden, Nephrotoxizität u.a. von Calcineurin- Inhibitoren, Rezidive der nephrologischen Grunderkrankung, Infektionen und Transplantatabstoßungen.^11,12 Die 10-Jahres-Transplantat-Überlebensrate liegt bei 57%.

Mechanismen, die für diese niedrige Rate eine Rolle spielen, sind vielfach auf chronisch humorale Mechanismen zurückzuführen.12,13,14,15 Die Ausbildung von donorspezifischen Antikörpern scheint im Langzeitverlauf ein wesentlicher Faktor für den chronischen Funktionsverlust im Rahmen einer antikörpervermittelten Rejektion zu sein.^16,17,18

1.2.1 Der Ischämie-/Reperfusionsschaden und die DGF

Der IR-Schaden ist eine der Hauptursachen für ein akutes Nierenversagen nach großen operativen Eingriffen sowie nach Transplantation. Er spielt eine wesentliche Rolle in der Entwicklung einer DGF und hat relevante Konsequenzen, da vor allem im Rahmen von Organtransplantationen die Funktion sowie das Kurz- und Langzeitüberleben des Transplantats beeinflusst wird.¹⁹ Im Rahmen der Transplantation tritt das akute Nierenversagen aufgrund der vorübergehenden Sauerstoffunterversorgung als IR-Schaden auf. Nach Organentnahme aus dem Spender kommt es zunächst zu einer Ischämiephase und folglich zu einer Unterbindung des Blutflusses. Dabei wird zwischen einer kalten Ischämie, also der Dauer der Konservierungszeit, und einer warmen Ischämie, in der die Blutzufuhr

Einleitung 10 unterbrochen ist und das Organ Körpertemperatur aufweist, unterschieden. Die Reperfusion schließt sich nach Anastomosierung der Gefäße und Wiederanlage des Blutflusses im Empfänger an. Auf zellulärer Ebene werden zwei Phasen unterschieden: der Schaden, der zunächst während der Ischämie auftritt, und der Schaden, der nach der Reperfusion entsteht.

Während der ischämischen Phase kommt es zu einer Hypoxie, die zu einem Adenosintriphosphat-Mangel (ATP-Mangel) mit Bildung reaktiver Sauerstoffradikale führt.

Durch vermehrte anaerobe Glykolyse mit resultierender Laktatanreicherung kommt es zur Senkung des intrazellulären pH-Wertes und zu lysosomaler Instabilität mit konsekutiver Schädigung der Zellen.^20,21 Der entstandene Gewebeschaden mit Zellschwellung, kapillärem Leakage, eingeschränkter Kapillarperfusion und erhöhter Blutviskosität führt in der Folge zu dem “no-reflow“-Phänomen. Dabei kommt es nach einsetzender Reperfusion zum Einwandern von Leukozyten, zur Ausbildung einer Inflammation und Aggravierung der lokalen Mikrozirkulationsstörungen mit Fortschreiten der Hypoxie und Verstärkung des IR- Schadens.^22,23 Die Interaktion zwischen Endothel und Leukozyten wird zudem durch eine erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen verstärkt. Ebenso erhöht sind proinflammatorische Zytokine und Interleukine (u.a. das Interferon γ), die als Entzündungsmediatoren und Immunmodulatoren dienen.

Das komplexe Zusammenspiel aus der Bildung freier Sauerstoffradikale, der Freisetzung proinflammatorischer Chemokine und Zytokine und der Aktivierung der Leukozytenadhäsion führt zu einem inflammatorischen Prozess, der das Transplantatgewebe schädigt und somit maßgeblichen Einfluss auf die Entstehung der DGF hat.²⁴ Charakteristische histologische Veränderungen umfassen das Bild der akuten Tubulusnekrose, Gefäßokklusionen, Ödembildung und Leukozyteninfiltration. Diese führen auf lange Sicht zur Fibrose sowie zum Funktionsverlust der Niere.²⁵

Die DGF tritt bei etwa 20-25% der postmortalen Nierenspenden in Europa und den USA auf.

Sie ist definiert als fehlendes Absinken des Serumkreatinin-Spiegels und die Notwendigkeit von mehr als einer Dialysebehandlung in den ersten sieben Tagen nach erfolgter Transplantation.^26,27 Das Auftreten einer DGF führt zu einem protrahierten postoperativen Verlauf für den jeweiligen Patienten und ist ebenso verbunden mit längeren Krankenhausliegezeiten sowie höheren Kosten.¹⁰ Die Ursachen der DGF sind multifaktoriell.²⁸ Bezogen auf das transplantierte Organ zählen zu den wesentlichen Risikofaktoren für eine DGF das Spenderalter und die somit vorbestehende Fibrose sowie die Dauer der kalten Ischämiezeit.^26,28

Einleitung 11 Das Auftreten der DGF korreliert mit der Dauer der kalten Ischämiezeit.^9,24,26,29 Eine DGF ist assoziiert mit einer erhöhten Inzidenz akuter Transplantatabstoßungen und geht mit einer schlechteren Langzeitprognose des Transplantats einher.^30,31 Immunologische Prozesse zeigen ebenfalls Auswirkungen in Bezug auf die Entstehung einer DGF. Besonders bei Zweittransplantationen ist bei höheren Human Leukocyte Antigen-Mismatchen (HLA- Mismatchen) mit vermehrtem Auftreten einer DGF und verkürzter Transplantat- Überlebenszeit zu rechnen. Bei AB0-Inkompatibilität zwischen Spender und Empfänger besteht ein etwas höheres immunologisches Risiko, auch die Häufigkeit von Infekten nimmt zu. Besonders zu erwähnen ist hier die Polyoma-Nephropathie, deren Auftreten mit einer höheren Immunsuppression zunimmt und zu einem deutlichen Verlust an Transplantatfunktion führen kann.^32,33

Das frühzeitige Erkennen zugrundeliegender Ursachen der DGF ist von großem Interesse, um eine Therapiestrategie planen und die Transplantatschädigung einschränken zu können.

1.2.2 Die akute Transplantatabstoßung

Die akute Abstoßung des Nierentransplantats ist aufgrund immunologischer Vordiagnostik und immunsuppressiver Therapie heutzutage besser beherrschbar.³⁴ Sie findet als Komplikation in 10-20% der Fälle in der frühen Periode nach Transplantation statt³⁵, kann jedoch zu jeder Zeit nach Transplantation auftreten.¹⁶ Das typische klinische Bild einer akuten Abstoßungsreaktion ist die Verschlechterung der Transplantatfunktion mit einem plötzlichen Anstieg des Serumkreatinins (> 20% des Ausgangswertes) sowie einer reduzierten Diurese.^36,37

Die Transplantatabstoßung tritt vor allem auf, wenn sich Spender und Empfänger in ihren Oberflächenmolekülen, den Haupthistokompatibilitätskomplexen (Major Histocompatibility Complex, MHC), unterscheiden. Eine Transplantation zwischen zwei Individuen einer Art nennt man eine allogene Transplantation, bei der die T-Lymphozyten des Empfängers die allogenen MHC-Moleküle des Spenderorgans als fremd erkennen. Daraus resultiert die Aktivierung des Immunsystems und im Falle der zellulären Abstoßung vor allem der T- Lymphozyten, die zur Transplantatdestruktion führen kann.³⁸ Bei genetischer Übereinstimmung zwischen Spender und Empfänger (nach isogener Transplantation) besteht keine Gewebeunverträglichkeit, sodass keine Transplantatabstoßung auftritt. Dies wäre bei der Transplantation zwischen eineiigen Zwillingen der Fall, bei der die Immunsuppression nach der Frühphase deutlich reduziert werden kann, weil das transplantierte Organ von den Empfänger-Leukozyten nicht als fremd erkannt wird. Sowohl T- als auch B-Lymphozyten

Einleitung 12 nehmen Einfluss auf die Immunreaktionen. T-Lymphozyten sind primär für die zellvermittelte Immunität verantwortlich, die eine entscheidende Rolle bei der akuten Transplantatabstoßung spielt. B-Lymphozyten lösen die humorale antikörpervermittelte Immunantwort aus, die sowohl an der akuten als auch der chronischen Transplantatabstoßung beteiligt ist. Des Weiteren tragen zur Antigen-spezifischen Immunantwort andere Zellen wie Makrophagen, neutrophile Granulozyten und natürliche Killerzellen über entzündliche Prozesse zur Transplantatabstoßung bei.³⁷

CD (Cluster of Differentiation, Oberflächenantigene) 4-positive T-Lymphozyten bestimmen die Spezifität der Immunantwort gegen ein allogenes Transplantat.³⁹ Diese binden direkt an MHC-Klasse-II-Moleküle auf der Zelloberfläche von Spenderleukozyten („passenger leukozytes“), von denen in erster Linie die antigenpräsentierenden Zellen (APC) von Bedeutung sind. Die CD8-positiven T-Lymphozyten wiederum binden an MHC-Klasse-I- Moleküle. Dadurch kommt es zur Aktivierung der T-Lymphozyten des Empfängers über den sogenannten „direkten Weg“.^40,41 Alternativ, auf indirektem Weg, können APC des Empfängers in das Transplantat einwandern und allogene Peptide über MHC-Moleküle des Spenders auf ihrer Oberfläche präsentieren.⁴² Über Zytokine, die die aktivierten T- Lymphozyten ausschütten, werden verschiedene Zellen wie z.B. zytotoxische T-Lymphozyten oder Makrophagen aktiviert. Dabei kommt es zu einer Gewebszerstörung mit massiver Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren und Einwanderung anderer immunkompetenter Zellen mit der Folge der zunehmenden Transplantatschädigung bzw.

Transplantatabstoßung.

Einleitung 13

1.3 Kleintiermodelle zur Untersuchung akuter Schädigungen der Transplantatniere Der Einsatz von translationalen Kleintiermodellen zur Untersuchung akuter Schädigungen der Transplantatniere ist von erheblicher Bedeutung. Die komplexen Mechanismen im Rahmen akuter Nierentransplantat-Schädigungen in Bezug auf akute Transplantatabstoßung und IR- Schaden können dadurch untersucht und geeignetere diagnostische Verfahren zur Differenzierung beider Mechanismen etabliert werden. Besonders genetisch modifizierte Mäuse (Knock-out-Mäuse, Deaktivierung mehrerer Gene) bieten ein wichtiges Tiermodell, um Aussagen über die Rolle bestimmter Gene bei Krankheiten und ihren Behandlungen sowie im Rahmen der Pathogenese der Transplantatschädigung machen zu können.⁴³ Eine große Anzahl und ein breites Spektrum an molekulargenetischen Tests und Techniken für die Analyse im Mausmodell stehen heutzutage zur Verfügung. Histologische und immunhistologische Untersuchungen des Nierengewebes, mRNA (messenger Ribonukleinsäure)-Analysen, ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)- und Westernblot-Techniken sowie operative Messungen der Inulin-/PAH (Para- Aminohippursäure)-Clearance zur Bestimmung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) und des renalen Blutflusses stellen gut etablierte Methoden dar. Diese werden zur Identifizierung von funktionellen und pathologischen Veränderungen der Niere eingesetzt. Die Tiere müssen für diese Untersuchungen getötet werden, sodass Veränderungen der Niere im zeitlichen Verlauf in demselben Tier nicht verfolgt werden können.

Durch die funktionelle Magnetresonanztomografie (MRT) ist es möglich, eine Verlaufsbeurteilung von Nierenveränderungen anhand nicht-invasiver, serieller Messungen in demselben Tier durchzuführen. Dennoch stellt die funktionelle MRT aufgrund der geringen Größe der Maus und der hohen Atemfrequenz eine besondere Herausforderung dar. Durch die Kombination verschiedener MRT-Parameter wird bei Tieren nach isogener und allogener Nierentransplantation eine multiparametrische funktionelle MRT durchgeführt, um die unterschiedlichen pathologischen Komponenten der akuten Transplantatschädigung an einem definierten Zeitpunkt und im zeitlichen Verlauf in demselben Tier zu untersuchen. Außerdem ermöglichen die Tiermodelle eine direkte Korrelation der MRT-Parameter mit der Nierentransplantat-Histologie. Die diagnostischen Möglichkeiten der funktionellen MRT- Techniken können evaluiert werden, was im klinischen Alltag aufgrund fehlender histologischer Untersuchungen am Gesamtorgan nicht möglich ist.

Einleitung 14

1.3.1 Mausmodell der akuten Nierentransplantatabstoßung und des IR-Schadens Eine akute T-Zell-vermittelte Transplantatabstoßung (TCMR, T cell-mediated rejection) kann im Mausmodell durch allogene Transplantation einer Spenderniere einer C57BI/6 (H^2b)-Maus auf eine Balb/c (H^2d)-Maus induziert werden.^43,44 Ein IR-Schaden im Transplantat ohne begleitende Abstoßung kann durch isogene Transplantation einer C57Bl/6-Niere auf eine C57Bl/6-Maus mit einer prolongierten, kalten Ischämiezeit von 60 Minuten und warmer Ischämie von 30 Minuten induziert werden.^17,43-45 Nach allogener NTx im Mausmodell kommt es innerhalb von 6 Tagen zu einer akuten Abstoßung mit ausgeprägten T-Zell- Infiltraten. Das Serumkreatinin steigt innerhalb der ersten Woche deutlich an, es kommt zum völligen Funktionsverlust des Nierentransplantats.^43,46 Tag 6 ist histologisch durch die Leukozyteninfiltration in das Nierengewebe charakterisiert. Neutrophile Granulozyten erscheinen in der Frühphase, wohingegen sich Monozyten, Makrophagen und T- Lymphozyten erst später präsentieren. Diese Zellinfiltrate können per Immunhistologie lokalisiert und mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)-Analyse quantifiziert werden⁴⁷. Im Rahmen der Transplantation mit einer prolongierten, kalten Ischämiezeit von 60 Minuten entsteht bereits innerhalb von 24 Stunden ein IR-Schaden mit Zeichen der akuten Tubulusnekrose. Im isogenen Modell ist dieser Schaden meist reversibel, im allogenen Modell triggert er die TCMR.^47,48

Die NTx im Mausmodell stellt eine chirurgische Herausforderung dar. Es kann zu Komplikationen wie Thrombosen, Embolien, Gefäßstenosen und Blutungen kommen.^49,50 Durch eine modifizierte Anastomosentechnik kann die Operationstechnik optimiert und die Komplikationsrate gesenkt werden, die Erfolgsrate liegt danach bei 95%.⁴⁵

Einleitung 15 1.4 Diagnostische Methoden zur Beurteilung von pathologischen Veränderungen der

Transplantatniere

1.4.1 Laborchemische Diagnostik

In der klinischen Routine werden pathologische Veränderungen der Transplantatniere anhand eines Anstiegs des Serumkreatinins detektiert. Dieser ist jedoch in der frühen Phase nach Transplantation wenig sensitiv, da die Empfänger vorher dialysepflichtig waren und hohe Kreatinin-Werte vor Transplantation aufweisen.⁵¹ Erst bei ungefähr 50% Verlust an Nierengewebe kommt es zu einem signifikanten Anstieg des Kreatinins. Im klinischen Alltag ist das Kreatinin jedoch weiterhin der wichtigste Parameter, um eine Funktionseinschränkung im Nierentransplantat zu erkennen. Ein Anstieg des Kreatinins deutet auf eine mangelnde Transplantatfunktion hin.⁵² Faktoren wie das Alter, das Geschlecht und die Muskelmasse haben jedoch Einfluss auf den Kreatininwert. Ein weiterer wichtiger Parameter zur Beurteilung der Nierenfunktion ist die GFR. In der Klinik wird sie anhand des Kreatinins oder Cystatin C berechnet und berücksichtigt das Geschlecht und die ethnische Herkunft.^53,54,55 Eine objektivierbarere Clearance lässt sich durch die Infusion von körperfremden Markersubstanzen wie Inulin erreichen. Die Clearance-Messung durch exogene Markersubstanzen ist jedoch sehr aufwendig und wird in der klinischen Routinediagnostik nicht eingesetzt, sondern ist klinischen Studien vorbehalten.⁵⁵ In der Kleintierdiagnostik kann die Messung der Inulin-Clearance Hinweise auf die Nierenfunktion geben. Das Messen der Proteinausscheidung im Urin ergänzt die Diagnostik im Hinblick auf pathologische Veränderungen der Nierentransplantatfunktion.⁵⁶ Eine Zunahme der Proteinurie kann hinweisend für das Auftreten von Nierenerkrankungen sein, die mit einem Verlust des renalen Filters einhergehen. Dies spielt besonders bei Rezidiven von proteinurischen Nierenerkrankungen und auch bei der chronischen Transplantatabstoßung eine Rolle.^56,57 1.4.2 Sonografische Diagnostik

Der Ultraschall mit Untersuchung der Transplantat-Größe, dem Parenchym-Pyelon-Verhältnis und der Resistance-Index-Messung (RI) als nicht-invasive Methode kommt ebenso zur Untersuchung der Transplantatniere zur Anwendung. Obwohl die RI-Messung vielversprechende Informationen zu Krankheitsverläufen von Nierenerkrankungen liefert^58-60, ist sie ein unspezifischer Parameter. Die RI-Messung kann ebenfalls durch extrarenale Faktoren beeinflusst werden und ist stark untersucherabhängig. Einige Studien belegen, dass Nierentransplantate mit einem hohen renalen RI-Wert > 0,80 ein deutlich schlechteres Outcome als Transplantate mit normalen RI-Werten ~ 0,7 aufweisen.⁵⁹ Eine andere Studie

Einleitung 16 hingegen zeigte, dass ein erhöhter RI bei allogenen Transplantaten, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Transplantation biopsiert wurden, keinen Zusammenhang mit der entsprechenden Histologie sowie der Notwendigkeit einer Dialyse besitzt. Vielmehr korreliere der RI eher mit hämodynamischen Prozessen des Empfängers als mit der Histopathologie.⁶¹ Die RI-Messung ist stark untersucherabhängig. Auch Faktoren wie Tachykardie, Tachypnoe, Arteriosklerose beim Empfänger und arteriovenöse Fistelbildung beeinflussen den RI erheblich.⁶²

1.4.3 Histologische Diagnostik

Die Nierenbiopsie bietet die Möglichkeit der histologischen Untersuchung von Nierengewebe und ist Goldstandard in der Erkennung von akuten oder chronischen Nierentransplantatschäden.

Die Morphologie einer Transplantatabstoßung in der Histologie ist vielfältig. Die Einführung der Banff-Klassifikation für die Beurteilung histopathologischer Veränderungen im Rahmen von Nierentransplantat-Biopsien ist Standard in der klinischen Diagnostik und stellt eine Graduierung der Arten von Transplantat-Abstoßungen dar. Es werden folgende Kategorien der Transplantathistologie unterteilt⁶³:

▪ Normales Biopsat (keine histopathologischen Veränderungen)

▪ Antikörpervermittelte Abstoßung (ABMR)

▪ Borderline Veränderungen

▪ T-Zell-vermittelte Abstoßung (TCMR)

▪ Interstitielle Fibrose und Tubulusatrophie (IFTA)

▪ Andere pathologische Veränderungen, die nicht durch eine akute oder chronische Abstoßung hervorgerufen werden

Als objektivierbare diagnostische Kriterien wird über eine semiquantitative Auswertung der Grad an Tubulitis, intimaler Arteriitis, Glomerulitis, Kapillaritis und interstitieller Inflammation in der Banff-Klassifikation bewertet. Eine Zuordnung der verschiedenen Abstoßungstypen ist damit möglich.⁶³ Eine Limitation der Nierenbiopsie ist die Invasivität.

Eine Nierenbiopsie ist für den Patienten belastend und kann mit Komplikationen wie Blutungen, arterio-venöser Fistelbildung und Infektionen einhergehen. Schwere Blutungskomplikationen treten in ungefähr 1% der Fälle auf.^64,65 Eine weitere Limitation ist der „sampling error“. Da bei einer Nierenbiopsie nur eine kleine Gewebeprobe zu einem bestimmten Zeitpunkt analysiert werden kann, ist die Möglichkeit einer Über- oder Unterschätzung der pathologischen Veränderungen gegeben.⁶⁶

Einleitung 17 1.5 Multiparametrische funktionelle Magnetresonanztomografie zur Diagnostik von

pathologischen Veränderungen der Transplantatniere

Mit der MRT, auch Kernspintomografie genannt, können Schnittbilder vom Inneren des menschlichen Körpers in beliebiger Orientierung sowie mit hohem Weichteilkontrast angefertigt werden. Genügen die natürlichen Kontrastmechanismen nicht, so gibt es die Möglichkeit, gadoliniumhaltiges Kontrastmittel einzusetzen. Der Einsatz gadoliniumhaltiger Kontrastmittel hat jedoch Limitationen bei dialysepflichtigen Patienten und Patienten mit sehr stark eingeschränkter Nierenfunktion aufgrund des sehr geringen Risikos der Entwicklung einer nephrogenen systemischen Fibrose.⁶⁷ Außerdem sollten bei repetitiven Untersuchungen in großer Anzahl, wenn möglich, alternative kontrastmittelfreie Untersuchungstechniken vorgezogen werden, um Gadoliniumablagerungen im Gewebe, die bei einzelnen Kontrastmitteln und häufiger Kontrastmittelapplikation beobachtet wurden,⁶⁸ zu minimieren.

Im Gegensatz zur Computertomografie wird bei der MRT keine ionisierende Strahlung verwendet.⁶⁹ Dies ist insbesondere im Hinblick auf die Wiederholbarkeit der Untersuchungen von großem Vorteil.

Seit der Einführung der MRT in die klinische Medizin steht eine möglichst exakte Darstellung von morphologischen und strukturellen Gewebsprozessen im Vordergrund. In den letzten Jahren ist das Interesse an funktionellen MRT-Techniken, die eine nicht-invasive Charakterisierung und Quantifizierung von Gewebeeigenschaften, Perfusionsveränderungen und inflammatorischen sowie fibrosierenden Prozessen ermöglichen, gestiegen.⁷⁰ Eingesetzt wurde die funktionelle MRT zunächst in der Neuroradiologie, da hier die Bildgebung nicht durch Atembewegung oder Herzaktion erschwert wird. Heutzutage werden die funktionellen MRT-Techniken ebenso in anderen Körperregionen, wie dem Abdomen und dem Thorax, etabliert.⁷¹ Um Fortschritte in der räumlichen und zeitlichen Auflösung von MRT-Aufnahmen zu erzielen, finden im Forschungsbereich Geräte mit einer Magnetfeldstärke von 7 Tesla (T) oder höher zunehmend Verbreitung. Der Vorteil liegt in einem erhöhten Signal-zu-Rausch- Verhältnis im MRT, das folglich zu einer besseren Darstellung von morphologischen, strukturellen und funktionellen Gewebsprozessen führt. Zudem ermöglicht die Bildgebung mit hoher Magnetfeldstärke neue Kontraste, die zur Visualisierung von zuvor nicht sichtbaren Strukturen beiträgt. Im Bereich der neuroradiologischen Diagnostik werden Geräte mit einer Magnetfeldstärke von 7 T bereits klinisch angewendet.⁷²

Einleitung 18 Bei den in der klinischen Routine verwendeten MRT-Techniken handelt es sich um morphologische Techniken, die anhand von Signalunterschieden Gewebe, Entzündungsherde oder Tumore differenzieren. Dabei wird keine absolute Quantifizierung von Gewebeeigenschaften vorgenommen, sondern es werden relative Signalunterschiede anhand von Grauwerten dargestellt. Durch die funktionelle MRT lassen sich verschiedene MRT- Parameter bestimmen, die Aussagen über Nierenperfusion, Gewebeödem bei akuter Nierenschädigung, Gewebehypoxie, Zellinfiltration und Fibrose ermöglichen. Ein Vorteil ist die Ermöglichung einer absoluten Quantifizierung. Die quantitativen MRT-Parameter zwischen Individuen und Zeitpunkten können dabei genau verglichen und somit als Bildgebungsmarker für einen Krankheitszustand genutzt werden. Bei quantitativen MRT- Techniken, die bislang noch überwiegend in der Forschung eingesetzt werden, wird für jedes Volumenelement im Gewebe (Voxel) ein quantitativer Wert anhand einer mathematischen Gleichung aus den in der MRT-Sequenz definierten Scanparametern und dem gemessenen MRT-Signal errechnet. Die ermittelten Werte werden dann in einer Parameterkarte (Map) als Bild dargestellt, wobei jedem Grau- oder Farbwert ein absoluter quantitativer Wert, z.B. die Perfusion, zugeordnet ist. Alle in dieser Arbeit etablierten und genutzten funktionellen MRT- Techniken liefern gut reproduzierbare quantitative Parameter. Die quantitativen Messungen werden auf unterschiedliche Arten vorgenommen. Diese Methode erscheint sehr aussichtsreich, was bereits in ersten klinischen Untersuchungen demonstriert wurde.^73-78 Zu den funktionellen MRT-Techniken gehören unter anderem die Perfusionsmessung mittels Arterial Spin Labeling (ASL), das T1- und T2-Mapping (T1- und T2-Relaxationszeit) und die Diffusionsmessung, die über den Apparent Diffusion Coefficient (ADC) quantifiziert wird (Tabelle 1.1). Diese Techniken wurden in der vorliegenden Arbeit im Mausmodell der akuten Transplantatabstoßung durch den direkten Vergleich mit histologischen, immunhistologischen und molekularen Untersuchungen validiert.

Einleitung 19 Tabelle 1.1: Übersichtstabelle der funktionellen MRT-Techniken und entsprechenden Biomarker

MRT-Technik Biomarker

ASL Arterial Spin Labeling Renale Perfusion

T2 T2-Mapping Gewebeödem, Inflammation

T1 T1-Mapping Gewebeödem, Mikrostruktur

DWI Diffusion Weighted Imaging Zellinfiltration, Interstitielle Fibrose ADC Apparent Diffusion Coefficient

1.5.1 Arterial Spin Labeling zur Bestimmung der renalen Perfusion

Die Messung der Gewebeperfusion mittels MRT liefert funktionelle Informationen über die Blutversorgung der Gewebe, Strukturen des arteriellen Blutsystems sowie die Permeabilität von Gefäßwänden. Das Arterial Spin Labeling (ASL) ermöglicht die kontrastmittelfreie Bestimmung der Nierenperfusion. Wasserprotonen des arteriellen Blutes werden magnetisch durch Hochfrequenzpulse markiert und dienen dann als körpereigenes Kontrastmittel für die Messung der Durchblutung. Die Markierung der Protonen erfolgt auf zwei verschiedene Arten: In der ersten Aufnahme erfolgt die Markierung global, d.h. alle Protonen werden durch einen Hochfrequenzpuls nicht-selektiv invertiert (nicht-selektiver Inversionspuls). In der zweiten Aufnahme findet die Markierung selektiv in einer Schicht statt (schichtselektiver Inversionspuls).^79,80 Die Signaldifferenz zwischen den beiden Bildern, die mit nicht-selektiver und selektiver Inversion aufgenommen werden, ist mit der Gewebeperfusion assoziiert und kann absolut quantifiziert werden.⁸¹

Für die Messung der Nierenperfusion werden überwiegend sogenannte „Flow-sensitive Alternating Inversion Recovery“ (FAIR)-Techniken eingesetzt.⁸² Dies ist eine Pulsed Arterial Spin Labeling (PASL)-Technik, bei der die Markierung des arteriellen Blutes durch mehrere kurze Inversionspulse erreicht wird.⁸¹ Vorteil der ASL-Technik ist die kontrastmittelfreie und nicht-invasive Quantifizierung der Perfusion. Dadurch ist die Technik wiederholt und ohne Risiken für den Patienten oder das Versuchstier durchführbar und mit anderen MRT- Messungen kombinierbar.⁷³

In der Niere lieferte der Einsatz des ASL in den letzten Jahren vielversprechende Ergebnisse bei der Untersuchung von nierentransplantierten Patienten^62,73 oder Patienten mit Nierenarterienstenose.⁸³ Auch Hueper et al. (2014) etablierten die Messung der renalen

Einleitung 20 Perfusion mittels ASL im Mausmodell des akuten Nierenversagens nach einseitigem IR- Schaden. Veränderungen der Perfusion wurden im zeitlichen Verlauf gemessen und waren abhängig vom Schweregrad des akuten Nierenversagens. Eine Korrelation der im MRT nachweisbaren frühen Perfusionsveränderungen mit dem Grad des Tubulusschadens in der Histologie und dem Ausmaß des Volumenverlustes der Niere konnte detektiert werden.⁸⁴ Ebenfalls zeigte eine Studie von Hueper et al. (2015) vielversprechende Ergebnisse bezüglich der Anwendbarkeit der ASL-Messung zur Quantifizierung der renalen Perfusion bei Patienten mit einer DGF. Es bestand eine Korrelation zwischen der gemessenen renalen Perfusion und der renalen Funktion.⁶²

1.5.2 Longitudinale (T1-) und transversale (T2-) Relaxationszeit zur Bestimmung des Gewebeödems

Die Quantifizierung der T1- und T2-Relaxationszeiten bietet die Möglichkeit, die Gewebezusammensetzung sowie den Wassergehalt des Gewebes zu bestimmen. Ein Anstieg der Relaxationszeiten deutet auf einen erhöhten Wassergehalt hin.^85-87 Da ein akuter Gewebeschaden zur Ausbildung eines Gewebeödems mit erhöhtem Wassergehalt führt, bietet die Messung der T1- und T2-Relaxationszeit eine gute Möglichkeit zur Beurteilung einer akuten Nierenschädigung im Rahmen eines IR-Schadens oder im Rahmen einer Transplantatabstoßung.^88,89

Die longitudinale T1-Relaxationszeit, auch Spin-Gitter-Relaxationszeit genannt, ist ein Maß für die Energie, die der Spin auf der Rückkehr in seinen Ruhezustand mit der Umgebung austauscht. Der Übergang der longitudinalen Magnetisierung in ihren Gleichgewichtszustand ist die T1-Relaxation. Dieser Prozess verläuft exponentiell in der Zeit t und ist abhängig von Temperatur, Viskosität und innerer Bewegung der Moleküle.⁸⁵ Die Inversion-Recovery- Sequenz ist bis heute die Standardmethode zur Messung der longitudinalen T1- Relaxationszeit. Dabei findet die Datenerfassung nach einer Inversion der Magnetisierung und einer anschließenden Wartezeit (Inversionszeit, TI) statt. Dazu wird als Ausgangsposition die Gleichgewichtsmagnetisierung bestimmt, die darauffolgend mit einem 180°-Winkel ausgelenkt wird, wonach die Relaxation beginnt. Nach bestimmten Wartezeiten zur Erholung der longitudinalen Magnetisierung in das thermische Gleichgewicht („recovery“) und unterschiedlichen Inversionszeiten wird aus der Längsmagnetisierung durch einen 90°-Impuls eine Quermagnetisierung erzeugt und aufgenommen.⁹⁰ Da Magnetisierungskomponenten mit unterschiedlichen T1-Zeiten unterschiedlich schnell relaxieren, kann T1 zu verschiedenen Inversionszeiten gemessen und bestimmt werden. Durch Variierung der Inversionszeit kann

Einleitung 21 zudem der Bildkontrast verändert werden.⁸⁵ Flüssigkeiten, insbesondere Wasser, weisen lange T1-Werte auf, da für Wasserstoffatome in einem homogenen Medium der Austausch der Energie mit der Umgebung weniger möglich ist. Gewebe mit kompakter Beschaffenheit haben kürzere T1-Werte, da die Energie in diesem Fall besser abgegeben werden kann. Diese Eigenschaft erlaubt eine Aussage über den Wassergehalt in unterschiedlichen Geweben.⁸⁹ Die transversale T2-Relaxationszeit, auch Spin-Spin-Relaxationszeit genannt, beschreibt den Energieaustausch der Spins untereinander durch wechselnde lokale Magnetfeldveränderungen. Es kommt zur Dephasierung der Spins und zu einer Verringerung der transversalen Magnetisierung, die zu einer Verringerung des Messsignals führt.

Magnetfeldinhomogenitäten bewirken eine zusätzliche Dephasierung, die als T2*-Relaxationszeit bezeichnet wird. Diese Inhomogenitäten überlagern den normalen T2- Abfall und beschleunigen die Relaxation. Um diese jedoch auszuschalten, wird ein Spin-Echo erzeugt. Dieses basiert auf der Abfolge eines 90°- und 180°-Impulses. Pro Anregung wird ein Echo ausgelesen.⁹⁰ Zur Messung der T2-Relaxationszeit werden Multi-Spin-Multi-Echo- Sequenzen verwendet. Dabei lassen sich durch Anregung eines 90°-Impulses und darauffolgender, multipler 180°-Impulse mehrere verschiedene Spin-Echos erzeugen, die dann zu Bildern mit unterschiedlichen Echozeiten (Echozeit, TE) führen.⁸⁵

In der kardialen Bildgebung wurden die T1- und T2-Relaxationszeit zur Bestimmung von Ödem und Fibrose bei Patienten mit Myokardinfarkt bzw. Kardiomyopathie bereits im klinischen Alltag eingeführt.^91-94 Auch Hueper et al. (2013) stellten im Mausmodell des akuten Nierenversagens nach einseitigem IR-Schaden einen Anstieg der T2-Werte, der mit der Zellinfiltration als Korrelat der akuten Inflammation assoziiert war, in Abhängigkeit der Schwere der Nierenschädigung fest.⁸⁸ Hueper et al. (2014) zeigten ebenfalls, dass das T1- Mapping die Beurteilung renaler Pathologien nach Ischämie induziertem, akuten Nierenversagen im Mausmodell ermöglicht.⁸⁹

Einleitung 22 1.5.3 Diffusionsbildgebung zur Bestimmung inflammatorischer Zellinfiltration und

interstitieller Fibrose

In den letzten Jahren hat die Diffusionsbildgebung (Diffusion Weighted Imaging, DWI) eine deutliche Entwicklung erfahren. Besonders in der Diagnostik zerebraler Ischämien hat sich diese Methode aufgrund der hohen Sensitivität für frühe Veränderungen im klinischen Alltag etabliert.^95,96 In der Abdomenbildgebung wird die DWI mittlerweile als Standardsequenz eingesetzt und ist besonders zur Detektion und Charakterisierung von Tumoren gut geeignet.⁹⁷

Die Diffusionsbildgebung basiert auf der Messung von Diffusionsbewegungen von Wassermolekülen im Gewebe. Die Diffusion erfolgt durch thermische Eigenbewegung der Moleküle, die auch Brownsche Molekularbewegung genannt wird.⁹⁸

Zur Messung der Gewebediffusion werden zwei Gradientenimpulse der gleichen Dauer und zwei Hochfrequenzpulse benötigt. Der erste 90°-Impuls führt zu einer Auslenkung der Längsmagnetisierung in die Transversalebene und zur Dephasierung der Protonen. Nach einer bestimmten Diffusionszeit wird ein 180°-Impuls geschaltet, der gegenläufig ist und die Protonen wieder rephasiert. Die Daten können dann in Form eines Echozugs ausgelesen werden. Vorteile dieser ultraschnellen Echo Planar Imaging (EPI)-Technik, die in der Regel für die Diffusionsbildgebung verwendet wird, sind die Auslesung aller Zeilen der Bildmatrix mit nur einer Anregung und die deutlich reduzierte Untersuchungszeit.⁹⁹ Die Stärke der Diffusionsgewichtung eines MRT-Bildes wird durch den b-Wert angegeben.¹⁰⁰ Je größer der b-Wert und je höher die Beweglichkeit der Wasserprotonen, desto höher ist der von Diffusion verursachte Signalverlust. Durch die Messung der Diffusion mit mindestens zwei unterschiedlichen b-Werten kann der apparente Diffusionskoeffizient (Apparent Diffusion Coefficient, ADC) bestimmt werden, der in mm²/s angegeben wird. Dadurch können die Signale quantifiziert und die räumliche Verteilung mittels ADC-Map angegeben werden.^101,102 Klinische Studien demonstrieren die Reduktion des ADC bei verschiedenen Nierenerkrankungen wie der chronischen Niereninsuffizienz^103,104, der Ureterobstruktion¹⁰⁵ und Funktionsstörungen der Transplantatniere.^75,77,78 Togao et al. (2010) wiesen im Mausmodell der Ureterobstruktion nach, dass die Reduktion des ADC in der Niere mit Zellinfiltration und interstitieller Fibrose assoziiert ist.¹⁰⁶ Dieser Zusammenhang wurde ebenso von Hueper et al. (2013) im Mausmodell des akuten Nierenversagens nach IR- Schaden nachgewiesen⁸⁸. Darüber hinaus war bei Patienten mit einer DGF in der frühen Phase nach NTx eine signifikante Reduktion des ADC nachweisbar, die durch

Einleitung 23 Tubulusschädigung im Rahmen des IR-Schadens sowie Abstoßungsreaktionen mit zellulärer Infiltration und Transplantatfibrose erklärt werden kann. Somit ist die Diffusionsbildgebung eine vielversprechende diagnostische Methode für den Nachweis von Pathologien der Transplantatniere.^105,107

1.6 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war es, akute Schädigungen der Transplantatniere in Mausmodellen mittels multiparametrischer funktioneller MRT nicht-invasiv zu untersuchen. Um die Transplantatschäden zu charakterisieren und Veränderungen quantitativ zu erfassen, sollten verschiedene Techniken der funktionellen MRT im Mausmodell eingesetzt und für die Bildgebung der Transplantatniere optimiert werden. Dazu wurden die kontrastmittelfreie ASL-Bildgebung zur Bestimmung der renalen Perfusion, das T1- und T2-Mapping zur Quantifizierung des Gewebeödems und der akuten Inflammation und die Diffusionsmessung zur Untersuchung inflammatorischer Zellinfiltration sowie interstitieller Fibrose genutzt.

Im ersten Versuchsteil der Arbeit sollte die multiparametrische funktionelle MRT an einem definierten Zeitpunkt (drei Wochen nach Transplantation) im Mausmodell der akuten Transplantatabstoßung nach allogener NTx im Vergleich zur isogenen NTx durchgeführt werden. Die Validierung der MRT-Messungen erfolgte durch den direkten Vergleich mit der Histologie, der Immunhistologie und der FACS-Analyse in demselben Tier. Es wurde ermittelt, wie sich die funktionellen MRT-Parameter bei bestimmten Pathologien verändern.

Im zweiten Versuchsteil der Arbeit wurden die validierten funktionellen MRT-Techniken eingesetzt, um frühe Veränderungen nach allogener und isogener NTx im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren mittels serieller Untersuchungen in demselben Tier zu charakterisieren. Die Ergebnisse wurden mit der Histologie als Endpunktmessung verglichen und interpretiert.

Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen somit die Grundlage für den Einsatz der multiparametrischen funktionellen MRT zur Untersuchung von molekularen Mechanismen, die für die akute Transplantatschädigung eine Rolle spielen, als auch zur Evaluierung von Effekten neuer experimenteller Therapien im Mausmodell bilden. Darüber hinaus soll die Arbeit helfen, die funktionelle MRT auch in der klinischen Routine bei Patienten, bei denen nur in seltenen Fällen ein detaillierter Abgleich von Bildgebungsparametern mit der Histopathologie möglich ist, einzusetzen und besser interpretieren zu können.

Material und Methoden 24

2 Material und Methoden

2.1 Liste der Materialien

2.1.1 Primärantikörper Tabelle 2.1: Primärantikörper

Antikörper Firma

Produkt-

Nummer Spezies Verdünnung CD4⁺ Beckton Dickinson (BD)

Pharmingen, Deutschland

550278 Rat anti- mouse

1:100

F4/80⁺ Biolegend, USA B153918 Rat anti-

mouse

1:1000

Fibronektin Abcam, USA AB2370 Rabbit anti-

mouse

1:200 CD3⁺ DAKO/Bizol, Deutschland A0452 Rabbit anti-

mouse

1:250

2.1.2 Sekundärantikörper Tabelle 2.2: Sekundärantikörper

Antikörper Firma Produkt-Nummer Spezies Verdünnung

Alexa Fluor 555 IgG

Invitrogen A21434 Goat anti-rat 1:500

2.1.3 FACS-Antikörper Tabelle 2.3: FACS-Antikörper

Antikörper

Produkt-

Nummer Firma

CD45⁺ 30-F11 BD Pharmingen, Deutschland

CD19⁺ 6D5 BD Pharmingen, Deutschland

TCR⁺ H37-597 BD Pharmingen, Deutschland

CD11⁺ eF780 eBioscience/Thermo Fisher Scientific, Deutschland F4/80⁺ 123115 Biolegend, Kalifornien

Material und Methoden 25

2.1.4 Geräte

Tabelle 2.4: Verwendete Geräte

Name Hersteller

7 Tesla Kleintier-MRT Bruker Pharmascan, PHS701, Deutschland

Standort: Imaging Center des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover

1-Kanal-Volumenspule Bruker, T10327 V3, Deutschland CODA Surgical Monitor Kent Scientific, USA

Kryostat Firma Leica, CM

3050S; 6 μm Schnittdicke Leica Microsystems GmbH, Deutschland Leica LM DB Leica Microsystems GmbH, Deutschland FACS Canto I BD Bioscience, Deutschland

2.1.5 Programme und Softwareprodukte

Tabelle 2.5: Verwendete Programme und Softwareprodukte

Name Hersteller

Matlab The MathWorks, USA

Elastix-Software Image Sciences Institute, University Medical Center Utrecht, Niederlande

Osirix-Software Version 6.0.2, Pixmeo, Schweiz GraphPad Prism 7.0 GraphPad Software, Inc., USA SPSS Version 23 IBM Corporation, USA

FACS Diva Software BD Bioscience, Deutschland

Material und Methoden 26

2.2 Versuchstiere und Haltung

Alle Experimente wurden durch die örtlich zuständige Veterinärbehörde des Niedersächsischen Landesamts für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt.

Die Aktenzeichen der Tierversuchsvorhaben lauten 33.14-42502-04-11/0492 und 33.12- 42502-04-14/1569. Für die Versuche wurden

▪ männliche Wildtyp Mäuse mit der Stammbezeichnung C57BL/6J^Han-ztm (H2^b) (B6) und

▪ Wildtyp Mäuse mit der Stammbezeichnung BALB/c J^Han-ztm (H2^d) (BALB/c)

mit einem Gewicht von jeweils 20 - 26 g und einem Alter zwischen zwölf und vierzehn Wochen verwendet. Die Tiere wurden von Charles River GmbH & Co. KG (Sulzfeld, Deutschland) und dem Institut für Versuchstierkunde (Medizinische Hochschule Hannover) bezogen. Zucht und Haltung der Versuchstiere erfolgte artgerecht im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover (Leiter: Prof. Dr. André Bleich) bei konstantem Tag- und-Nacht-Rhythmus (14:10) und freiem Zugang zu Trinkwasser sowie mit einer Standardernährung (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG).

Für alle Operationen wurde eine Inhalationsnarkose mit Isofluran durchgeführt. Zur Schmerzbehandlung wurde vor Operation Turbogesic® (Butorphanol) 1 mg/kg subkutan verabreicht. Die Analgesie erfolgte entsprechend den aktuellen Empfehlungen der Gesellschaft für Versuchstierkunde GV-SOLAS.

Im Rahmen der Versuche wurden die Tiere täglich überwacht. Als Abbruchkriterium für die Versuche wurden das Auftreten von Ödemen und neurologischen Störungen genutzt, das Verweigern der Nahrungsaufnahme sowie Passivität der Tiere. Bei Verhaltensauffälligkeiten der Tiere oder struppiger Erscheinung wurde das Kreatinin vorzeitig gemessen, ein Kreatinin von > 300 µmol/l war ebenfalls als Abbruchkriterium definiert. Zur klinischen Beurteilung der Mäuse wurde die unten beschriebene Belastungstabelle verwendet (Tabelle 2.6). Bei einem Score von

฀

 3 erfolgte die unmittelbare Tötung des Versuchstieres.

Material und Methoden 27

Tabelle 2.6: Klinische Beurteilung der Versuchstiere

Score Qualität Merkmale

6 Sehr aktiv Kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen

5 Aktiv Neugierig, schnelle, vereinzelte

Aktivitätspausen

4 Eingeschränkt Aktiv, Reagiert auf Zuwendung, häufige Aktivitätspausen

3 Ruhig, herabgesetzte Nahrungsaufnahme

Desinteressiert an der Umwelt, selten Aktivität, schläfrig

2 Lethargisch Keine Aktivität, Verharren, keine

Nahrungsaufnahme

1 Moribund Keine Aktivität, Atemschwierigkeiten, Tod zu

erwarten

Material und Methoden 28

2.3 Versuchsplan

Die Arbeit gliedert sich in zwei Versuchsteile, die in Abbildung 2.1 schematisch dargestellt sind.

Abbildung 2.1: Versuchsablauf zur Untersuchung akuter Schädigungen der Transplantatniere

Die Arbeit gliedert sich in zwei Versuchsteile. Der Versuchsplan ist in der Übersicht schematisch dargestellt und wird im folgenden Abschnitt genau erläutert.

Im ersten Versuchsteil wurde die akute Transplantatabstoßung im Mausmodell nach allogener NTx (n = 6 Tiere) im Vergleich zum transplantationsassoziierten IR-Schaden nach isogener NTx (n = 5 Tiere) an einem definierten Zeitpunkt (drei Wochen nach Transplantation) mittels multiparametrischer funktioneller MRT untersucht. Die Tiere wurden nach dem MRT an Tag 22 getötet und das Nierengewebe mittels Histologie, Immunhistologie und FACS-Analyse untersucht (Abbildung 2.1, Tabelle 2.7). Die Validierung der MRT- Messungen erfolgte durch den direkten Vergleich mit den Ergebnissen der Gewebsanalysen.

Es wurde ermittelt, wie sich die funktionellen MRT-Parameter bei bestimmten Pathologien verändern.

Im zweiten Versuchsteil wurden die validierten funktionellen MRT-Techniken eingesetzt mit dem Ziel, frühe Veränderungen nach allogener (n = 15) und isogener NTx (n = 17) mittels serieller Untersuchungen in demselben Tier zu charakterisieren. Zusätzlich wurden n = 19 gesunde B6-Mäuse als Kontrolle untersucht. Nach der letzten MRT an Tag 7 wurden die Tiere getötet, um histologische und immunhistologische Untersuchungen durchzuführen.

Morphologische Veränderungen wurden anschließend mit den MRT-Messungen verglichen (Abbildung 2.1, Tabelle 2.8).

Material und Methoden 29 Tabelle 2.7: Erster Versuchsteil – Querschnittsanalyse mit direktem Vergleich zwischen den funktionellen MRT-Parametern und den ex vivo-Analysen

Modell Spender Empfänger

Kalte Ischämie

Warme Ischämie

MRT-Tag nach OP

Anzahl Tiere Allogene

NTx

B6 BALB/c 60 min 30 min 21 6

Isogene NTx B6 B6 60 min 30 min 21 5

Tabelle 2.8: Zweiter Versuchsteil – Serielle MRT-Untersuchungen zur

Charakterisierung der Veränderungen im Modell der akuten Schädigung der Transplantatniere

Modell Spender Empfänger

Kalte Ischämie

Warme Ischämie

MRT-Tag nach OP

Anzahl Tiere

Kontrolltiere B6 B6 19

Allogene NTx B6 BALB/c 60 min 30 min 1 + 6 15

Isogene NTx B6 B6 60 min 30 min 1 + 6 17

Material und Methoden 30

2.4 Modell der akuten Nierentransplantatabstoßung

Alle Nierentransplantationen wurden vom Gefäßchirurgen Dr. med. Song Rong (Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen) an der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Als Modell der akuten Nierentransplantatabstoßung wurde ein bereits gut etabliertes und charakterisiertes Modell der allogenen NTx verwendet.⁴⁵ Der Spender wurde per Isofluran-Inhalation (3% während der Einleitung und 1-2% zum Erhalt der Narkose; Air 200 ml/min) anästhesiert. Butorphanol diente als Analgetikum (1 mg/kg subkutan). Nach medianer Laparotomie wurde die linke Niere inklusive Nierenarterie und -vene sowie Ureter en bloc präpariert und entnommen.

Der Empfänger wurde wie oben beschrieben mit Isofluran anästhesiert. Nach medianer Laparatomie wurde die linke Eigenniere entnommen. Dann wurden die Gefäße der Transplantatniere per End-zu-End-Anastomose mit der Aorta und Vena cava des Empfängers sowie der Ureter direkt mit dem Dach der Harnblase verbunden (Abbildung 2.2). Die rechte Eigenniere verblieb im Empfängertier.⁴⁵

Abbildung 2.2: Modell der Nierentransplantation

Die rechte Eigenniere verblieb im Empfängertier während die linke Niere entfernt und eine Spenderniere transplantiert wurde. A zeigt ein koronares T2-gewichtetes MRT-Bild einer Maus vor NTx, B zeigt ein koronares T2-gewichtetes MRT-Bild einer Maus nach NTx mit Darstellung der anatomischen Strukturen.

Material und Methoden 31 2.5 Multiparametrische funktionelle MRT zur Untersuchung akuter Schädigungen

der Transplantatniere im Mausmodell

Die MRT-Untersuchungen der nierentransplantierten Mäuse und gesunden Kontrolltiere erfolgten in Isoflurannarkose (3% während der Einleitung und 1-2% zum Erhalt der Narkose) an dem speziellen Kleintier-MRT mit einer Magnetfeldstärke von 7 T (Bruker Pharmascan, PHS7016, Ettlingen, Standort Imaging Centers des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover). Zur Signalaufnahme wurde eine 1-Kanal-Volumenspule (Bruker, T10327 V3, Ettlingen in Deutschland) verwendet. Die Scanzeit für ein Tier betrug 60 bis 75 Minuten. Die Atemfrequenz wurde überwacht und die Narkosetiefe so reguliert, dass die Atemfrequenz konstant bei etwa 50 bis 60 Atemzügen pro Minute lag.

Aufgrund technischer Probleme konnten einzelne MRT-Sequenzen nicht bei allen Tieren ausgewertet werden. Daher kann die Tieranzahl bei den verschiedenen MRT-Parametern variieren.

2.5.1 Multiparametrisches MRT-Protokoll

Zur Beurteilung von funktionellen und mikroskopischen Veränderungen der Transplantatnieren wurde ein multiparametrisches MRT-Protokoll eingesetzt. Dieses umfasste neben morphologischen Sequenzen Perfusions- und Diffusionssequenzen sowie T1- und T2- Mapping.^84,88,89 Die Messungen wurden in einer zentralen koronaren Schicht durch die Nierenmitte akquiriert. Die Scanparameter und die aus den Sequenzen ermittelten morphologischen und funktionellen MRT-Parameter sind in Tabelle 2.9 zusammengefasst.

Material und Methoden 32

Tabelle 2.9: MRT-Protokoll und Scanparameter am 7 T Bruker Pharmascan

Sequenz

Bewegungs- korrektur

Schicht-

führung Scanparameter

Ermittelte Parameter T2-TSE Atemtrigger Axial

Koronar

TR = 1500 ms TE = 33 ms

Matrix = 256 x 256 FOV = 35 x 35 mm² Schichtdicke = 1 mm

Morphologie

FAIR-EPI-ASL Registrierung Koronar TR = 18000 ms TE = 16,4 ms

13 TI = 100-8000 ms Matrix = 128 x 128 FOV = 35 x 35 mm² Schichtdicke = 2 mm

Renale Perfusion

Multi-Echo- Spin-Echo (T2 Mapping)

Atemtrigger Koronar TR = 2000 ms 7 TE = 11-77 ms Matrix = 256 x 256 FOV = 35 x 35 mm² Schichtdicke = 2 mm

T2-Zeit Gewebeödem Inflammation

Inversion- Recovery-EPI (T1 Mapping)

Registrierung Koronar TR = 18000 ms TE = 16,4 ms

13 TI = 100-8000 ms Matrix = 128 x 128 FOV = 35 x 35 mm² Schichtdicke = 2 mm

T1-Zeit Gewebeödem Mikrostruktur

EPI-DWI Atemtrigger Koronar TR = 4000 ms TE = 22 ms

Matrix = 128 x 128 FOV = 35 x 35 mm² Schichtdicke = 2 mm 7 b-Werte = 0, 50, 100, 200, 300, 500, 700 s/mm²

ADC Diffusion Zellinfiltration Interstitielle Fibrose

ADC = Apparent Diffusion Coefficient; ASL = Arterial Spin Labeling; DWI = Diffusion Weighted Imaging; EPI = Echo Planar Imaging; FAIR = Flow-sensitive Alternating Inversion Recovery; FOV = Field of View; TE = Echo Time; TI = Inversion Time;

TR = Repetition Time; TSE = Turbo-Spin-Echo

Material und Methoden 33

2.5.2 Arterial Spin Labeling zur Bestimmung der renalen Perfusion

Um die renale Perfusion zu quantifizieren, wurde die FAIR-EPI-ASL-Sequenz mit folgenden Scanparametern verwendet: TR/TE = 18000/16,4 ms, TI = 2000 ms, Matrix = 128 x 128, FOV = 35 x 35 mm², Schichtdicke = 2 mm. Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Signalstärken von MRT-Aufnahmen mit schichtselektivem (Kontrollbild) und nicht- selektivem Inversionspuls (Labelingbild) konnte die renale Perfusion (f) nach einem etablierten Verfahren gemäß der folgenden mathematischen Gleichung berechnet werden^79,80

ΔM1 ist die Signaldifferenz zwischen den Kontroll- und Labelingbildern, während M0 der vollkommen relaxierten longitudinalen Magnetisierung entspricht. Für die longitudinale Relaxationszeit des arteriellen Blutes (T1a) wurde eine Inversionszeit von 2200 ms festgelegt.¹⁰⁸ Die apparente Relaxationszeit T1app wurde pixelweise berechnet auf Basis der Analyse der Signaldifferenz ΔM, M0 und T1.

฀

 gibt den Blut-Gewebs-Teil-Koeffizient für Wasser mit einem konstanten Wert von 80 ml/100 g an.^82,109,110 Das in der vorliegenden Arbeit genutzte Prinzip zur Perfusionsmessung mittels ASL ist in Abbildung 2.3 dargestellt.

Abbildung 2.3: Schematische Darstellung der Perfusionsmessung mittels ASL

FAIR-ASL-Bilder wurden mittels eines nicht-selektiven (Mitte, Labelingbild) und mittels eines schichtselektiven Inversionspulses (links, Kontrollbild, Tag) erzeugt. Die Schichtpositionierung ist in rot, der Inversionspuls in gelb dargestellt (oben). Die mit der jeweiligen Inversion erzeugten Bilder sind in der unteren Zeile gezeigt. Die renale Perfusion ist abhängig von der Signaldifferenz zwischen den beiden Bildern und wird in ml/(min*100g) angegeben (Farbskala rechts unten).

฀

f =  2₀

M₁ M₀

1/T_1a −1/T_app

exp(−TI/T_1app)−exp(−TI/T_1a)