Effekt von Abscisinsäure auf den Raffinosezucker-Stoffwechsel und die Frosttoleranz beim Kriechenden Günsel (Ajuga reptans L.)

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Effekt von Abscisinsäure auf den Raffinosezucker Stoffwechsel und die Frosttoleranz beim Kriechenden Günsel

(Ajuga reptans L.)

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Diplomarbeit

Dem Fachbereich Biologie vorgelegt von

Till Weber

Ausgeführt am Institut für Pflanzenbiologie der Universität Zürich unter der Leitung von Prof. Dr. Felix Keller

Begutachtet von

Prof. Dr. Peter G. Kroth (Universität Konstanz) Prof. Dr. Felix Keller (Universität Zürich)

Juni 2004

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen 1

I. Einleitung 3

1. Ajuga reptans L. (Kriechender Günsel) 3

1.1 Systematische Stellung und morphologische Merkmale 3

1.2 Vorkommen 4

2. Die Kohlenhydrate (KH) sind ein wichtiger und vielseitiger Baustein

einer Pflanze 5

2.1 Die Oligosaccharide der Raffinosefamilie (RFO) sind eine

kleine, aber wichtige Zuckergruppe für viele Pflanzen 5 2.1.1 Chemische Grundstruktur der Oligosaccharide

der Raffinosefamilie (RFO) 5

2.1.2 Synthese der RFOs und

die daran beteiligten Enzyme 6

2.1.3 RFO Katabolismus 8

2.1.4 Kompartimentierung der RFO Synthese

innerhalb eines Blattes 10

2.2 Physiologische Bedeutung der RFOs 11

2.2.1 Phloemtransport der RFOs und anderer Zucker 11

2.2.2 Speicherung der RFOs 12

2.2.3 Schutz vor Frost und Trockenheit mit Hilfe der RFOs 13

3. Abscisinsäure (ABA), ein Phytohormon 16

3.1 Biosynthese der Abscisinsäure (ABA) 16

3.2 Inaktivierung von ABA durch Oxidation

oder durch Konjugation 18

3.3 Syntheseorte und physiologische Funktion von ABA 19

3.3.1 Syntheseorte der ABA 19

3.3.2 Physiologische Funktion und Interaktion von

ABA mit anderen Phytohormonen 19

4. Zielsetzung der vorliegenden Diplomarbeit 21

II. Material und Methoden 22

1. Material 22

1.1 Chemikalien, Hormone, Zucker und spezielle Labormaterialien 22

1.2 Primer 22

1.3 Kulturen von Ajuga reptans L. 23

1.3.1 Erdkulturen von Ajuga reptans L. 23

1.3.2 Kalluskulturen von Ajuga reptans L. 24 1.3.3 Zellsuspensionskulturen von Ajuga reptans L. 24

2. Methoden 25

2.1 Hormonbehandlung mit (±)-Abscisinsäure (ABA) 25 2.2 Cryosaftmethode zur Gewinnung des Zellsaftes 25

2.3 Entsalzung von Cryosäften 26

2.4 Messung der RFOs von den Cryosäften und der Enzymassays

mittels HPLC 27

2.5 LT50Methode 29

2.6 Leitfähigkeitsmessung zu Erfassung der Blattschädigung nach

LT50 Versuch 30

2.7 Messung der Raffinosesynthase (RafS) Aktivität und der

Galactan:Galactan-Galactosyltransferase (GGT) Aktivität 33

2.7.1 Messung der RafS Enzymaktivität 33

2.7.2 Messung der GGT Enzymaktivität 34

2.8 RNA Extraktion 35

2.9 Gel zur Quantifizierung der RNA 36

2.10 Herstellung der Sonden für die RafS und GGT 37

2.11 Northern Blot 37

2.12 Statistische Erhebung 40

III. Ergebnisse 41

1. HPLC-System 1 („Benson“) und das HPLC-System 2

(„Dionex“) ergeben gleichen Ergebnisse? 42

2. Die KH Konzentration bei Ajuga reptans sinkt im Dunkeln 43

3. RFO Konzentrationen in Suspensionskulturen, Kalluskulturen

und Pflanzen 44

3.1 Ajuga Zellkulturen synthetisieren keine RFOs 44 3.2. Ajuga Kalluskulturen synthetisieren auch keine RFOs 50 3.3 Ajuga reptans Pflanzen synthetisieren RFOs 54 4. Messung der Frostresistenz bei Ajuga reptans 59

4.1 Messung der Frostresistenz bei Ajuga reptans

aus dem Freien 59

4.2 Messung der Frostresistenz bei warmgehaltenen und

kältebehandelten Ajuga reptans 62

5. Die Enzymaktivität der RafS und GGT bei

warmgehaltenen und kälteinduzierten Ajuga reptans Pflanzen

verglichen mit den RFO Konzentrationen 71

5.1 Enzymaktivität der RafS bei warmgehaltenen und

kälteinduzierten Ajuga reptans Pflanzen 72

5.2 Enzymaktivität der GGT bei warmgehaltenen und

kälteinduzierten Ajuga reptans Pflanzen 75

6. RNA Extraktion und Northern Blot 77

IV. Diskussion 78

1. Hintergrund der Arbeit 78

2. RFO Akkumulation 79

3. ABA Behandlung 81

4. Endogenes ABA in Ajuga reptans L. 82

5. Enzymaktivitäten von RafS und GGT 83

5.1 RafS Aktivität 83

5.2 GGT Aktivität 84

6. Frostresistenz 86

7. Ausblick 90

8. Zusammenfassung 92

9. Summary 93

V. Anhang 94

VI. Literaturverzeichnis 99

VII. Dank 103

VIII. Erklärung 104

Abkürzungen

2,4-D 2,4-Dichlorphenoxyacetatsäure ABA Abscisic acid, Abscisinsäure ABA-GE ABA-β-D-Glycosylester ABAld Abscisinaldehyd

Aju Ajugose

AO Aldehyd Oxidase

AtAO Arabidopsis Aldehyd Oxidase ATP Adenosintriphosphat

BA 6-Benzylaminopurin

CAM Crassulacean Acid Metabolism cor cold-regulated

DEPC Diethylpyrocarbonat

DP Degree of Polymerisation, Polymerisationsgrad DPA 4´-Dehydrophaseinsäure

DTT 1,4-Dithitreitol

EDTA Ethylendiamintetraacetatsäure Fru Fructose

Gal Galactose

Gal-1-P α-D-Galactose-1-Phosphat

GGT Galactan:Galactan-Galactosyltransferase Glc Glucose

Gol Galactinol

GolS Galactinol Synthase

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-ethansulfonsäure Ino myo-Inositol

KH Kohlenhydrat

MES N-Morpholinoethansulfonsäure MOPS Morpholinopropansulfonsäure MS Murashige und Skoog Medium n number

NCED 9-cis Epoxycarotinoid Dioxygenase PA Phaseinsäure

PAD pulsed amperometric detection PCR Polymerase Chain Reaktion PEG Polyethylenglycol

PVP Polyvinylpyrrolidon PVPP Polyvinylpolypyrrolidon Raf Raffinose

RafS Raffinose Synthase

RFO Raffinose Family of Oligosaccharide rpm rotation per minute

SDR short-chain Dehydrogenase/Reduktase SDS Sodium Dodecyl Sulfat

SPS Saccharose-Phosphat-Synthase SSC Sodium Sodium Citrate

Sta Stachyose

StaS Stachyose Synthase Suc Sucrose, Saccharose TG Trockengewicht

TRITON Polyoxyethylen-p-t-octylphenol UDP Uridindiphosphat

Ver Verbascose

ZEP Zeaxanthin Epoxydase α-Gal α-Galactosidase

I. Einleitung

1. Ajuga reptans L. (Kriechender Günsel)

1.1 Systematische Stellung und morphologische Merkmale

Ajuga reptans L. (Kriechender Günsel) gehört zur Familie der Lamiaceae (=

Labiatae, Lippenblütler) und wird in die Ordnung der Lamiales eingeteilt. Die Ordnung Lamiales gehört zur Klasse der Dicotyledoneae, welche von der Abteilung der Spermatophyta eingefasst ist. Die Lamiaceae umfassen weltweit insgesamt etwa 200 Gattungen und 3200 Arten. Hier sind Kräuter, Stauden oder Halbsträucher vertreten, deren Stängel vierkantig und dekussiert beblättert sind. Die Blätter der Lamiaceae sind meist einfach und haben keine Nebenblätter. Die stark zygomorphen, selten radiären Blüten sind meist ungestielt, dicht gedrängt und quirlförmig in den Achsen von Hochblättern (Oberdorfer, 2001, p. 794; Schmeil und Fitschen, 1996, p. 518). Die Gattung Ajuga umfasst etwa 50 Arten, welche vor allem europäisch bis westasiatisch verbreitet sind.

Die morphologischen Merkmale dieser Gattung sind eine scheinährige Blütenkrone, bei der die Blüten nur die dreilappige Unterlippe deutlich ausgebildet haben und die Oberlippe kurz und unscheinbar ist. Die Blütenkranzröhre ist innen mit einem grundständigen Haarring versehen.

Abbildung 1.1: Blühende Ajuga reptans L., aufgenommen im Januar 2004 im Treibhaus des Botanischen Instituts der Universität Zürich

Die mehrjährige Ajuga reptans L. (siehe Abbildung 1.1) hat eine grundständige Rosette mit oberirdischen, beblätterten Ausläufern und kann zwischen 10 und 30 cm hoch werden. Die Blätter sind verkehrt-eiförmig, gestielt, oval, mehr oder weniger sitzend, ganzrandig oder stumpf gezähnt, zerstreut behaart bis kahl, oft durch einen hohen Anthocyangehalt violett gefärbt. Im Blütenstand sind die Blätter kürzer oder ein wenig länger als die Blüten. Die Blüten sind fast geruchlos, zu zwei bis sechs Scheinquirlen in den Hochblattwinkeln angeordnet. Die Krone ist meist blau, seltener rosa oder weiß, 1 bis 1,5 cm lang, mit sehr kurzer gerader Oberlippe und viel längerer dreiteiliger Unterlippe. Die Teilfrüchte sind etwa 2,5 mm lang. Der Chromosomensatz beträgt 2n=28.

1.2 Vorkommen

Die Gattung Ajuga ist europäisch und westasiatisch, subatlantisch bis submediterran verbreitet und blüht zwischen Frühling und Frühsommer. Ihre bevorzugten Standorte sind feuchte bis sehr feuchte, nährstoff- und humusreiche, tonige Böden auf Wiesen und Wälder in collin (ca. 500 m), subalpiner (von 1200 m bis 1800 m) bis alpiner Höhe.

Ajuga reptans L. wächst auf Wiesen und in artenreichen Wäldern, auf frischen, nährstoffreichen, neutral bis mäßig sauren humosen Lehmböden, im Licht oder Halbschatten. Die Ausbreitung der Pflanze findet generativ durch Ameisen oder vegetativ durch Ausläufer statt. Die Bestäubung der Blüten wird durch Insekten oder selbstbestäubend durch den Wind durchgeführt.

In der Schweiz sind nicht nur Ajuga reptans L. (Kriechender Günsel), sondern auch drei weitere Ajuga Arten vertreten. Ajuga genevensis L. (Genfer Günsel) bildet keine Ausläufer, ist submediterran bis eurasisch (kontinental) verbreitet und hat einen Chromosomensatz von 2n=32. Ajuga pyrimidalis L. (Pyramiden Günsel) bildet ebenfalls keine Ausläufer aus und besitzt im Blütenstand Blätter von doppelter Länge der Blüten. Sie wächst in präalpinen über nordischen (subozeanischen) Standorten.

Der Chromosomensatz beträgt 2n=32. Ajuga chamaepitys L. (Gelber Günsel) hat gelbe, aromatisch riechende Blüten und wächst vornehmlich in mediterranen bis submediterranen Lagen. Der Chromosomensatz beträgt 2n=28 (Lauber und Wagner, 1996, p. 842; Oberdorfer, 2001, p. 794).

2. Die Kohlenhydrate (KH) sind ein wichtiger und vielseitiger Baustein einer Pflanze

Die Kohlenhydrate werden aus dem atmosphärischen CO2 synthetisiert und sind das Produkt der photosynthetischen Reaktion einer Pflanze. Zucker, Stärke und Cellulose bilden eine Gruppe von Naturstoffen, die man zu den Kohlenhydraten (KH) zählt. Die KH sind Polyhydroxyaldehyde oder Polyhydroxyketone und davon abgeleitete Verbindungen. Die KH werden in drei Gruppen eingeteilt. Erstens die einfachen Zucker (Monosaccharide), zweitens Zucker mit zwei bis sechs Monosaccharid Molekülen (Oligosaccharide) und drittens Zucker die durch Polykondensation aus Monosacchariden entstanden sind (zum Beispiel Stärke und Cellulose).

Die KH können innerhalb einer Pflanze vielseitig als Transport-, Speicher- und als Energiestoffe, sowie als Gerüststoffe vorhanden sein (Strasburger, 1999, p. 29, 251; Heldt, 2003, p. 253). Die Cellulose bildet als Zellwandkomponente in verschieden chemischen Zusammensetzungen ein dauerhaftes und stabiles Grundgerüst der Pflanze. Die verschiedenen Zucker und auch die Stärke hingegen sind aber dynamisch in der Konzentration und im Aufenthaltsort in der Pflanze. Die Stärke wird bei der Photosynthese tagsüber in den Blättern gebildet und nachts wieder abgebaut und für andere Synthesen weiterverwertet. Die Stärke kann auch im Samen als Energievorrat für den zukünftigen Keimling eingelagert werden. Die Zucker können als langfristiger Energievorrat in der Pflanze oder im Samen genutzt werden. Zusätzlich können die Zucker auch für schlechte Witterungseinflüsse (Trocken- oder Winterperioden) als kurzfristiger Energievorrat in der Pflanze dienen.

2.1 Die Oligosaccharide der Raffinosefamilie (RFOs) sind eine kleine, aber wichtige Zuckergruppe für viele Pflanzen

2.1.1 Chemische Grundstruktur der Oligosaccharide der Raffinosefamilie (RFO)

Raffinose (Raf; [α-D-Gal (1Æ6) α-D-Glc (1Æ2) β-D-Fru]) ist die kleinste chemische Einheit der RFOs (Raffinose Family of Oligosaccharides). Die Raf ist in Blättern, Wurzeln und Samen der höheren Pflanzen der Gymno- und Angiospermen nachgewiesen worden (Bachmann et al., 1994; Amiard et al., 2003). Die chemischen

Bausteine der Raf sind Fructose (Fru) und Glucose (Glc), die α (1Æ2) glykosidisch miteinander verbunden sind und so die Saccharose (Suc) bilden. An der Suc wiederum ist ein Galactosylrest α (1Æ6) glykosidisch gebunden. Es können aber auch mehrere Galactosylreste (13 ≥ n ≥ 1) an der Saccharose gebunden sein. So kann ein Polymerisationsgrad (DP; Degree of Polymersation) der RFOs von bis zu 15 entstehen.

Durch Bindung eines Galactosylrest an die Raf, entsteht die Stachyose (Sta;

DP 4), aus der wiederum die Verbascose (Ver; DP 5) und Ajugose (Aju; DP 6) entstehen können.

Die Raf scheint im Pflanzenreich ubiquitär vorzukommen. Die weitverbreitete Sta wurde u.a. in Stachys tuberifera (Bachmann et al., 1994; Dey und Harborne, 1997, p. 167) und die weniger verbreitetete Aju in Ajuga reptans nachgewiesen.

Neben den RFOs gibt es noch andere pflanzliche Saccharosyl- Oligosaccharide:

Die Umbelliferose [α-D-Gal (1Æ2) α-D-Glc (1Æ2) β-D-Fru] ist in der Apiacea am häufigsten nachgewiesen worden. Sie schützt die Pflanze vor Trocken- und Kältestress.

Die Loliose [α-D-Gal (1Æ3) α-D-Glc (1Æ2) β-D-Fru] schützt vor Trockenheit (Amiard et al., 2003).

Die Tetrasaccharide Lychnose [α-D-Gal (1Æ6) α-D-Glc (1Æ2) β-D-Fru (1Å1) α–D-Gal] und Isolychnose [α-D-Gal (1Æ6) α-D-Glc (1Æ2) β-D-Fru (3Å1) α–D-Gal]

kommen gleichzeitig in Lychnis dioica aus der Familie der Caryphyllaceae vor. Sie werden als Speicherform von Kohlenstoff benutzt und sind nicht im Samen zu finden.

Lychnose und Isolychnose sind chemische Isoformen der Sta.

Die Planteose [α -D-Glc (1Æ2) β-D-Fru (6Æ1) α -D-Gal] kommt nur im Samen vor. Dort hat sie die Aufgabe als KH Speicher zu dienen und vor Austrocknung zu schützen (Dey und Harbone, 1997).

2.1.2 Synthese der RFOs und die daran beteiligten Enzyme

Es gibt zwei Abschnitte in der RFO-Synthese: einmal der Galactinol- abhängige und dann der Galactinol-unabhängige Weg.

Beim Galactinol-abhängigen Weg wird ein Galactoserest von Galactinol (Gol)

Zunächst wird UDP-Glc (UDP, Uridinphosphat) durch das Enzym UDP-Glucose- Epimerase zu UDP-Gal epimerisiert. Durch ein weiteres Enzym GolS (UDP- Galactose-myo-Inositol-Galactosyltransferase; Galactinol Synthase) (EC 2.4.1.123) wird der Galactoserest auf den cyclischen Alkohol myo-Inositol (Ino) in 1 αÆ1- Stellung übertragen und es entsteht so Gol (siehe Abbildung 1.2) (Bachmann et al., 1994; Sprenger und Keller, 2000; Heldt, 2003, p. 273ff). Gol hat einen DP von 2. Bei der GolS scheint es sich um ein Schlüssel- und Regulatorenzym in der RFO Synthese zu handeln, da die Enzymaktivität mit der RFO Konzentration positiv, mit der Suc Konzentration negativ korreliert (Sprenger und Keller, 2000). Dieses Enzym existiert in zwei Isoformen, wobei sich die Aktivität der GolS in verschiedenen Pflanzen durch Kälteinduktion auf das Vielfache sich steigern lässt (Bachmann et al., 1994; Castillo et al., 1990).

Ausgehend von Gol und Suc können dann die RFOs durch zwei verschiedene Enzyme synthetisiert werden.

So wird Raf (DP 3) vom Enzym Raffinose Synthase (RafS, 1-O- α-D-

Galactosyl-myo-Inositol:Saccharose-6- α-D-Galactopyranosyltransferase) (EC 2.4.1.81) biosynthetisiert, indem der Galactoserest von Gol auf Suc übertragen wird.

Das an der UDP-Gal gebundene myo-Inositol (Ino) wird wieder frei (siehe Abbildung 1.2).

Sta (DP 4) wird durch das Enzym Stachyose Synthase (StaS, 1-O- α -D- Galactosyl-myo-Inositol:Raffinose-6- α-D-Galactopyranosyltransferase) (EC 2.4.1.67) hergestellt, indem der Galactoserest vom Gol auf Raf übertragen wird (siehe Abbildung 1.2).

Beim Galactinol-unabhängigen Weg wird auf die Sta mit dem löslichen Enzym Galactan:Galactan-Galactosyltransferase (GGT) ein Galactoserest von einer weiteren Sta übertragen (Bachmann und Keller, 1995; Braun und Keller, 2000;

Tapernoux-Lüthi, 2004). Neben der Ver (DP 5) entsteht auch Raf. Anschließend kann die GGT aus der Ver die Aju (DP 6) synthetisieren. Weiter davon ausgehend entstehen durch die GGT noch Oligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad bis zu DP 15.

Das Enzym GGT hat ein saures pH-Optimum und die Aktivität korreliert positiv mit der RFO Akkumulation (Haab und Keller, 2002).

Abbildung 1.2: Syntheseweg von Galactinol und RFO (Raffinose und Stachyose) in der Pflanze (nach Taji et al., 2002)

2.1.3 RFO Katabolismus

Der erste katabolisierende Schritt der RFOs besteht darin, dass die endständige Gal durch eine α-Galactosidase (α-Gal; α-D-Galctosid Galactohydrolase) abgespalten wird (Dey und Harborne, 1997, p. 168 f.). Es gibt zwei verschiedene α-Galactosidasen. Einmal eine α-Gal, die ihr Optimum im sauren pH (um pH 5,0) und eine andere, die ihr Optimum im basischen pH (um pH 7,5) Bereich hat. Der zweite katabolisierende Schritt ist eine Phosphorylierung der freien Gal zu α-D-Galctose-1-Phosphat (Gal-1-P) durch die Galactokinase unter Verbrauch von Adenosintriphosphat (ATP).

Anschließend kann Gal-1-P über zwei verschiedene Schritte weiter metabolisiert werden (siehe Abbildung 1.3). Entweder wird Gal-1-P zu UDP-Glc oder zu Glucose-1-Phosphat verwandelt (Keller und Pharr, 1996).

Diese Endprodukte können dann wieder den anabolischen oder katabolischen Stoffwechselwegen der Pflanze zugeführt werden.

RFO_n

Gal

Gal1P Glc1P Gal1P UDPGlc

UDPGal UDPGlc Glc1P UDPGal

UTP

PP_i

ATP ADP H₂O RFO _n-1 (A)

(B)

(C) (E)

(D)

(F) (D)

I. II.

Abbildung 1.3: RFO Katabolismus. I. Pyrophosphorylase Weg. II. Leloir oder Uridyltransferase Weg. Die Enzyme der einzelnen Schritte sind: (A) α-Gal; (B) Galactokinase; (C) UTP-Hexose-1-Phosphat Uridyltransferase (= UDP- Galctose Pyrophoshorylase); (D) UDP-Glucose-4-Epimerase; (E) UTP- Glucose-1-Phosphat Uridyltransferase (= UDP-Glucose Pyrophosphorylase);

(F) UDP-Glucose-Hexose-1-Phosphat Uridyltransferase (nach Keller und Pharr, 1996)

Neben dem obigen RFO Katabolismus wurde die Hypothese einer anderen Abbaumöglichkeit der RFOs aufgestellt, bei der die RFO Syntheseenzyme formal rückwärts arbeiten. Dies wurde in der CAM Pflanze Peperomia camptotrichia (CAM, crassulacean acid metabolism) beobachtet. So wird die Sta über Raf und Gol bis zum UDP-Glc abgebaut. Dabei sind neben der alkalischen α-Gal und Galactokinase auch die rückwärts wirkenden RafS und GolS beteiligt (Madore, 1995).

2.1.4 Kompartimentierung der RFO Synthese innerhalb eines Blattes

Im Blatt von Ajuga reptans gibt es zwei Zellarten, in denen die RFO Synthese lokalisiert ist, die Mesophyll- und die Übergangszellen (siehe Abbildung 1.4).

In den Mesophyllzellen findet der Galactinol abhängige Syntheseweg im Cytosol und der Galactinol unabhängige Syntheseweg in der Vakuole statt. In den Übergangszellen wird Raf und Sta aus Suc synthetisiert und zwar Galactinol abhängig. Die Suc wird aus den Mesophyllzellen importiert.

Die Sta, Endprodukt des Galactinol abhängigen Syntheseweges, wird bei der Pflanze Stachys sieboldii in den Knollen (über das Phloem angeliefert) mit einem Tonoplast gebundenen Stachyosetransporter in die Vakuole transportiert. Ob dieser Transporter auch in der Ajuga reptans existiert und auf welche Weise die Sta bei der Ajuga reptans in die Vakuole gelangt, sind nicht geklärt.

In der Vakuole der Ajuga reptans werden aus der Sta höherkettige RFOs synthetisiert.

Abbildung 1.4: Syntheseweg der RFOs, Kompartimentierung zwischen Mesophyllzelle und Intermediärzelle und Transport über das Siebelement (Keller, 2004)

2.2 Physiologische Funktionen der RFOs

Es gibt drei physiologische Funktionen der RFOs. Erstens der Phloemtransport, zweitens die KH Speicherung, drittens der Schutz vor Frost und Trockenheit. In dieser Reihenfolge werden die aufgezählten Funktionen der RFOs in den folgenden Abschnitten behandelt.

2.2.1 Phloemtransport der RFOs und anderer Zucker

Es gibt zwei Arten von Phloembeladung. Die apoplastische (durch die Zellmembran entlang) und die symplastische Beladung (durch das Cytosol und den Plasmodesmen).

Bei der apoplastischen Beladung werden meist Suc und Zuckeralkohole weitergeleitet. Die Suc diffundiert aus den Mesophyllzellen symplastisch in die benachbarten Bündelscheidenzellen durch Plasmodesmen. Suc und Zuckeralkohole diffundieren weiter in die Parenchymzellen des Phloems. Aus den Parenchymzellen wird zumindest die Suc durch einen aktiven Transport aus der Bündelscheidenzelle in die Membran der Begleitzellen durch einen Suc-H⁺-Symporter transportiert. Wenn die Suc im Siebelement angelangt ist, diffundiert sie aus und wird dann über die Siebelemente des Phloems weitertransportiert (Taiz und Zeiger, 2002, p. 208).

Die Arabidopsis thaliana (Acker-Schmalwand), Lycopersicon sp. (Tomate) und die Nicotiana plumpaginifolia (Tabakpflanze) verwenden diese apoplastische Beladungsform von Suc (Taiz und Zeiger, 2002, p. 209).

Bei der symplastischen Beladung dagegen werden nicht nur Suc, sondern auch Raf und Sta weitergeleitet. Bei Pflanzen, wie Ajuga reptans (Bachmann und Keller, 1995) oder Curcurbita pepo (Kürbis) wird die symplastische Transportform benutzt (Taiz und Zeiger, 2002, p. 210).

Bei Ajuga reptans wird nicht die Raf aus den Mesophyllzellen, sondern aus den Übergangszellen weitertransportiert. Die Suc für die Raf Synthese in den Übergangszellen wird aus den Mesophyllzellen importiert. In den Übergangszellen wird die Suc mit dem dort synthetisierten Gol zur Raf und weiter zu Sta verbunden.

Die synthetisierten Raf und Sta können aufgrund ihrer Molekülgröße nicht durch die

Plasmodesmen zurück in die Mesophyllzellen diffundieren, sondern nur noch in Richtung der Siebröhren. Von Turgeon (1996) wurde dies als Polymerfallentheorie bezeichnet.

Für die Polymerfallentheorie müssen drei Voraussetzungen erfüllt sein:

Erstens muss die Suc für die Diffusion in den Mesophyllzellen in einer höheren Konzentration als in den Übergangszellen vorliegen. Zweitens müssen die Enzyme RafS und StaS in den Übergangszellen vorliegen. Drittens müssen die Plasmodesmen, die die Mesophyllzellen mit den Übergangszellen verbinden, für größere Moleküle als Suc undurchlässig sein. Nur dann kann die Polymerfallentheorie funktionieren (Taiz und Zeiger, 2002, p. 211). Desweiteren sind beim Phloem mit symplastischer Beladung sehr viele Plasmodesmen zwischen den Mesophyllzellen und den Übergangszellen vorhanden (Heldt, 2003, p. 354). Im Aufbau des Phloems mit symplastischer Beladung fehlen meist die Parenchym- und die Begleitzellen (Taiz und Zeiger, 2002, p. 211).

Für Ajuga reptans konnte gezeigt werden, dass die Pflanze nicht nur in den Mesophyllzellen, sondern auch in den Übergangszellen Raf und Sta synthetisiert (Bachmann und Keller, 1995). Zudem wurde eine von zwei GolS Isoformen mit in situ Hybridisierung klar in den Übergangszellen lokalisiert (Sprenger und Keller, 2000).

Die RFOs werden so in der symplastischen Beladungsform von Source (Assimilationsüberschuss) in Richtung Sink (Orte mit Assimilationsproduktbedarf) transportiert (Heldt, 2003, p. 354).

2.2.2 Speicherung der RFOs

Die in der Photosynthese gebildeten KH werden entweder direkt weiter verarbeitet oder kurzeitig oder langzeitig gespeichert. Dies geschieht in Blättern, Stängeln, Wurzeln, Knollen oder in Früchten und Samen.

KH können, so zum Beispiel die Stärke, in Chloroplasten als Zwischenprodukt der Photosynthese, und die RFOs, wie etwa die wasserlösliche Sta und höher polymerisierte RFOs, in der Vakuole gespeichert werden (Bachmann et al., 1995).

Bei der Speicherung haben die RFOs einen klaren Vorteil gegenüber der Stärke im Chloroplasten: Sie können in der riesigen Zentralvakuole der Mesophyllzelle gespeichert werden. Die Stärke hingegen muss sich mit dem limitierten

2.2.3 Schutz vor Frost und Trockenheit mit Hilfe der RFOs

Pflanzen haben verschiedene Strategien, um niedrige Temperaturen zu überleben. Es gibt dabei verschiedene Resistenzbereiche: kälteempfindlich, frostempfindlich und frostresistent.

Kälteempfindliche Pflanzen in tropischen und subtropischen Klimazonen zeigen schon bei Temperaturen um 15°C bis 0°C letale Schäden. Die in kühleren Klimazonen beheimateten Pflanzen überstehen diese Temperaturen, wobei deren Stoffwechsel verlangsamt ist.

Frostempfindliche Pflanzen vertragen noch Temperaturen knapp über dem Gefrierpunkt ohne größere Schäden. Schäden werden durch entstehende Eiskristalle in den Zellen verursacht, welche die Membranen aufreißen. Ionen und Metabolite (z.B. Aminosäuren, Zucker, K⁺ oder Ca²⁺) strömen dann durch die defekte Plasmamembran ins Außenmedium.

Frostempfindliche Pflanzen haben in ihrer Doppellipidmembran mehr gesättigte als ungesättigte Fettsäuren. Wenn die frostempfindlichen Pflanzen eine Kälteakklimatisation durchmachen, steigt die Aktivität von Desaturasen. Dadurch nehmen aber die ungesättigten zu den gesättigten Fettsäuren in der Konzentration zu (Palta et al., 1993), und so können die frostempfindlichen Pflanzen niedrigere Temperaturen vertragen. Ohne Kälteakklimatisation von frostempfindlichen Pflanzen werden unter anderem Thylakoidmembranen der Chloroplasten von Protoplasten durch Kälte und anschließenden Auftauprozess zerstört (Krause et al., 1988). Bei tiefen Temperaturen (bereits ab 15°C) wird die Eigenschaft der Fluidität von den Lipidkomponenten der Plasmamembran von flüssig zu fest verändert (Schopfer und Brennicke, 1999, p. 582).

Gefrierresistente Pflanzen dagegen halten tiefe Temperaturen unter dem Gefrierpunkt aus. Vergleichende Studien zeigen eine Veränderung in der Zusammensetzung der Plasmamembranlipide mit Zunahme der Frostresistenz auch bei gefrierresistenten Pflanzen. Diese Pflanzen akkumulieren in der Akklimatisationsphase chemische Substanzen, die eine Gefrierresistenz bewirken.

So werden lösliche KH wie Mono- und Oligosaccharide, Zuckeralkohole, cyclische Polyole, niedermolekulare Stickstoffverbindungen wie Betaine, Prolin oder Polyamine oder membranständige Proteine in der Zelle angehäuft (Uemura und Steponkus,

1994; Yu und Griffith, 2001). Außerdem nimmt in der Zelle die Konzentration von Suc und RFOs zu und die von Stärke ab (Castillo et al., 1990). Zusätzlich sei erwähnt, dass neben den RFOs (Hincha et al., 2003) auch durch Kälte induzierte Gene (Lee et al., 1999; Shinozaki und Yamaguchi-Shinozaki, 1996) oder Proteine (Koike et al., 1997; Koike et al., 2002) gefunden wurden. Durch die Transkriptionsprodukte der induzierten Gene oder der Proteine kann mitunter einen Frostschutz bewirkt werden.

Durch diese Maßnahme kann entweder der Gefrierpunkt erniedrigt oder der Gefrierprozess in einen extrazellulären Raum verlagert werden. Die Pflanze schützt sich durch eine veränderte Zusammensetzung von gelösten Metaboliten. Die osmotische Eigenschaft verändert sich, da viele lösliche neutrale oder osmotisch aktive Stoffe eingelagert werden (Schopfer und Brennicke, 1999).

Bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes liegt für die Pflanze das Wasser nicht in flüssigem sondern in festem Zustand vor. Dieser Zustand ähnelt der Trockenheit. Für die durch Kälte verursachte Trockenheit muss ein Ausgleich der Osmolarität auf biochemischer Ebene im Cytosol vorhanden sein durch eine erhöhte Teilchenkonzentration. Diesbezüglich wurde auch eine Stabilitätszunahme der membraneingelagerten Proteine bei RFOs mit hohen Polymerisationsgrad festgestellt (Hincha et al., 2003).

Bei Arabidopsis thaliana wurde bei Frost- und Trockenstress ein erhöhter Anteil von Raf und Gol, nicht aber von Sta gemessen. Bei nicht kälteakklimatisierten Pflanzen konnten keine RFOs detektiert werden. Die dafür verantwortlichen Gene der GolS wurden durch Kälte induziert (Taji et al., 2002). Die Pflanze konnte deshalb Trockenheit und Kälte überstehen, weil RFOs als wahrscheinlicher osmotischer Schutz vorhanden waren. Dieser Schutz durch RFOs kann als Anpassung an Kälte angesehen werden (Castillo et al., 1990). Einen Anstieg der Konzentration der RFOs und Zucker mit höheren Polymerisationsgraden konnte in Ajuga reptans in der kälter werdenden Jahreszeit beobachtet werden (Bachmann et al., 1994). GolS wird als Schlüsselenzym bei der RFO Synthese angesehen. Die Transkriptionsrate der GolS Gene und ihre Enzymaktivitäten werden durch niedrige Temperaturen aktiviert (Taji et al., 2002; Sprenger und Keller, 2000; Liu et al., 1998).

Bei Arabidopsis thaliana wurden etwa 7000 Gene mittels DNA-Microarrays

Transkriptionsraten ändern. Dabei wurde u.a. beobachtet, dass Gene für vier Gol-, zwei Raf- und zwei Suc Synthasen Stressinduziert waren (neben dem Gen Zeaxanthin Epoxidase für die ABA Synthese (Seki et al., 2002a).

Möglicherweise werden RFOs bei Kälte oder Kälteeinwirkung als Osmoseschutz in der Zelle produziert. Diese RFOs können dann über das Phloem über die ganze Pflanze verteilt werden. Durch Akkumulation und Anlagerung an die Membran kann die Zelle und somit die ganze Pflanze vor Frostschäden geschützt werden.

3. Abscisinsäure (ABA), ein Phytohormon

3.1 Biosynthese der Abscisinsäure (ABA)

Bei der Biosynthese des Phytohormons (+)1S-Abscisinsäure (ABA), formell ein Sesquiterpen, findet eine Verkürzung der Terpenoide aus der Carotinoidbiosynthese statt. Cis-ABA wird aus all-trans-Violaxanthin, ein Carotinoid, synthetisiert. Violaxanthin wird unter Freisetzung der beiden Endteile zu je 15 C- Atomen (Xanthoxin) und eines Mittelstücks aus 10 C-Atomen (Dialdehydverbindung) oxidativ gespalten (Heß, 1999, p. 239).

Abbildung 1.5: Syntheseweg der Abscisinsäure (ABA) und Kompartimentierung zwischen Plastiden und Cytosol (Seo und Koshiba, 2002). Die Enzyme sind in rot und die Komponenten in schwarz dargestellt.

Die Spaltung der Carotinoidprodukte findet in den Plastiden statt (siehe Abbildung 1.5). Die in der Carotinoidsynthese hergestellten Produkte sind unter anderem Vorstufen der ABA Synthese.

Der erste Schritt der spezifischen ABA Synthese ist eine Epoxidierung von Zeaxanthin über Antheraxanthin zu all-trans-Violaxanthin beides Mal mit Hilfe des Enzyms ZEP (Zeaxanthin Epoxidase). Das all-trans-Violaxanthin wird weiter zu 9-cis- Violaxanthin oder über all-trans-Neoxanthin zu 9′-cis-Neoxanthin umgeformt. Die dabei beteiligten Isomerasen wurden bis jetzt noch nicht identifiziert (Seo und Koshiba, 2002).

Das Enzym NCED (9-cis Epoxycarotenoid Dioxygenase) katalysiert die oxidative Spaltung des 9-cis Isomers der Epoxycarotenoide, wie das 9-cis- Violaxanthin und das 9′-cis-Neoxanthin zum Xanthoxin.

In der Literatur werden zwei Synthesevariationen der ABA diskutiert. Die erste Synthesevariation ist eine selektive oxidative Spaltung (definiert mit der Annahme, dass nur eins der beiden 9-cis-Xanthophylle das Xanthoxin bildet). Die zweite Variante ist eine nicht-selektive Spaltung der beiden Endstücke (mit der Annahme, dass beide der 9-cis-Xanthopylle das Xanthoxin bilden).

Innerhalb der ersten Synthesevariation sind drei verschieden Synthesewege möglich. Einmal ist eine Isomerisierung des 9-cis-Violaxanthins aus dem all-trans- Violaxanthin möglich, oder 9´-cis-Neoxanthin wird über zwei Isomerisationen aus dem all-trans-Violaxanthin über das 9-cis-Violaxanthin gebildet. Der dritte Weg ist, dass 9´-cis-Neoxanthin wieder über zwei Isomerisationen ausgehend vom all-trans- Violaxanthin über all-trans-Neoxanthin synthetisiert wird.

Bei der zweiten Synthesevariation sind nur zwei verschieden Alternativen möglich. All-trans-Violaxanthin kann zum 9-cis-Violaxanthin isomerisiert werden.

Dann entsteht daraus teilweise das 9´-cis-Neoxanthin. Aus beiden 9-cis- Xanthophyllen als Substrat kann dann Xanthoxin entstehen. All-trans-Violaxanthin könnte auch möglicherweise simultan in zwei einzelnen Isomerisationen zum all- trans-Neoxanthin und zum 9-cis-Violaxanthin umgebildet werden (Tayler et al., 2000).

Die nachfolgenden Reaktionen finden im Cytosol statt. Dabei werden drei mögliche Synthesewege vorgeschlagen:

Der erste Weg über ABAld (Abscisinaldehyd) ist wohl der wahrscheinlichste Weg in den Pflanzen, wie man bei der Charakterisierung der AtAO (Arabidopsis Aldehyde Oxidase) zeigen konnte. Sie katalysiert die Oxidation der ABAld zu ABA.

Ein Mitglied der SDR-Familie (short-chain Dehydrogenase/Reduktase) in Arabidopsis thaliana formt Xanthoxin zu ABAld um.

Der zweite Weg verläuft über die Xanthoxinsäure. In dieser Variante wird Xanthoxin vom Enzym AO (Aldehyde Oxidase) zuerst zur Xanthoxinsäure oxidiert und dann durch das Enzym SDR zur ABA umgeformt.

Der dritte mögliche Syntheseweg läuft über das Abscisinalkohol. Dies scheint wohl bei Mutanten von Arabidopsis thaliana ein Weg zu sein, bei denen die Oxidation von ABAld zu ABA mittels AO nicht möglich ist (Seo und Koshiba, 2002).

3.2 Inaktivierung von ABA durch Oxidation oder durch Konjugation

Das freie ABA wird durch Oxidation inaktiviert. Dabei entsteht das instabile 6- hydroxymethyl ABA. Mit ist eine Hydroxylierung zu 8'-Hydroxy-ABA geläufig; das Enzym dazu, die ABA 8'-Hydroxylase, ein P450-Monooxigenase, ist gerade kloniert worden (Kushiro et al., 2004). Dies wandelt sich eventuell spontan in die inaktive Phaseinsäure (PA) und weiter zu in die 4´-Dihydrophaseinsäure (DPA) um.

Eine weitere Möglichkeit der Inaktivierung der ABA ist die Konjugation von Monosacchariden. Die inaktivierte Form ist dann ABA-β-D-Glycosylester (ABA-GE).

Während das aktive ABA im Cytosol gefunden wurde, akkumuliert das ABA-GE in der Vakuole. Die Akkumulation von ABA-GE könnte auch ein Vorrat für die ABA darstellen (Taiz und Zeiger, 2002, p. 542; Zhou et al., 2004).

3.3 Syntheseorte und physiologische Funktion von ABA

Die ABA wird in verschiedenen Stellen innerhalb einer Pflanze synthetisiert und hat als Phytohormon viele verschiedene Funktionen. Darauf wird in den nächsten Kapiteln näher eingegangen.

3.3.1 Syntheseorte der ABA

ABA wird vor allem in Blättern, Wurzeln und reifenden Früchten synthetisiert.

Das Phytohormon wird in die Apoplasten von den produzierenden Zellen ausgeschieden und durch das Phloem und Xylem in die ganze Pflanze verteilt.

3.3.2 Physiologische Funktion und Interaktion von ABA mit anderen Phytohormonen ABA wirkt als Stresshormon. Gegenüber Cytokininen oder Gibberellinen, welche, ganz allgemein, das Zellwachstum anregen, wirkt ABA als Hemmstoff oder Antagonist gegenüber den anderen Phytohormonen (Cytokinin, Gibberelline, Ethylen, Jasmonsäure). ABA ist unter anderem bei der Ausprägung von Knospen- und Samenruhe, der Seneszenz, Dormanz, Stomataschluss und Blattfall beteiligt.

Die Induktion der ABA Synthese ist bei Trockenstress gut untersucht worden.

Nach dem Wegfall des Trockenstresses wird auch die Synthese der ABA reduziert.

Bei der CAM Pflanze Mesembryanthemum crystallinum wurde bei Trockenstress beobachtet, dass die Pflanze eine Umstellung bei der photosynthetischen CO2- Fixierung vom C3-Weg auf den C4-Weg mit Hilfe der ABA durchführt (Mohr und Schopfer, 1992, p. 409).

Behandlungen mit ABA und Suc haben einen synergistischen Effekt auf die myo-Inositol-1-Phosphat Synthase Genexpression (Yoshida et al., 2002). Dieses Enzym scheint für die RFO-Synthese wichtig zu sein (Vorstufe von myo-Inositol).

Bei Behandlungen mit niedriger Temperatur bei Tomaten und Spinat konnte ein 2 bis 3 facher Anstieg der ABA Konzentration festgestellt werden (Lång et al., 1994). Oder durch Applikation von racemischen (±)ABA konnte eine Zunahme der

Frostresistenz bei keimfrei gewachsenen Pflanzen und Zellkulturen der Trespe (Bromus inermis Leyss) bei gleichzeitiger Aktivitätsveränderung in der Proteinsynthese und Genexpression beobachtet werden (Robertson et al., 1994).

Bei Pflanzen die einem Kältestress und/oder einer ABA Applikation ausgesetzt waren, konnte beobachtet werden, dass darunter auch Gene für zwei GolS, zwei für RafS und eine für Suc Synthase bis zu fünffach mal mehr exprimiert wurden (Seki et al., 2002b).

Bei einer ABA Applikation konnte eine Verbesserung der Frostresistenz von Arabidopsis thaliana, bzw. bei Zellkulturen der Trespe (Bromus inermis Leyss) und beim Moos Physcomitrella patens festgestellt werden (Robertson et al., 1994;

Mäntylä et al., 1995; Minami et al., 2003). Ebenso konnte durch eine ABA Applikation eine Zunahme der Frostresistenz beim Weizen beobachtet werden (Veisz et al., 1996).

Durch Kälte und exogenes ABA konnte die Expression der cor Gene (cor, cold-regulated) in Arabidopsis thaliana angeregt werden. Diese Gene wurden auch exprimiert, wenn die Pflanze kälteakklimatisiert war. ABA scheint somit an der Ausprägung der Frostresistenz bei Pflanzen beteiligt zu sein (Gilmour und Thomashow, 1991).

Es bleibt zu klären, ob ABA nicht nur die Expression der cor Gene bei Kälte veranlasst, sondern auch die Transkription für Gene von RFO Enzymen aktiviert oder verstärkt oder gar unterdrückt. Denn ABA und RFOs haben nicht nur eine Aufgabe als Osmoseschutz (Osmoprotection) bei Trockenheit, sondern auch bei Kälte.

Gibt es eine Korrelation zwischen Kälte, ABA und RFOs, um Pflanzen frosttoleranter zu machen?

4. Zielsetzung

Von folgenden Fragestellungen wurde bei dieser Arbeit ausgegangen: Bewirkt ABA als Stresshormon auch in Ajuga reptans eine Steigerung der Frostresistenz, indem es die RFO Gehalte steigert? Hat ABA vielleicht gar keinen Effekt auf die RFO Synthese und somit auf die Frostresistenz der Pflanze? Oder hat das Phytohormon einen positiven Effekt auf die Resistenz gegen Kälte, ohne dabei die RFO Synthese selbst zu beeinflussen?

Es wurden Ajuga reptans Pflanzen unter den zwei definierten Haltungstemperaturen 22°C/22°C (Nacht/Tag) bzw. 3°C/8°C (Nachtabsenkung/Tag) gehalten. Gleichzeitig wurden verschiedene ABA Konzentrationen (0 µM, 10 µM und 100 µM) exogen auf die Blätter appliziert.

Anschließend wurden die RFO Konzentrationen und die Frostresistenz der Blätter gemessen. So wurde der Frage nachgegangen, ob die RFOs die Frostresistenz fördern können.

Zu den zwei wichtigen RFOs, Raf und Ver, wurden ferner die jeweiligen Enzymaktivitäten und die dazugehörige mRNA Konzentrationen (GGT und RafS) gemessen.

II. Material und Methoden

1. Material

1.1 Chemikalien

Alle Chemikalien, Hormone und Zucker wurden von folgenden Firmen bezogen:

Chemikalien:

Duchefa Biochemie, Amsterdam, Niederland; Sigma Aldrich, Buchs, Schweiz; Fluka, Buchs, Schweiz; BioRad Laboratory, Groton, CT, USA; Serva Boehringer,

Mannheim, Deutschland; ICN Biomedicals, Irvine , CA, USA; Pharmacia Biotech AB, Amersham, UK; BioLabs, Beverly, MA, USA

Hormone:

Duchefa Biochemie (BA und 2,4-D); Sigma (ABA) Zucker:

Wako Pure Chemical Industrie, Osaka, Japan (Galactinol); Calbiochem, La Jolla, CA, USA (Raffinose), Sigma (Stachyose), MegaZyme, North Rocks N.S.W., Australien (Verbascose); Fluka (myo-Inositol)

Spezielles Labormaterial:

MoBiTec, Göttingen, Deutschland; Dionex, Sunnyvale, CA, USA; Benson Polymeric Inc., Reno, NV, USA; Semadeni, Ostermundigen, Schweiz; Metrohm, Herisau, Schweiz; Macherey-Nagel, Oensingen, Schweiz; Kodak SA, Renens, Schweiz;

Amersham Bioscience, Amersham, UK 1.2 Primer

Die für die PCR benutzten Primer wurden von der Firma MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland synthetisiert, entsalzt und lyophylisiert versandt.

Die DNA Sequenz der einzelnen Primer sind, wie folgt:

Für die GGT Sonde:

GGT2 fw: GCAAGAGATCTATGGGAGCAC GGT6: AGTCCAGAACACGCTTAATGC Für die RafS Sonde:

3´RS-Kpnl: ACCGCCCCGACCACTCCGGTGACC 5´RS-Xhol: CGGGTCGGATATCGAACGGGAG

1.3 Kulturen von Ajuga reptans L.

1.3.1 Erdkulturen von Ajuga reptans L.

Die Pflanzenstecklinge der Ajuga reptans zur Vermehrung entstammen alle der gleichen Linie ab, damit die gewonnenen Daten homogener sind. Sie wurden in normaler Blumenerde in Minitreibhäusern mit durchsichtigem Plastikdeckel gezogen und verweilten in diesen über die ganze Versuchszeit. Alle Minitreibhäuser kamen zum Heranwachsen der Stecklinge in einen vollklimatisierten Raum (Phytotron).

Darin waren Temperatur, Licht und Luftfeuchtigkeit elektronisch regulierbar.

Nach etwa 2 Monaten bildeten die Stecklinge Ausläufer aus. Danach folgte die Aufteilung in die zwei Temperaturversuchsgruppen, Wärme/Kälte. Ein Teil der Minitreibhäuser blieb im Phytotron bei einer konstanten Wärmeeinstellung von 22°C (warmgehalten), der andere Teil der Minitreibhäuser aus dem Phytotron kam in die Kältekammer bei 3°C in der Nacht und bei 8°C am Tage (kältebehandelt).

Pro Versuchsreihe wurden alle Pflanzen der Stecklingsvermehrung aus ein und demselben Minitreibhaus verwendet.

• Phytotron

Temperatur: 22°C Nacht (8h) und Tag (16h)

Licht: ca. 90 μmol*m^-2*s^-1 (16h), unter dem Plastikdeckel des Minitreibhauses gemessen

Feuchtigkeit: immer 60% relative Luftfeuchtigkeit Gießinterval: zweimal pro Woche

• Kältekammer:

Temperatur: 3°C in der Nacht (12h) und 8°C am Tag (12h)

Licht: ca. 30 μmol*m^-2*s^-1 (12h), unter dem Plastikdeckel des Minitreibhauses gemessen

Feuchtigkeit: immer 60% relative Luftfeuchtigkeit

Gießinterval: einmal pro Woche, da hier weniger Wasser verbraucht wurde.

1.3.2 Kalluskulturen von Ajuga reptans L.

Um Kalluskulturen von Ajuga reptans herzustellen, wurden einige abgeschnittene Stängel von Blättern und einige Wurzelspitzen desinfiziert. Zur Desinfektion wurden die Oberflächen der Pflanzenteile in verdünntes (32% v/v) kommerzielles Bleichmittel (5% w/v Aktiv-Chlor) für 20 min gelegt und danach dreimal mit destilliertem H2O gewaschen (nach Tomás et al., 1992). Die desinfizierten Pflanzenteile wurden als kleine Stücke auf das feste MS Medium pH 5,7 gelegt (4,4 g/L Murashige and Skoog Medium mit 17,11 M D-Saccharose und 15 g/L Phyto-Agar). Das MS Medium enthielt noch zugesetzte Phytohormonderivate: 3,6 µM 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetatsäure, Cytokinin) und 1,6 µM BA (6- Benzylaminopurin, Auxin).

Nach etwa 4 bis 6 Wochen waren kleine Kalluskulturen gewachsen. Die Kalluskulturen erhielten etwa alle 4 Wochen das MS Medium neu und wurden bei 22°C und Dunkelheit gehalten. Zur Kältebehandlung wurden die Kulturen in die Kälte (3°C Nachtabsenkung und 8°C am Tage) gestellt.

1.3.3 Zellsuspenionskulturen von Ajuga reptans L.

Um Zellsuspenionskulturen von Ajuga reptans zu bekommen, wurden einige Kalli aus den ehemals abgeschnittenen Blattstängeln und Wurzelspitzen in kleine Stückchen zerteilt und in das MS Medium pH 5,7 überführt (4,4 g/L Murashige and Skoog Medium mit 17,11 M D-Saccharose, aber ohne Phyto-Agar). Die Phytohormonderivate im flüssigen MS Medium waren in gleicher Konzentration zugesetzt (siehe Abschnitt 2.1.2).

Nach etwa 4 Wochen bildeten sich in dem MS Medium neue Einzelzellen aus den anfänglichen Kalli. Diese Zellsuspenionskulturen erhielten etwa alle 4 Wochen das MS Medium neu und wuchsen bei Raumtemperatur (22°C), in der Dunkelheit und leichtem Schütteln von 100 rpm (rpm, rotation per minute) auf einem Rotationsschüttler heran. Das Schütteln verhinderte das Verklumpen der Zellen miteinander.

Zur Kältebehandlung wurden die Kulturen in die Kälte (3°C Nachtabsenkung und 8°C am Tage) gestellt.

2. Methoden

2.1 Hormonbehandlung mit (±)-Abscisinsäure (ABA)

Es wurde eine geeignete Methode gesucht, ABA auf die Ajuga reptans applizieren zu können. In der Literatur werden verschiedene Methoden genannt.

Entweder wurde das Hormon über die Wurzeln appliziert (Shen et al., 2001; Savoure et al., 1997) oder auf die Blätter gesprüht (Xiong et al., 1999) oder bei Einzelzellkulturen direkt in das flüssige Medium gegeben (Robertson et al., 1994).

Bei diesen Varianten wurde ein rasches Aufnehmen der applizierten ABA über die Wurzel, über das Blatt und bei Einzelzellkulturen gemessen (Becker et al., 2003; Lee und Chen, 1993). Für diese Arbeit wurde das Hormon durch Besprühen auf die Blätter appliziert, damit die ABA in der bestimmten Konzentration auf den Blättern vorlag und nicht durch das Wasser in der Erde verdünnt wurde.

Die in Erde gewachsenen Ajuga reptans Pflanzen, die Kalluskulturen und die Zellsuspensionskulturen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von ABA behandelt.

Die Pflanzen wurden mit ABA besprüht. Dafür wurde ABA in Leitungswasser aus einer Stocklösung gegeben und mit einer Konzentration von 10 und 100 µM an den Ober- und Unterseiten der Blätter besprüht. Bei den Kalluskulturen wurde die ABA mit den Konzentrationen von 1 bis 10 µM in den sich verfestigenden Agar gegeben. Bei den Zellsuspensionskulturen wurde ABA ins flüssige Medium mit den Konzentrationen von 1 bis 10 µM hinzu gegeben.

2.2 Cryosaftmethode zur Gewinnung des Zellsaftes

Mit dieser Methode kann der ganze Zellsaft eines Blattes (etwa 300 mg FG) und von Zellkulturen gewonnen werden (Bachmann et al., 1994).

Das zerkleinerte Blattmaterial von 7 cm² bis ungefähr 16 cm² großen Blättern wurde in einem MoBiTec-Säulchen mit einer Filterfritte (10 μm Porengröße) gegeben. Der Zellsaft wurde durch Schockgefrierung des Pflanzenmaterials in flüssigem Stickstoff, dann Auftauen und anschließendem Zentrifugieren bei 16000 g, 10 min und 4°C gewonnen. Durch die Zentrifugation können die im Zellsaft mit enthaltenen, löslichen KH (Zucker, Zuckeralkohole und cyclische Polyole), aber auch

Ionen und Phenole extrahiert werden. Bei der Zentrifugation bleiben bis zu 80% aller größeren Proteine an der zurückbleibenden Zellwand haften. Die Zentrifugation basiert somit auf dem Größenausschlussprinzip. Da ohne Hemmstoffe oder Puffer gearbeitet wurde, welche die Enzyme inaktivieren könnten, wurde bei maximal 4°C gearbeitet. Der nach der Zentrifugation erhaltene Zellsaft wurde dann entsalzt (siehe Abschnitt 2.4).

Zur Detektion der im Phloem des Blattes transportierten RFOs, bedarf es eines Tricks. Wenn das Blatt abgeschnitten und eine Zeit lang in Leitungswasser gestellt wird, können die RFOs im Phloem nicht weitertransportiert werden und stauen sich im Blatt an. Die RFO Synthese läuft jedoch weiter. Dadurch erhöht sich die Gesamtkonzentration an RFOs (Parpan, 1995; Haab und Keller, 2002). Da in dieser Arbeit aber die Konzentrationen der RFOs von Interesse waren, die eine Frostresistenz im Blatt bewirken, wurden deswegen die RFO Konzentrationen in frisch abgetrennten Blättern bestimmt.

Neben Blättern der Ajuga reptans wurden auch die Kalluskulturen (siehe Abschnitt 2.12) und Zellsuspensionskulturen (siehe Abschnitt 2.13) zur RFO Analyse herangezogen.

2.3 Entsalzung von Cryosäften

Die im Zellsaft (siehe Abschnitt 2.3) mit enthaltenen Ionen und Phenole werden durch die Entsalzung in einem MoBiTec-Säulchen mit einer 10 μm Filterfritte bei einer Zentrifugation von 4000 g, 4 min und 4°C extrahiert. Aufgetragen wurden je 50 µl Probe auf die Säulchen. Die Ionen und Phenole sind sekundäre Faktoren der Enzyme und stören die HPLC Analyse (siehe Abschnitt 2.5).

Die Entsalzung geschieht durch einen starken Kationenaustauscher in Form von HCO2- (70 μl Serdolit CS-2C) und einen Anionenaustauscher in Form von HCO3-

(200 μl Amberlite CG400). Die Hydroxyl-Form von Anionenaustauscher bindet selektiv auch KH, was verhindert werden sollte. Phenole werden durch das unlösliche, quervernetzte Polyvinylpyrrolidon (140 µl PVPP) herausgebunden. Das anschließende Waschen des Säulenmaterials mit Wasser (zweimal mit 325 µl destilliertem H2O) erlaubt das Auswaschen der an den Materialien physikalisch

gebundenen KH. Die entsalzte Probe ist nun 14 fach verdünnt und wird dann für die HPLC Analyse (siehe Abschnitt 2.5) auf eine 28 fache Verdünnung gebracht.

2.4 Messung der RFOs von den Cryosäften und der Enzymassays mittels HPLC

„Dionex“ (System 1):

Die mit Kunstharz bepackte Dionex-Säule (CarboPac^TM PA1; 4x250mm) ist eine Anionenaustauschersäule. Die Säule wurde bei 30°C und einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die positiv geladene Säulenmatrix bindet die unter alkalischen Bedingungen negativ geladenen KH. Die ungeladenen KH werden mit der deprotonierenden NaOH ionisiert (von OH-Gruppen der KH zu O^-- Gruppen). So binden diese unterschiedlich stark an die Säulenmatrix, in Abhängigkeit der Anzahl von O^--Gruppen.

Prinzipiell sind Disaccharide und höhere Oligosaccharide besser deprotonierbar, als Monosaccharide (Ladungsverschiebung innerhalb des Moleküls ist besser möglich). Die Disaccharide und höhere Oligosaccharide eluieren somit auch später wieder von der Säulenmatrix.

NaOH als Laufmittel löst die KH von der Säule. Zusätzlich kann Acetat eingesetzt werden, das die KH noch besser von der Säulenmatrix wieder löst. Acetat konkurriert mit den KH um die Bindungsstellen an der Säulenmatrix (dies ist vor allem zum Ablösen der längeren KH von Bedeutung). Durch einen Gradienten des NaOH ist eine Trennung der KH nach Ladung innerhalb der Säulenmatrix möglich.

Wenn noch Acetat beigemischt wird, verkürzt sich die Retentionszeit (Verweildauer der KH an der Säulenmatrix) erheblich. Kleine KH eluieren vor den Größeren.

Entgasung Helium Entgasung

Pumpe Dionex GP 50

Injektor Dionex ASI 100

Stationäre Phase CarboPac™ PA1 (4x250mm)-Säule mit Vorsäule

Säulentemperatur 30°C

Mobile Phase 100 mM NaOH Lösung mit einem linearen Acetatgradient: von 0 mM bis 120 mM

Flussrate 1,0 ml/min

Detektion PAD (pulsed amperometric detection), DionexED50

Integration Programm Chromeleon

Version 6.50 SP2 Build 968

„Benson“ (System 2):

Die Bensonsäulen (Carbohydrate Ca²⁺; 7,8x300 mm) sind ebenfalls wie die Dionex-Säulen mit Kunstharz bepackt. Das Kunstharz hatte in den Besonsäulen eine Partikelgröße von 8 bis 10 μm. Diese Kunstharzkügelchen sind zu unterschiedlichen Graden quervernetzt. Bei der BC100 Säule zu 8% und bei der BC200 Säule zu 4%.

Diese Quervernetzung bewirkt verschieden große Poren, die ein Größenausschlussprinzip verursachen. Kleine Moleküle werden länger in den Poren zurückgehalten als größere. Zur optimalen Arbeitstemperatur wurden die Säulen auf 90°C geheizt.

Gleichzeitig sind die Bensonsäulen auch eine Kationenaustauscher-Säule, mit ca. 0,1 mM Ca²⁺/Na2-EDTA als Flussmittel kontinuierlich regeneriert. Sie besteht aus sulfoniertem Polystyrol-divenylbenzol Kunstharz, das negativ geladen ist und Ca²⁺

Ionen kovalent gebunden hat. Das Ca²⁺ wiederum bindet so die KH über die in einer Lösung normal vorliegenden deprotonierten OH-Gruppen. So trennen sich die KH nach Größe und auch nach Ladung. Die BC100 Säule ist zum Beispiel fähig, Gal und Glc allein aufgrund der sterischen Stellung einer OH-Gruppe zu trennen.

300 mM NaOH wird nach der Trennung der KH durch die Säulen dazugegeben, um ein sehr basisches Milieu zu erhalten. Dadurch ist der nachgeschaltete Detektor in der Lage, die KH zu oxidieren (ebenso auch bei der Dionex). Die Detektorzelle hat eine Goldelektrode, an der die Hydroxylgruppen der KH oxidiert werden. Der Detektor arbeitet mit der „pulsed amperometric detection method“ (PAD). Diese Methode arbeitet mit drei verschiedenen Potentialen.

Das erste Potential liegt etwa bei 200 mV mit einer Zeit von 500 ms und oxidiert die jeweilige aus der Säule kommende Kohlenhydratfraktion.

Das zweite Potential liegt bei etwa 700 mV mit einer Zeit von 100 ms und „löst“

die oxidierten Kohlenhydrate von der Goldoberfläche.

Das dritte Potential liegt bei etwa –900 mV mit einer Zeit von 100 ms und regeneriert die Elektrodenoberfläche. Danach kehrt die Spannung auf das erste Potential zurück, bereit, die nächste Kohlenhydratfraktion zu oxidieren.

Entgasung Vakuum Entgasung

Pumpe Gynkotek Modell 480

Injektor Gynkotek Gina 50

Stationäre Phase Ca²⁺-Säule

Benson BC100 (7,8x300 mm) mit Vorsäule Benson BC200 (7,8x300 mm) mit Vorsäule

Säulentemperatur 90°C

Mobile Phase H2O mit Ca²⁺/Na2-EDTA, 50mM Flussrate BC100: 0,6 ml/min

BC200: 0,3 ml/min

Nachsäulenzumischung pneumatisch

250 mM NaOH (0,6 ml/min bei der BC100 Säule,

0,3 ml/min bei der BC200 Säule)

Detektion PAD (pulsed amperometric detection)

Integration Programm Chromeleon

Version BC100: 6.40 Build 681

BC200: 6.00 Build 435

Zur RFO Analyse wurden die Zucker Ver (Mr 826,725), Sta (Mr 666,583), Raf (Mr

494,362), Suc (Mr 342,299), Glc (Mr 180,157), Gal (Mr 180,157), Fru (Mr 180,157), das Galactosyl Cyclitol Gol (Mr 342,299) und das cyclische Polyol myo-Inositol (Mr

180,157) mit einer Konzentration von 5 nmol/20μl für die BC100 und BC200 oder mit einer Konzentration von 2,5 nmol/10μl für die DIONEX-HPLC eingesetzt.

2.5 LT50 Methode

Mit dieser Methode wird die Temperatur ermittelt, bei der mindestens 50% der getesteten Individuen (hier: Blätter) an Frost sterben (LT, letale Temperatur).

Abgeschnittene Blätter von Ajuga reptans wurden in einem programmierbaren Frostschrank Frosttemperaturen von -5°C, -10°C, -15°C und -20°C ausgesetzt und danach die Frostresistenz der Blätter über eine Leitfähigkeitsmethode bestimmt (siehe Abschnitt 2.7).

Für die Untersuchung wurden die abgeschnittenen Blätter (n=4) in einen Plastiksack mit einem kleinen Eiskristall gelegt und locker verschlossen, damit noch ein Gasaustausch stattfinden konnte. Der Eiskristall leitet das Gefrieren der evtl.

feuchten Luft im Sack ein und vermeidet eine Unterkühlung.

Der so befüllte Sack wurde nun eine Stunde lang bei -1°C inkubiert, bzw.

akklimatisiert. Anschließend wurde die Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 1°C/h auf die gewünschte Endtemperatur abgesenkt, die dann 3 h konstant blieb.

Der Auftauprozess wurde mit einer Geschwindigkeit von 2°C/h durchgeführt und

endete bei -1°C. Danach wurde der Sack aus dem Frostinkubator entnommen und auf Eis gelegt.

Nach der Frostbehandlung wurde von jedem Blatt die Leitfähigkeit zur Erfassung der Blattschädigung Behandlung mit den vier verschiedenen Frosttemperaturen gemessen. Aus den Ergebnissen der einzelnen Leitfähigkeitsmethode (siehe Abschnitt 2.7) wurde eine Kurve berechnet und daraus die LT50 Temperatur abgelesen.

2.6 Leitfähigkeitsmessung zur Erfassung der Blattschädigung nach LT50 Versuch

Um die Leitfähigkeit einer Ionenlösung zu messen, wird der elektrische Widerstand (R) der Lösung per Konduktometer (Metrohm, Typ 712) gemessen.

Dadurch kann indirekt auf die Leitfähigkeit einer Ionenlösung geschlossen werden.

Die Leitfähigkeit einer Lösung ist umgekehrt proportional zum Widerstand der Lösung und kann mit folgender Formel berechnet werden (Theorie aus der Bedienungsanleitung des Konduktometers):

σ = G * k = 1/R * l/A

σ elektrischer Widerstand (Siemens/cm)

G Leitwert (Siemens)

k Zellkonstante (cm^-1) R elektrischer Widerstand (Ω)

l Abstand Platinenplättchen (cm) A Fläche der Platinenplättchen (cm²)

Die Zellkonstante ist ein Maß für die Empfindlichkeit der Messzelle.

Da die Leitfähigkeit einer Lösung stark temperaturabhängig ist, muss die Messtemperatur immer angegeben werden, ansonsten können Abweichungen von 2 bis 2,5% pro °C auftreten oder es wird direkt auf die Referenztemperatur von 20°C umgerechnet.

Frostschäden bei Pflanzenzellen verursachen eine mechanische Beschädigung der Zellmembran. So kann beim Auftauen der Zellsaft durch die perforierte Membran austreten. Die im Zellsaft befindlichen Ionen erhöhen im umliegenden Milieu die

Zellen mit Frostresistenz haben nach dem Auftauen weitgehend intakte Membranen. So tritt kein oder kaum Zellsaft aus. Im umliegenden Milieu verändert sich die Ionenkonzentration wenig und die dadurch bedingte Leitfähigkeit verändert sich ebenso gering.

Zur Messung mit dem Konduktometer wurde eine Messzelle (Zellkonstante c = 0,89 cm^-1; Messbereich 1 μS/cm bis 100 mS/cm) benutzt. Aus Blättern wurden zwei Rondellen ausgestanzt, die einen Durchmesser von 8 mm hatten. Diese zwei Rondelle (zwei, damit die Messzelle nicht im Grenzbereich misst) wurden in ein Reagenzglas überführt und mit 3 ml dest. H2O aufgefüllt. Die Reagenzgläser wurden je mit einem Gummipropfen verschlossen und 2 h auf einem Rotationsschüttler mit 100 rpm geschüttelt. Somit konnten die Metaboliten und Ionen durch die frostgeschädigten Membranen in das Außenmilieu diffundieren. Die Reagenzgläser wurden auf dem Rotationsschüttler schräg positioniert, damit eine große Wasseroberfläche entsteht. Dabei wurde darauf geachtet, dass kein dest. H20 mit den Gummipropfen in Kontakt kommt, um keine Substanzen daraus auszuwaschen.

Anschließend wurden die Rondelle im Reagenzglas, mit einer Glasmurmel obendrauf, bei 80°C für 10 min erhitzt. Die Glasmurmeln verhinderten ein durchs Erhitzen verursachtes Verdunsten des dest. H20. Das Verdunsten des H2O hätte eine Aufkonzentrierung der Ionen und damit ein Verfälschen der Daten bewirkt. Durch das Erhitzen wurden alle Biomembranen zerstört. Die restlichen Ionen in den Blattzellen diffundierten in das umgebende Milieu aus.

Die Reagenzgläser wurden im Eiswasser für 5 min abgekühlt und danach 2 h auf dem Rotationsschüttler mit 100 rpm geschüttelt. Die Glasmurmeln wurden wieder durch Gummipropfen ersetzt. Nach dem Schütteln wurde die Ionenkonzentration wieder gemessen (in der Einheit μS/cm).

Die erste Messung ergab die Werte für die Frostbehandlung (σFrost) und die zweite Messung ergab die Werte der Leitfähigkeit nach der Totalschädigung (σTotal) der Zellmembran durch Erhitzen.

Aus der Messung σFrost und σTotal lässt sich folgendes Verhältnis berechnen:

σFrost/σTotal * 100% = σ-Verhältnis in %

Wenn die Werte σFrost und σTotal sehr ähnlich waren, lag das σ-Verhältnis nahe bei 100%. Dann wies das Blatt eine hohe Frostschädigung auf. War der Wert σFrost viel kleiner als der Wert Total, so lag das σ-Verhältnis nahe bei 0%. Dieses Blatt wies keine oder nur niedrige Frostschädigung auf.

Mit dieser Methode lässt sich nur eine relative Aussage über die Blattschädigung machen. Wenn aber vor der Frostbehandlung dem Blatt ein Rondell ausgestanzt und die Leitfähigkeit (σBackground) ermittelt und danach vom Wert σFrost

abgezogen wird, kann eine absolute Aussage zur Frostschädigung des Blattes gemacht werden. Dies wurde in folgender Weise gemacht, dass von den Pflanzen gleicher Versuchreihe pro Blatt alle zwei Wochen zwei Rondelle ausgestanzt und nach obigem Verfahren gemessen wurden. Diese Werte wurden als σBackground

angenommen und mit den Werten aus der Messung σFrost und σTotal innerhalb der entsprechenden Versuchswochen verrechnet. Mit diesem Verfahren wurden die absoluten σ-Verhältnisse ermittelt.

Außerdem wurde beim Ausstanzen darauf geachtet, dass im Rondell sich kein oder zumindest kein großes Leitbündel befand. Aus dem Leitbündel könnten noch zusätzliche Ionen von Phloem oder Xylem in das umliegende Milieu austreten und die Werte verfälschen. Es wurde ermittelt, dass das σ-Verhältnis eine viel geringere Streuung aufweist als die σ-Differenz aus σFrost und σTotal (Nötzli, 2003). Besonders wenn Rondelle ohne Leitbündel, anstatt mit Leitbündel, zu Messungen herangezogen wurden.

Ebenso wurde die Erhitzungsdauer ermittelt, ab wann eine Totalschädigung erfolgte. So konnte beobachtet werden, dass spätestens nach 5 min Erhitzung bei 80°C das σ-Verhältnis gegen einen Grenzwert strebte. Eine längere Erhitzungszeit bewirkte kaum eine wesentliche Änderung der Werte vom σ-Verhältnis. So wurde dann die Erhitzungszeit von 10 min übernommen.

Physiologisch zu erwarten sind sigmiud verlaufende Frostresistenzkurven. Je

höheren Frosttemperatur die Schädigungswerte in % geringer ausfallen als bei einer niedrigeren Frosttemperatur, ist dies nur durch Ausreißer in der Messung zu erklären.

Die Fehlerbalken in den Diagrammen sind Standardabweichungen.

2.7 Messung der Raffinosesynthase (RafS) Aktivität und

derGalactan:Galactan-Galactosyltransferase (GGT) Aktivität

Um die Aktivitäten von RafS und GGT zuverlässig zu messen, musste das Pflanzenmaterial für die Enzyme schonend extrahiert werden. Dazu wurde ein optimales Umgebungsmilieu für die RafS und GGT gewählt.

Es wurde in nKat/g FG (Frisch Gewicht) gemessen:

nKat/mg FG = 16,66 x U/g FG U/g FG = nmol/g FG /min 2.7.1 Messung der RafS Enzymaktivität

Das Blatt wurde ohne Mittelrippe zerkleinert und auf genau 200 mg Frischgewicht (FG) abgewogen. Zum Mörsern des Blattmaterials wurde noch etwas Seesand, eine Spatelspitze Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) und 400 μl Extraktionspuffer pH 7,5 in einen auf Eis vorgekühltem Mörser gegeben. Der Extraktionspuffer war aus folgenden Komponenten zusammengesetzt: 50 mM HEPES-KOH pH 7,5 (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-ethansulfonsäure), 2 mM MnCl2, 5 mM MgCl2, 40 mM DTT (1,4-Dithiotreitol), 1 mM Na2-EDTA (Na2- Ethylendiamintetraessigsäure), 2% (w/v) PVP K30 (Polyvinylpyrrolidon), 2% (w/v) PEG 6000 (Polyethylenglycol), 2% (w/v) PVPP, 0.1% (w/v) TRITON X-100 (Polyoxyethylen-p-t-octylphenol) und 1 mM Benzamidin. Jeweils direkt vor Gebrauch wurden noch 50 mM Natrium-Ascorbat dazugegeben.

Das gemörserte Pflanzenmaterial wurde bei 16000 g, 10 min, bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend entsalzt. Zur Entsalzung wurde eine 5 ml Spritze mit 2 porösen (35 μm) Polyethylenfritten und 4 ml Sephadex G-25 fine aufgefüllt und anschließend 2 min bei 1700 g und 4°C zentrifugiert. Dann wurde zweimal mit 2 ml destilliertem H2O gewaschen, jedes mal 2 min bei 1700 g und 4°C zentrifugiert. Zur Messung wurden die Säulchen zweimal mit 2 ml Assaypuffer pH 6,5 voräquilibriert und jedes mal 2 min bei 1700 g und 4°C zentrifugiert. Der Assaypuffer

war wie folgt zusammengesetzt: 50mM MES-NaOH pH 6,5 (N- Morpholinoethansulfonsäure) und 5mM DTT.

Die „Entsalzung“ beruht auf der Trennung nach Größe mit Hilfe der Sephadex G-25 fine. Die Sephadex G-25 Kügelchen bewirken, dass nur kleine Substanzen (Zucker, Phenole, Salze, etc.) in den Zwischenräumen der Kügelchen hängen bleiben und die größeren Substanzen (Enzyme, Proteine) nicht.

100 µl vom Überstand wurden in die Sephadexspritze auf die 4 ml Sephadex G-25 fine überführt und bei 1700 g, 2 min und 4°C zentrifugiert. Der Durchfluss wurde aufgefangen und davon das Volumen bestimmt. Ein Volumenverlust von den 100 µl wurde als Aufkonzentrierung der Proteine angenommen. Anschließend wurde die eigentliche Enzymaktivitätsmessung (mit Doppelbestimmung) mit Kontrolle (mit Doppelbestimmung) durchgeführt. Es wurden 10 μl Gol (Endkonzentration 5 mM), 10 μl Suc (Endkonzentration 50 mM), 20 μl entsalzter Extrakt in ein Eppendorfgefäß pippetiert. Bei der Kontrolle wurde dieser Ansatz direkt mit 10 μl 0,5 M NaOH abgestoppt. Der Reaktionsansatz inkubierte 3 h bei 30°C und wurde danach mit 10 μl 0,5 M NaOH abgestoppt. Anschließend wurden je 50 μl vom Enzymassay und von der Kontrolle entsalzt (siehe Abschnitt 2.4) und je einmal mit 150 μl destilliertem H2O gespült, wobei bei 4°C, 4 min und 4000 g zentrifugiert wurde. Die gebildete Raf wurde mittels HPLC-PAD auf der BC100 gemessen.

2.7.2 Messung der GGT Enzymaktivität

Die Vorbereitung wurde wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 2.6.1) durchgeführt. Bei der Enzymextraktion wurden hier nur 100 mg FG Blattmaterial und nur 300 µl Extraktionspuffer pH 5,0 verwendet. Der Extraktionspuffer war wie folgt zusammengesetzt: 50 mM Natrium-Citrat, 20 mM DTT, 5 mM MgCl2, 2% (g/v) PEG 20`000, 2% (g/v) PVP K30 und frisch dazu: 50 mM Natrium-Ascorbat.

Die Entsalzung fand genau wie oben (siehe Abschnitt 2.6.1) beschrieben statt.

Bei der Sephadexspritze wurde hier 1,5 bis 2 ml Sephadex G50 fine benutzt. Zur Äquilibrierung der Sephadexspritze wurde ein McIllvaine Assaypuffer pH 5,0 benutzt.

Dieser war aus folgenden Komponenten zusammengesetzt: 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M DiNatrium Phosphat.

Anschließend wurde die eigentliche Enzymaktivitätsmessung (mit

dafür 10 μl 100 mM Sta (Endkonzentration 50 mM), 10 μl entsalzter Extrakt in ein Eppendorfgefäß zusammengeführt. Bei der Kontrolle wurde dieser Ansatz direkt mit 5 μl 0,5 M NaOH abgestoppt. Der Reaktionsansatz inkubierte 30 min bei 30°C und wurde danach mit 5 μl 0,5 M NaOH abgestoppt. Anschließend wurden je 25 μl vom Enzymassay und der Kontrolle entsalzt (siehe Abschnitt 2.4) und je einmal mit 90 μl destilliertem H2O gespült, wobei bei 4°C, 4 min und 4000 g zentrifugiert wurde. Die gebildete Ver wurde mittels HPLC-PAD auf der BC200 gemessen.

Wenn negative Enzymaktivitäten in nKat/g FG vorkommen, ist dies auf die mathematische Berechnung zurückzuführen. Es werden von den Enzymaktivitäten der Proben, die Aktivitäten der internen Kontrollen abgezogen. Wenn also die interne Kontrolle eine höhere Aktivität hat, als die Probe, entsteht somit eine rechnerisch negative Aktivität. Diese negative Aktivität ist nicht physiologisch bedingt.

Die „Whiskers“ in den Diagrammbalken der Enzymaktivitäten sind Standardabweichungen.

2.8 RNA Extraktion

Neben den Enzymaktivitäten der RafS und GGT war die Transkription der jeweiligen mRNA von Interesse. Wird aufgrund der Applikation der ABA vermehrt mRNA der für die RFO Synthese wichtigen Enzyme transkribiert? Darüber gibt der belichtete Röntgenfilm des Northern Blots Auskunft. Es wird mit der unten beschriebenen Extraktionsmethode die gesamte mRNA der Zellen aus Blättern gewonnen. Anschließend wird aber mit Hilfe von speziellen Sonden nur die gesuchte mRNA radioaktiv markiert und dadurch identifiziert. Auf einem Röntgenfilm werden durch die mit ³²P markierten Sonden Punkte belichtet. In Abhängigkeit der Intensität der gesuchten RNA, werden die Punkte unterschiedlich groß.

In der Extraktionsmethode wurde wie folgt vorgegangen: Das Blattmaterial (1 g) wurde mittels Mörser und Pistill im flüssigen N2 pulverisiert. Der Mörser und Pistill wurden über Nacht in 5% Natrium-Hypochlorid sterilisiert und danach zweimal autoklaviert, bzw. zwischen den einzelnen Mörserungen zweier Proben immer mit 100% EtOH gereinigt. Das gewonnene Pulver wurde in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt, mit 750 μl TRIzol Reagent versehen und 5 min gemischt. Das Gemisch inkubierte 5 min auf Eis. Darauf wurde in das Eppendorfgefäß 200 µl 100% iges