Modifikation der microRNA-Expression durch
Histonacetylierung im triple-negativen Mammakarzinom
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Luisa Greiwe aus Hannover
Hannover 2018
Mariensee
2. Prof. Dr. Brigitte Schlegelberger
Institut für Humangenetik
Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Heiner Niemann 2. Gutachter: Prof. Dr. Ralph Brehm
Externer Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2018
„Epigenetic regulation of miR-192 and miR-194 in triple-negative breast cancer“
Greiwe, L., Vajen, B., Illig, T., Schlegelberger, B., and Skawran, B. (2017)
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Ziele der Arbeit ... 9
2 Literaturübersicht ... 11
2.1 Das Mammakarzinom ... 11
2.1.1 Unterteilung des Mammakarzinoms ... 11
2.1.2 Therapiemöglichkeiten ... 13
2.1.3 Das kanine Mammakarzinom ... 13
2.2 Epigenetik ... 14
2.2.1 Chromatinorganisation ... 15
2.2.2 Histonacetylierung und -deacetylierung ... 15
2.2.3 Histonacetylierung im Tumor ... 16
2.2.4 Histondeacetylase-Inhibitoren ... 17
2.3 MicroRNAs ... 18
2.3.1 Biogenese und Wirkung von microRNAs ... 19
2.3.2 MicroRNAs in Tumoren ... 21
3 Material und Methoden ... 23
3.1 Zellkultur ... 24
3.1.1 Langzeitlagerung der Zellen ... 24
3.1.2 Passagieren der Zellen ... 24
3.1.3 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Zählkammer ... 25
3.1.4 Behandlung mit Trichostatin A ... 25
3.1.5 Transiente Transfektion mit miRNA-mimics und siRNAs ... 25
3.1.6 Funktionelle Analysen ... 27
3.1.7 Bestimmung der Zellacetylierung ... 29
3.2 Expressionsanalysen ... 29
3.2.1 RNA-Isolation ... 29
3.2.2 Bestimmung der RNA-Konzentration ... 30
3.2.3 cDNA-Synthese... 30
3.2.4 Quantitative Echtzeit-PCR mit TaqmanAssays ... 30
3.2.5 Microarrays ... 32
3.3 Proteinquantifizierung ... 33
3.3.1 Herstellung von Gesamtzelllysaten ... 33
3.3.2 SDS-Polyacrylamidgelektrophorese und Western-Blots ... 33
3.4 Chromatin-Immunpräzipitation ... 35
3.5 Argonaute 2-Immunpräzipitation ... 37
3.6 Sequenzierung ... 39
3.7 Agarosegelelektrophorese ... 39
3.8 Bioinformatische Analysen ... 40
3.8.1 Identifizierung differenziell regulierter miRNAs ... 40
3.8.2 Identifizierung putativer Zielgene ... 40
3.9 Statistik ... 40
4 Ergebnisse ... 42
4.1 HDAC-Expression und Acetylierungsstatus im Mammakarzinom ... 42
4.1.1 HDAC-Expression in öffentlichen Datenbanken ... 43
4.1.2 HDAC-Expression in den verwendeten Zelllinien ... 44
4.1.3 Basale Gesamtacetylierung ... 45
4.1.4 Sequenzierung der triple-negativen Brustkrebszelllinien ... 47
4.2 Behandlung mit dem HDAC-Inhibitor TSA ... 48
4.2.1 Acetylierungsstatus nach TSA-Behandlung ... 48
4.2.2 Funktionelle Analysen nach 24 h TSA-Behandlung ... 50
4.3 Identifizierung epigenetisch regulierter miRNAs ... 51
4.3.1 Analyse von miRNA-Microarrays nach TSA-Behandlung ... 51
4.3.2 Validierung der miRNA-Microarray-Ergebnisse ... 53
4.3.3 Chromatin-Immunpräzipitation ... 54
4.4 Bedeutung von miR-192 und miR-194 im Mammakarzinom ... 55
4.4.1 Funktionelle Effekte der miRNAs ... 55
4.4.2 Einfluss von miR-192 und miR-194 auf das Migrationsverhalten ... 58
4.4.3 Expression von miR-192 und miR-194 in öffentlichen Datenbanken ... 60
4.5 Analyse von mRNA-Microarrays ... 60
4.6 ARHGAP19 ... 63
4.6.1 Validierung der mRNA-Microarray-Ergebnisse von ARHGAP19 ... 63
4.6.2 Überprüfung der direkten Bindung von miR-192 und ARHGAP19 ... 64
4.6.3 Funktionelle Effekte nach ARHGAP19-Knockdown ... 66
4.6.4 ARHGAP19-Expression in öffentlichen Datenbanken ... 68
4.7 MSI2 ... 68
4.7.1 Validierung der mRNA-Microarray-Ergebnisse von MSI2 ... 69
4.7.2 Überprüfung der direkten Bindung von miR-194 und MSI2 ... 70
4.7.3 Funktionelle Effekte nach MSI2-Knockdown ... 71
4.7.4 MSI2-Expression in öffentlichen Datenbanken ... 74
5 Diskussion ... 75
5.1 HDAC-Expression und Acetylierungsstatus in den verwendeten Zelllinien ... 75
5.2 HDAC-Inhibition ... 77
5.3 Epigenetisch regulierte miRNAs ... 78
5.4 Die funktionellen Effekte von miR-192 und miR-194 ... 80
5.5 Analyse der Zielgene ... 82
5.6 ARHGAP19 ... 83
5.7 MSI2 ... 86
5.8 Fazit und Ausblick ... 91
6 Zusammenfassung ... 93
7 Summary ... 95
8 Verzeichnisse ... 97
8.1 Literaturverzeichnis ... 97
8.2 Abkürzungsverzeichnis ... 116
8.3 Abbildungsverzeichnis ... 120
8.4 Tabellenverzeichnis ... 122
9 Anhang ... 123
A.9.1 Zusätzliche Tabellen ... 123
A.9.2 Material ... 126
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1 Einleitung und Ziele der Arbeit
Brustkrebs ist mit einer Inzidenz von über 1,8 Millionen Neuerkrankungen jährlich die zweithäufigste Tumorerkrankung weltweit. Bei Frauen machen Mammatumore mit 1,67 Millionen ein Viertel aller Tumorerkrankungen aus und liegen damit an erster Stelle. Bei den tumorbedingten Todesursachen bei Frauen sind 14 % auf Brustkrebs zurückzuführen (Ferlay et al., 2015).
Bei triple-negativen Mammakarzinomen sind keine spezifischen Rezeptoren nachweisbar. Die Therapie gestaltet sich deswegen schwieriger und Patientinnen haben eine schlechtere Prognose im Vergleich zu Patientinnen, bei deren Mammakarzinomen spezifische Rezeptoren nachweisbar sind. Neben der Operation wird therapeutisch meist eine, mit vielen Nebenwirkungen einhergehende, Chemotherapie eingesetzt (Abramson et al., 2015). Es ist nötig, für diese heterogene Gruppe von Tumoren, weitere Therapieoptionen zu ermitteln.
Zwischen dem kaninen und dem humanen Mammakarzinom bestehen große Ähnlichkeiten, sowohl in der Klinik und der Pathologie, als auch im Verhalten und der Prognose (Abadie et al., 2017; Nguyen et al., 2017). So wie der Hund als Modell für das Mammakarzinom für den Menschen verwendet werden kann, können auch einige Erkenntnisse aus der humanen Forschung auf den Hund übertragen werden.
Bei der Krebsentstehung spielen nicht nur chromosomale Mutationen eine wichtige Rolle, sondern auch die veränderte Genexpression (Perri et al., 2017). Die Expression wird durch epigenetische Mechanismen, wie die Histonacetylierung, beeinflusst. Der Verlust der Acetylierung bewirkt eine starke Chromatinkondensation und damit eine verminderte Transkriptionsaktivität der betroffenen Bereiche. Die Entfernung des Acetylrestes erfolgt durch Histondeacetylasen. Diese Histondeacetylasen sind in vielen Tumoren, wie auch in Mammakarzinomen, überexprimiert (Huang et al., 2005;
Ververis and Karagiannis, 2012; Wilson et al., 2006). Die Histonacetylierung reguliert neben der Genexpression unter anderem auch die Expression von microRNAs (miRNAs) (Ali et al., 2015).
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MiRNAs sind kurze, nicht-kodierende RNAs, die einen starken Einfluss auf die Genexpression haben. Sie bewirken eine spezifische Reduktion der mRNA auf post- transkriptionaler Ebene und steuern so Prozesse wie Differenzierung, Proliferation und Apoptose. Die Expression von miRNAs ist in vielen Tumoren dereguliert, und sie können somit an der Krebsentstehung beteiligt sein (Tuna et al., 2015).
Ziel dieser Arbeit war es, miRNAs zu ermitteln, die durch Histonacetylierung reguliert werden. Dafür wurden verschiedene triple-negative Brustkrebszelllinien und eine Nichttumorzelllinie mit dem Histondeacetylase-Inhibitor Trichostatin A behandelt.
Mittels miRNA-Microarrays wurden epigenetisch regulierte miRNAs identifiziert und deren Einfluss auf die Zellviabilität, Apoptoserate und das Migrationsverhalten der Zellen betrachtet.
Welche Gene durch die miRNAs beeinflusst werden und wodurch die Wirkungen auf die Zelllinien bedingt sind, ist häufig unbekannt. Deswegen wurden putative Zielgene der untersuchten miRNAs identifiziert. Es sollte der Anteil der interessierenden Gene an der Wirkung der miRNAs analysiert werden. Dafür wurden nach Herunterregulation der Gene die Zellviabilität, Apoptoserate und das Migrationsverhalten der Brustkrebszellen untersucht.
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2 Literaturübersicht
2.1 Das Mammakarzinom
Mammakarzinome sind die häufigste Tumorerkrankung der Frau und zeichnen sich durch inter- und intratumorale Heterogenität in der Histopathologie und der molekularen Klassifikation aus (Turashvili and Brogi, 2017). Auch in der Ansprechbarkeit auf die Therapie und die Prognose bestehen große Diskrepanzen.
Dieses Kapitel soll eine Übersicht über die Möglichkeiten der Unterteilung des Mammakarzinoms geben sowie die verschiedenen Therapieoptionen. Weiterhin wird das kanine Mammakarzinom beschrieben, mit Fokus auf Gemeinsamkeiten und Unterschiede zu dem Mammakarzinom der Frau.
2.1.1 Unterteilung des Mammakarzinoms
Das Mammakarzinom kann immunhistochemisch nach dem Rezeptorstatus eingeteilt werden, es werden die Expression von Estrogen- und Progesteronrezeptor und die Amplifikation des Wachstumsfaktorrezeptors HER2 betrachtet. Wird keiner dieser Rezeptoren nachgewiesen, spricht man vom dreifach negativen Mammakarzinom (triple-negatives Mammakarzinom = TNBC). Ungefähr 10-20 % der primären Mammakarzinome gehören zu dieser Gruppe (Morris et al., 2007).
Seit ungefähr 15 Jahren wird die Einteilung des Mammakarzinoms nach molekularen Subtypen als eine weitere Methode zur Klassifizierung dieser heterogenen Krankheit genutzt. Demnach sind es fünf Gruppen: Luminal A, Luminal B, HER2, Basal-like und Normal-Breast-Like (Perou et al., 2000; Sørlie et al., 2001). Auch diese Gruppierung hat noch Lücken, da innerhalb der Gruppen noch Diskrepanzen zwischen Prognose und Therapie bestehen. Ungefähr 80 % der triple-negativen Tumore decken sich mit der molekularen Gruppe Basal-like (Cakir et al., 2012; Goldhirsch et al., 2011).
Tumore des Basal-like-Subtyps treten häufiger bei jüngeren Patientinnen auf und haben eine schlechte Prognose (Cakir et al., 2012; Carey et al., 2006; Humberto Parada, 2017).
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Die Gruppe der TNBC lässt sich nach Lehmann et al. (2011) durch Genexpressionsanalysen in sechs Untergruppen einteilen: in zwei basale Subtypen (basal-like 1 und basal-like 2), in den immunmodulatorischen Subtyp (immunomodulatory), den mesenchymalen Subtyp (mesenchymal), den mesenchymal-Stammzellen-ähnlichen Subtyp (mesenchymal stem-like) und den luminaler-Androgenrezeptor-ähnlichen Subtyp (luminal androgen receptor). Bei den basalen Subtypen ist eine erhöhte Expression von Genen festzustellen, die an der Zellzyklusregulation und DNA-Reparatur beteiligt sind. Der immunmodulatorische Subtyp zeichnet sich durch eine Aktivierung von Immunzellprozessen aus. Bei den mesenchymalen- und mesenchymal-Stammzellen-ähnlichen Subtypen sind beispielsweise Gene angereichert, die im Zusammenhang mit Zellmotilität und Zelldifferenzierung stehen. Beim luminalen-Androgenrezeptor-ähnlichen Subtyp ist die Expression des Androgenrezeptors erhöht (Lehmann et al., 2011).
Ungefähr 5-10 % der primären Mammakarzinome sind erblich bedingt, wovon sich die meisten davon auf eine pathogene Variante in einem der Tumorsuppressorgene BRCA1, DNA repair associated (BRCA1) oder BRCA2, DNA repair associated (BRCA2) zurückführen lassen (Slavin et al., 2017). Aber auch andere Gene, wie ATM serine/threonine kinase (ATM), BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1 (BRIP1), Cadherin 1 (CDH1), Checkpoint kinase 1 (CHEK1), Fanconi anemia complementation group C (FANCC), Fanconi anemia complementation group M (FANCM), Nibrin (NBN), Partner and localizer of BRCA2 (PALB2), Phosphatase and tensin homolog (PTEN), RAD51 paralog C (RAD51C), RAD51 paralog D (RAD51D) und Tumorprotein 53 (TP53), stehen im Zusammenhang mit einem erhöhten Brustkrebsrisiko (Frey et al., 2017; Lalloo and Evans, 2012). Bei Frauen, die eine pathogene Variante in BRCA1-/BRCA2 tragen, besteht ein erhöhtes Risiko an Mammakarzinomen zu erkranken (Couch et al., 2013; Gaudet et al., 2013). Die Wahrscheinlichkeit liegt bis zum 70. Lebensjahr bei pathogenen Varianten in BRCA1 bei 55-85 % und bei pathogenen Varianten in BRCA2 bei 35-60 % (Chandler et al., 2016). Diese Tumorsuppressoren wirken über ihre Beteiligung an der DNA-Reparatur und treten häufig zusammen mit pathogenen Varianten in TP53 sowie bei rezeptornegativen Mammakarzinomen auf (Lord and Ashworth, 2016).
13 2.1.2 Therapiemöglichkeiten
Die Therapie des Mammakarzinoms setzt sich, wie man dem Leitlinienprogramm Onkologie für Mammakarzinome entnehmen kann, meist aus der Kombination verschiedener Teilschritte zusammen. Sie ist im Wesentlichen abhängig vom Alter und Gesundheitsstatus der Patientin sowie der Klassifikation des Tumors. Die Operation ist eine wichtige Komponente, welcher häufig eine Chemotherapie vorangeht, die sogenannte neoadjuvante Therapie. Postoperativ schließt sich, wenn sinnvoll, eine Radiotherapie an. Je nach Tumor erfolgt schließlich eine systemische adjuvante Therapie, wobei die endokrine Therapie, die Chemo- und die Antikörpertherapie zu unterscheiden sind. Bei Patientinnen mit estrogen- und/oder progesteronrezeptor- positiven Tumoren werden endokrine Therapien mit Tamoxifen oder Aromataseinhibitoren verwendet. Adjuvante Chemotherapeutika, wie Taxane und Anthrazykline, sind z.B. indiziert bei HER2-positiven oder triple-negativen Tumoren.
Bei HER2-überexprimierenden Tumoren wird teilweise eine Antikörpertherapie mit Trastuzumab eingesetzt. Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP)-Inhibitoren sind eine recht neue Gruppe von Medikamenten und werden bei Tumoren mit einer nachgewiesenen pathogenen Variante in BRCA1 oder BRCA2 eingesetzt (http://www.leitlinienprogramm-onkologie.de/leitlinien/mammakarzinom/).
Die Therapie von triple-negativen Mammakarzinomen ist bis jetzt recht eingeschränkt und die eingesetzten Chemotherapeutika führen zu vielen Nebenwirkungen (Abramson et al., 2015). Momentan befinden sich jedoch Medikamente zur gezielten Krebstherapie in klinischen Studien (Vidula and Bardia, 2017). Insbesondere die Inhibition des Androgenrezeptors zeigt sich als eine vielversprechende Option der Therapie des TNBCs, ebenso wie der Einsatz von Proteinkinase B (AKT)-Inhibitoren (Kim et al., 2017; Traina et al., 2015).
2.1.3 Das kanine Mammakarzinom
Bei der Hündin ist das Mammakarzinom, wie bei der Frau, die häufigste Tumorerkrankung (Davis and Ostrander, 2014). Der Estrogen-, Progesteron- und HER2-Rezeptornachweis dient ebenfalls der Klassifikation dieser Tumoren (Mulas et al., 2005). Die Einteilung in die Subtypen Luminal A, Luminal B, HER2 und Basal ist
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auch möglich (Gama et al., 2008). Bei beiden Spezies sind gleiche Onkogene überexprimiert oder amplifiziert, Tumorsuppressoren unterexprimiert, deletiert oder mutiert sowie die gleichen Signalwege verändert (Liu et al., 2014a). Pathogene Varianten in den Tumorsuppressorgenen BRCA1 und BRCA2 sind auch beim Hund mit einem höheren Mammakarzinomrisiko assoziiert (Borge et al., 2011; Enginler et al., 2014; Rivera et al., 2009). Weitere Parallelen sind beispielsweise die Überexpression des Insulin-like growth factor 1-Rezeptors (Jaillardon et al., 2015) und die bessere Prognose estrogenrezeptorpositiver Tumore (Gama et al., 2008; Nguyen et al., 2017). Bei der Analyse differenziell exprimierter miRNAs gibt es ebenfalls Übereinstimmungen. So sind beispielsweise im Mammakarzinom von Mensch und Hund im Vergleich zum normalen Mammagewebe miR-15a und miR-16 vermindert exprimiert und miR-21 und miR-29b überexprimiert. MiR-15a und miR-16 sind in humanen Tumoren als tumorsuppressiv wirkend beschrieben, während miR-21 und miR-29b als onkogen wirkend im humanen Mammakarzinom gelten (Boggs et al., 2008). Die Parallelen zwischen dem humanen und kaninen Mammakarzinom zeigen, dass es möglich ist, Erkenntnisse zwischen der humanmedizinischen und veterinärmedizischen Forschung zu übertragen.
2.2 Epigenetik
Die Epigenetik beschäftigt sich mit der strukturellen Anpassung chromosomaler Bereiche zur Erfassung, Signalisierung und Konservierung veränderter Aktivitäten (Bird, 2007). Es werden Faktoren betrachtet, die die Genexpression beeinflussen ohne dabei die Sequenz zu verändern (Aguilera et al., 2010). Epigenetische Mechanismen sind für die normale Entwicklung und Differenzierung von Geweben notwendig. Sie können jedoch auch zu malignen Entartungen von Zellen führen (Fraga et al., 2005a;
Sharma et al., 2010). Zu den epigenetischen Mechanismen gehören neben der DNA- Methylierung, Histonvariationen und -modifikationen, Nukleosom-Umstrukturierung auch nicht-kodierende RNAs wie z.B. miRNAs (You and Jones, 2012).
15 2.2.1 Chromatinorganisation
Die DNA ist im Zellkern mit speziellen Proteinen, den Histonen, als Chromatin verpackt. 147 Basenpaare der DNA sind um ein Histonoktamer, bestehend aus jeweils zwei der Histonproteine H2A, H2B, H3 und H4, gewickelt und bilden damit ein Nukleosom. Das Linker Histon H1 bewirkt eine Stabilisierung der DNA in ihrer Position um die Histone sowie eine starke Aufspiralisierung und damit eine kompaktere Struktur des Chromatins (Cutter and Hayes, 2015).
Die Organisation des Chromatins ist unerlässlich zur Verpackung der DNA im Zellkern und zur Gewährleistung einer regionalen Erreichbarkeit des Chromatins. Nach der Replikation ist eine korrekte Wiederanordnung der Nukleosomen nötig und zur DNA- Reparatur eine komplette Zugänglichkeit aller Basenpaare (Clapier and Cairns, 2009).
Die kompakte Organisation des Chromatins verhindert die Bindung von DNA- bindenden Proteinen und verbirgt regulatorische DNA-Sequenzen. Durch epigenetische Mechanismen kann die Chromatinstruktur regional, im Wesentlichen in ihrer Kompaktheit und Erreichbarkeit, beeinflusst werden (Sharma et al., 2010). Durch die veränderliche Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie kann die Genexpression geregelt werden (Clapier and Cairns, 2009).
Eine bessere Erreichbarkeit des Chromatins wird z.B. durch posttranslationale Histonmodifikationen und das Lösen der DNA von den Histonoktameren ermöglicht, diese können dann ihre Position zur DNA verändern (Längst and Manelyte, 2015). Zu den Histonmodifikationen gehören beispielsweise Acetylierung, Phosphorylierung, Methylierung, Ubiquitinylierung und die Sumolyierung (Bannister and Kouzarides, 2011).
2.2.2 Histonacetylierung und -deacetylierung
Die posttranslationale Modifikation der Histonacetylierung findet an den ε- Aminogruppen der Lysinreste im N-terminalen Bereich statt. Dieser Vorgang ist reversibel, Histonacetyltransferasen (HATs) bewirken eine Acetylierung und die Deacetylierung erfolgt durch Histondeacetylasen (HDACs) (Seto and Yoshida, 2014).
Durch die Acetylierung können Nukleosomen-Anordnung und Faltung des Chromatins beeinflusst werden. Die positiv geladenen, basischen Seitenketten der Aminosäuren
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der Histone ziehen die negativ geladene DNA an. Die Acetylierung der Lysinreste reduziert die positive Ladung und führt so zu einer lockereren Konfiguration des Chromatins und ermöglicht so eine vermehrte Genexpression (Shahbazian and Grunstein, 2007). Außerdem fungieren die acetylierten Histone als Bindungsstellen für Aktivatoren der Transkription (Haberland et al., 2009). Eine schematische Darstellung ist in Abbildung 2.1 dargestellt.
Abbildung 2.1 Histonacetylierung und -deacetylierung
Die Acetylierung der Lysinreste erfolgt durch Histonacetyltransferasen (HATs) und resultiert in einer offenen Chromatinstruktur. Dadurch ist eine vermehrte Transkription möglich. Histondeacetylasen (HDACs) reduzieren die Acetylierung der Histone und somit die Transkription (Verändert nach Rodd et al., 2012)
2.2.3 Histonacetylierung im Tumor
Die Histonacetylierung hat große Bedeutung bei der Chromatinorganisation und Genexpression und wird in gesunden Zellen durch eine ausgewogene Aktivität von HATs und HDACs reguliert. Die Balance von Acetylierung und Deacetylierung ist in verschiedenen Krankheiten häufig verändert (Parbin et al., 2014). So ist beispielsweise in diversen Tumorarten eine Hypoacetylierung von Lysin 16 des Histons H4
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festzustellen (Fraga et al., 2005b). Eine Überexpression von HDACs, welche in einigen Tumorentitäten festzustellen ist, geht häufig mit einer schlechten Prognose für die Patienten einher (Esteller, 2007; Schrump, 2009). Im Mammakarzinom korreliert die erhöhte HDAC-Expression mit einer signifikanten Reduktion der Estrogen- und Progesteronrezeptorexpression (Sulaiman et al., 2016). Die HDAC-Überexpression führt zu einer verminderten Acetylierung in bestimmten Bereichen und damit durch eine kompaktere Chromatinstruktur zu einer reduzierten Transkription verschiedener Gene und miRNAs. So kann auch die Expression von Tumorsuppressorgenen vermindert sein (Perri et al., 2017).
Abgesehen von der erhöhten Expression können HDACs beispielsweise bei Leukämien durch onkogene Fusionsproteine zu spezifischen Promotern geleitet werden und so die Expression beeinflussen (Wang et al., 1998). Die bisher 18 bekannten HDACs werden in vier Klassen eingeteilt (Seto and Yoshida, 2014). Sie werden in verschiedenen Geweben unterschiedlich stark exprimiert und unterscheiden sich in ihrer Lokalisation innerhalb der Zellen. Einige sind mehr im Nukleus vorhanden, andere vorwiegend im Zytoplasma (Hull et al., 2016). Die HDACs sind unterschiedlich an diversen biologischen Prozessen beteiligt, unter anderem an der Signaltransduktion, der Zellmotilität, der Deacetylierung verschiedender Substrate und der DNA-Reparatur (Hull et al., 2016). HDACs scheinen für das Überleben und das Wachstum von Tumorzellen nötig zu sein und bieten somit einen Weg in der Tumortherapie (Falkenberg and Johnstone, 2014).
2.2.4 Histondeacetylase-Inhibitoren
Der Knockdown von HDACs in verschiedenen Tumorentitäten wirkt sich tumorsuppressiv aus, so ist unter anderem die Proliferationsrate reduziert und die Apoptoserate steigt an (Schrump, 2009). Die Hemmung der HDACs kann durch Histondeacetylase-Inhibitoren (HDAC-Inhibitoren) erfolgen. Der Einsatz führt in Tumorzellen zu einer erhöhten Apoptoserate, einer Hemmung der Angiogenese und beeinflusst das Zellwachstum sowie die Differenzierung (Hull et al., 2016). HDAC- Inhibitoren wirken unter anderem durch die Hyperacetylierung von Histonen und führen durch eine gelockerte Chromatinstruktur zu einer transkriptionellen Aktivierung.
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Allerdings können sie auch andere Proteine beeinflussen wie strukturelle Proteine und DNA-bindende Transkriptionsfaktoren. Die tumorsuppressive Wirkung kann also auf verschiedene Weise verlaufen. Weiterhin kann auch die Expression von nicht- kodierenden RNAs durch HDAC-Hemmer beeinflusst werden (Eckschlager et al., 2017).
HDAC-Inhibitoren variieren in ihrer Spezifität für ihr Ziel, ihrer Pharmakokinetik und ihrer Aktivität. Die meisten HDAC-Inhibitoren sind nicht sehr selektiv und hemmen diverse HDACs. Somit ist nicht immer zu sagen, ob die Effekte auf der Hemmung nur einer bestimmten HDAC resultiert, auf der Kombination mehrerer HDACs oder anderer Proteine (Falkenberg and Johnstone, 2014). In klinischen Studien zeigten sich bei Anwendung am Patienten Nebenwirkungen, die jedoch nicht schwerwiegend waren (Garmpis et al., 2017). Trotzdem zeigen HDAC-Inhibitoren viel Potential für die Therapie von Tumoren und werden in der Therapie von Neoplasien eingesetzt.
Vorinostat, Romidepsin sowie Belinostat sind zur Therapie von T-Zell-Lymphomen und Panobinostat für das Multiple Myelom zugelassen (Eckschlager et al., 2017). In vorklinischen Studien zeigte beispielsweise der HDAC-Inhibitor Vorinostat eine positive Wirkung gegen Mammatumore und der HDAC-Inhibitor Entinostat befindet sich in klinischen Studien für die Therapie des Mammakarzinoms (Eckschlager et al., 2017; Min et al., 2015).
2.3 MicroRNAs
Protein-kodierende Sequenzen machen im Genom von Eukaryoten ungefähr 2 % des transkribierten Genoms aus, aber auch die nichtkodierenden Sequenzen erfüllen viele Funktionen (Liu et al., 2013). Die synthetisierten, nichtkodierenden RNAs (ncRNAS) sind in kurze nichtkodierende RNAs und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) unterteilbar (Peschansky and Wahlestedt, 2014). Zur ersten Gruppe gehören auch die
~22 Nukleotide langen microRNAs (miRNAs), welche die Genexpression posttranskriptional regulieren können.
19 2.3.1 Biogenese und Wirkung von microRNAs
MicroRNA-Gene sind überall im Genom lokalisiert: beispielsweise im Intron oder der 3‘UTR von proteinkodierenden Genen oder lncRNA-Transkripten, teilweise überschneiden sie sich mit den Exonen von lncRNAs oder liegen sowohl im Intron als auch im Exon (Hammond, 2015; Rodriguez et al., 2004). Ihre Biogenese wird über einen speziellen Promoter oder gemeinsam mit dem Gen, in dem sie liegen (host gene), reguliert (García-López et al., 2013). Manche miRNAs sind in Clustern lokalisiert und werden koexprimiert (Bhaskaran and Mohan, 2014).
Die Transkription der miRNAs erfolgt mit der RNA-Polymerase II und das entstehende Primärtranskript wird als pri-miRNA bezeichnet. Es ist mehrere hundert Nukleotide lang, mit einem Poly-A-Schwanz am 3'-Ende sowie ein 7-Methylguanosin-Cap am 5'- Ende versehen, und lagert sich zu einer Schleife zusammen (Bhaskaran and Mohan, 2014; García-López et al., 2013). Die pri-miRNAs werden mit Hilfe eines Mikroproteinkomplexes, bestehend aus der RNAse III Drosha und dem doppelsträngige RNA-Bindeprotein DGCR8, im Nukleus zu Vorläufer-miRNAs (pre- miRNAs) prozessiert (Bhaskaran and Mohan, 2014; Hammond, 2015). Diese doppelsträngigen RNAs bilden eine typische Haarnadelstruktur und werden mit Exportin 5 in das Zytoplasma geschleust. Dort werden sie durch das RNase-III-Enzym Dicer, mit Hilfe des RNA-bindenden Proteins TRBP, in 18-23 Nukleotide lange doppelsträngige RNAs geschnitten, die dann zu reifen miRNAs vereinzelt werden (Bhaskaran and Mohan, 2014; García-López et al., 2013). Von den beiden resultierenden Stränge wird der eine vom 5‘-Ende „5p“ genannt und der andere „3p“.
Meist wird der eine degradiert und nur der Leitstrang verbleibt (Hammond, 2015). In Abbildung 2.2 ist die miRNA-Biosynthese schematisch dargestellt.
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Abbildung 2.2 Biogenese von miRNAs
MicroRNA-Gene werden durch die RNA-Polymerase II (RNA pol II) als primäre Transkripte (pri-miRNAs) transkribiert und mit der RNAse III Drosha und dem Bindeprotein DGCR8 zu Vorläufer-miRNAs (pre- miRNAs) prozessiert. Diese werden durch Exportin 5 (Exp 5) ins Zytoplasma transportiert und dort von dem RNase-III-Enzym Dicer mit dem RNA-bindenden Protein TRBP zu doppelsträngigen RNAs geschnitten, welche nach Vereinzelung die reifen miRNAs (mature miRNAs) werden (verändert nach Asgari, 2011).
Die reife miRNA wird in einen Ribonukleoproteinkomplex aufgenommen, welcher unter anderem das Protein Argonaute 2 (AGO2) enthält. Dieser RNA-induced silencing complex (RISC) bewirkt eine posttranskriptionale Repression durch komplementäre
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Bindung an die 3’UTR der Ziel-mRNA (Hammond, 2015). Bei kanonischen Bindungsmotiven liegt eine Komplementarität der Basen 2-7 des 5‘-Endes der miRNA, der sogenannten Seed-Sequenz, vor (Lewis et al., 2003). Erhöht wird die Regulation durch Komplementarität der Nukleotide 1 und / oder 8 oder einem A gegenüber von Nukleotid 1 (Bartel, 2009). Die Bindung der miRNA führt zu Degradation und zur translationalen Hemmung der Ziel-mRNA (Mott and Mohr, 2015; Werfel et al., 2017).
Da nur eine partielle Komplementarität ausreichend sein kann und das auch nur über eine kurze Sequenz, ist es nicht leicht, Zielgene von miRNAs zu identifizieren. Eine miRNA kann hunderte von mRNAs regulieren und viele mRNAs werden von vielen miRNAs reguliert (Bartel, 2009; Friedman et al., 2009).
2.3.2 MicroRNAs in Tumoren
Die Expression von miRNAs ist in vielen Tumoren im Vergleich zum normalen Gewebe verändert und häufig ist eine insgesamt verminderte miRNA-Expression zu sehen.
Einige Expressionsprofile sind spezifisch für Neoplasien gleichen Ursprungs und den Grad der Differenzierung (Lu et al., 2005; Volinia et al., 2006). Ursächlich für die veränderte Expression können epigenetische Mechanismen, unter anderem eine verminderte Histonacetylierung, sein (Bandres et al., 2009).
Auch in Mammakarzinomen sind regelmäßig einige miRNAs besonders stark exprimiert, andere vermindert exprimiert (Tsai et al., 2018). Die molekularen Subtypen lassen sich teilweise durch differenzielle miRNA-Expression klassifizieren (Blenkiron et al., 2007). Abgesehen von der Möglichkeit, Tumore durch miRNA- Expressionsprofile zu klassifizieren, besteht auch die Möglichkeit miRNAs zur Therapie von Krankheiten einzusetzen. MiRNAs regulieren die Expression von Genen und können so in metabolische und zelluläre Signalwege einwirken. Sie können dadurch Proliferation, Differenzierung und das Überleben von Zellen beeinflussen (MacFarlane and Murphy, 2010). TNBC und auch andere Tumoren werden häufig chemotherapeutisch bekämpft; dabei sind die starken Nebenwirkungen eine zu verbessernde Problematik. Die zielgerichtete Therapie unter Einsatz von künstlich synthetisierten miRNAs (miRNA-mimics) oder miRNA inhibierenden Molekülen bietet die Möglichkeit die gängigen Behandlungsmethoden zu unterstützen oder im Idealfall
22
zu ersetzen (Petrovic and Ergun, 2018). In klinischen Studien wurden bereits miRNAs, mit teilweise erfolgsversprechenden Resultaten, getestet (Reid et al., 2016).
Sogenannte TargomiRs zeigten sich positiv in der Therapie von Pleuramesotheliomen, wobei es sich nur um eine kleine Patientenkohorte handelte und weitere Untersuchungen noch nötig sind (Zandwijk et al., 2017).
In Tumoren können miRNAs onkogen oder tumorsuppressiv wirken, in dem sie die Expression von Tumorsuppressorgenen bzw. Onkogenen vermindern. Häufig sind onkogene miRNAs (Onkomirs) in Tumoren überexprimiert und tumorsuppressive miRNAs sind geringer exprimiert (Svoronos et al., 2016). Während eine miRNA in manchen Tumorentitäten als Onkomir fungiert, wirkt sie woanders vielleicht tumorsuppressiv. Dies ist durch die Regulierung verschiedener mRNAs durch eine miRNA zu erklären (Calin and Croce, 2006; Robb et al., 2017; Sun et al., 2013).
Eine miRNA reguliert die Expression vieler mRNAs, ein großer Teil davon ist bis jetzt unbekannt (Robb et al., 2017). So kennt man auch viele Funktionen von miRNAs noch nicht. Um das Verhalten von Tumoren besser einschätzen zu können und gezielte Therapien zu ermöglichen, ist es wichtig, detailliertere Kenntnisse über die Ziel- mRNAs und die Wirkungsweisen von miRNAs zu erlangen.
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3 Material und Methoden
In diesem Teil werden die angewendeten Methoden erläutert. Die verwendeten Materialien sind im Anhang aufgeführt. Es wurden nicht sämtliche Methoden mit allen verwendeten Zelllinien durchgeführt. Ursächlich ist dafür, dass nicht alle Methoden mit allen Zelllinien etabliert wurden. Weiterhin waren einige Untersuchungen für die Nichttumorzelllinie MCF12A nicht relevant und wurden mit einer oder mehreren der drei verwendeten Brustkrebszelllinien HCC38, HCC1395 und HCC1937 durchgeführt.
Nachfolgende Tabelle dient der Übersicht über verwendete Methoden:
Methode MCF12A HCC38 HCC1395 HCC1937
HDAC-Expression X X X X
Acetylierung und Viabilität unbehandelte Zellen
X X X X
Sequenzierung X X X
Zellviabilität, Apoptoserate und Acetylierung nach TSA-Behandlung
X X X X
Analyse miRNA-Microarrays nach TSA-Behandlung
X X X
miRNA-/lncRNA-Expression X X X X
Analyse mRNA-Microarrays nach TSA-Behandlung
X X X
Analyse mRNA-Microarrays nach transienter miRNA-Transfektion
X X
ARHGAP19-/MSI2-Expression X X X
Transwell-Migration-Assay X
Chromatin-Immunpräzipitation X
Argonaute 2-Immunpräzipitation X Viabilität und Apoptoserate nach
transienter Transfektion mit small interfering RNAs (siRNAs)
X
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3.1 Zellkultur
Die vier verwendeten Zelllinien (siehe Tabelle A4 in Kapitel 9.2.4.1) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen und nach Lieferung auf Trockeneis in Kultur genommen. Die Zellen wurden expandiert und jeweils mehrere Aliquots von 1 x 10⁶ oder 2 x 10⁶ Zellen eingefroren, die je nach Bedarf für Versuche aufgetaut wurden. Diese waren jeweils nicht länger als einen Monat für Versuche in Kultur.
Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 in feuchter Atmosphäre in RPMI-1640 unter Zugabe von 10 % FKS, 4,5 mg/mL Glucose, 2,4 mg/mL HEPES, 0,11 mg/mL Natriumpyruvat und 100U/mL Penicillin/Streptomycin in T75- oder T175-Zellkulturflaschen.
Eine Ausnahme bildete die Zelllinie MCF12A, welche in DMEM/F12 mit 5 % Pferdeserum, 20ng/mL Humaner Epidermaler Wachstumsfaktor, 100 ng/mL Choleratoxin, 0,01 mg/mL bovinem Insulin, 500 ng/mL Hydrocortison und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin kultiviert wurde.
3.1.1 Langzeitlagerung der Zellen
Zur Langzeitlagerung wurden 1 x 10⁶ oder 2 x 10⁶ Zellen in 500 µL Recovery Cell Culture Freezing Medium in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Rekultivierung wurden die Zellen bei 37 °C im Wasserbad aufgetaut und in 12 mL des jeweiligen vorgewärmten Mediums in 75-cm²-Kulturflaschen pipettiert bzw. MCF12A zunächst in 8mL Medium pipettiert und dann bei 140 g zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet anschließend in 12 mL Medium aufgenommen. Nach 3-5 Tagen konnten die Zellen für Versuche verwendet werden.
3.1.2 Passagieren der Zellen
Die auf dem Boden haftenden Zellen wurden nach Absaugen des Kulturmediums mit PBS gewaschen und danach mit Trypsin-EDTA-Lösung bedeckt im Brutschrank inkubiert. Die Inkubationszeiten variierten je nach Zelllinie zwischen 5 und 10 Minuten.
Die Ablösung der Zellen wurde dann lichtmikroskopisch im Inversionsmikroskop kontrolliert und bei Bedarf wurde die Zeit im Brutschrank um 1-2 Minuten verlängert.
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Der Ablösungsprozess wurde mit der drei- bis vierfachen Menge Kulturmedium abgestoppt und die Zellen durch wiederholtes Auf-und Abpipettieren vereinzelt.
3.1.3 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Zählkammer
Nach der oben beschriebenen Ablösung der Zellen wurde die Zellsuspension in ein 50er-Falcon überführt und mit einer 100 µL-Pipette so viel Medium auf eine mit Deckgläschen präparierte Neubauer-Zählkammer gegeben, dass sich der Kapillarspalt vollgesaugt hatte. Der Mittelwert von vier Eckquadraten wurde bestimmt und durch Multiplizierung mit 10000 die Zellzahl pro Milliliter berechnet.
3.1.4 Behandlung mit Trichostatin A
Die Behandlung mit Trichostatin A (TSA) erfolgte über 24 h in 175-cm²-Kulturflaschen für die RNA- und Proteingewinnung, 150er-Kulturschalen für die Chromatin- Immunpräzipitation und in 96-well-Platten für die Bestimmung von Acetylierung, Apoptose und Proliferation.
Die Zellaussaat erfolgte abhängig vom eingesetzten Kulturgefäß:
Verwendetes Kulturgefäß Zellzahl Volumen Medium (µL)
175-cm²-Kulturflasche 1,5 Mio 22 mL
150-cm²-Kulturschale 1,3 Mio 15 mL
75-cm²-Kulturflasche 800.000 12 mL
96-well-Kulturplatte 2.300 50 µL
Einen Tag nach der Aussaat erfolgte ein Mediumwechsel gegen das jeweilige Zellkulturmedium mit 100 ng/mL TSA, bzw. 100 ng/mL Ethanol als Vehikelkontrolle.
Aufgrund der kurzen Halbwertszeit des TSAs wurde das Medium nach 12 Stunden erneuert.
3.1.5 Transiente Transfektion mit miRNA-mimics und siRNAs
Die transiente Transfektion wurde mit miRNA-mimics mit den Brustkrebszelllinien HCC38, HCC1395 und HCC1937 durchgeführt. MiR-192 und miR-194 wurden einzeln
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und in Kombination in einer Gesamtkonzentration von 50 nM transfiziert. Für den Knockdown von Genen wurde die Zelllinie HCC38 mit siRNAs in einer Konzentration von 10nM transfiziert. AllStars Negative Control siRNA (Negativkontrolle) wurde sowohl für die Transfektion mit miRNA-mimics als auch für die mit siRNAs in entsprechenden Konzentrationen als Negativkontrolle eingesetzt. Bei dieser siRNA ist zu keinem Säugetiergen eine Homologie bekannt.
Die Transfektion erfolgte für die AGO2-Immunpräzipitation in 150cm2-Kulturschalen mit je 1,5 x 10⁶ Zellen, für RNA-Isolierung oder zur Herstellung in Gesamtzelllysaten in 6-Well-Kulturplatten mit je 1 x 10⁵ Zellen und für funktionelle Assays in 96-Well- Kulturplatten mit je 4400 Zellen.
Für die Transfektionen wurden HiPerfect-Transfektionsreagenz und miRNA-mimics bzw. siRNAs wie folgt gemischt:
Reagenz 96-well
(HCC38/
HCC1937) 96-well (HCC1395)
6-well 150cm2- Kulturschalen miRNA-mimic (20µM)
HiPerfect OptiMEM Zellsuspension
0,125 µL 0,25 µL ad 10 µL
40 µL 0,125 µL
0,75 µL ad 10 µL
40 µL 3,4 µL
6 µL ad 270 µL 1090 µL
51 µL 90 µL ad 4050 µL 8 mL
Reagenz 96-well (HCC38/
HCC1937)
96-well (HCC1395) 6-well siRNA (10µM / 20µM)
HiPerfect OptiMEM Zellsuspension
1 µL von 250 nM
Vorverdünnung 0,25 µL
ad 10 µL
40 µL 1 µL von 250 nM
Vorverdünnung 0,75 µL
ad 10 µL
40 µL 1,36 µL von 5 µM
Vorverdünnung 6 µL
ad 270 µL 1090 µL
Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde der Transfektionsmix in die Wells, bzw. die Platte gegeben und dann die Zellsuspension dazu gegeben. Für den 96-Well-
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Ansatz wurde für eine bessere Vermischung die Zellsuspension zum Mix in das Reagiergefäß gegeben und dann erst in die Wells pipettiert. Nach 24 h wurde der Transfektionsmix durch frisches Medium ersetzt.
siRNA-Bezeichnung Lotnummer
siARHGAP19 #6 20081120
siARHGAP19 #7 20101201
siMSI2 #7 20130521
siMSI2#8 201612090190
3.1.6 Funktionelle Analysen
Nach TSA-Behandlung und Transfektion mit miRNA-mimics oder siRNAs wurden funktionelle Analysen zur Proliferation, Apoptose und Migration durchgeführt, um die Effekte des TSAs bzw. der transienten Transfektion zu bestimmen.
3.1.6.1 Bestimmung der Zellviabilität
Die Zellviabilität wurde mit dem WST-1-Assay bestimmt, der auf der Umwandlung des stabilen Tetrazoliumsalzes WST-1 zu löslichem Formazan durch stoffwechselaktive Zellen beruht. Die Menge des Formazans korreliert mit der Anzahl an Zellen und kann photometrisch bestimmt werden.
Die Zellen wurden in Triplikaten im 96-well-Format in einem Volumen von 50 µL ausgesät und entweder wurde eine transiente Transfektion durchgeführt oder nach 24 h eine TSA-Behandlung. Zusätzlich wurden 50 µL Medium als Leerwert pipettiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde WST-1-Reagenz im Verhältnis 1:10 in jedes Well gegeben und die Zellen dann für eine Stunde im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde im Multidetektionsleser Synergy 2 die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm, abzüglich der Hintergrundabsorption bei 650 nm und des Leerwertes, bestimmt. Die Absorption wurde zur Kontrolle normalisiert.
28 3.1.6.2 Bestimmung der Apoptose
Zur Bestimmung der Apoptose nach TSA-Behandlung oder transienter Transfektion wurde das Caspase-Glo3/7-Assay verwendet. Das im Reagenz enthaltene luminogene Substrat wird nach Zelllyse durch die Aktivität von Caspase 3 und -7 gespalten und die entstehende Lumineszenz ist proportional zur Aktivität der Caspasen.
Zeitgleich zur Aussaat und Behandlung zur Bestimmung der Zellviabilität wurde die gleiche Zellzahl in Triplikaten in 50 µL angesetzt und ebenfalls eine transiente Transfektion oder eine TSA-Behandlung durchgeführt. Als Leerwert wurden ebenfalls 50 µL Medium pipettiert. In jedes Well wurde zu den gewünschten Zeitpunkten, parallel zum Pipettieren des WST-1-Reagenzes, 50 µL Caspase-Glo-3/7-Reagenz in jedes Well gegeben und die Zellen dann für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Lumineszenz wurde in einer weißen Mikrotiterplatte im Multidetektionsleser Synergy 2 gegen den Leerwert bestimmt. Die Lumineszenz wurde zur Negativkontrolle und dann zur Zellviabilität normalisiert, um ungleiche Zellzahlen einzurechnen.
3.1.6.3 Transwell-Migration-Assay zur Bestimmung des Migrationsverhaltens Zur Bestimmung des Migrationsverhaltens wurde ein Transwell-Migration-Assay durchgeführt. Diese Methode wurde nur mit der Zelllinie HCC38 etabliert.
Nach transienter Transfektion wurde die Anzahl an Zellen bestimmt, die durch eine Membran mit Mikroporen in Richtung eines Kulturmediums mit höherer Serumkonzentration wanderten.
Dafür wurden HCC38-Zellen im 6-well-Format mit miRNA-mimics oder siRNAs transfiziert. Nach 24 h erfolgte ein Mediumwechsel auf RPMI-1640 mit nur 1 % FKS.
Bei siRNA-Transfektionen wurden die Zellen zunächst noch einen Tag mit RPMI-1640 10 % FKS kultiviert. Nach 24 h in dem serumarmen Medium wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA geerntet und die Zellzahl bestimmt. 50.000 Zellen wurden in 250 µL Medium mit 1 % FKS in die Transwells gegeben. Im Well unterhalb des Transwells
29
befand sich Medium mit 10 % FKS. Nach der Migrationszeit von 24 h bei 37 °C im Brutschrank wurden die nicht migrierten Zellen von der Oberseite der Membran mit einem Wattestäbchen entfernt. Die Zellen auf der Unterseite wurden in 95%igem Methanol fixiert und in Giemsa-Lösung gefärbt. Im Lichtmikroskop wurden sechs Bereiche des Transwells fotografiert, die Zellen darauf gezählt und darüber die Gesamtzahl an migrierten Zellen berechnet.
3.1.7 Bestimmung der Zellacetylierung
Die Bestimmung der Acetylierung vor und nach TSA-Behandlung erfolgte mit dem Cellular Histone Acetylation Assay Kit. Bei diesem zellbasierten ELISA wird die relative Histonacetylierung der Zellen bestimmt. Die Menge des gebundenen Antikörpers (anti- acetylated histone/p53-K382) gegen acetyliertes Histon/p53-K382 korreliert mit dem umgesetzten HRP-Konjugat und kann photometrisch bestimmt werden.
Zeitgleich zur Zellviabilitätsbestimmung wurde für die Bestimmung der Acetylierung die gleiche Zellzahl in Triplikaten in 96-well-Zellkulturplatten ausgesät und wiederum eine TSA-Behandlung durchgeführt.
Zu den gewünschten Zeitpunkten wurde zeitgleich mit dem Pipettieren des WST-1- Reagenzes mit der Durchführung des Cellular Histone Acetylation Kits begonnen.
Die Absorption wurde zur Kontrolle und zur Zellviabilität normalisiert, um ungleiche Zellzahlen einzurechnen.
3.2 Expressionsanalysen
3.2.1 RNA-Isolation
Die RNA-Isolation wurde mit dem Direct-zol RNA MiniPrep-Kit von Zymo Research durchgeführt.
Die Probenbereitung erfolgte durch Zugabe von 700 µL TriReagent pro Well einer 6- well-Kulturplatte, aus der vorher das Medium entfernt wurde oder durch Aufnahme eines Pellets von ungefähr 1 x 10⁶ Zellen in 700 µL des Reagenzes. Dafür wurden, wie
30
oben beschrieben, die Zellen mit Trypsin abgelöst und die Zellsuspension mit Medium dann bei 140 g für fünf Minuten zentrifugiert und der Überstand über dem Zellpellet abgenommen.
Die in TriReagent aufgenommenen Proben wurden entweder direkt nach Herstellerangaben mit dem Direct-zol MiniPrep Kit von Zymo Research extrahiert oder bei -80 °C zur späteren Aufarbeitung gelagert.
Die Qualität der Gesamt-RNA wurde für Microarray-Experimente mit dem RNA-6000- Nano-Kit auf dem Bioanalyzer überprüft.
Die extrahierte RNA wurde bei -80 °C gelagert.
3.2.2 Bestimmung der RNA-Konzentration
Die Konzentration und Reinheit der RNA wurde mit dem Nanophotometer bestimmt.
3.2.3 cDNA-Synthese
Die isolierten RNA-Proben wurden mit dem High-Capacity-cDNA-Reverse- Transcription-Kit in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben.
Für die Reverse Transkription der mRNA wurde das Protokoll des Herstellers mit RNAse Inhibitor verwendet, bei dem Random Hexamer Primer eingesetzt werden. Pro Reaktionsansatz waren 250 ng RNA in einem Gesamtvolumen von 20 µL enthalten.
Für die Bestimmung der miRNA-Expression wurde eine Reverse Transkription mit spezifischen Primern nach dem Protokoll des TaqMan Small RNA Assays von Applied Biosystems durchgeführt. Es wurden 100 ng RNA pro 15 µL-Ansatz eingesetzt.
Die Proben wurden sofort eingesetzt oder bei -20 °C gelagert.
3.2.4 Quantitative Echtzeit-PCR mit TaqmanAssays
Zur Quantifizierung der Expression von mRNAs oder miRNAs wurde eine quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) durchgeführt.
Dafür wurde die synthetisierte cDNA mit Takyon Rox Probe MasterMix dTTP Blue und Taqman-Genexpressions-Assays bzw. Taqman-miRNA-Assays verwendet.
Die Proben wurden in Triplikaten in eine 96-Well Fast PCR-Platte pipettiert und im Thermocycler StepOnePlus gemessen.
31 Messung der mRNA-Expression
Reagenz Volumen (µL)
Takyon-ROX-Mastermix Wasser
20x Taqman-Genexpressions-Assay cDNA
10 7 1 2
Zeit Temperatur
10 Minuten 95 °C
15 Sekunden 60 Sekunden
95 °C
60 °C 40x
∞ 4 °C
Messung der miRNA-Expression
Reagenz Volumen (µL)
Takyon-ROX-Mastermix Wasser
20x Taqman-miRNA-Assay Spezifische cDNA
10 7,67 1 1,33
Zeit Temperatur
10 Minuten 95 °C
15 Sekunden 60 Sekunden
95 °C
60 °C 40x
∞ 4 °C
Die relative Expression wurde mit der Δ CT- oder Δ Δ CT-Methode berechnet, wobei TBP (TATA-box binding protein) als Referenzgen für die mRNA-Expression verwendet wurde und RNU6B (RNA, U6 small nuclear 6, pseudogene) für die miRNA-Expression.
TBP und RNU6B wurden bereits in vorangegangenen Versuchen als Referenzgene
32
für die Bestimmung der relativen Expression mittels qPCR in der Arbeitsgruppe Epigenomik des Instituts für Humangenetik der Medizinischen Hochschule Hannover etabliert.
ΔCT=CT (Zielgen)-CT (Referenzgen) relative Expression = 2-ΔCT ΔΔCT=ΔCT (behandelte Probe)-ΔCT (Kontrollprobe) relative Expression = 2-ΔΔCT
3.2.5 Microarrays
Es wurden mRNA- und miRNA-Microarrys nach TSA-Behandlung und nach transienter Transfektion durchgeführt.
Die Veränderung der miRNA-Expression wurde nach TSA-Behandlung untersucht.
Die mRNA-Expression wurde ebenfalls nach TSA-Behandlung und zusätzlich nach transienter Transfektion mit den miRNA-mimics miR-192-5p und miR-194-5p analysiert.
Die TSA-Behandlungen wurden in allen vorhandenen Zelllinien in zwei unabhängigen Proben untersucht.
Für die zweifache Messung der mRNA-Expression nach transienter Transfektion der Zelllinien HCC38 und HCC1937 wurden jeweils drei unabhängige Ansätze gepoolt.
Die gescannten Arrays wurden nach Extrahierung mit der Feature Extraction-Software in die GeneSpring-Software geladen, mit der sie analysiert wurden.
3.2.5.1 miRNA-Expressionsanalysen mit miRNA-Microarrays
Die miRNA-Expressionsanalysen wurden mit dem SurePrint G3 Human miRNA r 21.0 8x60K Microarray Kit nach dem Protokoll „miRNA Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit“ (Version 3.1.1 August 2015) der Firma Agilent durchgeführt. Nachfolgend sind die Schritte kurz zusammmengefasst.
Nach Dephosphorylierung von 100 ng Gesamt-RNA wurden die miRNAs am 3‘-Ende mit Cyanine 3-pCp gelabelt. Die mit einer Spinsäule gereinigten Proben wurden für
33
20 h auf den Microarray hybridisiert. Nach mehreren Waschschritten wurden die Proben mit dem High-Resolution Microarray-Scanner gescannt.
3.2.5.2 mRNA-Expressionsanalysen mit mRNA-Microarrays
Die mRNA-Expressionsanalysen wurden mit dem SurePrint G3 Human Gene Expression v3 8x60K Microarray Kitnach dem Protokoll „One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis Low Input Quick Amp Labeling“ (Version 6.9.1 August 2015) der Firma Agilent durchgeführt, die Schritte sind nachfolgend kurz zusammmengefasst.
Aus 100 ng Gesamt-RNA wurde mit T7 Promoter Primern und T7 RNA-Polymerase cRNA hergestellt, die mit Cyanine 3-CTP markiert wurde. Die markierte cRNA wurde mit dem RNeasy mini-Kit aufgereinigt und die Effizienz des Farbstoffeinbaus mit dem Nanophotometer bestimmt. Nach der Fragmentierung und der Hybridisierung für 17 h erfolgte nach mehreren Waschschritten das Scannen der Arrays.
3.3 Proteinquantifizierung
3.3.1 Herstellung von Gesamtzelllysaten
Für den Nachweis von Proteinen wurden Gesamtzelllysate hergestellt. Dafür wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA geerntet, die Zellzahl bestimmt und bei 250 g und 4°C für 5 min zentrifugiert. Nach Waschen in kaltem PBS wurde erneut zentrifugiert und das Zellpellet in RIPA-Puffer lysiert. Zur Vergleichbarkeit der Proben wurden 1 Mio Zellen in 225 µL RIPA-Puffer aufgenommen. Nach einer Inkubationszeit von 30 min auf Eis wurden die Proben bei 13.000 g und 4 °C für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
3.3.2 SDS-Polyacrylamidgelektrophorese und Western-Blots
Der Nachweis von Proteinen erfolgte mit SDS-Polyacrylamidgelektrophorese mit anschließendem Western-Blot.
34
Die Gesamtzelllysate wurden mit Roti Load 1 versetzt und für 5 min bei 95 °C erhitzt und dann auf ein 12%iges Trenngel mit einem 3%igen Sammelgel aufgetragen. Als Größenmarker wurde Precision Plus Protein Dual Color Standard verwendet. Die Proteine wurden bei 100 V für 1,5 h aufgetrennt und nachfolgend im Tank-Blot- Verfahren bei 100 V für 1 h auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.
Der erfolgreiche Proteintransfer wurde mit einer dreiminütigen Färbung in Ponceau- Rot überprüft.
Nach einer einstündigen Inkubation der Membran in Blockierlösung bei Raumtemperatur wurde die Membran in, mit Antikörpern versetzte, Blockierlösung über Nacht bei 4 °C eingelegt.
Am nächsten Tag erfolgte, nach dreimaligem Waschen für 5 min in PBS-T, eine einstündige Inkubation mit dem sekundären, einem HRP-gekoppelten, Antikörper bei Raumtemperatur. Die Antikörper mit ihren Verdünnungen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
Primärantikörper Blockierlösung Verdünnung Sekundärantikörper Verdünnung
Argonaute 2 Milch 1:1.000 Rabbit IgG 1:1.000
Acetyl. Histone H4 Lys5
Milch 1:2.000 Rabbit IgG 1:20.000
Acetyl. Histone H4 Lys8
Milch 1:1.000 Rabbit IgG 1:20.000
Acetyl. Histone H4 Lys12
Milch 1:5.000 Rabbit IgG 1:20.000
Acetyl. Histone H4 Lys16
Schoko 1:5.000 Rabbit IgG 1:70.000
ß-Actin Milch 1:2.000 Mouse Ig 1:25.000
MSI2 Milch 1:1.000 Rabbit IgG 1:1.000
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Nach dreimaligem Waschen in PBS-T für jeweils 5 Minuten wurden die Proteinbanden mit SuperSignal-West-Femto-Maximum-Sensitivity-Substrat im LAS-3000 Imaging System detektiert. Als Ladekontrolle diente Aktin, welches in vorangegangenen Versuchen der Arbeitsgruppe Epigenomik des Instituts für Humangenetik der Medizinischen Hochschule Hannover etabliert wurde.
3.4 Chromatin-Immunpräzipitation
Zur Untersuchung der Acetylierung bestimmter Lysinreste verschiedener Histone im Promoterbereich der lncRNA miR194-2HG (miR194-2 Host Gene) nach TSA- Behandlung wurde eine Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender qPCR durchgeführt. Dieser Versuch wurde nur mit der Zelllinie HCC38 durchgeführt.
Crosslinking zum Aufbau stabiler Verbindungen zwischen DNA und Histonen: Die Zellen wurden dafür einen Tag nach Aussaat für eine Stunde mit TSA, bzw. Ethanol als Kontrolle behandelt. Nach der Fixierung mit 1 % Formaldehyd für 15 min wurde mit 0,125 M Glycin abgestoppt. Nach Waschen und nachfolgendem Abschaben in 1 x PBS wurden die Zellen bei 4000 rpm für 5 min zentrifugiert und in je 500 µL Lysispuffer aufgenommen.
Sonifizierung: Das Pellet wird in Lysispuffer aufgenommen und anschließend mit dem Covaris S220 in 500 bp große Fragmente sonifiziert. Die Sonifizierung wurde mit Agarosegelektrophorese überprüft.
Preclearing zur Reduzierung unspezifischer Bindung an die Metallbeads: Nach Zentrifugation bei 13.000 g für 5 Minuten bei 4 °C wird im Überstand die DNA- Konzentration im Nanophotometer bestimmt. Nun wurden von den beiden Proben jeweils die gleiche Menge DNA abgenommen, mit der sechsfachen Menge Dilutionspuffer verdünnt und anschließend jeweils 15 µg DNA abgenommen und als Input bis zum Decrosslinken bei 4 °C gelagert. Zu den IP-Proben wurden 40 µL Metallbeads pro 1 mL Dilutionspuffer gegeben und bei 4 °C über Nacht im Rotor inkubiert.
Immunpräzipitation mit verschiedenen Antikörpern: Mittels Magnet wurden die geklärten Lysate auf neue 1,5 mL Reaktionsgefäße aufgeteilt; die Anzahl entsprach
36
den eingesetzten Antikörpern. Nach Zugabe der verschiedenen Antikörper kamen die Proben für mindestens 6 h wieder auf den Rotor bei 4 °C, wobei dann erneut je 40 µL Magnetbeads dazu gegeben wurden.
Waschen: Mittels Magnet wurde der Überstand verworfen und die Beads mit den anhängenden Antikörpern mit je 1 mL TSE I, TSE II und Puffer III gewaschen und dazwischen jeweils 10 min bei 4 °C auf dem Rotor inkubiert. Nach kurzem Waschen mit 1 mL 1x PBS wurden die Proben zweimalig mit 100 µL Elutionspuffer bei 30 °C für 20 min inkubiert. Das Eluat wurde in neuen Reaktionsgefäßen gesammelt und die Proben bis zum Decrosslinken bei 4 °C gelagert.
Decrosslinking zum Lösen der Verbindungen zwischen DNA-Fragmenten und Histonen: Eluate und Inputs wurden über Nacht bei 65 °C inkubiert.
Die DNA-Extraktion erfolgte mit dem QIAquick PCR Purification Kit nach Herstellerangaben.
Die gesamten Proben wurden gepoolt und daraus Verdünnungen von 1:5, 1:25 und 1:125 für eine Standardkurve hergestellt.
Die qPCR mit spezifischen Primern (siehe Tabelle A4 in Kapitel 9.2.4.2) für den Promoterbereich von miR194-2HG wurde in Triplikaten mit SYBRGreen PCR Master Mix in einer 96-Well Fast PCR-Platte im Thermocycler StepOnePlus gemessen.
Reagenz Volumen (µL)
SYBRGreen PCR Master Mix 10
Wasser 8
Primer miR194-2HG_ChIP2 (je 10 µM fw bzw. rv) 0,4
DNA 2
37
Zeit Temperatur
10 Minuten 95 °C
15 Sekunden 60 Sekunden
95 °C
60 °C X40
15 Sekunden 95 °C
60 Sekunden 60 °C
+1 °C
15 Sekunden 95 °C
∞ 4 °C
Berechnung:
Die Histonacetylierung im Promoter der lncRNA miR194-2HG wurde mit der %-Input- Methode berechnet und auf die H3- bzw. H4-Gesamtmenge normalisiert.
3.5 Argonaute 2-Immunpräzipitation
Zum Nachweis der Bindung der microRNAs miR-192-5p und miR-194-5p an potenzielle Ziel-mRNAs wurde eine Argonaute 2-Immunpräzipitation (AGO2-IP) durchgeführt. Dieser Versuch wurde nur mit der Zelllinie HCC38 etabliert.
Nach transienter Transfektion mit miRNA-mimics und Negativkontrolle wurden RISCs mittels Immunpräzipitation isoliert. Diese RISCs, deren Funktion posttranskriptionelles Gen-Silencing ist, bestehen unter anderem aus miRNA, Ziel-mRNA und Argonautenprotein. Zur Immunräzipitation wurde der Antikörper gegen das Argonautenprotein a-AGO2, bzw. der Antikörper aHa gegen Immunglobulin G (IgG) als Kontrolle der Hintergrundanreicherung, eingesetzt. Die Anreicherung gebundener mRNA in den Komplexen wurde mit qPCR untersucht.
Zunächst wurde die Zelllinie HCC38 mit den miRNA-mimics miR-192-5p bzw. miR- 194-5p und der AllStars Negative Control siRNA in Konzentrationen von 20 nM (miR- 192) und 50 nM (miR-194) in 150 cm²-Kulturschalen transient transfiziert. 48h nach Aussaat wurden die Zellen in kaltem 1 x PBS abgeschabt. Durch die parallele
38
Zellzahlbestimmung einer zusätzlichen Zellkulturschale nach Ablösung mit Trypsin/EDTA konnten die Anzahl abgeschabter Zellen berechnet und jeweils 10 Millionen Zellen pro Ansatz in einem 50 mL Falcon gesammelt werden. Nach Zentrifugation bei 1200 rpm für 5 Minuten konnte der Überstand verworfen werden und das Pellet bis zur weiteren Bearbeitung bei -80 °C eingefroren werden.
Dynabeads Protein G - Antibody Binding: Pro Probe wurden auf zwei 1,5 mL Reaktionsgefäße jeweils 75 µL Dynabeads verteilt und mittels Magneten dreimal mit 1mL Citrat-Phosphatpuffer gewaschen. Nach Aufnahme der Beads in 400 µL Citrat- Phosphatpuffer wurden pro Probe 12,5 µg AGO2-Antikörper bzw. IgG-Antikörper hinzugegeben und für eine Stunde bei 4 °C im Rotor inkubiert.
Dynabeads Protein G-Vorbereitung zur IP: Mittels Magnet wurden die Beads erneut mit 1 mL Citrat-Phosphatpuffer gewaschen und bis Zugabe der Proben auf Eis mit 100 µL Citrat-Phosphatpuffer gelagert.
Zelllyse und Protein-AGO2-Bindung: Die Zellpellets wurden in 900 µL NP-Lysispuffer aufgenommen, nach 20 Minuten Inkubation auf Eis erfolgte eine Zentrifugation für 15 Minuten bei 13.000 g und 4 °C. Der Überstand wurde, nach Abnahme von 20 µL für die Inputproben, auf die Antikörper-präparierten Beads verteilt. Die Proben wurden bei 4 °C auf dem Rotor für eine Stunde platziert.
Waschen: Die Proben wurden mittels Magnet jeweils dreimal mit 1 mL IP Washpuffer und High Salt Washpuffer, darauf jeweils zweimal mit 1mL Phosphatase Washpuffer und PNK-Puffer gewaschen. Beim letzten Waschschritt erfolgte die Aufteilung für RNA-Isolation (80 %) und Western-Blot (20 %). Die Proben wurden trocken gesaugt, für die RNA-Isolation wurden die Metallbeads in 350 µL Trizol aufgenommen. Nach 5 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden die Überstände mit Hilfe des Magnetständers abgenommen und die RNA mit dem Direct-zol RNA MiniPrep-Kit isoliert. Für den Western-Blot, welcher der Kontrolle diente, wurden die Proben in 20 µL 1 x Rotiload aufgenommen. Nach 5 Minuten Inkubation bei 95 °C wurde auf dem Magnetständer der Überstand abgenommen, welcher bis zum Auftragen auf das SDS- Polyacrylamidgel im Kühlschrank lagerte.
Aus den isolierten RNA-Proben wurde cDNA hergestellt. Die qPCR wurde mit Takyon Rox Probe MasterMix dTTP Blue und Taqman-Genexpressions-Assays durchgeführt
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und die Anreicherung der mRNAs nach miRNA-mimic-Transfektion wurde auf die Kontrolle normalisiert.
Folgende drei Bedingungen mussten erfüllt sein, damit davon ausgegangen werden konnte, dass es sich bei dem untersuchten Gen um ein miRNA-Zielgen handelt:
log2F(AGO2-IPIgG)>0 log2F(AGO2-IPInput)>0 log2F(AGO2-IPLysat)<0
3.6 Sequenzierung
Die Sequenzierung der triple-negativen Brustkrebszelllinien HCC38, HCC1395 und HCC1937 wurde durch die Abteilung Erbliche Krebserkrankungen des Instituts für Humangenetik der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Die unbehandelten Zellen wurden, wie in Kapitel 3.1.2 beschrieben, abgelöst und nach zweimaligem Waschen wurde jeweils aus einer Million Zellen die DNA-extrahiert. Für die Sequenzierung wurde das TruSight Cancer Panel von Illumina verwendet.
Die anschließende Analyse mit der SeqPilot-Software wurde für die Brustkrebsrisikogene durchgeführt.
3.7 Agarosegelelektrophorese
PCR-Reaktionen und die sonifizierte DNA wurden elektrophoretisch aufgetrennt, um die Ergebnisse zu überprüfen. Die Proben wurden mit 5x Probenauftragspuffer versetzt und mit dem Größenmarker GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder auf ein ein- bis 2%iges Agarosegel mit einer Ethidiumbromidkonzentration von 1 µg/mL aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei 100 V für 45 min in 1x TBE-Puffer. Zur Visualisierung und Dokumentation der DNA-Banden wurden das GelDoc UV Imager System und die QuantityOne 1D-Analysis-Software eingesetzt.
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3.8 Bioinformatische Analysen
3.8.1 Identifizierung differenziell regulierter miRNAs
Zur Identifizierung differenziell regulierter miRNAs nach TSA Behandlung wurden die miRNA Microarray-Messungen in die Software Genespring eingeladen und dabei mittels Quantilnormalisierung zur 90. Perzentile normalisiert.
Mit Fold-Change (FC)-Analysen (cut-off ≥ 2,0) wurden miRNAs identifiziert, deren Expression in den TSA-Proben im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle in der Zelllinie erhöht ist.
3.8.2 Identifizierung putativer Zielgene
Für die Identifizierung von putativen miRNA-Zielgenen wurden die Messungen der mRNA-Microarrays in die Software GeneSpring geladen und dabei mittels Quantilnormalisierung zur 75. Perzentile normalisiert. Ferner wurden Listen mit vorhergesagten Zielgenen der miR-192-5p bzw. miR-194-5p geladen. Bei der Zusammenstellung der Listen musste eine Übereinstimmung der Gene in den Datenbanken Targetscan und miRmap und einer der Datenbanken miRWalk oder miRanda vorhanden sein.
Mit Fold-Change-Analysen (FC ≥ 2,0) wurden die vorhergesagten Zielgene identifiziert, deren Expression in den TSA-Proben im Vergleich zur Kontrolle in der jeweiligen Zelllinie erniedrigt ist, sowie in den miRNA-mimic-behandelten Proben ebenfalls reduiziert sind.
3.9 Statistik
Die Experimente wurden in mindestens drei biologisch unabhängigen Replikaten durchgeführt. Ausnahmen bildeten die Proteinquantifizierung, die nur einmal durchgeführt wurde, die Microarrays sowie die AGO2-Immunpräzipitationen, die mit zwei unabhängigen Replikaten gemacht wurden.
Die Darstellung der Ergebnisse und die statistische Auswertung erfolgten mit dem Programm GraphPad Prism. Es wurde neben dem Mittelwert die Standardabweichung dargestellt. Die Berechnung der Signifikanz wurde bei Versuchen mit zwei
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Bedingungen mit einem gepaarten t-Test oder einem Zweistichproben-t-Test durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als x̅ ± SD dargestellt. Bei Versuchen mit mehr als zwei Bedingungen wurde eine 1-way-ANOVA mit anschließendem Post-Hoc-Test nach Dunnett oder Tukey-Kramer verwendet. Die Signifikanzniveaus sind in den Abbildungen wie folgt angegeben: ns P> 0,05; * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001;
**** P≤0,0001.
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4 Ergebnisse
In dieser Arbeit wurde die Auswirkung von Histonacetylierung auf triple-negative Mammakarzinome untersucht. Dafür wurden die Zelllinie MCF12A, die von einer Patientin mit einer Mastopathie stammt, und die drei triple-negativen Brustkrebszelllinien HCC38, HCC1395 und HCC1937 als in vitro-Modelle verwendet.
Die Brustkrebszelllinien stammen alle von Patientinnen, welche an einem triple- negativen Mammakarzinom erkrankt waren. Zur Analyse der Auswirkung des HDAC- Inhibitors TSA auf die Zelllinien wurden Versuche zur Zellviabilität, Apoptoserate und Gesamtacetylierung durchgeführt. Da die veränderte Acetylierung Auswirkungen auf die Expression von Genen und auch von miRNAs hat, wurden miRNA-Microarrays analysiert, um epigenetisch durch Acetylierung regulierte miRNAs zu ermitteln. Dabei wurden unter anderem die miR-192-5p und die miR-194-5p als TSA-induziert gefunden. Diese miRNAs wurden weitergehend untersucht und ihr Einfluss auf die Zellen nach transienter Transfektion in funktionellen Untersuchungen zu Zellviabilität, Apoptoserate und Migrationsverhalten analysiert. Zur weiteren Charakterisierung der miRNAs wurden vorhergesagte Zielgene mittels mRNA-Microarrays nach TSA- Behandlung und nach transienter Transfektion mit den miRNAs identifiziert. Als putatives Zielgen der miR-192-5p wurde das Gen ARHGAP19 (Rho GTPase activating protein 19) ermittelt und für die miR-194-5p das Gen MSI2 (musashi RNA binding protein 2). Durch Knockdown der Gene ARHGAP19 und MSI2 und darauffolgende funktionelle Analysen wurde deren Beitrag an der funktionellen Wirkung der miRNAs untersucht.
4.1 HDAC-Expression und Acetylierungsstatus im Mammakarzinom
In Tumoren ist häufig eine erhöhte Acetylierung festzustellen, welche durch erhöhte Expression von HDACs zustande kommt. Zur Untersuchung des Acetylierungsstatus im Mammakarzinom wurde die HDAC-Expression in öffentlich verfügbaren Datensätzen analysiert. Um festzustellen, ob sich die verwendeten Zelllinien als Modell
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für Versuche eignen, wurden die Expression verschiedener HDACs und die basale Acetylierung bestimmt.
4.1.1 HDAC-Expression in öffentlichen Datenbanken
Die Expression verschiedener HDACs wurde in Mammakarzinomen und in normalem Brustgewebe in öffentlich verfügbaren Datensätzen analysiert. Die NCBI Geo Datenbank beinhaltet einen Expressionsdatensatz, in dem normales Brustgewebe, in mehrere Gruppen unterteilte Mammakarzinome und verschiedene Brustkrebszelllinien analysiert wurden. Die Mammakarzinome wurden in TNBC, Luminal A, Luminal B und HER2 eingeteilt. Teilweise war eine deutlich erhöhte Expression der HDACs in den Mammakarzinomen im Vergleich zu normalen Brustgeweben festzustellen. Hier sind beispielhaft HDAC1, HDAC2, HDAC3 und HDAC4 dargestellt (Abbildung 4.1 A-D).
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Abbildung 4.1 Expression von HDAC1, HDAC2, HDAC3 und HDAC4 in Brustgewebe und verschiedenen Mammakarzinomen in öffentlich verfügbaren Datensätzen
Mit Hilfe der NCBI Geo-Datenbank wurde die Expression von (A) HDAC1, (B) HDAC2, (C) HDAC3 und (D) HDAC4 in normalem Brustgewebe, Mammakarzinomen und verschiedenen Zelllinien (siehe Tabelle A1 in Kapitel 9.1) verglichen. Die Mammakarzinome wurden in TNBC, Luminal A und Luminal B und HER2 eingeteilt. Analysiert wurde der Datensatz mit der Zugangsnummer GSE65216. Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz wurde eine 1-way-ANOVA durchgeführt mit anschließendem Post-Hoc- Test nach Tukey-Kramer. (ns P> 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001; **** P≤0,0001)
4.1.2 HDAC-Expression in den verwendeten Zelllinien
Die Expression von HDACs ist in Mammakarzinomen im Vergleich zu normalem Brustgewebe häufig erhöht (vergleiche Kapitel 4.1.1). Deshalb sollte untersucht werden, ob die HDAC-Expression auch in den, für diese Arbeit verwendeten, Zelllinien verändert ist. Dafür wurde beispielhaft die Expression von HDAC1, HDAC2, HDAC3
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und HDAC4 in den Zelllinien MCF12A, HCC38, HCC1395 und HCC1937 mittels qPCR bestimmt. Im Vergleich zur Nichttumorzelllinie MCF12A ist die HDAC-Expression in den triple-negativen Brustkrebszelllinien insgesamt erhöht (Abbildung 4.2).
Abbildung 4.2 Basale Expression verschiedener HDACs in den verwendeten Zelllinien
Die basale Expression von HDAC1, HDAC2, HDAC3 und HDAC4 wurde mittels qPCR unter Normalisierung zu TBP (2-ΔΔCT) in der Nichttumorzelllinie MCF12A und den triple-negativen Brustkrebszelllinien HCC38, HCC1395 und HCC1937 gemessen (n=3). Die HDAC-Expression wurde auf MCF12A normalisiert. Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz wurde eine 1-way-ANOVA mit anschließendem Post-Hoc-Test nach Dunnett durchgeführt. (ns P> 0,05; * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001)
4.1.3 Basale Gesamtacetylierung
Um festzustellen, ob sich die insgesamt erhöhte Expression der HDACs auf den Acetylierungsstatus auswirkt, wurde die basale Gesamtacetylierung der verwendeten Zelllinien bestimmt. Die Acetylierung war in den triple-negativen Brustkrebszelllinien HCC38, HCC1395 und HCC1937 im Vergleich zur Nichttumorzelllinie MCF12A signifikant reduziert (Abbildung 4.3).
