Die vier verwendeten Zelllinien (siehe Tabelle A4 in Kapitel 9.2.4.1) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen und nach Lieferung auf Trockeneis in Kultur genommen. Die Zellen wurden expandiert und jeweils mehrere Aliquots von 1 x 10⁶ oder 2 x 10⁶ Zellen eingefroren, die je nach Bedarf für Versuche aufgetaut wurden. Diese waren jeweils nicht länger als einen Monat für Versuche in Kultur.
Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 in feuchter Atmosphäre in RPMI-1640 unter Zugabe von 10 % FKS, 4,5 mg/mL Glucose, 2,4 mg/mL HEPES, 0,11 mg/mL Natriumpyruvat und 100U/mL Penicillin/Streptomycin in T75- oder T175-Zellkulturflaschen.
Eine Ausnahme bildete die Zelllinie MCF12A, welche in DMEM/F12 mit 5 % Pferdeserum, 20ng/mL Humaner Epidermaler Wachstumsfaktor, 100 ng/mL Choleratoxin, 0,01 mg/mL bovinem Insulin, 500 ng/mL Hydrocortison und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin kultiviert wurde.
3.1.1 Langzeitlagerung der Zellen
Zur Langzeitlagerung wurden 1 x 10⁶ oder 2 x 10⁶ Zellen in 500 µL Recovery Cell Culture Freezing Medium in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Rekultivierung wurden die Zellen bei 37 °C im Wasserbad aufgetaut und in 12 mL des jeweiligen vorgewärmten Mediums in 75-cm²-Kulturflaschen pipettiert bzw. MCF12A zunächst in 8mL Medium pipettiert und dann bei 140 g zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet anschließend in 12 mL Medium aufgenommen. Nach 3-5 Tagen konnten die Zellen für Versuche verwendet werden.
3.1.2 Passagieren der Zellen
Die auf dem Boden haftenden Zellen wurden nach Absaugen des Kulturmediums mit PBS gewaschen und danach mit Trypsin-EDTA-Lösung bedeckt im Brutschrank inkubiert. Die Inkubationszeiten variierten je nach Zelllinie zwischen 5 und 10 Minuten.
Die Ablösung der Zellen wurde dann lichtmikroskopisch im Inversionsmikroskop kontrolliert und bei Bedarf wurde die Zeit im Brutschrank um 1-2 Minuten verlängert.
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Der Ablösungsprozess wurde mit der drei- bis vierfachen Menge Kulturmedium abgestoppt und die Zellen durch wiederholtes Auf-und Abpipettieren vereinzelt.
3.1.3 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Zählkammer
Nach der oben beschriebenen Ablösung der Zellen wurde die Zellsuspension in ein 50er-Falcon überführt und mit einer 100 µL-Pipette so viel Medium auf eine mit Deckgläschen präparierte Neubauer-Zählkammer gegeben, dass sich der Kapillarspalt vollgesaugt hatte. Der Mittelwert von vier Eckquadraten wurde bestimmt und durch Multiplizierung mit 10000 die Zellzahl pro Milliliter berechnet.
3.1.4 Behandlung mit Trichostatin A
Die Behandlung mit Trichostatin A (TSA) erfolgte über 24 h in 175-cm²-Kulturflaschen für die RNA- und Proteingewinnung, 150er-Kulturschalen für die Chromatin-Immunpräzipitation und in 96-well-Platten für die Bestimmung von Acetylierung, Apoptose und Proliferation.
Die Zellaussaat erfolgte abhängig vom eingesetzten Kulturgefäß:
Verwendetes Kulturgefäß Zellzahl Volumen Medium (µL)
175-cm²-Kulturflasche 1,5 Mio 22 mL
150-cm²-Kulturschale 1,3 Mio 15 mL
75-cm²-Kulturflasche 800.000 12 mL
96-well-Kulturplatte 2.300 50 µL
Einen Tag nach der Aussaat erfolgte ein Mediumwechsel gegen das jeweilige Zellkulturmedium mit 100 ng/mL TSA, bzw. 100 ng/mL Ethanol als Vehikelkontrolle.
Aufgrund der kurzen Halbwertszeit des TSAs wurde das Medium nach 12 Stunden erneuert.
3.1.5 Transiente Transfektion mit miRNA-mimics und siRNAs
Die transiente Transfektion wurde mit miRNA-mimics mit den Brustkrebszelllinien HCC38, HCC1395 und HCC1937 durchgeführt. MiR-192 und miR-194 wurden einzeln
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und in Kombination in einer Gesamtkonzentration von 50 nM transfiziert. Für den Knockdown von Genen wurde die Zelllinie HCC38 mit siRNAs in einer Konzentration von 10nM transfiziert. AllStars Negative Control siRNA (Negativkontrolle) wurde sowohl für die Transfektion mit miRNA-mimics als auch für die mit siRNAs in entsprechenden Konzentrationen als Negativkontrolle eingesetzt. Bei dieser siRNA ist zu keinem Säugetiergen eine Homologie bekannt.
Die Transfektion erfolgte für die AGO2-Immunpräzipitation in 150cm2-Kulturschalen mit je 1,5 x 10⁶ Zellen, für RNA-Isolierung oder zur Herstellung in Gesamtzelllysaten in 6-Well-Kulturplatten mit je 1 x 10⁵ Zellen und für funktionelle Assays in 96-Well-Kulturplatten mit je 4400 Zellen.
Für die Transfektionen wurden HiPerfect-Transfektionsreagenz und miRNA-mimics bzw. siRNAs wie folgt gemischt:
Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde der Transfektionsmix in die Wells, bzw. die Platte gegeben und dann die Zellsuspension dazu gegeben. Für den
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Ansatz wurde für eine bessere Vermischung die Zellsuspension zum Mix in das Reagiergefäß gegeben und dann erst in die Wells pipettiert. Nach 24 h wurde der Transfektionsmix durch frisches Medium ersetzt.
siRNA-Bezeichnung Lotnummer
siARHGAP19 #6 20081120
siARHGAP19 #7 20101201
siMSI2 #7 20130521
siMSI2#8 201612090190
3.1.6 Funktionelle Analysen
Nach TSA-Behandlung und Transfektion mit miRNA-mimics oder siRNAs wurden funktionelle Analysen zur Proliferation, Apoptose und Migration durchgeführt, um die Effekte des TSAs bzw. der transienten Transfektion zu bestimmen.
3.1.6.1 Bestimmung der Zellviabilität
Die Zellviabilität wurde mit dem WST-1-Assay bestimmt, der auf der Umwandlung des stabilen Tetrazoliumsalzes WST-1 zu löslichem Formazan durch stoffwechselaktive Zellen beruht. Die Menge des Formazans korreliert mit der Anzahl an Zellen und kann photometrisch bestimmt werden.
Die Zellen wurden in Triplikaten im 96-well-Format in einem Volumen von 50 µL ausgesät und entweder wurde eine transiente Transfektion durchgeführt oder nach 24 h eine TSA-Behandlung. Zusätzlich wurden 50 µL Medium als Leerwert pipettiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde WST-1-Reagenz im Verhältnis 1:10 in jedes Well gegeben und die Zellen dann für eine Stunde im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde im Multidetektionsleser Synergy 2 die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm, abzüglich der Hintergrundabsorption bei 650 nm und des Leerwertes, bestimmt. Die Absorption wurde zur Kontrolle normalisiert.
28 3.1.6.2 Bestimmung der Apoptose
Zur Bestimmung der Apoptose nach TSA-Behandlung oder transienter Transfektion wurde das Caspase-Glo3/7-Assay verwendet. Das im Reagenz enthaltene luminogene Substrat wird nach Zelllyse durch die Aktivität von Caspase 3 und -7 gespalten und die entstehende Lumineszenz ist proportional zur Aktivität der Caspasen.
Zeitgleich zur Aussaat und Behandlung zur Bestimmung der Zellviabilität wurde die gleiche Zellzahl in Triplikaten in 50 µL angesetzt und ebenfalls eine transiente Transfektion oder eine TSA-Behandlung durchgeführt. Als Leerwert wurden ebenfalls 50 µL Medium pipettiert. In jedes Well wurde zu den gewünschten Zeitpunkten, parallel zum Pipettieren des WST-1-Reagenzes, 50 µL Caspase-Glo-3/7-Reagenz in jedes Well gegeben und die Zellen dann für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Lumineszenz wurde in einer weißen Mikrotiterplatte im Multidetektionsleser Synergy 2 gegen den Leerwert bestimmt. Die Lumineszenz wurde zur Negativkontrolle und dann zur Zellviabilität normalisiert, um ungleiche Zellzahlen einzurechnen.
3.1.6.3 Transwell-Migration-Assay zur Bestimmung des Migrationsverhaltens Zur Bestimmung des Migrationsverhaltens wurde ein Transwell-Migration-Assay durchgeführt. Diese Methode wurde nur mit der Zelllinie HCC38 etabliert.
Nach transienter Transfektion wurde die Anzahl an Zellen bestimmt, die durch eine Membran mit Mikroporen in Richtung eines Kulturmediums mit höherer Serumkonzentration wanderten.
Dafür wurden HCC38-Zellen im 6-well-Format mit miRNA-mimics oder siRNAs transfiziert. Nach 24 h erfolgte ein Mediumwechsel auf RPMI-1640 mit nur 1 % FKS.
Bei siRNA-Transfektionen wurden die Zellen zunächst noch einen Tag mit RPMI-1640 10 % FKS kultiviert. Nach 24 h in dem serumarmen Medium wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA geerntet und die Zellzahl bestimmt. 50.000 Zellen wurden in 250 µL Medium mit 1 % FKS in die Transwells gegeben. Im Well unterhalb des Transwells
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befand sich Medium mit 10 % FKS. Nach der Migrationszeit von 24 h bei 37 °C im Brutschrank wurden die nicht migrierten Zellen von der Oberseite der Membran mit einem Wattestäbchen entfernt. Die Zellen auf der Unterseite wurden in 95%igem Methanol fixiert und in Giemsa-Lösung gefärbt. Im Lichtmikroskop wurden sechs Bereiche des Transwells fotografiert, die Zellen darauf gezählt und darüber die Gesamtzahl an migrierten Zellen berechnet.
3.1.7 Bestimmung der Zellacetylierung
Die Bestimmung der Acetylierung vor und nach TSA-Behandlung erfolgte mit dem Cellular Histone Acetylation Assay Kit. Bei diesem zellbasierten ELISA wird die relative Histonacetylierung der Zellen bestimmt. Die Menge des gebundenen Antikörpers (anti-acetylated histone/p53-K382) gegen acetyliertes Histon/p53-K382 korreliert mit dem umgesetzten HRP-Konjugat und kann photometrisch bestimmt werden.
Zeitgleich zur Zellviabilitätsbestimmung wurde für die Bestimmung der Acetylierung die gleiche Zellzahl in Triplikaten in 96-well-Zellkulturplatten ausgesät und wiederum eine TSA-Behandlung durchgeführt.
Zu den gewünschten Zeitpunkten wurde zeitgleich mit dem Pipettieren des WST-1-Reagenzes mit der Durchführung des Cellular Histone Acetylation Kits begonnen.
Die Absorption wurde zur Kontrolle und zur Zellviabilität normalisiert, um ungleiche Zellzahlen einzurechnen.