A.9.2.1 Lösungen und Puffer für die Chromatin-Immunpräzipitation BSA/Lachssperma-DNA:
5 % (v/v) BSA in 1 x PBS 20ng/mL Lachssperma-DNA
1mL Pureproteome Protein G Magnetic Beads Lysepuffer:
1 % (v/v) SDS 10 mM EDTA
50 mM Tris-HCl (pH 7,8) TSE I:
150 mM NaCl 0,1 % (v/v) SDS 1 % (v/v) Triton 2 mM EDTA
20 mM Tris-HCl (pH 7,8) Dilution Puffer:
1% (v/v) Triton 2 mM EDTA 150 mM NaCl
20 mM Tris-HCl (pH 7,8)
127 TSE II:
500 mM NaCl 0,1 % (v/v) SDS 1 % (v/v) Triton 2 mM EDTA
20 mM Tris-HCl (pH 7,8) Puffer III:
0,25 M LiCl 1 % (v/v) NP-40
1 % (w/v) Deoxycholate 1 mM EDTA
10 mM Tris-HCl (pH 7,8) Elutionspuffer:
0,1 M NaHCO3 1 % (v/v) SDS
Immer frisch angesetzt
TBE-Puffer:
89 mM Tris 89 mM Borsäure 2 nM EDTA
A.9.2.2 Lösungen und Puffer für die AGO2-IP Citrat-Phosphatpuffer (pH 5,0):
25 mM Citric Acid 65 mM Na2HPO4
128 High-Salt Waschpuffer (pH 7,5):
50 mM HEPES-KOH (pH 7,5) 500 mM KCl
0,05 % Igepal
0,5 mM DTTimmer frisch dazu
1x Complete Protease Inhibitor Cocktailimmer frisch dazu
IP-Waschpuffer (pH 7,5):
50 mM HEPES-KOH (pH 7,5) 300 mM KCl
0,05 % Igepal NP-Lysepuffer:
50 mM HEPES-KOH (pH 7,5) 150 mM KCl
2 mM EDTA 1 mM 0,5 NaF 0,5 % Igepal
0,5 mM DTTimmer frisch dazu
1x Complete Protease Inhibitor Cocktailimmer frisch dazu
Phosphatase-Waschpuffer:
50 mM Tris-HCl (pH7,5) 20 mM EGTA
0,5 % Igepal PNK-Puffer:
50 mM Tris-HCl (pH7,5) 50 mM NaCl
10 mM MgCl2
129 1x Roti-Load:
25 % Roti-Load 4x +0,5 % DTT (1 M)
A.9.2.3 Lösungen und Puffer für Expressionsanalysen Blockierlösung Milch:
1xPBS
0,05 % (v/v) Tween 5 % (w/v) Milchpulver Blockierlösung Schoko:
1 x PBS
0,05 % (v/v) Tween
3 % (w/v) Slim-Fast Schokolade Blockierlösung BSA:
1 x TBS-T
5 % (w/v) Bovines Serumalbumin Elektrophoresepuffer:
25 mM Tris-Base 192 mM Glycin 0,1 % (w/v) SDS
130 Blottingpuffer:
25 mM Tris-Base 150 nM Glycin
10 % (v/v) Methanolvor Gebrauch frisch dazu gegeben PBS-T
1 x PBS
0,05 % (v/v) Tween Ponceau-Rot:
0,5 % (w/v) Ponceau 5 % (v/v) Essigsäure RIPA-Puffer:
10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 % (v/v) Igepal CA-630
0,5 % (w/v) Natriumdeoxycholat 0,1 % (w/v) SDS
1 x EDTA-free Complete Proteinase Inhibitor Cocktailvor Gebrauch frisch dazu gegeben
A.9.2.4 Zellkultur
A.9.2.4.1 Verwendete Zelllinien
Alle Zelllinien wurden von der Firma American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA erstanden.
131 Tabelle A4 Verwendete Zelllinien
Zelllinie Beschreibung Bezugsquelle
MCF12A Diese nichttumorigene epitheliale Zelllinie entstammt von der Reduktionsplastik einer 60-jährigen Frau mit Mastopathie. Die Immortalisierung erfolgte spontan.
ATCC (Bestellnummer CRL-10782)
HCC38 Diese epitheliale triple-negative Zelllinie entstammt dem duktalen Karzinom einer 50-jährigen Frau, welche zuvor schon an einem Leiomyosarkom erkrankt war.
ATCC (Bestellnummer CRL-2314)
HCC1395 Diese epitheliale triple-negative Zelllinie entstammt dem duktalen Karzinom einer 43-jährigen Frau, deren Mutter ebenfalls an Brustkrebs erkrankt war.
ATCC (Bestellnummer CRL-2324)
HCC1937 Diese epitheliale triple-negative Zelllinie entstammt dem duktalen Karzinom einer 23-jährigen Frau.
ATCC
(Bestellnummer CRL-2336)
A.9.2.4.2 Lösungen, Puffer und Reagenzien für die Zellkultur Medium für MCF12A (Lagerung bei 4 °C):
DMEM/F12 (Panbiotech)
132
Medium für HCC38, HCC1395 und HCC1937 (Lagerung bei 4 °C):
RPMI-1640 (Sigma) 10 % (v/v) FBS superior
100 U/mL Penicillin/Streptomycin 4,5 mg/mL Glucose
2,4 mg/mL HEPES
0,11 mg/mL Natriumpyruvat
Tabelle A5 Verwendete Primer
Primer Sequenz
miR194-2HG_ChIP2 fw gtttcttgtgagctgctccc miR194-2HG_ChIP2 rv ggacctttgctaaccccaga
Tabelle A6 Verwendete Sonden für qPCR
Zielgen / ZielmiRNA Bestellnummer Hersteller
miR-192 000491 Life Technologies/Thermo Fisher
Scientific, Langenselbold, Deutschland
miR-194-5p 000493 Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
primiR-194-1 Hs03303313_pri Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
primiR-194-1 Hs03302784_pri Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
133
miR194-2HG Hs03856391 Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
RNU6B 001093 Life Technologies/Thermo Fisher
Scientific, Langenselbold, Deutschland
ARHGAP19 Hs00999645_m1 Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
DEPDC1B Hs00921669_m1 Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
MSI2 Hs01592569_m1 Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
TBP Life Technologies/Thermo Fisher
Scientific, Langenselbold, Deutschland
Tabelle A7 Verwendete miRNA-mimics und siRNAs
Produkt Bestellnummer Hersteller
Allstars Negative Control siRNA SI03650318 Qiagen, Hilden, Deutschland siARHGAP19 #6 SI04145358 Qiagen, Hilden, Deutschland siARHGAP19 #7 SI04147234 Qiagen, Hilden, Deutschland
siMSI2 #7 SI04312665 Qiagen, Hilden, Deutschland
siMSI2 #8 SI04312665 Qiagen, Hilden, Deutschland
syn-hsa-miR-192-5p miScript
134 Tabelle A8 Verwendete Antikörper
Antikörper Bestellnummer Hersteller
a-AGO2 11A9-100 Chromotek, Planegg,
Deutschland
acH3K9 9649S Cell Signaling Technology,
Leiden, Niederlande
acH4K5 07-327 Merck, Darmstadt,
Deutschland
acH4K8 07-328 Merck, Darmstadt,
Deutschland
acH4K12 07-595 Merck, Darmstadt,
Deutschland
acH4K16 07-329 Merck, Darmstadt,
Deutschland
aHa (IgG) 7c9-100 Chromotek, Planegg,
Deutschland
Argonaute 2 C34C6 Cell Signaling Technology,
Leiden, Niederlande
ARHGAP19 sc-398428 Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg, Deutschland
ß-Actin 3700 Cell Signaling Technology,
Leiden, Niederlande
H3 (unmodified) ab1791 Abcam, Cambridge, UK
H4 (unmodified) ab10158 Abcam, Cambridge, UK
Mouse Ig 554002 Becton-Dickinson, Heidelberg,
Deutschland
MSI2 ab76148 Abcam, Cambridge, UK
Rabbit IgG sc-2004 Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg, Deutschland
135 Tabelle A9 Verwendete Chemikalien
Chemikalie Hersteller
Agarose TopVision Fermentas/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Ammoniumpersulfat für Elektrophorese Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Bovines Serumalbumin Cell Signaling Technology, Leiden, Niederlande
DL-Dithiothreitol solution (DTT) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
EDTA-Lösung (0,5 M) Lonza, Köln, Deutschland EDTA-Dinatriumsalz-Dihydrat Merck, Darmstadt, Deutschland
Essigsäure, 100 % J. T. Baker / Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Ethanol, absolut J. T. Baker / Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Ethidiumbromid (1%ige Lösung in Wasser)
Merck, Darmstadt, Deutschland
Formaldehyd, 16 % (w/v), methanolfrei Pierce / Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Glycin Applichem, Darmstadt, Deutschland
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland
Isopropanol J. T. Baker / Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Kaliumchlorid Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Kaliumhydroxid Merck, Darmstadt, Deutschland
Methanol J. T. Baker / Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Magnesiumchlorid Hexahydrat Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
136
Milchpulver, fettarm, blottinggrade Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Natriumfluoridlösung, 0,5 M Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland
Natriumchlord Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland
Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt, Deutschland PBS-Trockensubstanz ohne Ca/Mg Merck, Darmstadt, Deutschland
Ponceau S Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) (gebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige 30 % Acrylamid-, Bisacrylamid-Stammlösung)
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 % Lösung
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) Merck, Darmstadt, Deutschland Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS)
Tabelle A10 Verwendete Enzyme, Kits und sonstige Reagenzien
Produkt Hersteller
Giemsas Azur-Eosin-Methylenblaufärbung Merck, Darmstadt, Deutschland Caspase-Glo3/7-Assay Promega, Mannheim, Deutschland Cellular Histone Acetylation Assay Kit CycLex Co, Nagano, Japan
Complete EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail
Roche, Mannheim, Deutschland
137
Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo Research, Freiburg im Breisgau, Deutschland
DMEM/F12 Pan-Biotech, Aidenbach, Deutschland
DNA-Ladepuffer 6x Thermo Fisher Scientific,
Braunschweig, Deutschland
Dynabeads Protein G Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland
FBS superior Merck, Darmstadt, Deutschland
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
Gene Expression Wash Buffer Kit Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
Gene Ruler 100 bp plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Giemsa-Lösung Merck, Darmstadt, Deutschland
Glucoselösung (100g/L) Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland
HEPES-Lösung (1M) Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland
High Capacity Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
miRNA complete Labeling Reagent and Hyb Kit
Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
miRNA Spike-In Kit Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
Natriumpyruvat (100 mM) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
138
One-color Spike-in Kit Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
OptiMEM I Reduced Serum Medium Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
PBS-Lösung ohne Ca²+/Mg²+, steril Merck, Darmstadt, Deutschland PCR Mycoplasmen-Test-Kit I/C PromoCell, Heidelberg, Deutschland Penicillin/Streptomycin, 1000/mL Merck, Darmstadt, Deutschland Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad, München, Deutschland Pureproteome Protein G Magnetic Beads Merck, Darmstadt, Deutschland QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Deutschland
Recovery Cell Culture Freezing Medium Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
RNA Spike-In Kit, one color Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Deutschland
Roti-Load 1 Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Slim-Fast Schokolade Allpharm, Messel, Deutschland
SurePrint G3 Human miRNA r 21.0 8x60K Microarray Kit
Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
SYBRGreen PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Takyon ROX Probe 2x MasterMix dTTP blue
Eurogentec, Köln, Deutschland Transfektionsreagenz HiPerFect Qiagen, Hilden, Deutschland
139
Trichostatin A Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland
Trypsin / EDTA- Lösung Merck, Darmstadt, Deutschland Ultrapure Salmon Sperm DNA Thermo Fisher Scientific,
Langenselbold, Deutschland Zellproliferationsreagenz WST-1 Roche, Mannheim, Deutschland Tabelle A11 Verwendetes Verbrauchsmaterial
Verbrauchsmaterial Hersteller
96-Well Fast PCR-Platte, Halbrand Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Blottingpapier Whatman GB005 GE Healthcare, Freiburg, Deutschland AFA Microtube 130 µL Covaris/Thermo Fisher Scientific,
Langenselbold, Deutschland Deckgläser für Haemocytometer, 20x26
mm
Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland
Hybridization Chamber Gasket Slides Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
Klebefolie für PCR-Platten, optisch klar Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Mikrotiterplatte 96 well, weiß Greiner Bio-One, Kremsmünster,
Österreich
Millex-GP-Filter, 0,22µM Merck, Darmstadt, Deutschland Nitrocellulose-Membran Amersham
Protran BA83, 0,2 µM
GE Healthcare, Freiburg, Deutschland Nunc Kryoröhrchen, 1,8 mL Thermo Fisher Scientific, Langenselbold,
Deutschland
Ozone-Barrier Slide Cover Kit Agilent Technologies, Waldbronn, Germany
Parafilm Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
PCR SingleCap 8er SoftStrips 0,2 mL Biozym, Hessisch-Oldendorf, Hannover
140 Pipettenspitzen Biosphere 10 µL / 100 µL / 300 µL / 1000 µL
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Pipettenspitzen 10 µL / 100 µL / 1000 µL Nerbe Plus, Winsen (Luhe), Deutschland Reaktionsgefäß 0,6 mL / 1,5 mL / 2 mL Nerbe Plus, Winsen (Luhe), Deutschland Reaktionsgefäß 1,5 mL / 2 mL / 5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Röhre 15 mL / 50 mL / 50 mL mit
Standfuß
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
RNA-Nanochips Agilent Technologies, Waldbronn,
Deutschland
Transwell, 6,5 mm mit 8 µm Porengröße Corning Life Sciences BV, Amsterdam, Niederlande
Zellkulturflasche Standard T25 / T75 / T175
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Zellkulturplatte Standard 96-Well /
24-Well / 12-24-Well / 6-24-Well
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Zellkulturschale 150 cm² Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Tabelle A12 Verwendete technische Ausstattung und Geräte
Gerät Hersteller
Autoklav 3870 ELV Systec GmbH, Linden, Deutschland
Autoklav DX-150 Systec GmbH, Linden, Deutschland
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies, Waldbronn,
Deutschland Biologische Sicherheitswerkbank Safe
2020
Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland
Blottingkammer Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland
CO2-Inkubator Binder CB150 Binder, Tuttlingen, Deutschland DNA-Microarray-Scanner SureScan
High-Resolution Technology
Agilent, Waldbronn, Deutschland
141 Einfriercontainer Mr.Frosty für 1-2 mL Gefäße
Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland
Gel Doc UV Imager System Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland
VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland
Heizblock Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg, Deutschland Hybridisierungsofen ShelLab, Cornelius, OR, USA CO2-Inkubator Binder, Tuttlingen, Deutschland
LAS-3000 Imaging System Fujifilm Europe, Düsseldorf, Deutschland
Magnetrührer MR 3001 K Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland
Magnetständer MPC-S Dynal Biotech, Hamburg, Deutschland Microarray Hybridization Chamber Agilent Technologies, Waldbronn,
Deutschland
Mikrowelle T.D.S. MW81W Samsung, Schwalbach, Deutschland Mikroskop Eclipse TS100-F mit
DS-L3-Kontrolleinheit
Nikon, Düsseldorf, Deutschland
Multidetektionsleser Synergy 2 BioTek Instruments, Bad Friedrichshall, Deutschland
Nanophotometer P300 Implen, München, Deutschland Neubauer Zählkammer Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Ofen UM200 Memmert, Schwabach, Deutschland
pH-Meter Inolab pH Level 2 WTW, Dinslaken, Deutschland
Pipette Pipetman P10 Gilson International, Limburg-Offheim, Deutschland
142
Pipette Pipetman P100 Gilson International, Limburg-Offheim, Deutschland
Pipette Pipetman P1000 Gilson International, Limburg-Offheim, Deutschland
Pipette Research 8-Kanal 30 - 300 µL Eppendorf, Hamburg, Deutschland Pipette Research Plus 0,5 - 10 µL Eppendorf, Hamburg, Deutschland Pipette Research Plus 10 - 100 µL Eppendorf, Hamburg, Deutschland Pipette Research Plus 100 – 1000 µL Eppendorf, Hamburg, Deutschland Pipettierhelfer Accu-jet pro Brand, Wertheim, Deutschland Reinstwasseranlage arium pro UV Sartorius, Göttingen, Deutschland Schüttler SkyLine DRS-12 ELMI, Riga, Lettland
StepOnePlus System Transilluminator LKB 2011 MacroVue Stromversorgungsgerät Power Pack
P25
Biometra, Göttingen, Deutschland Thermocycler PTC-200 MJ Research, St. Bruno, Kanada Thermocycler TProfessional TRIO Biometra, Göttingen, Deutschland Thermomixer Comfort Eppendorf, Hamburg, Deutschland Transilluminator LKB 2011 MacroVue LKB, Bromma, Schweden
Vortex-Schüttler VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland
Wasserbad GFL, Burgwedel, Deutschland
Zentrifuge 5804 R Eppendorf, Hamburg, Deutschland Zentrifuge Allegra 21R Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland Zentrifuge Heraeus Pico21 Thermo Fisher Scientific, Braunschweig,
Deutschland
Zentrifuge VWR Galaxy Mini VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland
MiniSpin Microcentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland
143 Tabelle A13 Verwendete Software und Onlinetools
Software / Onlinetools Hersteller / Internetseite
Ensembl release 91 https://www.ensembl.org/index.html Feature Extraction Software Version
11.0.1.1
Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland
Gen5 Data Analysis Software v1.11 BioTek Instruments, Bad Friedrichshall, Deutschland
Genespring v13.0 Agilent Technologies, Waldbronn,
Deutschland
GEO Datenbank mit Onlinetool GEO2R https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
GraphPad Prism v5.02 GraphPad Software
ImageJ Version 1.51f https://imagej.nih.gov
LAS-3000 Image Reader Software v2.2 Fujifilm Europe, Düsseldorf, Deutschland
Lncipedia 5.0 https://lncipedia.org/
Microsoft Office 2010 (Excel, Powerpoint, Word)
Microsoft Corporation, Redmont, WA, USA
QuantityOne 1-D Analysis Software Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland
SeqPilot Version 4.3.1 JSI Medical Systems GmbH, Ettenheim, Deutschland
StepOne Software Version 2.1 Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland
TargetScan 7.1 http://www.targetscan.org
144 Danksagung
Zuerst möchte ich mich bei Frau Prof. Dr. Brigitte Schlegelberger für die Möglichkeit der Promotion im Institut für Humangenetik der Medizinischen Hochschule bedanken.
Ein weiterer Dank geht an Herrn Prof. Dr. Heiner Niemann als veterinärmedizinischer Betreuer, besonders für die unmittelbare Beratung bei fachlichen und bürokratischen Fragestellungen.
Mein herzlicher Dank gilt Frau Dr. Britta Skawran für ihren Einsatz, der mir ermöglicht hat diese Doktorarbeit zu schreiben sowie ihre hervorragende und unkomplizierte Betreuung.
Vielen Dank an Frau Dr. Beate Vajen für ihr großes Engagement und die vielen, guten Ratschläge.
Dem gesamten Team Epigenomik möchte ich für die gute Arbeitsatmosphäre und die tolle Zusammenarbeit danken.
Weiterhin möchte ich mich bei den Kolleginnen und Kollegen im Institut für Humangenetik für jegliche Hilfe oder einfach nur ein gutes Gespräch bedanken.
Ich danke meiner Familie und meinen Freunden für Ihre Unterstützung, ihre motivierenden Worte und ganz besonders Tabea und Harriet für das Korrekturlesen.
Von ganzem Herzen möchte ich mich bei Manu bedanken, der immer für mich da ist, mir den Rücken stärkt und so viel Geduld hat.
Zu allerletzt möchte ich mich noch bei Frieda für ihre treue Begleitung und den Ansporn für die benötigten Auszeiten bedanken.
145