Aus der Abteilung Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie des Zentrums Innere Medizin
der Medizinischen Hochschule Hannover
Einfluss einer Glutamin-Supplementation auf den Ernährungsstatus, den Krankheitsverlauf
und die intestinale Schleimhautintegrität bei parenteral ernährten Patienten
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Kersten Borchert aus Gardelegen
Hannover, 2003
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 15.03.2004
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Horst von der Hardt Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Stephan C. Bischoff Referent: Priv.-Doz. Dr. med. Gratiana Steinkamp Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. Ernst Kuse
Tag der mündlichen Prüfung: 15.03.2004 Promotionsausschußmitglieder:
Vorsitzender: Prof. Dr. med. Henning Zeidler Mitglied: Prof. Dr. med. Gorig Brunner Mitglied: Prof. Dr. med. Jörn Elsner
Gewidmet
meinen Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG... 5
1.1. Glutamin, eine bedingt essentielle Aminosäure... 5
1.1.1. Glutamin bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED)... 6
1.1.2. Glutamin bei Pankreatitis ... 8
1.1.3. Glutamin bei Lebererkrankungen und Tumoren... 9
1.2. Total Parenterale Ernährung... 11
1.2.1. Definition und Einsatz... 11
1.2.2. Glutamin in der parenteralen Ernährung... 11
1.3. Fragestellung... 12
2. PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN ... 14
2.1. Patienten... 14
2.1.1. Voraussetzung zur Studiendurchführung ... 14
2.1.2. Studiendesign und Rekrutierung ... 14
2.1.3. Studiengruppen... 15
2.2. Monitoring klinischer Parameter ... 16
2.2.1. Anamnese und Untersuchung... 16
2.2.2. Total Parenterale Ernährung... 16
2.2.3. Anthropometrie ... 18
2.2.4. Laborchemische Analysen ... 19
2.3. Messung der Aminosäuren... 22
2.3.1. Messung der Aminosäuren in Plasmaproben ... 22
2.4. Messung der Darmpermeabilität... 23
2.4.1. High Performance Liquid Chromatographie (HPLC)... 23
2.5. Statistik... 25
3. ERGEBNISSE... 26
3.1. Studiengruppe 1: Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen... 26
3.1.1. Charakterisierung der Patienten ... 26
3.1.2. Verlauf der Krankheitsaktivität... 27
3.1.3. Klinisch-Chemische Parameter ... 29
3.1.4. Aminosäuremuster ... 31
3.1.5. Darmpermeabilität... 33
3.2. Studiengruppe 2: Akute Pankreatitis... 35
3.2.1. Charakterisierung der Patienten ... 35
3.2.2. Klinischer Verlauf ... 36
3.2.3. Behandlungsdauer ... 41
3.2.4. Aminosäuremuster ... 42
3.3. Studiengruppe 3: Andere gastroenterologische Erkrankungen ... 46
3.3.1. Charakterisierung der Patienten ... 46
3.3.2. Klinischer Verlauf ... 47
3.3.3. Aminosäuremuster ... 48
4. DISKUSSION ... 50
4.1. Glutamin und chronisch-entzündliche Darmerkrankungen... 50
4.2. Glutamin und Pankreatitis... 53
4.3. Glutamin bei kritisch Kranken... 57
5. ZUSAMMENFASSUNG... 60
6. LITERATURVERZEICHNIS ... 62
7. ANHANG ... 78
7.1. Einwilligung ... 78
7.2. Information für die Station ... 79
7.3. Formblätter... 80
7.3.1. Formblatt zur Berechnung des CDAI... 80
7.3.2. Formblatt zur Berechnung des APACHE II... 81
7.3.3. Formblatt bei unerwünschten Nebenwirkungen ... 82
7.4. Tabellen ... 83
8. DANKSAGUNG ... 97
VERZEICHNIS DER TABELLEN UND ABBILDUNGEN
Tabelle 1: Übersicht der Studiengruppen... 15
Tabelle 2: Diagnosen... 16
Tabelle 3: Zusammensetzung der TPE... 18
Tabelle 4: Anthropometrische Parameter... 19
Tabelle 5: Erhobene Studienparameter ... 20
Tabelle 6: Charakterisierung der Patienten mit CED an Tag 0... 27
Tabelle 7: Charakterisierung der Patienten mit Pankreatitis an Tag 0... 36
Tabelle 8: Plasma-Aminosäurespiegel ... 44
Tabelle 9: Charakterisierung der Patienten ... 46
Tabelle 10: Verstorbene Patienten und Todesursachen ... 47
Tabelle 11: Laborverlauf bei Lebererkrankungen... 47
Tabelle 12: Laborverlauf bei Tumorerkrankungen ... 48
Tabelle 13: Aminosäure-Konzentrationen bei Lebererkrankungen ... 49
Tabelle 14: Aminosäure-Konzentration bei Tumorerkrankungen ... 49
Tabelle 15: Laborparameter an Tag 0 ... 83
Tabelle 16: Laborparameter der Studiengruppe 1 im Verlauf ... 85
Tabelle 17: Laborparameter der Studiengruppe 2 im Verlauf ... 87
Tabelle 18: Laborparameter der Studiengruppe 3 an Tag 0... 89
Tabelle 19: Laborparameter bei Patienten mit Lebererkrankungen im Verlauf ... 90
Tabelle 20: Laborparameter bei Patienten mit Tumorerkrankungen im Verlauf... 91
Tabelle 21: Aminosäure-Konzentration der Studiengruppe 1 im Verlauf ... 92
Tabelle 22: Aminosäure-Konzentration der Studiengruppe 2 im Verlauf ... 93
Tabelle 23: Aminosäure-Konzentration in Abhängigkeit vom CRP ... 94
Tabelle 24: Aminosäure-Konzentration in der Studiengruppe 3 an Tag 0 ... 96
Abbildung 1: Chemische Struktur von Glutamin... 5
Abbildung 2: Aufbau einer HPLC-Anlage... 24
Abbildung 3: Verlauf des CDAI ... 28
Abbildung 4: Verlauf von CRP und Leukozyten ... 28
Abbildung 5: Steroid-Therapie... 29
Abbildung 6: Verlauf des Serum-Harnstoff ... 30
Abbildung 7: Verlauf der Lymphozyten ... 31
Abbildung 8: Gesamt-Aminosäurekonzentration... 32
Abbildung 9: Glutamin-Konzentration ... 32
Abbildung 10: Glutamat- und Phenylalaninkonzentration... 33
Abbildung 11: Änderung der Permeabilität ... 34
Abbildung 12: CDAI-Änderung bezogen auf die Permeabilität... 35
Abbildung 13: APACHE II und CRP im Verlauf ... 37
Abbildung 14: sTNFR-75... 38
Abbildung 15: Verlauf der Leukozyten- und Lymphozytenzahlen ... 39
Abbildung 16: Viscerale Proteine im Verlauf... 39
Abbildung 17: Verlauf der Triglyceride und des Cholesterin... 40
Abbildung 18: Kaplan-Meyer-Analyse der stationären Behandlung und der TPE-Dauer... 41
Abbildung 19: Behandlungsdauer und TPE-Kosten ... 42
Abbildung 20: Hospitalisations- und TPE-Dauer ... 42
Abbildung 21: Verlauf von Plasma-Glutamin und Gesamt-Aminosäuren ... 45
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN
AA aromatische Aminosäure(n) ALA Alanin
AP Alkalische Phosphatase APACHE II acute physiology and health
evaluation score II ARG Arginin
AS Aminosäure(n) ASN Asparagin β-ALA Beta-Alanin BB Blutbild
BCAA branched-chained amino acids (verzweigt-kettige AS) BCM Body Cell Mass
(Körperzellmasse) BF Body Fat (Körperfett) BMI Body Mass Index Ca2+ Calcium
CCC Cholangiozelluläres Karzinom CDAI crohn's disease activity index
CED Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen
CHE Cholin-Esterase CIT Citrullin CK Kreatin-Kinase Cl- Chlorid CO2 Kohlendioxid CRP C-reaktives Protein CT Computertomographie CYS Cystin
DNA Desoxyribonukleinsäure ECM Extrazellulärmasse EE energy expenditure
(Energieumsatz)
γ-GT Gamma-Glutamyl-Transferase GI-Trakt Gastrointestinal-Trakt
GLDH Glutamat-Dehydrogenase GLN Glutamin
gln- Kontroll-Gruppe gln+ Glutamin-Gruppe GLU Glutaminsäure GLY Glycin
GOT Glutamat-Oxalacetat-Transferase GPT Glutamat-Pyruvat-Transferase HCC Hepatozelluläres Karzinom HIV humanes immundefizienz Virus HPLC High performance liquid
chromatographie
IgA Immunglobulin A ILE Isoleucin
K+ Kalium
LBM Lean Body Mass (Magermasse) LDH Laktat-Dehydrogenase LEU Leucin
LTx Lebertransplantation LYS Lysin
MΩ Mega-Ohm M. Crohn Morbus Crohn M. Wilson Morbus Wilson
MCT mittelkettige Fettsäuren MET Methionin
Mg2+ Magnesium MW Mittelwert n.s. nicht signifikant Na+ Natrium
ORN Ornitin PBC Primär Biläre Zirrhose
PDA Pulsed Amperometric Detector PHE Phenylalanin
PRO Prolin
PSC Primär Sklerosirende Zirrhose PTT partielle Thromboplastinzeit R Resistance (Widerstand) REE resting energy expenditure
(Ruheenergieumsatz)
SD Standardabweichung SER Serin
SIRS systemic inflamatory response syndrom
sTNFR-75 löslicher Tumor-Nekrosefaktor Rezeptor p75
TAU Taurin
TBW Total Body Water (Gesamt Körperwasser)
THR Threonin TNF- Tumor Nekrose Faktor TPE Total parenterale Ernährung TRY Tryptophan
TYR Thyrosin VAL Valin Xc Reactance
XLM-Test Xylose-Lactulose-Mannitol-Test XL-Ratio Xylose-Lactulose-Ratio
Einleitung 5
1. Einleitung
1.1. Glutamin, eine bedingt essentielle Aminosäure
Glutamin ist die am häufigsten vorkommende Aminosäure im menschlichen Organismus. Sie zirkuliert im menschlichen Blut mit einer Konzentration von 500-800 µmol/l. Eine 70 kg schwere Standardperson mit 15 kg Muskelmasse und 20 % des Körpergewichts extrazelluläre Flüssigkeit hat einen intrazellulären (Muskel-) Glutaminpool von ca. 300 mmol und einen extrazellulären Pool von ca. 7 mmol (1). Die intrazelluläre Glutaminkonzentration ist somit 30fach erhöht gegenüber dem Extrazellulärraum, wodurch ein großer Gradient zwischen beiden Räumen entsteht (2, 3). Die meisten anderen Aminosäuren zirkulieren mit deutlich niedrigeren Konzentrationen, weshalb die Abgabe an die unterschiedlichen Gewebe (Substratabgabe = Blutfluss x Konzentration) weit geringer ist als beim Glutamin. Diese Tatsache, sowie das Vorhandensein von zwei Aminogruppen erklärt, warum Glutamin als wichtigstes „Stickstoff-Shuttle“ verantwortlich für 30-35 % des gesamten im Blut transportierten Aminosäure-Stickstoffs ist (4).
Abbildung 1: Chemische Struktur von Glutamin
Die neutrale Aminosäure Glutamin mit einem Molekulargewicht von 146,1 besitzt im Gegensatz zu den meisten anderen Aminosäuren zwei Stickstoffseitenketten (eine α-Aminogruppe und eine Amid-Gruppe)
Für viele Stoffwechselwege ist Glutamin ein wichtiges Substrat. In der Gluconeogenese kann das Kohlenstoffgerüst des Glutamins in der Leber und der Niere zu Glukose umgebaut werden (5). Glutamin ist das wichtigste Substrat für die renale Ammoniakbildung (6, 7), ein essentieller Vorläufer in der Nukleotidbiosynthese (dies scheint zum Teil den modulierenden Effekt auf proliferierende Zellen zu erklären), ein Regulator der Glycogen- und Proteinbiosynthese, sowie aufgrund der hohen Konzentration, in der es in vielen Zellen vorkommt, als Ammoniakfänger und als Stickstoffdonor für die Biosynthese einer Vielzahl von wichtigen Zellbestandteilen (Aminozucker, Aminosäuren). Glutamin stellt das wichtigste metabolische Substrat für die Zellen des Gastrointestinaltraktes (Enterozyten, Kolonozyten) und vieler anderer schnell proliferierender Zellen, einschließlich der des Immunsystems dar (8-10). Hauptlieferanten von Glutamin sind die Lunge und die Skelettmuskulatur, welche in der Lage sind, Glutamin de novo aus Glutamat und Ammoniak mit Hilfe der Glutaminsynthetase zu bilden (11). Im Gegensatz dazu katalysiert die Glutaminase die
CH CH
CH2
C H2 O
NH2 NH3
(+)
O
O
(-)
Einleitung 6 Hydrolyse des Glutamin zu Glutamat und Ammoniak. Dies geschieht hauptsächlich in den glutaminkonsumierenden Zellen, wie z.B. den Mucosazellen des Darms, den Lymphozyten oder den Tubuluszellen der Niere (2). Eine Ausnahme hierzu stellt die Leber dar, welche abhängig vom Bedarf anderer Organe sowohl Glutamin synthetisieren als auch konsumieren kann.
Im Hungerzustand hat der Darm mit ca. 3 mmol/h einen Anteil von ca. 12 % am gesamten Glutamin-Turnover. Der first-pass-Effekt im Splanchnikusgebiet nach enteraler Glutaminsupplementation beträgt ca. 35-50 % (8).
Während kataboler Situationen wie Fasten, Operationen, Traumen oder Infektionen sinken die Glutaminkonzentrationen in Blut und Gewebe deutlich ab (12-14). Die Abnahme der Glutaminkonzentration übersteigt die aller anderen Aminosäuren und dauert auch während der Erholungsphase noch an, während andere Aminosäuren bereits wieder normale Konzentrationen erreicht haben. Dabei korreliert die Rückkehr der Glutaminkonzentration auf das Niveau vor Schädigung mit der Rückkehr funktioneller Kapazität des Gewebes. Die enge Beziehung zwischen der Konzentration von freiem Muskel-Glutamin und der Rate der Proteinsynthese legt die Vermutung nahe, dass die Erhaltung des intrazellulären Glutaminpools die Erhaltung von Muskelprotein während katabolem Stress fördert (15, 16).
Daraus wurde abgeleitet, dass Glutamin in katabolen Situationen zu einer bedingt essentiellen Aminosäure wird (17-19).
1.1.1. Glutamin bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED)
In der Bundesrepublik Deutschland treten chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (Morbus Crohn, Colitis ulcerosa) mit einer Inzidenz von 2-8 Neuerkrankungen pro Jahr und 100 000 Einwohner auf. Bis heute ist die Ätiologie dieser Erkrankungen nicht sicher geklärt.
Als mögliche Ursachen werden Störungen der Regulation des intestinalen Immunsystems, Autoimmunmechanismen oder infektiologische Ursachen diskutiert. Hierbei gilt besonderes Augenmerk dem Zusammenhang zwischen M. Crohn und der Region des NOD2-Gens (CARD15) auf Chromosom 16. Das Protein NOD2/CARD15 wird in Monozyten exprimiert und dient als cytosolischer Rezeptor für bakterielle Lipopolysaccharide (20). Hierdurch wird die Aktivierung von NF-κB, einem entscheidenden Mediator der Entzündungsreaktion, getriggert. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass eine Mutation dieses Gens mit M. Crohn des Ileums sowie der fibrostenotischen Form des M. Crohn assoziiert ist (21-23).
Die Standardtherapie einer akuten Exazerbation der Erkrankung umfasst neben der Medikation mit lokalen oder systemischen entzündungshemmenden Substanzen
Einleitung 7 (Salazosulfapyridin, 5-Aminosalizylsäure, Prednisolon, u.a.) bei einigen Patienten eine vorübergehende künstliche Ernährung (24, 25).
Die Ernährung von Patienten mit CED hat eine ernährungsmedizinische und therapeutische Indikation. Während die ernährungsmedizinische Indikation insbesondere den Ernährungszustand des Patienten berücksichtigt, zielt die therapeutische Indikation auf die Beeinflussung der Krankheitsaktivität.
Eine negative Nährstoffbilanz wird beispielsweise durch intestinale Verluste verursacht (Malassimilation, hochsitzende Fistel etc.). Die Schwere der Verluste korreliert mit der Darmwandschädigung im Rahmen der Erkrankung. Es konnte bereits gezeigt werden, dass eine künstliche enterale oder parenterale Ernährung unabhängig von einer medikamentösen Therapie einen therapeutischen Effekt besitzt (26, 25). Sowohl der akute Schub, als auch die Remissionsdauer der Erkrankung werden günstig beeinflusst. Dieser Effekt ist unabhängig von der Krankheitsaktivität und der Lokalisation der Erkrankung.
Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sind durch entzündliche Veränderungen der intestinalen Mukosa mit Mukosaatrophie, erhöhter intestinaler Permeabilität und daraus resultierender systemischer Endotoxinämie charakterisiert (27, 28). Die erhöhten Endotoxin- Konzentrationen korrelieren mit der Aktivität der Grunderkrankung und werden als ein pathogenetischer Faktor der entzündlichen Darmerkrankung diskutiert (28). Die Endotoxinämie und die erhöhte Freisetzung von Zytokinen werden unter anderem als eine Ursache der katabolen Stoffwechselveränderungen und der daraus resultierenden Mangelernährung bei Patienten mit Morbus Crohn und anderen chronisch-entzündlichen Erkrankungen gesehen (29-31).
Zusätzlich fördert die Gabe von Steroiden (1 mg/kg/d) und die vorübergehende parenterale Ernährung der Patienten im akuten Schub der Erkrankung zu einer Mukosaatrophie (27).
Bereits die über mehrere Tage dauernde total parenterale Ernährung allein führt zu einer erheblichen Darmatrophie mit Abnahme der Mukosadicke und Höhe der Villi (32, 33). Dabei kommt es zu einer Veränderung der Enzymaktivität (34) und einer Abnahme der sekretorischen IgA-Level im Darm. Im Tierversuch war damit eine erhöhte bakterielle Translokation aus dem Darm verbunden (35). Diese Effekte werden zum Teil auf das Fehlen von Glutamin, dem Hauptenergiesubstrat für das Dünndarmepithel, in Standard-TPE- Lösungen zurückgeführt (36). Eine Zufuhr von Glutamin führt zu einer erhöhten Glutaminaufnahme und einer gesteigerten Verstoffwechselung im Intestinum (37). In einer 1993 publizierten Studie zur parenteralen Anwendung von Glutamin bei Patienten während TPE konnte anhand des Lactulose-Mannitol-Belastungstests eine weitgehend konstante
Einleitung 8 intestinale Permeabilität und Atrophie der Mukosa in der Glutamin-Gruppe gezeigt werden, während in der konventionell ernährten Gruppe beide Parameter zunahmen (38). Dieser Effekt war auch bei den wenigen in der Studie eingeschlossenen Patienten mit entzündlicher Darmerkrankung nachweisbar. Diese in vivo Ergebnisse bestätigen entsprechende Experimente an intestinalen Zellen in vitro (39).
Im akuten Schub eines Morbus Crohn ist der oxidative Stress durch freie Radikale erhöht.
Glutathion ist ein wichtiges Antioxidans zum Schutz des Gewebes vor einer Schädigung durch Radikale (40, 41). Dies ist möglich durch die im Glutathion vorhandenen Disulfidbrücken. Glutamin ist das Hauptsubstrat in der Glutathionsynthese (42, 43) und spielt somit auch eine Rolle bei der Protektion vor freien Radikalen.
Die bisherigen Ergebnisse lassen vermuten, dass die parenterale Gabe von Glutamin einen positiven Effekt auf den Verlauf eines akuten Schubes einer entzündlichen Darmerkrankung haben könnte. Es sollte durch die Gabe von Glutamin möglich sein, sowohl intestinale Funktionen als auch die damit zusammenhängende systemische Endotoxinämie günstig zu beeinflussen. Deshalb sollte in der vorliegenden Untersuchung geprüft werden, ob eine parenterale Substitution mit Glutamin einen positiven Effekt auf den Krankheitsverlauf und insbesondere auf die Darmpermeabilität und -integrität bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen hat (24).
1.1.2. Glutamin bei Pankreatitis
Die akute Pankreatitis ist eine Erkrankung mit einer Inzidenz von 38 pro 100 000 Einwohner und Jahr. Rund 25 % der Patienten entwickeln eine schwere Pankreatitis mit lebensbedrohlichen Komplikationen und einer Mortalität von 6-8 %. Der klinische Verlauf der Erkrankung ist einerseits abhängig vom Grad der lokalen Komplikationen (Nekrosen (44), Pseudozysten (45, 46)) andererseits von der systemischen inflammatorischen Reaktion. Bei der akuten Pankreatitis scheint möglicherweise eine gestörte Mucosabarriere im Darm der Grund für die Endotoxinämie und Bakteriämie zu sein, welche das systemic inflammation response syndrom (SIRS) beschleunigen. Desweiteren sind endogene Bakteriämien die Hauptursache für sekundäre Infektionen von nekrotischen Arealen. Ungeachtet der jüngst publizierten Ergebnisse bezüglich früher enteraler Ernährung bei Patienten mit akuter Pankreatitis (47-49) gehört die parenterale Ernährung häufig immer noch zum Behandlungskonzept der akuten Pankreatitis (50, 51). Es wird angenommen, dass eine über einen längeren Zeitraum durchgeführte parenterale Ernährung bei diesen Patienten mit einer Atrophie der Darmmukosa (32, 33) und gesteigerter intestinaler Permeabilität, (38, 52), verbunden mit bakterieller Translokation, assoziiert ist (35). Dies sind weitere Gründe, die bei
Einleitung 9 der Ausbildung einer Endotoxinämie und Bakteriämie eine Rolle spielen. In katabolen Situationen, wie der akuten Pankreatitis (53), wird Glutamin zu einer bedingt essentiellen Aminosäure (17-19). Glutamin ist ein wichtiges Substrat für exokrine und endokrine Pankreaszellen (54-56). Im Tierversuch konnte gezeigt werden, dass durch Glutaminzusatz zu total parenteraler Ernährung oder Elementardiät eine Pankreasatrophie vermindert werden kann (57, 58). Es ist daher zu vermuten, dass eine Glutamin-Supplementation einen positiven Effekt auf den Verlauf von akuten Pankreatitiden hat. Dies sollte in der vorliegenden Studie ebenfalls geprüft werden.
1.1.3. Glutamin bei Lebererkrankungen und Tumoren
Auch im Rahmen der Leberzirrhose wird eine gesteigerte intestinale Permeabilität beobachtet, die verbunden ist mit einer systemischen Endotoxinämie (59) und einer erhöhten Mortalität (60, 61). Die Endotoxinämie mit der daraus folgenden Zytokinfreisetzung ist auch ein Grund für den veränderten Proteinstoffwechsel, der durch eine reduzierte Proteinsynthese und einen erhöhten Proteinabbau charakterisiert ist (62). Dies verstärkt das Ausmaß der Proteinmangelernährung. Eine Proteinmangelernährung ist mit einer schlechteren Prognose und einer höheren Mortalität nach Lebertransplantation verbunden (63).
Eine zusätzliche Zufuhr von Glutamin erhöht dessen Verstoffwechselung im Intestinum (37).
Dadurch kommt es zu einem Erhalt oder einer Verbesserung der intestinalen Barriere und einer Reduktion der eingeschwemmten Endotoxine und der freigesetzten Zytokine (35, 38).
Es sollte durch die Gabe von Glutamin möglich sein, sowohl die intestinale Funktion als auch die katabole Stoffwechselsituation bei Patienten mit Leberzirrhose günstig zu beeinflussen.
In verschiedenen tierexperimentellen Studien wurde bereits Ende der 80er Jahre der positive Einfluss von Glutamin auf den Leberstoffwechsel nachgewiesen. So konnte gezeigt werden, dass die durch eine parenterale Ernährung hervorgerufene Leberverfettung durch eine Glutamin-Supplementation verhindert werden kann, da hierdurch eine Stimulation der Glukagonsekretion und Senkung des Insulin/Glukagon-Verhältnisses sowie eine Senkung der peripheren Lipolyse und Fettaufnahme in die Leber erreicht werden (36, 58, 64, 65).
Bei ausgeprägter Leberschädigung sind freie Sauerstoffradikale ursächlich an der Entstehung der Gewebsschädigung beteiligt. Wie bereits im Kapitel 1.1.1 erwähnt, kommt dabei dem Glutathion und dem Glutamin als Substrat für das Glutathion eine wichtige Bedeutung als Radikalfänger zu (40 – 43). Bei schwerem Leberschaden konnte durch eine Glutamingabe der Abfall von Glutathion und der Anstieg von Leberenzymen vermindert werden (66).
Zu beachten ist jedoch, dass ein Teil des Glutamins zu Ammoniak verstoffwechselt wird. Bei Patienten mit Leberzirrhose ist die Plasmakonzentration von Ammoniak aufgrund eines
Einleitung 10 erhöhten portokavalen Shunts und einer eingeschränkten Clearance in der Leber oftmals erhöht und mit der hepatischen Enzephalopathie assoziiert. Die Gabe von 0,5 g/kg/d Glutamin bei einem 70 kg schweren Patienten führt zu einer zusätzlichen Ammoniakproduktion von ca.
70 mmol/h. Nach bisherigen Untersuchungen beträgt die Detoxifikationsfähigkeit für Ammoniak bei Leberzirrhotikern ca. 2,0 mmol/h/kg (140 mmol/h bei 70 kg). Demnach sollte z.B. die Gabe von 0,3 g/kg/d Glutamin ohne wesentliche Erhöhung des Ammoniakspiegels möglich sein. Hierzu fehlen jedoch bisher entsprechende klinische Daten.
Bisher sind keine Untersuchungen publiziert, die den Einsatz von Glutamin bei Patienten mit Leberzirrhose untersucht haben. In der vorliegenden Untersuchung möchten wir den Effekt einer höheren Glutaminzufuhr bei Patienten mit Leberzirrhose zeigen.
Bei Tumorbefall kann der Tumor zu einem Hauptkonsumenten für Glutamin werden, bedingt durch die hohen Reproduktionsraten dieser Zellen (67, 68). Durch den hohen Verbrauch von Glutamin im Tumor kommt es zu einem Abfall der Aktivität der Glutaminase in der Darmmukosa, dem wichtigsten Enzym der Glutaminhydrolyse in den Darmepithelien (69).
Dadurch kommt es zu einem Abfall der Muskel-Glutaminkonzentration. Die Leber ändert in dieser Situation ihre Eigenschaft von einem Glutaminkonsumenten zu einem Glutaminproduzenten. Allerdings kommt es dabei, im Gegensatz zum Fasten oder während einer Azidose, nicht zu einem Ammoniakanstieg im Plasma (68). Der Abfall der Muskel- Glutaminkonzentration und damit das Auftreten einer Mangelernährung konnte in tierexperimentellen Studien durch Glutamingabe verhindert werden, ohne dabei das Wachstum des Tumors zu beschleunigen (70). Durch die Gabe von Glutamin kann möglicherweise auch bei Tumorpatienten einer Malnutrition entgegengewirkt werden.
Ausserdem bestehen Vermutungen, durch die Erhöhung der Anzahl von Zellen in der Mitose diese Tumorzellen anfälliger für zellzyklus-spezifische Chemotherapien zu machen (71).
Allerdings gibt es keine veröffentlichten Ergebnisse bezüglich des Einflusses von Glutamin auf den Verlauf von Tumorerkrankungen.
Einleitung 11
1.2. Total Parenterale Ernährung
1.2.1. Definition und Einsatz
Bei der künstlichen Ernährung eines Patienten unterscheidet man zwischen oraler (Trinknahrung), enteraler (Sondenkost) und total parenteraler Ernährung (TPE). Bei der TPE kann es sich entweder um standardisiert oder individuell hergestellte intravenöse Substratlösungen handeln. Die Indikation zur total parenteralen Ernährung sollte streng gestellt werden. Als Grundlage können die Kriterien der ASPEN von 1996 betrachtet werden.
Dabei gilt als Grundsatz, dass eine parenterale Ernährung dann durchzuführen ist, wenn eine enterale Ernährung nicht möglich ist. Beispielindikationen sind:
1. Unfähigkeit zur Nahrungsaufnahme über den GI-Trakt (z.B. Kurzdarmsyndrom, Strahlenenteritis, Ileus, stenosierende Tumoren, unstillbares Erbrechen)
2. Akute Pankreatitis
3. Akuter Schub einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung (besonders bei intestinaler Blutung oder Fistelbildung)
4. Bewusstseinsverlust und konsekutive Schluckunfähigkeit (z.B. Koma, Polytrauma)
5. Chronisch-konsumierende Erkrankungen (z.B. Tumorerkrankung oder fortgeschrittene Leberzirrhose), insbesondere bei Anwendung von hochdosierter Chemotherapie
6. wenn eine bedarfsdeckende orale oder enterale Ernährung nicht möglich ist
Allen Indikationen gemein ist die Tatsache, dass der Patient nicht in ausreichendem Maße oral oder enteral Nahrung zuführen kann, darf oder will. Ist eine enterale Ernährung innerhalb von 5-7 Tagen möglich, so ist häufig eine parenterale Ernährung nicht nötig und sollte vermieden werden, da es unter parenteraler Ernährung zu Komplikationen wie Infektionen über den zentralvenösen Zugangsweg oder Darmatrophie kommen kann (72, 73).
1.2.2. Glutamin in der parenteralen Ernährung
Grundlegender Bestandteil einer total parenteralen Ernährung sind Aminosäurelösungen.
Idealerweise sollten diese Lösungen alle essentiellen und nicht-essentiellen Aminosäuren enthalten. Dies ist allerdings aufgrund der besonderen chemisch/physikalischen Eigenschaften einiger Aminosäuren nicht möglich (74, 75). So oxidiert z.B. Cystein bei neutralem oder leicht alkalischem pH-Wert während der Hitzesterilisation und Lagerung sehr schnell und bildet das Dimer Cystin, welches mit 0,1 g/l H2O sehr schlecht löslich ist und ausfällt. Ebenso schlecht löslich ist auch Taurin (0,4 g/l), was dazu führt, dass es in nur unzureichenden
Einleitung 12 Konzentrationen von 0,4-0,5 g/l in Aminosäurelösungen vorhanden ist. Gleiches gilt auch für Glutamin, das als Monoaminosäure aufgrund seiner spezifischen chemisch/physikalischen Eigenschaften kommerziell erhältlichen Aminosäurelösungen nicht hinzugefügt werden kann.
Zu diesen Eigenschaften gehört zum einen der Abbau von gelöstem Glutamin zum zyklischen Produkt Pyroglutamat, verbunden mit der Freisetzung von Ammoniak (76), zum anderen die mit 35 g/l geringe Löslichkeit von L-Glutamin in Wasser (74). Aminosäurelösungen, die freies Glutamin enthalten, müssen täglich frisch und unter streng sterilen Bedingungen hergestellt und bei maximal 2-4 °C gelagert werden, bzw. es müssen die Glutaminlösungen bei –20 °C gelagert werden (77). Um eine Ausfällung zu verhindern, darf die Glutaminkonzentration 1- 1,5 % nicht überschreiten (75). Allerdings reichen diese Konzentrationen nicht aus, um den Bedarf von z.B. kritisch kranken Patienten zu decken. So blieb die Verwendung von freiem Glutamin lediglich kontrollierten klinischen Studien vorbehalten (17, 78, 79). Aufgrund der in diesen Studien gezeigten positiven Effekte wurde nach anderen Möglichkeiten der Applikation dieser Aminosäuren gesucht. Da kurzkettige Peptide offensichtlich effizient verwertet werden (80), wurden Glutamin-, Cystein- oder Thyrosinhaltige kurzkettige Peptide synthetisiert und deren in vivo Aufnahme und die spätere Verwertung in Geweben anhand von Tiermodellen, an gesunden Probanden und später an Patienten mit verschiedenen Erkrankungen untersucht. Dabei hat sich gezeigt, dass synthetisch hergestellte Dipeptide in Wasser hochlöslich (z.B. Bis-Glycyl-L-Cystin 541 g/l; L-Alanyl-L-Glutamin 586 g/l) (74) und auch während der Hitzesterilisierung thermostabil bleiben. Damit wurden alle erforderlichen chemisch/physikalischen Eigenschaften für den klinischen Gebrauch von Dipeptiden erbracht, und auch die gefahrlose parenterale Applikation selbst hoher Konzentrationen von bioverfügbarem Glutamin wurde möglich (81). Dabei waren keine Nebenwirkungen einer Glutamin-Supplementation zu beobachten (82, 83). Nach der Bereitstellung kommerzieller Glutamin-Dipeptid-Lösungen stehen diese auch einer breiten klinischen Anwendung zur Verfügung (z.B. Dipeptamin®= Alanyl-Glutamin, Fresenius AG, Glamin®= Glycyl-Glutamin, Baxter GmbH).
1.3. Fragestellung
In der vorliegenden Dissertationsarbeit soll untersucht werden, wie sich die Supplementation einer total parenteralen Ernährung mit Glutamin auf den Krankheitsverlauf (subjektives Empfinden, Laborparameter, klinische Parameter, Scores) und auf die intestinale Schleimhautintegrität (D-Xylose-Test, Lactulose-Test) bei Patienten mit gastroenterologischen Erkrankungen auswirkt. Ebenso soll der Plasma-Glutaminspiegel unter dem Einfluss einer Glutamin-Supplementation der TPE untersucht werden.
Einleitung 13 Ausgangspunkt für diese Untersuchungen war ein i.v.-Glutaminpräparat (Dipeptamin®, Fa.
Fresenius), welches Glutamin in Form eines wasserlöslichen Alanyl-Glutamin-Dipeptides enthält.
Mit der Durchführung der Studie soll der Nachweis gelingen, dass eine Glutamin- Supplementation bei gastroenterologischen Patienten einen positiven klinischen Effekt hat. Es wird erwartet, dass sich dieser Effekt in einer Verbesserung klinisch-chemischer Parameter, den angewandten Funktionstests oder einer Verkürzung der Hospitalisierungs- und Parenteralisierungsdauer bei den Patienten der Glutamin-Gruppe im Vergleich zur Kontroll- Gruppe zeigt. Dies soll mit Hilfe der o.g. Untersuchungen gelingen. Der nachgewiesene klinische Effekt könnte dann zu einem breiteren Einsatz von Glutamin-Supplementen in der parenteralen Ernährung von gastroenterologischen Patienten außerhalb der Intensivmedizin führen.
Patienten, Material und Methoden 14
2. Patienten, Material und Methoden
2.1. Patienten
2.1.1. Voraussetzung zur Studiendurchführung
Bei der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover wurde die Zustimmung (Nummer 1422 vom 23.08.96) zur Durchführung der klinischen Studie "Einfluss von Glutamin-Supplementation auf den Ernährungsstatus, den Krankheitsverlauf und die intestinale Schleimhautintegrität bei Patienten, die parenteral ernährt werden müssen"
eingeholt.
Die Studie wurde nach den Grundsätzen der „Deklaration von Helsinki“, revidierte Fassung vom Oktober 1996, durchgeführt.
2.1.2. Studiendesign und Rekrutierung
Die Studie wurde als prospektive, randomisierte und kontrollierte Follow-up-Studie an 77 Patienten durchgeführt. Gemäß dem Studienprotokoll wurden die Patienten nach ihrer Diagnose zunächst drei Gruppen zugeordnet (Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, Patienten mit Pankreatitis und Patienten mit anderen gastroenterologischen Erkrankungen). Alle drei Gruppen wurden in je zwei Untergruppen randomisiert, von denen eine Gruppe TPE mit Dipeptamin® (Fa. Fresenius AG, Bad Homburg) die andere TPE mit einer Standard-Aminosäurelösung ohne Dipeptamin® erhielt.
Im Rahmen der Studie wurden Patienten der Abteilung Gastroenterologie und Hepatologie, Zentrum Innere Medizin und Dermatologie der Medizinischen Hochschule Hannover, nach den folgenden Ein- und Ausschlusskriterien ausgewählt:
Einschlusskriterien:
1. Studienunabhängige Indikation zur parenteralen Ernährung über ≥ fünf Tage 2. Alter: 16-80 Jahre
3. Schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der klinischen Studie 4. keine Schwangerschaft
Ausschluss- oder Abbruchkriterien:
1. Beendigung der parenteralen Ernährung nach weniger als fünf Tagen 2. Widerruf der Einwilligung
3. Ammoniakanstieg > 50 mmol/l (bei initialen Normalwerten bzw. > 2fach des Ausgangswertes (bei initial erhöhtem Ammoniakspiegel) trotz Dosisreduktion
4. Verdacht auf unerwünschte Effekte von Glutamin (z.B. deutliche Verschlechterung des Krankheitsbildes, die durch Glutamin bedingt sein könnte)
Patienten, Material und Methoden 15 Die Patienten wurden durch die zuständigen Stationsärzte oder durch Ärzte des Ernährungsteams anhand eines Aufklärungs- und Einwilligungsbogens (s. Anhang 7.1) über die Studie informiert und auf mögliche Gefahren hingewiesen.
Erwähnt wurden weiterhin die zur Durchführung der Aminosäure-Messungen benötigten Blutproben, die bei klinisch notwendigen endoskopischen Eingriffen zusätzlich entnommenen Biopsien, die Durchführung des XLM-Tests (nicht bei Ablehnung seitens der behandelnden Ärzte) sowie die im Zusammenhang mit der Auswertung erfolgte Datenerfassung per Computer. Alle Patienten, die sich bereiterklärten, an der Studie teilzunehmen, wurden aufgefordert, den schriftlichen Einwilligungsbogen zu unterschreiben und über die Möglichkeit unterrichtet, jederzeit die Studie ohne Angabe von Gründen abbrechen zu können. Bei Patienten, die nicht einwilligungsfähig, bzw. nicht volljährig waren, wurde die Einwilligung von den gesetzlichen Vertretern bzw. Angehörigen eingeholt. Die Einteilung in die verschiedenen Studiengruppen erfolgte anschließend nach dem oben angegebenen Schema.
2.1.3. Studiengruppen
Insgesamt konnten 77 Patienten für die prospektive Studie ausgewertet werden. In Tabelle 1 sind die Studiengruppen (CED, Pankreatitis, Lebererkrankung/Tumoren/andere Erkrankungen) mit 1, 2 und 3 bezeichnet. Jede Gruppe wurde in zwei Untergruppen (Glutamin-Gruppe: G1, ... und Kontroll-Gruppe: K1, ...) unterteilt. In den drei Studiengruppen gab es zwischen der Glutamin- und der Kontroll-Gruppe keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich Anzahl, Geschlechtsverteilung, Alter und Dauer der TPE. Die einzelnen Diagnosen in den verschiedenen Studiengruppen sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 1: Übersicht der Studiengruppen
Studiengruppe 1 2 3 Total
G1 K1 G2 K2 G3 K3 Glutamin ja nein ja nein ja nein
Anzahl Patienten (n) 12 12 14 14 11 14 77 Geschlecht (m:w) 6:6 9:3 7:7 9:5 5:6 7:7 43:34 Alter (Jahre) 30,1
(23,7-45,7)
40,0 (28,1-56,5)
57,6 (20,1-77,5)
54,2 (27,5-80,6)
49,7 (37,8-65,5)
59,9 (51,3-72,7)
49,9 (32,8-64,6) Alter (Jahre): Spanne 16 - 69 26 - 64 20 - 78 28 - 81 27 - 78 30 - 77 16 - 81 TPE-Dauer (d): 24,5
(17,5-34,5)
18,5 (14,3-20,8)
9,5 (6 – 16)
16 (10 – 18)
10,0 (7,0-21,0)
17,0 (9,0-27,0)
16,0 (9,0-24,0) TPE-Dauer (d): Spanne 5 - 92 7 - 47 5 - 45 6 - 39 7 - 31 6 - 37 5 - 92
Patienten, Material und Methoden 16 Tabelle 2: Diagnosen
Primärdiagnose Glutamin Kontrolle Total
Studiengruppe 1
M. Crohn 9 10 19
Colitis ulcerosa 3 2 5
Studiengruppe 2
Akute Pankreatitis 13 13 26 Akuter Schub einer chron. Pankreatitis 1 1 2
Studiengruppe 3
Divertikulitis 1 3 4
Infektiöse Enteritis 2 1 3
Leberzirrhose 3 1 4
Carcinom der Leber oder Gallenwege 1 2 3
Lebermetastasen 1 1 2
Autoimmunerkrankung der Leber (PBC, PSC) 0 2 2 Sonstige Erkrankung der Leber oder Gallenwege* 0 2 2 Carcinom (extrahepatisch) 3 2 5
Total 37 40 77
*Z.n. LTx. mit Transplantatversagen, Cholangitis
Aufgrund der in Tabelle 2 ersichtlichen Heterogenität in der Studiengruppe 3 haben die Daten dieser Gruppe lediglich einen deskriptiven Charakter. Eine Aufteilung der Gruppe in Untergruppen mit vergleichbaren Diagnosen konnte nicht erfolgen, da eine statistische Auswertung aufgrund der zu geringen Gruppengröße nicht mehr möglich gewesen wäre.
2.2. Monitoring klinischer Parameter
2.2.1. Anamnese und Untersuchung
Anamnese und Untersuchungsbefunde wurden zu Beginn und am Ende der parenteralen Ernährung sowie, falls ein Zeitraum von einer Woche dabei überschritten wurde, im wöchentlichen Intervall erhoben (s. Tabelle 5). Ergänzend dazu wurden, je nach Diagnosegruppe, zusätzliche Parameter zur Berechnung krankheitsspezifischer Indizies verwendet.
2.2.2. Total Parenterale Ernährung
Um eine für den Patienten möglichst optimale Zusammenstellung der total parenteralen Ernährung zu erreichen, wurde im Rahmen der Studie die TPE für jeden Patienten individuell
Patienten, Material und Methoden 17 berechnet und zubereitet. Das Prinzip, welches in der Studie zur Berechnung der individuellen TPE verwendet wurde, ist vom Ernährungsteam der Hochschule entwickelt worden (95).
Dazu wurde zunächst der Ruheenergieumsatz (Resting energy expenditure, REE; in kcal/d) nach der Formel von Harris und Benedict aus Körpergewicht (in kg), Körpergröße (in cm) und Alter (in Jahren) schätzungsweise berechnet (84):
REE (männlich) = 66 + (13,7 x Gewicht) + (5,0 x Größe) - (6,8 x Alter) REE (weiblich) = 655 + (9,6 x Gewicht) + (1,8 x Größe) - (4,7 x Alter)
Der REE wurde mit dem Faktor (f) multipliziert, in den der Allgemeinzustand des Patienten und andere Einflüsse eingehen (z.B. Körpertemperatur, Mobilität), woraus sich der geschätzte tatsächliche Gesamtumsatz (Energy expenditure, EE) ergab. Als Standardwert wird von einem Faktor f = 1,5 ausgegangen. Eine Reduktion auf 1,2 erfolgte bei Zeichen einer Inflammation (z.B. Temperatur >38,5°C). Schließlich wurden Art und Menge der Substrate (Glukose, Aminosäuren und Lipide) sowie der Vitaminsupplementation, Elektrolyt- und Spurenelementzusätze bestimmt. Hierbei erfolgte eine Anpassung, wenn Grenzwerte für die empfohlene Zufuhr überschritten wurden. Die Zusammensetzung der Aminosäurenzufuhr erfolgte je nach Einteilung in die Kontroll- bzw. Glutamin-Gruppe. Dabei erhielten die Patienten der Kontroll-Gruppe 1,5g/kg KG/d einer Standard-Aminosäure-Lösung (Aminoplasmal 10%®, Fa. B.Braun, Melsungen). Diese Lösung ist frei von Glutamin. In der Glutamin-Gruppe erhielten die Patienten 1,2g/kg KG/d der Standard-Aminosäure-Lösung sowie als Zusatz 0,3g/kg KG/d einer Glutamin-Dipeptid-Lösung (Dipeptamin®).
Tabelle 3 fasst die Bestandteile der TPE zusammen.
Patienten, Material und Methoden 18 Tabelle 3: Zusammensetzung der TPE
Substrate Richtwerte
Kontrolle Glutamin-Gruppe
Glukose (Glukose 40®) 60% des Nicht-AS-Bedarfs*
Aminosäuren (Aminoplasmal 10%®) 1,5 g/kg/d 1,2 g/kg/d
Glutamin-Dipeptid - 0,3 g/kg/d
Lipide (Lipofundin MCT 20%®) 40% des Nicht-AS-Bedarfs*
Vitamine
Soluvit® und VitalipidAdult® Je 1 Ampulle (20 +10 ml) Elektrolyte
Kaliumphosphat 20 ml
7,45% Kaliumchlorid 20 ml 5,85% Natriumchlorid 80 ml 24,3% Kalium-Magnesium-Aspartat 20 ml 10% oder 20% Calcium-Gluconat 20 bzw. 10 ml Spurenelemente
Zink-Aspartat 4 ml
Inzolen infantibus® 10 ml
Sonstiges
0,9% Natriumchlorid nach Volumenbedarf
* Die Aufteilung der Kalorienzufuhr auf die einzelnen Substrate wurde folgendermaßen durchgeführt: Zunächst wurde der Kalorienbedarf berechnet, der durch die Zufuhr der Aminosäuren (1,5 g/kg/d) gedeckt war. Der verbliebene Kalorienbedarf wurde anschließend auf Glukose und Lipide aufgeteilt (Richtwerte: 60% als Glukose, 40% als Lipide).
2.2.3. Anthropometrie
Die Messung der Parameter zur Einschätzung des Ernährungszustandes des Patienten wurde bei den Patienten zu Beginn und Ende der parenteralen Ernährung durchgeführt.
Bestimmt wurden Größe, Gewicht und Body Mass Index (BMI, Berechnung aus Körpergewicht in kg geteilt durch Quadrat der Körpergröße in m) (85).
Zur Abschätzung der Körperzusammensetzung wurde eine bioelektrische-Impedanz-Analyse (BIA) durchgeführt (Gerät BIA 2000-M, Fa. Data Input, Frankfurt a.M.). Das Gerät ermittelt die Resistance (R; Maß für die Fettmasse) sowie die Reactance (Xc; Maß für die Körperzellmasse) und bestimmt daraus den Phasenwinkel α. Aus diesen Werten lassen sich das Gesamtkörperwasser (Total body water, TBW), die Körperfettmasse (Body fat, BF) und die Magermasse (Lean body mass, LBM) berechnen, welche jeweils als prozentualer Anteil am Gesamtkörpergewicht ausgedrückt wurden. Die Körperzellmasse (Body cell mass, BCM) und die Extrazellulärmasse (Extracellular mass, ECM) sind weitere, im Rahmen der BIA
Patienten, Material und Methoden 19 erhobene Parameter, deren Quotient (ECM/BCM-Ratio) zusätzliche Aussagen über den Ernährungszustand erlaubt (86, 87).
Tabelle 4: Anthropometrische Parameter
Parameter Kürzel Berechnung Normalbereich (m/w) Body-Mass-Index BMI Gewicht / Grösse2 20 - 25 kg/m2
Resistance R Messung 380 - 480 / 480 - 580 Ω Reactance Xc Messung 10 – 12% der Resistance Phasenwinkel α Messung 5,0 - 9,0°
Gesamtkörperwasser TBW modifizierte Kushner-Formel* 50 - 60% / 55 - 65%
Körperfettmasse BF Gewicht – LBM 10 - 15% / 20 - 25%
Magermasse LBM TBW / 0,732 85 - 90% / 75 - 80%
Körperzellmasse BCM LBM × α × Konstante > 50% der LBM Extrazellulärmasse ECM LBM – BCM < 50% der LBM ECM/BCM-Ratio - ECM / BCM < 1
* Berechnet nach Kushner (88)
2.2.4. Laborchemische Analysen
Während des Studienzeitraumes wurden bei den Patienten wöchentlich klinische und Laborparameter erhoben (Tabelle 5). Das Prinzip der Aminosäurenbestimmung wird im nächsten Abschnitt näher erläutert.
Patienten, Material und Methoden 20 Tabelle 5: Erhobene Studienparameter
Parameter Tag 0/1 Tag
7/8 Tag
14/15 Tag ... Ende Einwilligung x Anamnese, Untersuchung x x x x Größe, Gewicht, Gewichtsveränderungen x x x x
Körpertemperatur x x x x
Anthropometrie x x x x
Plasmaproben für Aminosäuren-Messung x x x x Blutbild (BB), Diff-BB, Quick-Test, PTT x x x x x S-Elektrolyte (K+, Na+, Cl-, Ca2+, Mg2+, Phos) x x x x x S-Kreatinin, S-Harnstoff x x x x GOT, GPT, GLDH, AP, γ-GT, CHE, Bilirubin x x x x x S-Amylase, S-Lipase x x x x x Protein, Albumin, CRP x x x x
S-Glukose x x x x x
Eisen, Transferrin, Ferritin x x x x
LDH, CK, ECP x x x x
Cholesterol, Triglyceride x x x x Studiengruppe 1
CDAI x x x x
Histologie# x
XLM-Test x x
Studiegruppe 2
APACHE II-Score x
CT-Severity-Index x x x x x
sTNFR-75 x x x x x
# nur bei Indikation
Patienten, Material und Methoden 21 Zusätzlich zu den allgemein erhobenen Parametern gab es Spezielle, die zur Erfassung und Bestimmung krankheitsspezifischer Indizes verwendet wurden. Dabei handelte es sich in der Studiengruppe 1 (Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen) um den Crohn´s Disease Activity Index (CDAI) (89). Die Berechnung des CDAI erfolgte in dieser Patientengruppe jeweils zu Beginn der TPE und am Ende des Beobachtungszeitraumes. Die Berechnung erfolgte nach dem Formblatt zur Berechnung des CDAI (s. 7.3.1, Seite 80).
In der Studiengruppe 2 (Patienten mit akuter Pankreatitis) wurde zur Klassifizierung und Einschätzung der Krankheitsschwere die Berechnung des Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II (APACHE II) (90, 91) (Formblatt zur Berechnung des APACHE II, 7.3.2, Seite 81) und des CT-Severity-Index nach Balthazar (92, 93) zu Beginn der parenteralen Ernährung durchgeführt. Beim APACHE II-Score handelt es sich um ein gebräuchliches multifaktorielles Grading-System, welches unverzüglich nach Aufnahme des Patienten durchgeführt werden kann. Patienten mit einem APACHE II-Score unter 6 haben im Allgemeinen einen unkomplizierten Verlauf, solche mit kompliziertem Verlauf bewegen sich im Bereich bis 10 Punkte, Patienten mit einem APACHE II von über 14 haben eine sehr ernste Prognose. Als morphologisches Grading-System hat sich der Balthazar Score etabliert (92). In der vorliegenden Arbeit wurde der modifizierte CT-Severity-Index verwendet, welcher auf dem alphabetischen Balthazar-Score beruht (93). Dabei wird den Graden A-E des Balthazar -Scores jeweils ein Zahlenwert (A = 0, B = 1,...) zugeordnet und die Ausdehnung der lokalen Pankreas-Nekrose hinzuaddiert (< 30 % Nekrose = 2, 30 - 50 % Nekrose = 4 und
> 50 % Nekrose = 6 Punkte). Es können bis zu 10 Punkte vergeben werden.
Die Messung des sTNFR-75 (löslicher Tumor-Nekrose-Faktor-α-Rezeptor p75) erfolgte mit einem kommerziell erhältlichen Assay der Firma R&D Systems, Minneapolis, USA (94). Zur Analyse wurden Serumproben verwendet, die vor der Analyse jeweils 10fach verdünnt wurden. Im Assay ist ein für sTNFR-75 spezifischer monoklonaler Antikörper mit der Mikroplatte verbunden. Standards und Proben wurden in die vorgefertigten Kammern pipettiert. Dadurch werden alle vorhandenen gelösten TNF-Rezeptoren an dem festen Antikörper gebunden. Nach dem Auswaschen aller ungebundenen Substanzen, wird ein für sTNFR-75 spezifischer polyklonaler Antikörper, der mit einer Peroxidase verbunden ist, den Kammern zugegeben. Nach erneutem Waschen wird eine Substrat-Lösung (Wasserstoff- Peroxid und Tetramethylbenzidin) hinzugegeben, die zu einer Farbentwicklung in Abhähigkeit von der Menge des gebundenen TNF-Rezeptors führt. Nach Stoppen der Farbentwicklung mit 2N Schwefelsäure wird die Farbintensität im Photometer bei 450nm
Patienten, Material und Methoden 22 gemessen. Die minimal messbare Konzentration an sTNFR-75 beträgt mit diesem Assay 1,0 pg/ml.
2.3. Messung der Aminosäuren
2.3.1. Messung der Aminosäuren in Plasmaproben
Zur Aminosäurenanalyse wurde EDTA-Plasma verwendet, welches am Entnahmetag für 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert wurde. Jeweils 0,5 ml des Überstandes wurden direkt nach der Zentrifugation mit 0,5 ml 5%iger Sulfosalicylsäure zur Enteiweißung versetzt. Nach erneuter Zentrifugation über 2 min bei 14.000 U/min erfolgte der Zusatz eines Lithium-Citrat- Puffers (Fa. Biotronic, Maintal) zum Überstand im Verhältnis 1:1. Zur Aufbewahrung bis zur endgültigen Messung wurden die Aliquots bei -80°C gelagert. Zur Messung der Aminosäurenkonzentration wurde ein automatischer Aminosäureanalyser verwendet (Liquimat LC5001, Fa. Biotronic, Maintal). Zur Analyse wurden 50 µl des Probenmaterials aufgegeben. Dabei wurde die Vorwaschsäule BTC-F (Fa. Biotronic, Maintal) zur Bindung des in den Pufferlösungen unvermeidlich enthaltenen Ammoniaks sowie in der Trennsäule das Trennharz BTC2710 (Fa. Biotronic, Maintal) verwendet. Die Trennung erfolgte durch stufenweisen isokratischen Einsatz von Lithium-Puffern. Die Detektion der aufgetrennten Aminosäuren basiert auf dem Ninhydrin-Nachweis. Diese Reaktion zwischen Aminosäuren und Ninhydrin läuft nach dem folgenden Schema ab:
stoff blauerFarb Ninhydrin
mid Ninhydrina
mid Ninhydrina Aldehyd
Ninhydrin Aminosäure
O H
O H CO
⎯
⎯ →
⎯ +
+
⎯
⎯
⎯
⎯ →
⎯ +
−
−
−
2 2 2
2
Dabei baut das Ninhydrin die Aminosäuren zu Aldehyd und CO2 ab. Das reduzierte Ninhydrin bildet mit dem freigesetzten Ammoniak und einem weiteren Molekül Ninhydrin, einen blauvioletten Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum von 570 nm. Bei den Aminosäuren Prolin und Hydroxyprolin bildet sich ein gelber Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum von 440 nm. Aus diesem Grund arbeitet das Gerät bei der Absorptionsmessung mit einer Zweikanal-Messung. Die Extinktionsflächen wurden elektronisch integriert und als Flächenäquivalente von einem Integrator (Shimadzu C-R3A, Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) ermittelt.
Neben den Konzentrationen der einzelnen Aminosäuren erfolgt zusätzlich die Angabe der Gesamtaminosäure-Konzentration, die Konzentration der verzweigtkettigen AS (BCAA;
Isoleucin, Leucin Valin), der aromatischen AS (AA; Tyrosin, Phenylalanin) sowie die Berechnung des Fisher-Index. Dieser gibt das Verhältnis der BCAA zu AA an und kann als
Patienten, Material und Methoden 23 Marker für eine Aminosäure-Stoffwechselstörung angesehen werden. Werte von <2,5 sind als pathologisch anzusehen.
2.4. Messung der Darmpermeabilität
Eine Methode zur Beurteilung der Darmintegrität besteht in der Durchführung von Darmfunktionstest (27, 52). Dies geschieht in der Regel mithilfe von schwer resorbierbaren Zuckern. Ein Beispiel hierfür ist der D-Xylose-Lactulose-Mannitol-Test (XLM-Test). In unserer Studie wurde dieser Test modifiziert, indem auf die Zugabe von Mannitol verzichtet wurde. Dies war notwendig, da sich das Mannitol in der HPLC-Messung als nicht völlig reine Substanz herausstellte und bis zu drei Peaks ergab. Die damit erzielten Ergebnisse sind jedoch vergleichbar mit solchen, in denen zusätzlich Mannitol verwendet wurde (96). Da es sich bei der Methode nicht um ein standardisiertes Verfahren handelt, ist auch kein Vergleich mit Daten in der Literatur möglich. Somit ist anhand der von uns durchgeführten Messung lediglich eine Beurteilung des Verlaufs der Darmpermeabilität während der TPE möglich.
Beide Zucker wurden von Sigma, Deutschland bezogen. Die Herstellung des Zuckergemisches erfolgte durch die Zentralapotheke der MHH.
Der Test selbst wurde nach folgendem Verfahren durchgeführt:
1. Blasenentleerung nüchtern
2. 25 g D-Xylose, 5 g Lactulose in 400 ml Wasser oder Tee trinken
3. Sammeln von 5h-Sammel-Urin (Zusatz von 5 ml Thymol 10% in Isopropanol zur Konservierung), Menge notieren, Aufbewahrung von 3x10 ml bei -20°C
4. Messung der D-Xylose-, Lactulose-Konzentration (mittels High Performance Liquid Chromtographie (HPLC)) (96, 97)
2.4.1. High Performance Liquid Chromatographie (HPLC)
Die Chromatographie ist eine physikalische Methode, bei der die zu trennenden Substanzen zwischen zwei Phasen verteilt werden. Die ruhende Phase wird als stationäre Phase bezeichnet und wird durch das Material in der Trennsäule repräsentiert. Die andere Phase bewegt sich unter Druck durch die Trennsäule und wird deshalb als mobile Phase bezeichnet.
Ist die mobile Phase eine Flüssigkeit, so spricht man von Flüssigkeitschromatographie. In Abbildung 2 ist eine HPLC-Anlage schematisch dargestellt. Es wurden folgende Geräte und Materialien verwendet:
• Entgaser-Modul (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland)
• Mikro-Injektions-Ventil mit 25µl Probenschleife (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland)
Patienten, Material und Methoden 24
• Gradienten-Pumpe (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland)
• Pulsed Amperometric Detector (PDA) mit einer Goldelektrode und einer Silber / Silberchlorid-Elektrode (Fa. Dionex, Idstein, Deutschland)
• Carbopac Anionen-Austauscher-Säule PA 100 mit Vorsäule (Fa. Dionex, Idstein, Deutschland)
• Deionisiertes Wasser mit hohem Widerstand (18 MΩ) (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland)
Abbildung 2: Aufbau einer HPLC-Anlage
Schematische Darstellung einer HPLC-Anlage mit Photometer als Detektor (nach G.Geier)
Die Eluatbereitung erfolgte, indem das HPLC-Wasser mit Hilfe von Helium für 15 min entgast wurde. 50%ige Natriumhydroxid-Lösung wurde hinzugefügt und 5 min gerührt, um die erforderliche Konzentration von 90 mmol/l NaOH zu erreichen.
Einem Aliquot von 0,5ml wurden zur Probenaufbereitung 200µl vom internen Standard (Melibiose 0,1 mg/l) zugefügt. Nach einer 15 minütigen Inkubationsperiode (4° C) wurden die Proben bei 9000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein weiteres Gefäß transferiert und zur Weiterverwendung mit 90 mmol/l NaOH verdünnt (1:20). 25µl dieses Überstandes wurden auf die Anionentauschersäule gegeben. Die Proben wurden mit dem 90mmol-NaOH-Eluat bei einer Flussrate von 1 ml / min bei 25 °C und einem Säulendruck von ca. 140 bar eluiert. Dabei betrug die Analysendauer ca. 20 min. Die Analyte wurden an der Carbopac PA100- Anionentauschersäule mit dem Pulsed Amperometric Detector unter Verwendung einer Gold-Arbeits-Elektrode und einer Silber / Silberchlorid- Referenzelektrode getrennt gemessen. Dabei entsteht durch die Anlagerung der Zuckermoleküle eine Spannungsänderung, die detektiert wird. Folgende Wiederholungssequenz mit drei verschiedenen Potentialen wurde verwendet:
Patienten, Material und Methoden 25 Spannung
E
Dauer T 1 0,05 V 0,4 s 2 0,75 V 0,2 s 3 - 0,15 V 0,4 s
Die Empfindlichkeit der PDA wurde auf 100nC eingestellt. Die Berechnung der Zuckerkonzentration erfolgte durch Integrationsanalyse der Fläche des Referenzpeak und der Flächen der Lactulose- und D-Xylosepeaks. Anschließend konnte aus den Konzentrationen der Zucker über den Quotienten aus D-Xylose zu Laktulose die Permeabilität berechnet werden.
2.5. Statistik
Alle Daten wurden, soweit nicht anders gekennzeichnet, mit den Lagemaßen Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD) angegeben. Datumsdifferenzen (Zeiträume, Alter, etc.) wurden als Median mit Angabe der 25% und 75% Perzentile beschrieben. Die statistische Auswertung der erhobenen Daten wurde mit Hilfe des Programms SPSS für Windows® 9.0.1 (Fa. SPSS Inc., USA) durchgeführt. Bei allen Parametern wurde zunächst auf Normalverteilung getestet. Dies geschah mit Hilfe des 1-Stichproben-Kolmogorov-Smirnow- Z-Test. Zum Vergleich eines Parameters zwischen Patientengruppen (unverbundene Stichprobe; z.B. Alter in der Glutamin- und in der Kontroll-Gruppe) diente der Student´s-t- Test (t-Test) bei normalverteilten Parametern bzw. der Mann-Whitney-U-Test (U-Test), wenn in einer oder beiden Gruppen keine Normalverteilung vorlag. Zum Testen verbundener Stichproben (z.B. Gewicht zu Beginn des Untersuchungszeitraumes und am Ende der Untersuchung) wurde wiederum der t-Test bei normalverteilten Parametern bzw. der Wilcoxon-Rangsummen-Test (W-Test) bei nicht normalverteilten Parametern, sowie bei mehr als zwei Vergleichswerten der Friedmann-Test (F-Test) eingesetzt. Bei qualitativen Angaben wurden die absoluten und prozentualen Häufigkeiten genannt und mit dem Chi-Quadrat-Test (χ2-Test) verglichen. Folgende Irrtumswahrscheinlichkeiten wurden definiert:
p < 0.05* = statistisch signifikant p < 0,01** = statistisch hochsignifikant p < 0,001*** = statistisch höchstsignifikant.
Ergebnisse 26
3. Ergebnisse
3.1. Studiengruppe 1: Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen
3.1.1. Charakterisierung der Patienten
Unter den 77 in die Studie eingeschlossenen Patienten befanden sich insgesamt 24 mit einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung. Diese 24 Patienten (19 mit akutem Schub eines Morbus Crohn und 5 mit einer akuten Colitis Ulcerosa) wurden zu je 12 in die Glutamin- und die Kontroll-Gruppe randomisiert. Bei der Randomisierung wurde keine Unterscheidung hinsichtlich der Lokalisation der Erkrankung (z.B. terminales Ileum, Colon, etc.) getroffen. 9 Patienten mit M. Crohn und 3 mit Colitis ulcerosa wurden mit Glutamin behandelt, in der Kontroll-Gruppe betrug das Verhältnis 10:2. In der Glutamin-Gruppe betrug das mittlere Alter der 6 männlichen und 6 weiblichen Patienten 30,1 Jahre (23,7 - 45,7). In der Kontroll- Gruppe wurden 9 männliche und 3 weibliche Patienten untersucht, deren mittleres Alter bei 40,0 Jahren (28,1 - 56,5) lag.
Bezüglich des Ernährungszustandes (gemessen am BMI) gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen. In der Glutamin-Gruppe betrug der durchschnittliche BMI 20,6 ± 11,3, in der Kontroll-Gruppe 22,7 ± 3,6. Auch die Krankheitsschwere, gemessen an Entzündungsparametern, wie CRP und Leukozyten, sowie dem Crohn´s Disease Activity Index (CDAI), fanden sich zu Beginn der Untersuchung keine signifikant unterschiedlichen Werte. CRP und Leukozytenzahl betrugen in der Glutamin-Gruppe 35,9 ± 34,4 g/l bzw. 11,3
± 5,7 Tsd/µl. In der Kontroll-Gruppe wurde an Tag 0 der Untersuchung mit 40,8 ± 41,1 g/l für das CRP und 13,5 ± 5,0 für die Leukozyten keine signifikant unterschiedlichen Werte gemessen. Auch die errechneten Werte für den CDAI waren zu Beginn der parenteralen Ernährung in beiden Gruppen nicht unterschiedlich: 207 ± 101 in der Glutamin-Gruppe und 176 ± 107 in der Kontroll-Gruppe. Alle zu Beginn der Untersuchung erfassten Parameter der Glutamin- und der Kontroll-Gruppe liefert Tabelle 6. Neben der Entzündungsaktivität, die zu Beginn der Untersuchung keine Unterschiede zwischen den Gruppen zeigte, bestanden bei den Plasma-Aminosäuren-Konzentrationen und der Nierenfunktion ebenfalls keine signifikanten Differenzen. So betrugen an Tag 0 die Gesamt-Aminosäure- und die Plasma- Glutamin-Konzentration in der Glutamin-Gruppe 3029,8 ± 827,6 µmol/l bzw. 558,6 ± 113,0 µmol/l und in der Kontroll-Gruppe 2515,7 ± 370,0 µmol/l bzw. 454,3 ± 68,6 µmol/l. Das
Ergebnisse 27 Serumkreatinin war mit 53,7 ± 16,2 µmol/l in der Glutamin- und 65,5 ± 15,6 µmol/l in der Kontroll-Gruppe ebenfalls nicht unterschiedlich.
Tabelle 6: Charakterisierung der Patienten mit CED an Tag 0
gln + gln -
N 12 12
Geschlecht m = 6
w = 6
m = 9 w = 3
Alter [Jahre] 30,1
(23,7 - 45,7)
40,0 (28,1 - 56,5) Gewicht [kg] 59,7 ± 11,3 69,8 ± 13,2 BMI [kg / m2] 20,6 ± 3,1 22,7 ± 3,6 CRP [g / l] 35,9 ± 34,4 40,8 ± 41,1 Leukozyten [Tsd / µl] 11,3 ± 5,7 13,5 ± 5,0
CDAI 207 ± 101 176 ± 107
Plasma-AS-
Konzentration [µmol/l] 3029,8 ± 827,6 2515,7 ± 370,0 Plasma-Glutamin
[µmol/l] 558,6 ± 113,0 454,3 ± 68,6 Kreatinin [µmol/l] 53,7 ± 16,2 65,5 ± 15,6
3.1.2. Verlauf der Krankheitsaktivität
Um eine Beurteilung des Krankheitsverlaufes vornehmen zu können, wurden klinisch- chemische Parameter sowie als Aktivitätsscore der Crohn´s Disease Activity Index (CDAI) untersucht. Die gemessenen Laborparameter waren Entzündungsparameter, wie Leukozytenzahl und das CRP, sowie viscerale Proteine (Protein, Albumin, Transferrin), die Anzahl der Lymphozyten und, als ein Marker der Katabolie, die Serum- Harnstoffkonzentration. Als ein weiteres Maß für die Aktivität der Erkrankung und den klinischen Verlauf wurde der Bedarf an Steroiden, Immunsuppressiva und Antibiotika untersucht. Zu Beginn der Untersuchung gab es hinsichtlich der genannten Parameter keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen.
In beiden Gruppen kam es innerhalb von 14 Tagen zu einem signifikanten Abfall des CDAI:
in der Glutamin-Gruppe fiel der Wert von initial 207 ± 101 auf 159 ± 38 Punkte (p<0,03). In der Kontroll-Gruppe kam es zu einem Abfall von 176 ± 107 auf 129 ± 103 Punkte (p<0,01).
Abbildung 3 zeigt den Verlauf grafisch. Im Vergleich beider Gruppen konnte kein Effekt der Glutamin-Supplementation auf die Krankheitsaktivität (gemessen am CDAI) nachgewiesen werden.
Ergebnisse 28 Abbildung 3: Verlauf des CDAI
0 100 200 300 400 500
p<0,03
Tag 0 Tag 14
gln +
CDAI
0 100 200 300 400 500
p<0,01
Tag 0 Tag 14
gln -
CDAI
Verlauf des CDAI in der Glutamin- und der Kontroll-Gruppe. Die gestrichelte Linie gibt jeweils den Median an.
Nach 14 Tagen gib es in beiden Gruppen einen Abfall des CDAI (p<0,03 in der Glutamin- bzw. p<0,01 in der Kontroll-Gruppe). Zwischen beiden Gruppen konnten nach 14 Tagen keine Unterschiede im Abfall des CDAI gesehen werden.
Zur weiteren Beurteilung der Krankheitsaktivität wurden neben dem CDAI als Entzündungsparameter das CRP und die Anzahl der Leukozyten herangezogen. Beide Parameter lagen sowohl in der Glutamin- als auch in der Kontroll-Gruppe über der Norm. An Tag 0 betrug das mittlere CRP 35,9 ± 34,4 mg/l in der Glutamin-Gruppe bzw. 40,8 ± 41,1 mg/l in der Kontroll-Gruppe (Norm: <5 mg/l). Die Leukozytenzahl war initial auf 11,3 ± 5,7 Tsd/µl (Glutamin-Gruppe) bzw. 13,5 ± 5,0 Tsd /µl erhöht (Norm: bis 11,3 Tsd/µl). Da in beiden Gruppen vergleichbare Mengen an Glucocorticoiden verabreicht wurden, ist ein Einfluss der Corticoide auf die Leukozytenzahl zu vernachlässigen. In Abbildung 4 ist der Verlauf des CRP und der Leukozyten dargestellt.
Abbildung 4: Verlauf von CRP und Leukozyten
1 7 14 1 7 14
0 50 100 150
p< 0,05
Tag
gln + gln -
CRP [mg/l]
1 7 14 1 7 14
0 10 20 30 40
Tag
gln - gln +
Leukozyten [Tsd/µl]
Die Abbildung zeigt den CRP-Verlauf in beiden Gruppen. In beiden Gruppen kam es innerhalb von 14 Tagen zu einem Abfall des CRP. Dieser war nur in der Kontroll-Gruppe signifikant (p<0,05). Der Verlauf der Leukozytenzahl ist sowohl in der Glutamin- als auch in der Kontroll-Gruppe nicht signifikant. Bleibt in der Glutamin-Gruppe die Leukozytenzahl nahezu konstant, so steigt sie in der Kontroll-Gruppe tendenziell an (n.s.).