dem Transkriptionsaktivator des Maltosesystems von Escherichia coli
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
an der Universität Konstanz Fachbereich Biologie
vorgelegt von
Anja Schlegel
Tag der mündlichen Prüfung: 10.06.2002 1. Referent: Prof. Dr. W. Boos 2. Referent: Priv. Doz. Dr. M. Dahl
Peter Schlegel (1940 - 1984)
Clausen, T., Schlegel, A., Peist, R., Schneider, E., Steegborn, C., Chang, Y-S., Haase, A., Bourenkov, G. P., Bartunik, H. D. und Boos, W. (2000). X-ray structure of MalY from Escherichia coli: a pyridoxal 5’-phosphate-dependent enzyme acting as a modulator in mal gene expression. EMBO J. 19(5): 831-842.
Joly, N., Danot, O., Schlegel, A., Boos, W., und Richet, E. (2002). The Aes protein directly controls the activity of MalT, the central transcriptional activator of the Escherichia coli maltose regulon. J. Biol. Chem. 277(19): 16606-16613.
Schlegel, A., Böhm, A., Lee, S-J., Peist, R., Decker, K., und Boos, W. (2002). Network regulation of the Escherichia coli maltose system. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4(3): 301- 307.
Schlegel, A., Danot, O., Richet, E., Ferenci, T. und Boos, W. (2002). The N-terminus of the Escherichia coli transcription activator MalT represents the interaction domain with MalY. J. Bacteriol. 184(11): 3069-3077.
An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. W. Boos danken, der mir das Thema dieser Arbeit zur Verfügung stellte und ermöglichte, sie an seinem Lehrstuhl anzufertigen. Mit Humor und stets offener Tür war er jederzeit bereit, zu diskutieren und bei Problemen zu helfen.
Vielen Dank möchte ich auch Ralf sagen, der zu Beginn der Arbeit meine Betreuung übernahm, und allen anderen (teils ehemaligen) 1048ern, besonders Tanja, Reinhold und Gerhard, die mir so manches Mal geduldig mit Rat und Tat weiterhalfen.
Danke außerdem den übrigen Mitgliedern der Arbeitsgruppe, da ich von fast jedem im Laufe der Zeit wertvolle Tips oder praktische Hilfe erhielt. Ein besonderes Dankeschön geht dabei an Pari.
Evelyne Richet möchte ich für eine fruchtbare Zusammenarbeit im Rahmen der Analyse der MalT-Aes-Interaktion danken und Tim Clausen für die Strukturaufklärung von MalY, die nicht nur schöne Bildern lieferte, sondern auch zum Verständnis der Funktion des Proteins beitrug.
Michael Dahl und Stefan Schönert gilt mein Dank für die Möglichkeit, am BIAcore zu arbeiten, sowie für die damit verbundene Anleitung und Gastfreundschaft.
Ein extra Danke an Tanja und Reinhold für das aufmerksame Korrekturlesen der Arbeit.
Zum Schluß möchte ich mich besonders herzlich bei meiner Mutter bedanken, die mir meine Ausbildung ermöglicht hat.
1 Zusammenfassung...1
2 Einleitung...3
2.1 Escherichia coli ...3
2.2 Das Maltosesystem ...4
2.2.1 Das Maltosetransportsystem ...5
2.2.1.1 ABC-Transporter...5
2.2.1.2 Das Maltoporin LamB...7
2.2.1.3 Das Maltosebindeprotein MalE ...8
2.2.1.4 Die membranspannenden Proteine MalF und MalG...9
2.2.1.5 Die ATP-bindende Untereinheit MalK ...10
2.2.1.6 MalM...12
2.2.2 Die Enzyme des Maltosesystems...13
2.2.2.1 Die a-Amylase MalS...13
2.2.2.2 Die Amylomaltase MalQ ...13
2.2.2.3 Die Maltodextrinphosphorylase MalP...14
2.2.2.4 Die Maltodextringlucosidase MalZ...15
2.2.3 Regulation des Maltosesystems...16
2.2.3.1 Der Transkriptionsaktivator MalT...16
2.2.3.2 Struktur der MalT-abhängigen Promotoren...18
2.2.3.3 Die endogene Induktion...20
2.2.3.4 Katabolitrepression und Inducer Exclusion ...20
2.2.3.5 Streß durch Glucoselimitierung ...21
2.2.3.6 Physikalische Größen...22
2.2.3.7 Trehalosesystem ...23
2.2.3.8 Proteine mit regulatorischer Wirkung...23
2.2.3.9 Mlc ...24
2.2.3.10 MalK...25
2.2.3.11 MalY...27
2.2.3.12 Aes ...30
2.3 Zielsetzung...33
3 Material und Methoden ...34
3.1 Abkürzungen...34
3.2 Chemikalien und Bezugsquellen...35
3.3 Bakterienstämme, Bakteriophage und Plasmide...36
3.4 Medien und Wachstumsbedingungen...40
3.4.1 Flüssige Medien ...40
3.4.2 Feste Medien...40
3.4.3 Medienzusätze...41
3.4.4 Wachstumsbedingungen ...41
3.4.5 Bestimmung der Zelldichte von Bakterienkulturen...41
3.5 Genetische und molekularbiologische Methoden...42
3.5.1 Stammkonstruktion...42
3.5.1.1 Konstruktion von RP156...42
3.5.1.2 Konstruktion von AS39-57 und AS60-68 ...42
3.5.2 Präparation, Restriktionsverdau, Ligierung und Sequenzierung von DNA...43
3.5.3 Transformation...43
3.5.4 PCR...43
3.5.5 Plasmidkonstruktion ...44
3.5.5.1 Konstruktion von pACS2 ...44
3.5.5.2 Konstruktion von pACS20-24...44
3.5.5.3 Konstruktion von pDK1-5...45
3.5.5.4 Liste der verwendeten Oligonucleotide...45
3.5.6 Isolierung repressionsnegativer Mutanten von MalY...46
3.6 Biochemische Methoden...46
3.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)...46
3.6.2 Western-Blot...47
3.6.3 Bestimmung der b-Galactosidaseaktivität...47
3.6.4 Bestimmung der Cystathionaseaktivität ...48
3.6.5 Reinigung von N-terminalen MalT-Fragmenten aus Inclusion bodies ...48
3.6.6 Reinigung von His-tag-Aes...49
3.6.7 Reinigung von MalY...50
3.6.8 Nachweis von Inclusion bodies...50
3.6.9 Oberflächenplasmonen-Resonanzspektroskopie...50
3.6.10 Herstellung von Zellextrakten mit überexprimiertem MalT...52
3.6.11 Gelfiltration von Aes mit N-terminalen Fragmenten von MalT ...53
3.6.12 Nativgel ...53
4 Ergebnisse...54
4.1 Repressionsnegative Mutanten in malY...54
4.1.1 Charakterisierung der Mutanten...54
4.1.2 Lokalisation der Mutationen in der Kristallstruktur...57
4.2 N-terminale Fragmente von MalT...59
4.2.1 Der N-Terminus von MalT interagiert in vivo mit MalY...61
4.2.2 Der N-Terminus von MalT interagiert nicht mit MalK...62
4.2.3 Reinigung der N-terminalen MalT-Fragmente...63
4.2.4 Untersuchungen zur Interaktion von Aes mit MalT...65
4.2.4.1 Interaktionsstudien mittels Oberflächenplasmonen-Resonanzspektroskopie .66 4.2.4.2 Weitere in vitro-Analysen zur Interaktion von Aes mit dem N-Terminus von MalT...70
4.3 Analyse von Mutationen in malT, die zu erhöhter Expression der mal-Gene führen ...71
4.3.1 Weitere Analyse der Mutante T38R...77
4.4 Klonierung und Überexpression von Aes-Fragmenten...78
4.5 Verwertung möglicher Substrate von Aes in vivo...81
5 Diskussion...83
5.1 Die Interaktionsfläche mit MalT in MalY ...84
5.1.1 Einfluß von IPTG auf lacZ-Fusionen zu mal-Genen...85
5.2 Bindestellen für MalK, MalY und Aes in MalT...85
5.2.1 Interaktion N-terminaler Fragmente von MalT mit MalY und MalK ...85
5.2.2 Analyse der Interaktion von MalT und Aes in vitro...87
5.2.3 Konstitutive Mutanten von MalT...89
5.2.3.1 Die Mutante T38R...93
5.3 Fragmente von Aes interagieren nicht mit MalT...94
5.4 Physiologische Substrate von MalY und Aes...96
5.5 Ausblick ...98
6 Literaturverzeichnis...100
Abbildungen
Einleitung Abbildung 1: Genetische Organisation und Aktivierung des Maltoseregulons von Escherichia coli...4Abbildung 2: Komponenten des Maltosesystems ...6
Abbildung 3: Modell des Maltodextrintransports...12
Abbildung 4: Domänen von MalT...18
Abbildung 5: Regulation der Aktivität von MalT ...27
Abbildung 6: Sequenzvergleich zwischen MalY und homologen Proteinen...30
Abbildung 7: Sequenzvergleich zwischen Aes und homologen Proteinen...32
Material und Methoden Abbildung 8: Meßanordnung am BIAcore-Biosensor ...52
Ergebnisse Abbildung 9: Überexpression von MalY und repressionsnegativen Mutanten...55
Abbildung 10a: Dimer von MalY...59
Abbildung 10b: Lokalisation des Interaktionsbereichs mit MalT auf der Oberfläche von MalY...59
Abbildung 11: Überexpression von MalT-Fragmenten...60
Abbildung 12: Reinigung von MalT-Fragmenten ...64
Abbildung 13: Reinigung von Aes ...66
Abbildung 14: Bindung von überexprimiertem MalT an Aes am Sensorchip des BIAcore ...67
Abbildung 15: Bindung eines unbekannten Faktors aus Zellextrakten an Aes am
Sensorchip des BIAcore...69
Abbildung 16: Bindung des 100 aa-Fragments von MalT an Aes am Sensorchip
des BIAcore ...70 Abbildung 17: Nativgel von Aes nach Inkubation mit dem 100 aa-Fragment von MalT...71
Abbildung 18: Sensitivität von Wildtyp-MalT und MalTc-Mutanten gegenüber MalK, MalY und Aes...76 Abbildung 19: Überexpression von Aes-Fragmenten...79
Diskussion
Abbildung 20: Gelfiltration von MalY mit DT1 ...86 Abbildung 21: Lokalisation der Mutationen in der Aminosäuresequenz von MalT...93
Tabellen
Material und Methoden
Tabelle 1a: Bakterienstämme und Bakteriophage...36 Tabelle 1b: Plasmide...38
Ergebnisse
Tabelle 2: Betroffene Reste repressionsnegativer Mutanten von MalY und Aktivität der malK-lacZ-Fusion in EZ7 in Anwesenheit der verschiedenen
Protein-Varianten...56 Tabelle 3: Expression von malK-lacZ in Stämmen mit plasmidkodierten MalT-
Fragmenten...62 Tabelle 4: Expression von malK-lacZ in BRE1162 in Anwesenheit von Aes, mit und
ohne MalT’...65
Tabelle 5: b-Galactosidaseaktivität [U mg-1] von pop7169 mit Wildtyp-MalT und Mutanten des Proteins in An- und Abwesenheit von
plasmidkodiertem MalK, MalY und Aes ...74 Tabelle 6: Expression von malEp-lacZ in An- und Abwesenheit einer Insertion in aes
oder glk und einer Mutation in malT...78 Tabelle 7: Expression von malK-lacZ in BRE1162 in Anwesenheit von Aes und
Fragmenten des Proteins...81
1 Zusammenfassung
Das Maltosesystem von Escherichia coli besteht aus 10 Genen, deren Produkte der Aufnahme und Verwertung von Maltose und Maltodextrinen dienen. Das System wird durch den Transkriptionsaktivator MalT positiv reguliert, der durch Bindung des Induktors Maltotriose in seine aktive Konformation überführt wird. MalK, die ATP-hydrolysierende Untereinheit des Transportsystems, kompetiert mit Maltotriose um die Bindung an MalT und inaktiviert das Protein. Zusätzlich sind zwei weitere Proteine bekannt, die mit MalT interagieren und repressorisch wirken: MalY, das die enzymatische Aktivität einer bCS-Lyase besitzt und Aes, eine Acetylesterase. In der vorliegenden Arbeit sollte die Interaktion von MalT mit den beiden Proteinen, deren physiologische Funktion noch ungeklärt ist, genauer analysiert werden.
Um den Bereich in MalY zu identifizieren, der an der Interaktion mit MalT beteiligt ist, wurden repressionsnegative Mutanten des Proteins isoliert. Da in der Zwischenzeit die Kristallstruktur von MalY gelöst wurde, war es möglich, über die von den 14 Mutationen betroffenen Reste einen Interaktionsbereich von MalY mit MalT zu definieren, der eine deutlich abgegrenzte Struktur auf der Oberfläche des Proteins darstellt.
Außerdem wurde untersucht, welche Bereiche von MalT für die Bindung der Repressorproteine eine Rolle spielen. In vivo konnte durch Titrationsexperimente mit Fragmenten von MalT nachgewiesen werden, daß für die Bindung von MalY 250 N-terminale Aminosäuren ausreichend sind, jedoch nicht für die Bindung von MalK. Dies wurde durch Gelfiltrationsexperimente von O. Danot bestätigt. Interaktionsstudien mittels Oberflächenplasmonen-Resonanzspektroskopie sprechen dafür, daß bereits 100 N-terminale Aminosäuren von MalT Aes binden können.
17 Mutanten von MalT, die aus glucoselimitierten Chemostatkulturen stammen und in Anwesenheit von MalK malG-lacZ verstärkt exprimieren, sowie 9 früher isolierte sogenannte MalTc-Mutanten, die das Maltosesystem konstitutiv exprimieren, wurden zur weiteren Analyse in einen Stammhintergrund ohne Repressorproteine transduziert. Alle führen weiterhin zu erhöhter Expression des Systems in Abwesenheit von exogenen Maltodextrinen, somit ist durch keine Mutation ausschließlich die Bindestelle von MalK betroffen. In
Anwesenheit plasmidkodierter Repressorproteine sind drei Klassen von Mutanten mit unterschiedlichen Sensitivitätsmustern zu erkennen, und keines der MalT-Proteine ist resistent gegenüber allen drei Repressoren. Aes ist das einzige Protein, gegen das eine Reihe von Mutanten fast völlige Resistenz aufweist. Unter diesen befinden sich Mutationen an vier Positionen, die die Sensitivtät gegenüber MalY nicht verringern. Die betroffenen Reste sind wahrscheinlich Teil der Interaktionsfläche mit Aes. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß die drei repressorisch wirkenden Proteine, obwohl sie in der Regulation der Aktivität von MalT auf ähnliche Weise wirken, verschiedene Bereiche des Proteins erkennen.
Eine der Mutanten, die in vivo in Abwesenheit der bekannten Repressorproteine erhöhte Expression einer malEp-lacZ-Fusion aufweist, wurde von N. Joly in einem in vitro- Trankriptionsassay eingesetzt. Unter diesen Bedingungen zeigte die Mutante keine Konstitutivität. Daraus kann auf einen weiteren, bisher unbekannter Faktor geschlossen werden, der MalT durch direkte Interaktion reprimiert. Die Bindung dieses Faktors wird durch die Mutation verhindert.
Es wurden verschiedene Fragmente von Aes kloniert und überexprimiert. Diese wurden in vivo auf ihre Fähigkeit, MalT zu reprimieren, untersucht. Jedoch sind auch die beiden größten Fragmente, die jeweils aus zwei Dritteln des Proteins bestehen, nicht fähig, MalT zu reprimieren. Es scheint möglich, daß die Bindung von Aes an MalT kooperativ durch auf der Primärstruktur weitverteilte Reste vermittelt wird.
2 Einleitung
2.1 Escherichia coli
Das stäbchenförmige, Gram-negative Enterobakterium Escherichia coli besiedelt überwiegend den Darm von Säugetieren und ist dort die meiste Zeit einer eher konstanten Umgebung ausgesetzt. Dagegen muß es sich an starke Schwankungen der Umweltbedingungen adaptieren, wenn es dieses Habitat verläßt, was eine Voraussetzung für seine Verbreitung darstellt.
Wildtypstämme von E. coli können die meisten in der Zelle vorkommenden Verbindungen selbst synthetisieren und müssen neben einigen Salzen lediglich Kohlenstoff, meist in Form von Zuckern, aus dem umgebenden Medium aufnehmen. Neben der Fähigkeit zur Toleranz schnell wechselnder physikalischer Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur, Osmolarität, O2-Gehalt und pH-Wert, muß E. coli deshalb auch in der Lage sein, die vorhandenen Kohlenstoffquellen wahrzunehmen, sich darauf hinzubewegen und sie optimal zu nutzen. Dies bedeutet, daß es auch effektive Aufnahmesysteme für Substrate besitzen muß, die in geringen Konzentrationen vorkommen. Andererseits sollte bei Angebot verschiedener Kohlenstoffquellen die für das Bakterium wertvollste zuerst genutzt werden.
Für die Aufnahme unterschiedlicher Kohlenstoffquellen hat E. coli spezifische Klassen von Transportsystemen entwickelt. So gelangt beispielsweise Lactose über ein PMF (proton- motiv-force)-getriebenes System, das die Energie für den Transport aus einem Protonengradient bezieht, in das Zellinnere. Glucose wird über ein PTS (phospho-enol- pyruvate phosphotransferase system) transportiert, das die Zucker während des Membrandurchtritts phosphoryliert. Maltose und Maltodextrine werden über einen ABC (ATP binding cassette)-Transporter aufgenommen, der im Folgenden beschrieben wird (eine Übersicht zu den verschiedenen Transportsystemen geben (Boos & Lucht, 1996; Maloney &
Wilson, 1996; Postma et al., 1996). Energetisch sinnvoll ist es hierbei, daß die zuständigen Systeme bei Bedarf schnell induziert und die jeweils nicht benötigten Systeme in ihrer Aktivität und der Expression ihrer Gene herabgesetzt werden. E. coli hat hierfür ein komplexes regulatorisches Netzwerk entwickelt, in dem sich die verschiedenen Systeme sowohl selbst als
auch gegenseitig regulieren und eine optimale Nutzung der vorhandenen Kohlenstoffquellen ermöglichen.
2.2 Das Maltosesystem
Das Maltosesystem (mal-System) von E. coli stellt ein Beispiel einer komplex regulierten Nutzung einer Kohlenstoffquelle dar. Das gesamte Regulon mit Ausnahme von malT selber wird durch den Transkriptionsaktivator MalT positiv reguliert (Abb. 1). Es besteht aus 10 Genen, die in zwei Regionen geclustert vorliegen. Die Produkte dienen der Aufnahme und Verwertung von Maltose und Maltodextrinen, a(1Æ4)-verknüpften Glucosepolymeren, die bei der Hydrolyse von Stärke und Glycogen freigesetzt werden. Die malA-Region bei 76,5 Minuten (min) besteht aus dem im Uhrzeigersinn abgelesenen Gen malT und dem dazu divergent transkribierten malPQ-Operon, dessen Produkte am Stoffwechsel beteiligt sind (Debarbouille & Schwartz, 1979; Hofnung & Schwartz, 1971; Raibaud et al., 1983).
Abbildung 1: Genetische Organisation und Aktivierung des Maltoseregulons von Escherichia coli.
Dargestellt sind die Gene des mal-Systems und ihre Regulation durch MalT und cAMP/CAP. Die Pfeile geben die Transkriptionsstartpunkte und Transkriptionsrichtung an. MalTi ist die inaktive, MalTa die aktive Konformation des Aktivators (Nach Schwartz, 1987).
Die malB-Region bei 91,4 min enthält das gegen den Uhrzeigersinn transkribierte malE/F/G- und divergent davon das malK/lamB/malM-Operon. Die durch diese Gene kodierten Proteine sind am Transport beteiligt, nur die Funktion von MalM ist noch nicht geklärt (Gilson et al., 1986; Raibaud et al., 1979; Silhavy et al., 1979). Weitere Enzyme werden von malZ bei 9,1 min und malS bei 80,5 min kodiert (Freundlieb & Boos, 1986; Tapio et al., 1991). Die Produkte der Gene werden im Folgenden beschrieben, ihr Zusammenspiel ist in Abb. 2 dargestellt.
2.2.1 Das Maltosetransportsystem
2.2.1.1 ABC-Transporter
Um in das Cytoplasma von E. coli zu gelangen, müssen die Substrate des Maltosesystems die äußere und die innere Zellmembran, die aus Phospholipiden und Lipopolysacchariden bestehen, und die dazwischenliegende Mureinschicht überwinden. Dies geschieht mit Hilfe eines Transportsystems, das zu der Familie der ABC-Transporter gehört. ABC-Transporter sind sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten zu finden und sind häufig von medizinischer Relevanz. Beispiele hierfür sind das P-glycoprotein, das an der Multiresistenz bestimmter Krebszellen gegenüber Pharmaka durch deren aktiven Efflux beteiligt ist (Gottesman & Pastan, 1993; Hamada & Tsuruo, 1988) und CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), das bei Patienten mit zystischer Fibrose mutiert vorliegt (Collins, 1992; Riordan et al., 1989). In Prokaryoten erfolgt v. a. die Aufnahme verschiedener Nährstoffe über ABC-Transporter, es sind aber auch einige Exportprozesse beschrieben worden.
Die Familie der ABC-Transporter ist durch 4 Domänen charakterisiert. Zwei hydrophobe Domänen besitzen in den meisten Fällen je 6 membranspannende Segmente, wobei eine Domäne des mal-Systems, MalF, mit zwei zusätzlichen N-terminalen Transmembrandomänen eine Ausnahme darstellt. Außerdem befinden sich an die Membran assoziiert zwei hochkonservierte cytoplasmatische Domänen, die ATP binden und durch ATP-Hydrolyse die
Abbildung 2: Komponenten des Maltosesystems. Dargestellt ist der Transport und Abbau von Maltose und Maltodextrinen. Die Glucoseeinheiten am reduzierenden Ende der Maltdextrine sind grau eingefärbt. Die Funktion von MalM ist bisher ungeklärt (Nach Schwartz, 1987).
Energie für den Transport der Substrate über die Zellmembran entgegen einem Konzentrationsgradienten liefern. Bakterielle Transporter benötigen akzessorische Substratbindeproteine außerhalb der cytoplasmatischen Membran, die bei Gram-negativen Organismen löslich im Periplasma vorliegen und bei Gram-positiven über einen Lipidanker an die Membran gebunden sind. In einigen Fällen werden weitere Komponenten gemeinsam mit den Hauptdomänen des Transporters exprimiert, wie im Fall des mal-Systems das Außenmembranprotein LamB (Boos & Lucht, 1996; Boos et al., 1996; Higgins, 1992).
2.2.1.2 Das Maltoporin LamB
Das Außenmembranprotein LamB besteht aus 421 Aminosäuren (aa) und hat ein Molekulargewicht von 47,4 kDa (Clement & Hofnung, 1981). Es dient dem Phagen l als Rezeptor und liegt in einer geschätzten Anzahl von 103 pro Zelle vor (Randall-Hazelbauer &
Schwartz, 1973). Bei hohen Konzentrationen im Medium können Maltose und Maltotriose durch die unspezifischen Porine OmpC und OmpF in das Periplasma diffundieren. Für längere Dextrine und bei limitierenden Maltosekonzentrationen, wie sie in der natürlichen Umgebung der Zelle zu finden sind, ist LamB für die Aufnahme des Substrats notwendig (Nakae & Ishii, 1980; Nikaido & Vaara, 1985; Szmelcman & Hofnung, 1975). In mikromolaren Konzentrationen diffundieren alle Maltodextrine mit einer Rate in der Größenordnung von 10 nmol/min/109 Zellen durch die Außenmembran (Brass et al., 1985; Ferenci, 1980; Wandersman
& Schwartz, 1982). Bei geringen Substratkonzentrationen wird die Permeation des Zuckers durch dessen spezifische, reversible Bindung an LamB erhöht. Mit zunehmender Kettenlänge des Substrats nimmt der Fluß über die Membran entsprechend der Stabilitätskonstante der Bindung zu und ist bei einem Substrat von 5 Resten gesättigt (Benz et al., 1987; Szmelcman &
Hofnung, 1975; Szmelcman et al., 1976). LamB transportiert neben Maltodextrinen mit geringerer Effizienz auch andere Zucker. Bei Wachstum auf Glucose unter limitierenden Bedingungen wird seine Expression dereprimiert und es stellt den entscheidenden Faktor für die Glucoseaufnahme dar. Dies wurde auch für Lactose und in geringerem Maße für Arabinose und Glycerin beobachtet (Brass et al., 1985; Death & Ferenci, 1993). Außerdem ist LamB notwendig für die effiziente Aufnahme von Trehalose bei geringen Konzentrationen. Der
Stoffwechsel der Trehalose induziert das mal-System zu etwa 30% der vollständigen Induktion bei Wachstum auf Maltose (Klein & Boos, 1993).
LamB bildet ein Trimer aus drei wassergefüllten Kanälen, die die Außenmembran durchdringen (Neuhaus et al., 1983). Das Grundgerüst des Monomers ist ein 18 strängiges antiparalleles ß- Barrel, das eine Pore mit einem Durchmesser von 5-6 Å bildet. Drei der Loops, die die Einzelstränge miteinander verbinden, sind nach innen gefaltet und bilden mit einem Loop einer benachbarten Untereinheit eine Restriktionsstelle. Eine Reihe aromatischer Reste entlang des Kanals bildet einen hydrophoben Pfad, die sogenannte „greasy slide“, eine Abfolge von möglichen Zuckerbindestellen. Es wurde ein Modell für den Zuckertransport aufgestellt, nach dem das Substrat über die „greasy slide“ diffundiert. Die Restriktionsstelle wird durch die spezifische Substratbindung in diesem Bereich überwunden (Schirmer et al., 1995).
2.2.1.3 Das Maltosebindeprotein MalE
malE kodiert für das 396 aa große MBP (maltose binding protein)-Vorläuferprotein, von dem während des Exports in das Periplasma die N-terminale Signalsequenz von 26 aa abgespalten wird. Das Molekulargewicht des reifen Proteins beträgt 40,7 kDa (Bedouelle et al., 1980;
Duplay et al., 1984). Im Periplasma einer induzierten Zelle befinden sich ungefähr 30000 Moleküle MBP (Dietzel et al., 1978; Kellermann & Szmelcman, 1974).
Die verschiedenen Maltodextrine besitzen eine gemeinsame Bindestelle in MBP, wobei die Affinität von MBP für Maltose geringer ist als für längere Dextrine (Szmelcman et al., 1976).
Für den Transport von Maltose und Maltodextrinen bis zu einer Länge von Maltoheptaose über die Cytoplasmamembran ist MBP essentiell (Ferenci, 1980; Shuman, 1982).
Aus Messungen der Leitfähigkeit LamB-haltiger Membranen wurden geschlossen, daß MBP eine hohe Affinität für das Maltoporin besitzt. Die Assoziation der Proteine sollte dabei ein Schließen der LamB-Kanäle bewirken (Neuhaus et al., 1983). Entgegen der ursprünglichen Interpretation einer Reihe transportdefizienter Mutanten in malE besitzt die Bindung von MBP an LamB keinen direkten Effekt auf die Diffusion durch die Außenmembran (Brass et al., 1985; Freundlieb et al., 1988; Wandersman et al., 1979).
LamB und MBP sind die einzigen Produkte des mal-Systems, die an der Chemotaxis von E.
coli gegenüber Maltose beteiligt sind (Brass & Manson, 1984). Die Rolle von LamB liegt dabei
in der Aufnahme von Maltose (Hazelbauer, 1975b). Diese wird im Periplasma von dem eigentlichen Chemorezeptor MBP gebunden. Substratbeladenes MBP interagiert direkt mit dem transmembranen Signalüberträger Tar (taxis to aspartate and some repellents), der das Signal in das Cytoplasma weiterleitet (Koiwai & Hayashi, 1979; Manson & Kossmann, 1986;
Springer et al., 1977; Wang & Koshland, 1980).
Die Kristallstruktur von substratbeladenem und freiem MBP wurde gelöst und das sogenannte
„venus flytrap“-Modell entworfen. Danach wird das Substrat über Wasserstoffbrückenbindung und van der Waals Interaktionen fest an Reste gebunden, die ein Gelenk ausbilden. Dieses verbindet die beiden globulären Domänen, die aus dem N- und C- Terminus gebildet werden und ebenfalls an der Ligandenbindung beteiligt sind. Bindung des Substrats führt zu einer Biegung des Gelenks und zum Übergang von der offenen in die geschlossene Konformation, in der die Bindung an die Rezeptoren für Transport und Chemotaxis möglich ist. Eine Mutantenanalyse zeigte, daß Reste beider globulärer Domänen an der Interaktion mit den Transport- und Chemotaxiskomponenten beteiligt sind, wodurch beide Konformationen unterschieden werden können (Sharff et al., 1992; Spurlino et al., 1991). Die für die Chemotaxis und für den Transport verantwortlichen Reste in MBP sind nicht identisch, überlappen jedoch teilweise (Duplay & Szmelcman, 1987; Hazelbauer, 1975a;
Treptow & Shuman, 1988; Zhang et al., 1996; Zhang et al., 1992).
MPB wurde in einer Reihe weiterer Mitglieder der Familie der Enterobacteriaceae nachgewiesen. Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens besitzen alle ein MBP mit einem Molekulargewicht um 40 kDa und transportieren Maltose mit hoher Affinität (Dahl & Manson, 1985).
2.2.1.4 Die membranspannenden Proteine MalF und MalG
Die hydrophoben Proteine MalF und MalG sind die integralen Komponenten des Maltosetransportsystems. MalF besteht aus 514 aa, sein Molekulargewicht beträgt 56,9 kDa, und es besitzt 8 transmembrane Domänen (Boyd et al., 1987; Froshauer & Beckwith, 1984;
Froshauer et al., 1988). Es liegt in 100-1000 Kopien pro Zelle vor (Shuman et al., 1980).
MalG hat mit 296 aa ein Molekulargewicht von 32,2 kDa und 6 transmembrane Domänen.
Der N- und C-Terminus beider Proteine ist im Cytoplasma lokalisiert (Boyd et al., 1993;
Dassa & Hofnung, 1985).
Die Konsensussequenz EAA-X3-G-X9-I-X-LP ist hochkonserviert in den Membranproteinen der Bindeprotein-abhängigen ABC-Transportsystemen. Dieser Bereich liegt in MalF und MalG etwa 90 aa vom C-Terminus entfernt (Dassa & Hofnung, 1985). Eine Oligonukleotidmutagenese ergab, daß Reste der membranspannenden Segmente (mss) 6, 7 und 8 von MalF, die Teil der Consensussequenz sind oder diese flankieren, am Transport oder an der Komplexbildung mit MalG und MalK beteiligt sind. MalF vermittelt außerdem Substratspezifität, für die Reste der Helix 6 entscheidend sind (Ehrle et al., 1996; Merino &
Shuman, 1998).
Es wurden außerdem Mutanten in malG mit einem Dex-Mal+ Phänotyp isoliert, die bestätigen, daß neben MBP beide Komponenten des Transportkomplexes Substratspezifität vermitteln (Wandersman et al., 1979). Durch eine Insertionsmutagenese wurden Regionen in MalG identifiziert, die jeweils entweder beim Transport oder der Komplexbildung eine Rolle spielen. Ein Rest des 3. periplasmatischen Loops ist für Interaktion mit MBP notwendig (Nelson & Traxler, 1998). Eine Reihe von Mutanten von MalF und MalG ermöglichen in Abwesenheit von MBP Maltosetransport und ATP-Hydrolyse (Davidson et al., 1992;
Treptow & Shuman, 1985). Sequenzierung ergab, daß in der Regel zwei Mutationen dafür notwendig sind. Die Mutationen sind in membranspannenden Domänen geclustert und beeinflussen wahrscheinlich gegenseitig ihre Position oder Konformation (Covitz et al., 1994).
Es konnte nachgewiesen werden, daß die N-terminale Domäne von MBP mit MalG und die C- terminale Domäne mit MalF interagiert (Hor & Shuman, 1993).
2.2.1.5 Die ATP-bindende Untereinheit MalK
MalK ist ein lösliches, mit der cytoplasmatischen Membran assoziiertes Protein von 371 aa und einem Molekulargewicht von 40,7 kDa, das in induzierten Zellen in über 104 Kopien als Dimer vorliegt (Bavoil et al., 1980; Gilson et al., 1982; Kennedy & Traxler, 1999). Eine teilweise transmembrane Lokalisation des Proteins wurde diskutiert (Schneider et al., 1995).
MalK und die ATP-bindenden Untereinheiten anderer ABC-Transporter sind hochhomolog, auch über den Bereich der sogenannten Walker A- und Walker B-Regionen hinaus, die an der
ATP-Bindung beteiligt sind (Higgins et al., 1986; Panagiotidis et al., 1993; Walker et al., 1982).
Je ein Molekül MalF und MalG bilden mit zwei Molekülen MalK, die kooperativ am Transport beteiligt sind, einen Komplex. Dieser transportiert das Substrat unter ATP- Hydrolyse, jedoch nur in Anwesenheit von substratbeladenem MBP (Davidson & Nikaido, 1991; Davidson & Sharma, 1997; Panagiotidis et al., 1993). Nach früheren Untersuchungen sollte MalK entweder nur über MalG oder nur über MalF an die Cytoplasmamembran assoziiert sein (Panagiotidis et al., 1993; Shuman & Silhavy, 1981). Neuere Ergebnisse sprechen jedoch dafür, daß beide Proteine notwendig sind. Die EAA-Regionen von MalF und MalG sind zwar nicht symmetrisch in ihrer Funktion, kooperieren jedoch beim Transport und interagieren mit der helikalen Domäne, dem Loop 2-3, der zwischen dem Walker A- und Walker B-Motiv von MalK liegt. ATP-Bindung fördert die Interaktionen innerhalb des Komplexes (Hunke et al., 2000; Mourez et al., 1997). Inzwischen wurde die Struktur von MalK aus Thermococcus litoralis gelöst. Die Dimerisierung findet wie in E. coli und Salmonella typhimurium über die ATPase-Domäne statt, die regulatorischen, C-terminalen Domänen befinden sich an den entgegengesetzen Polen (Diederichs et al., 2000). Von der T.
litoralis MalK-Struktur wurde ein Modell für das MalK von E. coli und Salmonella typhyimurium abgeleitet (Böhm et al., 2002).
Anhand von Arbeiten mit Vanadat, das einen Übergangszustand in der ATP-Hydrolyse stabilisiert, wurde ein Modell für den Transport entwickelt (Chen et al., 2001; Davidson, 2002; Sharma & Davidson, 2000) (Abb. 3). Bindung von Maltose überführt MBP in die geschlossene Konformation. In dieser Konformation bindet MBP an den Membrankomplex und stimuliert Transport und ATP-Hydrolyse (I). Im Übergangszustand kommt es zu einer festen Bindung von MBP an MalF und MalG, wobei die Substratbindestellen der Proteine einander zugewandt sind. Die geöffnete Konformation von MBP erleichtert die Abgabe der Maltose an die Bindestelle in MalF und MalG (II). Es folgt Maltosetransport und die Ablösung von MBP von der Membran (III). MBP aktiviert die ATPase-Aktivität von MalK, indem es beide Untereinheiten von MalK zusammenführt, wodurch eine vollständige Nukleotidbindestelle entsteht.
Abbildung 3: Modell des Maltodextrintransports. Zustand I bis III ist im Text beschrieben (Nach Chen et al., 2001).
2.2.1.6 MalM
MalM ist ein Protein von 306 aa mit einem Molekulargewicht von 31,9 kDa. Es besitzt eine funktionelle Signalsequenz und ist mit MBP vergleichbaren Mengen im Periplasma lokalisiert.
Wahrscheinlich ist es schwach mit der äußeren Membran assoziiert (Gilson et al., 1986;
Rousset et al., 1986). In malM Mutanten konnte keine Auswirkung auf die Diffusion von Maltodextrinen durch LamB beobachtet werden (Freundlieb et al., 1988). Es ist auch nicht an der Chemotaxis gegenüber Maltose beteiligt (Brass & Manson, 1984). Seine Funktion ist bisher ungeklärt, sie könnte in der Aufnahme eines Substrates liegen, das ebenfalls durch die cytoplasmatischen Komponenten des Maltosesystems transportiert wird. Denkbar wäre auch eine enzymatische Aktivität im Rahmen der Maltoseverwertung.
2.2.2 Die Enzyme des Maltosesystems
2.2.2.1 Die a-Amylase MalS
MalS ist ein Protein von 676 aa mit einem Molekulargewicht von 75,7 kDa, einschließlich der N-terminalen Signalsequenz von 17 aa, die bei Sekretion in das Periplasma abgespalten wird.
Es weist Homologien zu a-Amylasen, einer Cyclodextrin-Glucanotransferase und einer Maltohexaose-freisetzenden Amylase auf. Außerdem ist es homolog zu einem weiteren Enzym des Maltosesystems, der Maltodextrin-Glucosidase, und in zwei konservierten Bereichen im N-Terminus auch zu LamB (Momma, 2000; Schneider et al., 1992b).
Das Enzym besitzt die Aktivität einer a-Amylase, die Maltodextrine mit mindestens 3 Glucoseeinheiten unter Freisetzung von Glucose, Maltose und Maltotriose hydrolysieren kann. Erst mit Dextrinen der Länge von Maltoheptaose als Kohlenstoffquelle vermittelt die Expression von MalS einen Wachstumsvorteil, da längere Dextrine nicht über die Cytoplasmamembran transportiert werden (Ferenci, 1980; Freundlieb & Boos, 1986). Das Enzym greift sein Substrat vom nicht-reduzierenden Ende her an und setzt bei der Hydrolyse von Amylose und Maltodextrinen mit mehr als 6 Glucoseeinheiten als Hauptprodukt Maltohexaose frei (Freundlieb et al., 1988).
MalS ist als Monomer mit Disulfidbrücken zwischen Cys40-58 und Cys104-520 aktiv. Eine der Disulfidbrücken liegt im N-Terminus, der über die zweite Disulfidbrücke mit der C-terminalen Amylasedomäne verknüpft ist. Der N-Terminus besitzt wahrscheinlich Chaperonfunktion und erhält die korrekte Faltung von MalS (Spiess et al., 1997). Außerdem wird DsbA (PpfA) für die Faltung von MalS benötigt. Die Faltung wird bei niedrigen Temperaturen zusätzlich durch DegP stimuliert, das dagegen bei hohen Temperaturen Proteaseaktivität aufweist (Kamitani et al., 1992; Spiess et al., 1999).
2.2.2.2 Die Amylomaltase MalQ
malQ kodiert für die Amylomaltase, ein monomeres, cytoplasmatisches Protein von 78,4 kDa (Hatfield et al., 1969; Pugsley & Dubreuil, 1988). Sie katalysiert die Abspaltung einer
Glucoseeinheit oder eines längeren Dextrins vom reduzierenden Ende eines Donordextrins und den Transfer des Dextrinylrestes auf das nichtreduzierende Ende eines Akzeptordextrins.
Durch die Disproportionierungsreaktion entstehen zunehmend längere Dextrine, wobei die Anzahl der glycosidischen Bindungen erhalten bleibt. Während Glucose als Akzeptor ausreichend ist, muß der Donor mindestens aus 3 Glucoseeinheiten bestehen und zumindest in geringen Mengen als Primer vorhanden sein (Palmer et al., 1976; Schwartz, 1987). Deshalb sind Mutanten in malQ nicht mehr in der Lage, ausschließlich auf Maltose zu wachsen, sondern werden in Anwesenheit einer weiteren Kohlenstoffquelle im Medium durch sie sogar inhibiert, was in kurzer Zeit zu Sekundärmutationen in malT und malK führt, die den Maltosetransport verhindern (Schwartz, 1987).
2.2.2.3 Die Maltodextrinphosphorylase MalP
malP kodiert für die Maltodextrinphosphorylase, die als Dimer im Cytoplasma vorliegt. Die beiden Monomere, die jeweils über einen Lysinrest ein Molekül Pyridoxalphosphat gebunden haben, bestehen aus je 796 aa mit einem Molekulargewicht von 90,5 kDa einschließlich des Cofaktors (Palm et al., 1987; Schächtele et al., 1978; Schwartz, 1987). MalP spaltet von Maltodextrinen ab einer Kettenlänge von 5 Glucoseeinheiten vom nichtreduzierenden Ende phosphorolytisch Glucose ab, so daß Glucose-1-Phosphat (Glc-1-P) entsteht. Hierbei handelt es sich um eine reversible Reaktion, das Gleichgewicht verschiebt sich mit höheren Pi- Konzentrationen im Cytoplasma auf die Seite der Phosphorolyse, und ein Überschuß von Glc-1-P führt zur Synthese von Dextrinen (Schwartz, 1987; Schwartz & Hofnung, 1967).
Zusammenfassend läßt sich folgern, daß der Abbau von Maltose nur durch ein Zusammenspiel von MalP und MalQ möglich ist. Zuerst dient die Maltose als Akzeptor der durch MalQ katalysierten Aufpolymerisierung zu längeren Dextrinen, die schließlich durch MalP abgebaut werden können. Am Ende werden Glucose und Glucose-1-Phosphat frei, die in Glucose-6- Phosphat umgewandelt werden und in die Glycolyse eingehen. malP-Mutanten sind in der Lage, auf Maltose zu wachsen, jedoch nimmt die Länge der Zellen stark zu, was durch die Anhäufung linearer, langkettiger Dextrine in der Zelle durch die Aktivität von MalQ verursacht wird (Schwartz, 1965; Schwartz, 1967).
MalP ist hochhomolog zu anderen bakteriellen und tierischen Phosphorylasen (Choi et al., 1989; Palm et al., 1985). Die Kristallstruktur wurde sowohl in Anwesenheit von Maltohexaose als auch des Pseudo-Tetrasaccharids Acarbose gelöst (Brunkhorst et al., 1999) (O'Reilly et al., 1999; O'Reilly et al., 1997). Das katalytische Zentrum von MalP liegt zwischen der N- und C-terminalen Domäne am Ende eines Tunnels, der die Substratbindestelle darstellt. Die Substratspezifität des Enzyms kann über das Vorhandensein von 5 Sub- Bindestellen erklärt werden (Watson et al., 1999; Watson et al., 1997). Lysin 533 spielt eine Schlüsselrolle in der Phosphorolyse (Schinzel, 1991). Auch der hochkonservierte äußerste C- Terminus spielt eine wichtige funktionelle oder strukturelle Rolle (Palm et al., 1987).
2.2.2.4 Die Maltodextringlucosidase MalZ
Durch Mutanten in malF und malG, die im Gegensatz zum Wildtyp p-Nitrophenyl-a- Maltosid transportieren, wurde entdeckt, daß es im Cytoplasma ein weiteres MalT- abhängiges Enzym geben muß, das dieses Substrat spaltet (Reyes et al., 1986). Dabei handelt es sich um die Maltodextringlucosidase MalZ, die aus 604 aa besteht und ein Molekulargewicht von 68,9 kDa besitzt. Sie ist ein monomeres Protein mit Homologien zu Glucosidasen, a-Amylasen und Pullulanasen (Tapio et al., 1991).
Die Substrate von MalZ sind Maltodextrine der Länge Maltotriose bis Maltoheptaose. MalZ katalysiert die für Glucosidasen untypische Reaktion der Abspaltung von Glucose und etwas Maltose vom reduzierenden Ende eines Maltodextrins. Somit erhöht MalZ das Verhältnis von Glucose zu Glucose-1-P, den Endprodukten der Maltoseverwertung. Jedoch ermöglicht Überexpression von MalZ Mutanten in malQ kein Wachstum auf Maltotriose, obwohl Glucose und Maltose freigesetzt werden. Wahrscheinlich wirkt die Akkumulation der Maltose toxisch (Boos et al., 1996; Peist et al., 1996; Tapio et al., 1991). Mutanten in malZ zeigen keinen Phänotyp bei Wachstum auf Maltose und Maltodextrinen (Reyes et al., 1986).
Dagegen wird die Funktion von MalZ in einer pgm Mutante deutlich. In dieser führt eine zusätzliche Mutation in malZ, zu stark reduziertem Wachstum. Das Enzym ist außerdem homolog zu Cyclodextrinyltransferasen. Seine Fähigkeit, Cyclodextrine zu spalten, dürfte jedoch nicht von physiologischer Bedeutung sein, da diese Substrate nicht in die Zelle transportiert werden (Peist et al., 1996; Podkovyrov & Zeikus, 1992; Szmelcman et al., 1976).
2.2.3 Regulation des Maltosesystems
2.2.3.1 Der Transkriptionsaktivator MalT
MalT ist ein Protein von 901 aa und einem Molekulargewicht von 103,0 kDa, das zu der MalT- oder LAL-Familie gehört, einer Klasse von bakteriellen Transkriptionsaktivatoren, die aus Proteinen über 90 kDa mit einer ATP-Bindestelle nahe des N-Terminus und Homologien zu LuxR um den C-Terminus besteht (Cole & Raibaud, 1986; Valdez et al., 1999). Das gesamte mal-Regulon von E. coli mit Ausnahme von MalT selbst steht unter ausschließlich positiver Kontrolle des Trankriptionsaktivators, das Protein weist in Abwesenheit des Induktors keine Repressorfunktion auf (Boos & Shuman, 1998; Debarbouille & Schwartz, 1979; Hofnung & Schwartz, 1971; Schwartz, 1987).
In einer Zelle, die auf Glycerin gewachsen ist, werden mehrere Hundert Moleküle MalT synthetisiert (Débarbouillé & Schwartz, 1979). Die Expression von malT ist CAP-abhängig.
Die CAP-Bindestelle mit der konservierten TGTGA-Sequenz befindet sich um die Position - 70,5 des malT-Promotors. Bindung von CAP begünstigt in Anwesenheit von cAMP die spezifische Bindung der RNA-Polymerase (Chapon, 1982b; Chapon & Kolb, 1983; Raibaud et al., 1991). Der Bereich von 83 bp vor dem Transkriptionsstart von malT enthält alle nötigen Elemente für die Expression des Gens, eine Sequenz mehr als 120 bp vor dem Transkriptionsstart ist an einer Reduktion der malT-Expression beteiligt (Raibaud et al., 1983;
Raibaud et al., 1991). Die Expression von malT ist sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene limitiert. Es wurden Mutationen in der Promotorregion isoliert, die zu erhöhter MalT-Synthese führen. Diese sind zum Teil im Bereich der Pribnow Box lokalisiert, bewirken eine fast CAP-unabhängige Expression und erhöhen die Rate der Transkriptionsinitiation. Andere Mutationen befinden sich in der Shine-Dalgarno-Sequenz und verstärken die Ribosomenbindung (Chapon, 1982a; Chapon & Kolb, 1983).
Der N-Terminus von MalT ist in einer Sequenz hochhomolog zu der Typ A Konsensussequenz ATP-hydrolysierender Proteine, die einen Teil der ATP-Bindestelle darstellt. MalT bindet ATP, dATP und AMP-PNP mit hoher Affinität, die ohne Maltotriose jedoch verringert ist. Auch die Affinität für ADP und GTP ist relativ hoch. Eine geringe ATPase-Aktivität wurde nachgewiesen, die durch Maltotriose stimuliert werden kann. Sie ist
jedoch weder für die Bindung an die DNA, noch für die Entstehung des offenen Komplexes notwendig (Richet & Raibaud, 1987; Richet & Raibaud, 1989). Der C-Terminus von MalT ist für die Bindung an DNA verantwortlich. Es wurden C-terminale, an Glutathion-S-Transferase fusionierte MalT-Fragmente isoliert, die an MalT-Boxen binden. Bestehen diese aus mindestens 100 Aminosäuren, sind sie außerdem negativ dominant über das Wildtypprotein.
Das kürzeste DNA-bindende MalT-Fragment, das isoliert wurde, besteht aus 95 Resten (Vidal-Ingigliardi et al., 1993). Es aktiviert einige, jedoch nicht alle MalT-abhängige Promotoren. In dieser Region sind Serin 834 und Glutamin 876 essentiell für die Transkriptionsaktivierung, wahrscheinlich über direkten Kontakt mit der RNA-Polymerase, aber nicht für die DNA-Bindung (Danot & Raibaud, 1993; Danot et al., 1996). Durch limitierte Proteolyse konnte das Protein in 4 Domänen eingeteilt werden, von denen die ersten drei kloniert, gereinigt und charakterisiert wurden (Abb. 4). Die globuläre Domäne 1 (DT1, aa 1-241) allein bindet ATP und besitzt ATPase-Aktivität. Maltotriosebindung erfolgt über einen Bereich, der sich über DT2 (aa 242-436) und 3 (aa 437-806) erstreckt, aber auch DT3 allein bindet den Zucker schwach. Bindung von Maltotriose bewirkt eine Konformationsänderung, bei der sich DT1 und DT3 auf DT2 zubewegen (Danot, 2001). Die Kristallstruktur von DT3 wurde gelöst. Sie besteht aus einer rechtsgedrehten Superhelixstruktur, die eine große Protein-Protein-Interaktionsfläche und eine mögliche Zuckerbindestelle besitzt, und einer kleinen C-terminalen Subdomäne. Es ist denkbar, daß die Oligomerisierung von MalT über diese Domäne und DT2 stattfindet (Steegborn et al., 2001).
MalT liegt inaktiv als Monomer vor und oligomerisiert in der aktiven Konformation. Die Oligomere bestehen aus 3 bis 6 Molekülen. Maltotriose und ATP induzieren im Gegensatz zu ADP jeweils allein teilweise die Multimerisierung, sind beide Faktoren vorhanden, überwiegt die multimere Form des Proteins. In vivo könnte die ATP-Hydrolyse an der Auflösung des Multimers oder Nukleoproteinkomplexes beteiligt sein (Schreiber & Richet, 1999).
Es wurden MalT-Mutanten isoliert, die in Abwesenheit von Induktor die Aktivität der mal- Gene erhöhen und nur bei geringen Proteinkonzentrationen durch Maltotriose weiter stimuliert werden können. Außerdem besitzen sie eine 5-fach höhere Affinität für Maltotriose als das Wildtypprotein. Diese konstitutiven, als malT c bezeichneten Mutationen sind in zwei Regionen im ersten Drittel des Gens geclustert (aa 220-244 und aa 351-359) (Dardonville &
Raibaud, 1990; Debarbouille et al., 1978). Während der Wildtyp nur durch Induktorbindung in
die aktive Konformation überführt wird, ist im Fall der MalTc-Proteine das Gleichgewicht durch eine strukturelle Veränderung auf diese Seite verschoben. Dem entspricht die Analyse einer limitierten Proteolyse von MalTc26, bei der Produkte entstanden, die einer Mischung aus Wildtypprotein in An- und Abwesenheit von Maltotriose entsprechen. In Anwesenheit von Maltotriose ergab sich das gleiche Muster für MalTc26 und Wildtypprotein (Danot, 2001).
Abbildung 4: Domänen von MalT. Die Domänen DT1-4 von MalT sind schematisch dargestellt. Ihre Funktionen und die Positionen der Aminosäuren ihrer Grenzen sind angegeben. Die Beteiligung von DT3 an der Oligomerisierung ist noch nicht bestätigt. L: Linker (Nach Danot, 2001).
2.2.3.2 Struktur der MalT-abhängigen Promotoren
MalT bindet an die Sequenz 5’-GGGGAT/GGAGG-3’, die sogenannte MalT-Box. Diese ist mehrfach im Promotorbereich der Gene des mal-Regulons, sowohl von E. coli als auch von Klebsiella pneumoniae, zu finden. Die Promotoren der verschiedenen mal-Gene variieren in der Anzahl und Lokalisierung der CAP- und MalT-Bindestellen. Zwei Elemente sind allen Genen gemeinsam und notwendig. Eines ist eine MalT-Box um die Position -37,5 oder -38,5 vom Transkriptionsstartpunkt, die in Transkriptionsrichtung orientiert ist. Das zweite Element sind zwei direkte Wiederholungen von MalT-Bindestellen upstream von Position -38, die durch drei Basenpaare getrennt sind und in beiden Orientierungen vorliegen können. Eine weitere Bindestelle kann, muß aber nicht vorhanden sein (Danot & Raibaud, 1993; Raibaud &
Richet, 1987; Vidal-Ingigliardi et al., 1991). Das malPQ-Operon benötigt eine höhere
Konzentration an MalT für seine Expression als malE/F/G und malK/lamB/malM (Debarbouille & Schwartz, 1980). Außerdem sind Maltotriose und ATP notwendig für die Bindung an die MalT-Box und für die Trankriptionsaktivierung, auch ADP hat einen leicht stimulierenden Effekt (Dardonville & Raibaud, 1990; Raibaud & Richet, 1987; Richet &
Raibaud, 1989).
Anhand der überlappenden Promotoren von malE und malK wurde ein Modell der Transkriptionsaktivierung durch MalT entwickelt. In dieser Region liegen 4 CAP- und 5 MalT-Bindestellen, an die die Proteine in der großen Rinne der DNA binden. Mit Ausnahme der MalT-Box 5 liegt die große Rinne aller Bindestellen auf derselben Seite der Helix. Für die Aktivierung ist eine komplexe Nukleoprotein-Struktur notwendig, in dem sich die DNA um einen Kern aus MalT- und CAP-Molekülen wickelt (Raibaud, 1989). An den Promotoren von pulA und pulC in K. pneumoniae, die zu zwei zusätzlichen MalT-abhängigen Operonen dieses Organismus gehören, wurde das Modell bestätigt und außerdem nachgewiesen, daß die MalT- Moleküle kooperativ an ihre Boxen binden (Vidal-Ingigliardi et al., 1991).
Der malK-Promotor enthält zwei überlappende Serien dreier MalT-Bindestellen. Ohne CAP bindet MalT an die hochaffinen Boxen, und es findet keine Trankription statt. In Anwesenheit von CAP bindet MalT an die geringer affinen Boxen und aktiviert die Transkription, da nur diese Bindestellen relativ zu Pribnow-Box korrekt positioniert sind (Richet et al., 1991). CAP vermittelt dabei die Repositionierung von MalT nicht über Interaktionen mit dem Protein sondern durch Biegung der DNA (Richet & Søgaard-Andersen, 1994).
CAP und MalT binden kooperativ am malE-Promotor, wobei das CAP-Molekül, das an die Box 3 bindet, direkt an der Aktivierung beteiligt ist. Es unterstützt die Bindung des C- Terminus der a-Untereinheit der RNA-Polymerase (aCTD) an die DNA direkt downstream der Box 3 über einen Kontakt aktivierenden Region 1 von CAP mit der aCTD (Richet, 2000).
Der Promotor von malP enthält 4 MalT Boxen und eine nichtessentielle CAP-Bindestelle.
MalT bindet unabhängig von CAP, das die Bindung an Box 4 sogar verhindert, an die Boxen 1- 3. Somit wirkt sich CAP auf dieses Operon nur indirekt über die Regulation der MalT- Konzentration aus (Danot & Raibaud, 1994).
Der malZ-Promotor enthält drei MalT-Boxen und keine CAP-Bindestelle, der von malS ebenfalls drei MalT-Boxen und eine mögliche, aber wahrscheinlich nicht funktionelle CAP- Bindestelle (Schneider et al., 1992a; Tapio et al., 1991).
2.2.3.3 Die endogene Induktion
Maltotriose ist der einzige bisher nachgewiesene Induktor des mal-Systems (Raibaud &
Richet, 1987). Jedoch auch ohne Maltotriose im Wachstumsmedium ist durch endogene Induktion eine Expression der Gene meßbar. Der endogene Induktor kann entweder aus Glucose-1-Phosphat und Glucose oder Glycogen gebildet werden. Eine ptsG ptsM glk Mutante, die nicht auf Glucose wächst, diese aber über das Galactosetransportsystem akkumulieren kann, polymerisiert Maltose, Maltotriose und Maltodextrin unabhängig von den Enzymen des mal-Systems. Diese Maltodextrinsynthese und daraus resultierende Induktion des Systems ist abhängig von der Phosphoglucomutase bzw. der Anwesenheit von Glucose-1- Phosphat. Mutanten in malQ sind konstitutiv in der Expression des Systems wegen der Entstehung von Maltotriose aus dem Glycogenabbau, die nicht mehr aufpolymerisiert werden kann. Der exakte Weg, durch den der interne Induktor entsteht, ist bisher noch unklar, es könnte eine noch nicht identifizierte Maltose/Maltotriose-Phosphorylase beteiligt sein (Decker et al., 1993; Ehrmann & Boos, 1987). Überexpression von glk verringert die Expression des mal-Systems, wenn es nur endogen durch gluconeogenetisch synthetisierte Maltotriose induziert wird. Dagegen wird die mal-Gen Expression in einer malQ-Mutante, in der die Maltotriose aus dem Glycogenabbau stammt, durch die Glucokinase nicht beeinflußt.
Dies bestätigt die Notwendigkeit der freien internen Glucose für die Bildung des internen Induktors (Meyer et al., 1997).
2.2.3.4 Katabolitrepression und Inducer Exclusion
Transport von Zuckern über das PTS wie im Fall der Glucose reguliert die Aufnahme von nicht-PTS-Zuckern. Einerseits wirkt phosphoryliertes EIIAGlc als allosterischer Aktivator der Adenylatcyclase. Bei Transport von Glucose wird deshalb durch die Abnahme an phosphoryliertem EIIAGlc weniger cAMP synthetisiert. Dies führt zu einer Abnahme der Transkription der cAMP/CAP-abhängigen Gene, der Katabolitrepression. Andererseits werden die Aufnahmesysteme von nicht-PTS-Systemen durch die dephosphorylierte Form von EIIAGlc direkt inhibiert. Das diauxische Wachstum läßt sich überwiegend durch diese
sogenannte Inducer Exclusion erklären (Inada et al., 1996; Kolb et al., 1993; Peterkofsky et al., 1989; Postma et al., 1996; Tagami et al., 1995).
Die Expression eines malT-lacZ-Hybridproteins ist um den Faktor 2,5 geringer in Zellen, die auf Glucose wachsen, als in Zellen, die auf Glycerin wachsen. Zugabe von cAMP im Glucosemedium hebt diese Reduktion nahezu wieder auf. Die Expression von malT ist somit sensitiv gegenüber der Katabolitrepression, und über die Regulation der MalT-Konzentration wirkt sie sich indirekt auf das gesamte Regulon aus. Zumindest die Gene des Transportsystems werden außerdem zusätzlich direkt reguliert (Débarbouillé & Schwartz, 1979; Raibaud et al., 1991). MalK ist das Zielprotein der Inducer Exclusion im Maltosesystem. Drei von 4 Mutationen, die Resistenz gegenüber Inducer Exclusion vermitteln, sind in den letzten 100 aa des C-Terminus von MalK lokalisiert, eine liegt zwischen der Walker A- und Walker B-Region (Dean et al., 1990).
Jedoch nicht nur PTS-Zucker können Katabolitrepression und Inducer Exclusion bewirken, sondern auch verschiedene nicht-PTS-Zucker (Hogema, 1998; Hogema et al., 1998).
Außerdem sinkt bei Wachstum auf Glycerin die Expression von malT um den Faktor 2 bis 3.
Phosphorylierung von Glycerin zu Glycerin-3-Phosphat ist dabei notwendig, jedoch kein weiterer Stoffwechselschritt. Es wurden zwei verschiedene Regulationswege beobachtet. Die Repression der Transkription ist EIIAGlc, cAMP und CAP abhängig, wobei die Menge an cAMP reguliert wird. Die Translation wird dagegen unabhängig von cAMP durch ein Absinken des pH-Wertes des Wachstumsmediums reprimiert. Ähnliche Effekte wurden mit nicht-PTS-Zuckern beobachtet (Eppler & Boos, 1999).
2.2.3.5 Streß durch Glucoselimitierung
Bei Wachstum von E. coli unter glucoselimitierenden Bedingungen werden die Gene des Maltosesystems MalT- und CAP-abhängig induziert. Die Analyse von Batchkulturen zeigte, daß die Induktion von MalT selber mit dem CAP-Gehalt korreliert, am höchsten zu Beginn der Stationärphase ist und über längere Zeit anhält. Dagegen nimmt die Expression von LamB, das die Glucoseaufnahme bei geringen Zuckerkonzentrationen wesentlich verbessert, mit anhaltender Stationärphase wieder ab. Die Expression wird wahrscheinlich durch die Synthese des internen Induktors reguliert (Death & Ferenci, 1993; Notley & Ferenci, 1995). Bei
verlängertem Wachstum einer Chemostatkultur unter Glucoselimitierung traten Mutationen unter anderem in malT auf, die die Nährstoffaufnahme durch LamB-Überexpression erhöhen (Notley-McRobb & Ferenci, 1999).
2.2.3.6 Physikalische Größen
Das mal-System wird auch durch physikalische Einflüsse reguliert. Hohe Osmolarität verringert die uninduzierte Expression des Regulons mit Ausnahme der von malT.
Maltoseinduzierte oder malTc-abhängige Expression wird dadurch jedoch kaum beeinflußt.
malQ-Mutanten werden nicht reprimiert, sofern Glycogensynthese möglich ist. Deshalb scheint die Osmoregulation über die Menge an internem Induktor vermittelt zu werden (Bukau et al., 1986).
Liegt der pH-Wert des extrazellulären Mediums über 6, wird CAP-abhängig die Transkription von malT sowohl im uninduzierten als auch induzierten Zustand erhöht. Dieser Vorgang geschieht schnell und scheint deshalb unabhängig von größeren metabolischen Veränderungen zu sein (Alonzo et al., 1998; Heyde et al., 1991).
Die Expression von LamB ist bei 27°C höher als bei 37°C. Die Thermoregulation ist in envY- Mutanten aufgehoben, und der Defekt kann durch überexprimiertes EnvY wieder komplementiert werden (Lundrigan & Earhart, 1984; Lundrigan et al., 1989).
Innerhalb einer Zelle variiert die Expression der mal-Gene außerdem zeitabhängig. MBP wird bei Wachstum auf Maltose erst kurz vor und während der Zellteilung exprimiert. Der Anteil an MBP am Gesamtproteingehalt des Periplasmas beträgt dann 30-40% und gleichzeitig ist die Entstehung von Polkappen, einer Vergrößerung des periplasmatischen Raums an den Enden der Zelle, zu beobachten (Dietzel et al., 1978). Es wurde außerdem beobachtet, daß bei Maltoseinduktion LamB erst im letzten Viertel der Generationszeit einer Zelle in die äußere Membran eingebaut wird, und daß der Einbau in der Umgebung des sich bildenden Septums beginnt (Ryter et al., 1975).
2.2.3.7 Trehalosesystem
TreR ist der Repressor des Trehaloseoperons. Dieses besteht aus treB, das für das EnzymIITre des Trehalose-PTS kodiert, und treC, dessen Produkt eine cytotoplasmatische Trehalose-6- Phosphat-Hydrolase darstellt (Horlacher & Boos, 1997; Klein et al., 1995; Rimmele & Boos, 1994). Eine treR-Mutation wirkt bei Wachstum auf Maltose durch die Expression von treB der Repression des mal-Regulons durch überexprimiertes malK entgegen. Unter diesen Bedingungen gelangt Maltose durch erleichterte Diffusion über EnzymIITre in die Zelle und induziert das mal-System. In Abwesenheit von Maltose und Trehalose im Medium hat die Derepression von treC einen induzierenden Effekt. TreC synthetisiert wahrscheinlich einen Induktor aus endogenen Substraten, allerdings wird in einer treR-Mutante nicht vermehrt Maltotriose gebildet. Dafür wandelt TreC Maltose unabhängig von MalT in ein Produkt um, bei dem es sich um Maltosephosphat handeln könnte (Decker et al., 1999).
2.2.3.8 Proteine mit regulatorischer Wirkung
Für verschiedene Proteine wurde ein regulierender Einfluß auf die Expression des mal-Systems nachgewiesen, wobei die Bedeutung von einigen in diesem Zusammenhang noch ungeklärt ist.
Das nucleoidassoziierte Protein H-NS ist Bestandteil des Chromosom-Protein-Komplexes und homolog zu StpA (Atlung et al., 1997; Zhang & Belfort, 1992). Gemeinsam fördern beide Proteine die Translation von MalT und damit die Transkription aller mal-Gene. Mutation in stpA haben allein keinen Effekt, dennoch kann StpA bei 37°C die Funktion von H-NS teilweise übernehmen, aber nicht bei 30°C. Die Expression des malK lamB malM und malEFG-Operons wird in hns und hns-stpA-Stämmen neben der reduzierten MalT-Menge auch durch einen verringerten Gehalt an cAMP-CAP beeinflußt (Johansson et al., 1998).
EnvZ und OmpR bilden ein Zweikomponentensystem, das eine wichtige Funktion in der osmoregulierten Kontrolle der Synthese der Porine OmpF und OmpC hat (Hall & Silhavy, 1981). Eine Mutante in envZ, die zu Überphosphorylierung von OmpR führt, verringert die Transkription von malT unabhängig von cAMP-CAP. Andererseits haben Nullmutationen in envZ keinen Einfluß auf die LamB-Expression, so daß EnvZ wahrscheinlich keine Rolle in der
normalen Regulation des mal-Systems spielt (Aiba et al., 1989; Case et al., 1986; Wandersman et al., 1980).
CreB/C ist ein weiteres Zweikomponentensystem, dessen spezifische Funktion noch ungeklärt ist (Wanner, 1996). Anhand des Vorhandenseins des „cre-tag“-Motivs wurde malE dem cre-Regulon zugeordnet. Bei Übergang von Vollmedium auf Minimalmedium wird wahrscheinlich CreC aktiviert und phosphoryliert CreB, das an den „cre-tag“ bindet und die Transkription von malE reprimiert, dagegen die der anderen Gene des cre-Regulons aktiviert.
malE ist das einzige Gen des Regulons, bei dem sich der „cre-tag“ in der transkribierten Sequenz befindet, wodurch sich die Repression erklären läßt (Avison et al., 2001).
2.2.3.9 Mlc
Bei Wachstum von E. coli auf glucosehaltigem LB-Medium exkretieren die Zellen Acetat, was zu einer Senkung des pH-Wertes und schließlich zu Beendigung des Wachstums führt, noch bevor die Glucose aufgebraucht ist. Ein bei 35,3 min lokalisiertes Gen kodiert für ein Protein der sogenannten ROK (repressor, ORFs, kinases)-Familie, die Transkriptionsrepressoren und Zucker-Kinasen enthält. Dieses verringert bei Überexpression die Akkumulation von Acetat und ermöglicht Wachstum, bis die gesamte Glucose und das Acetat aufgebraucht sind.
Dadurch entstehen auf Agarplatten große Kolonien, weshalb das Gen, das auch als dgsA publiziert wurde, mlc (making large colonies) genannt wurde. Das Protein ist hoch homolog zu NagC, einem Regulator verschiedener Operone (Hosono et al., 1995; Morris et al., 1985;
Plumbridge, 1995; Plumbridge, 1998; Plumbridge, 1991; Titgemeyer et al., 1994). Mlc reprimiert neben seiner eigenen Expression, die außerdem einer schwachen Katabolitrepression unterworfen ist, eine Reihe weiterer Genen wie beispielsweise das manXYZ-Operon. Dabei bindet es an jeweils einen einzelnen Operator, eine DNA-Sequenz, die der NagC-Bindestelle sehr ähnlich ist. Der Verlust von Mlc führt nur zu einer 3- bis 5-fachen Derepression der betroffenen Gene, weshalb man die Regulation durch Mlc eher als Modulation bezeichnen kann. Bei malT bindet es in der Region zwischen +1 bis +23 in Bezug zum Transkriptionsstart und interagiert wahrscheinlich direkt mit der RNA-Polymerase (Decker et al., 1998; Plumbridge, 1998). Es reprimiert außerdem ptsG, das für die membrangebundene Untereinheit EIICBGlc des PTS kodiert, und das ptsHIcrr-Operon, das für die
cytoplasmatischen Komponenten kodiert (Plumbridge, 1999; Zeppenfeld et al., 2000). Die Aktivität von Mlc wird wiederum durch den Glucosetransport über EIICBGlc moduliert.
Während des Glucostransportes wird Mlc von dephosphoryliertem EIICBGlc an die Membran gebunden und die durch Mlc regulierten Gene werden dereprimiert. Ein Überschuß an Mlc kann die Phosphorylierung von EIICBGlc und Phosphorylierung der Substrate dadurch verhindern. Für die Bindung von Mlc an EIICBGlc ist die IIB-Domäne mit der Phosphorylierungsstelle Cys421 und der IIC-B-Linker notwendig. Dieser Bereich vermittelt auch die Signale über die Aktivität anderer PTS-Transporter an Mlc. Der Linker ist notwendig für die Regulation der Expression von ptsG, aber nicht für den Phosphattransport auf die transportierte Glucose (Lee et al., 2000). Bisher wurde Mlc überwiegend als Repressor verschiedener zuckerverwertender Systeme, v.a. von PTS-Genen, angesehen. Jedoch gibt es erste Hinweise, daß auch andere Systeme durch Mlc reprimiert und einige aktiviert werden (Sabine Seitz, persönliche Mitteilung). Somit kann Mlc als globaler Regulator betrachtet werden.
2.2.3.10 MalK
MalK erzeugt nicht nur die Energie für den Transport von Maltodextrinen, sondern wirkt auch regulatorisch auf das mal-System. Wird plasmidkodiertes MalK überexprimiert, verringert sich die Expression des Systems, und seine Induktion wird auch in Anwesenheit externer Maltodextrine verhindert. Ein malTc Stamm zeigt Resistenz gegen diese Wirkung von MalK, die auch durch eine Promotormutation in malT, die zu erhöhter Expression des Gens führt, aufgehoben wird (Reyes & Shuman, 1988). Die Repression wird durch direkte Protein- Protein-Interaktion vermittelt. Damit entspricht MalK im Gegensatz zu Mlc nicht der klassischen Definition eines Repressors nach Jacob & Monod, 1961, einem DNA-bindenden Protein, das Transkription verhindert. Jedoch wird dieser Begriff im Folgenden für MalK und weitere auf Proteinebene mit MalT interagierende Proteine wegen ihrer Wirkung verwendet.
Die Inaktivierung von MalT durch MalK und die ebenfalls repressorisch wirkenden Proteinen MalY und Aes ist in Abb. 5 schematisch dargestellt. Interaktion von MalK und MalT wurde sowohl in vivo als auch in vitro nachgewiesen und findet auch mit MalTc1 statt. Deshalb wurde die fehlende Fähigkeit zur Repression der Mutante mit einem Defekt in der
Signalübertragung zwischen beiden Proteinen erklärt. Eine MalK-Mutante (G137A), die kein ATP hydrolysiert, wird zum „Superrepressor“, d.h. sie reprimiert stärker als das Wildtypprotein. Dagegen zeigen Zellen mit erhöhter ATP-Hydrolyse durch MalK erhöhte Expression der mal-Gene. Die aktive, am Transport beteiligte Form von MalK scheint somit keine Repression zu vermitteln, sondern nur die inaktive ATP-gebundene Form (Kühnau et al., 1991; Panagiotidis et al., 1998). Nach diesem Modell findet eine Autoregulation des Systems statt. Ist der Transportkomplex in Abwesenheit von Maltodextrinen im Medium inaktiv, wird die Transkription der mal-Gene herunterreguliert. Ungeklärt ist bisher, ob MalK in seiner inaktiven Konformation vom Transportkomplex abdissoziiert, um mit MalT zu interagieren, oder ob MalT durch inaktives MalK an die Membran assoziiert wird.
Die verschiedenen Eigenschaften von MalK im Transport, der Interaktion mit MalT und der Inducer Exclusion sind unabhängig voneinander. Es wurden Mutationen isoliert, die jeweils nur zum Verlust einer dieser Eigenschaften führen. MalK ist länger als andere ATP-bindende Untereinheiten von ABC-Transportsystemen entsprechend seiner zusätzlichen regulatorischen Funktion. Mutationen in den C-terminalen 110 aa verringern die Repression von MalT (Kühnau et al., 1991). Die Analyse der Mutanten ermöglichte anhand der vorhergesagten Struktur die Identifikation einer in der C-terminalen regulatorischen Domäne des Proteins gelegenen Interaktionsfläche mit MalT. In der Nähe und senkrecht dazu liegt ein Bereich über den die Inducer Exclusion vermittelt wird. Zusätzlich wurden sogenannte RDMs (regulatory domain motifs) entdeckt, die in der Linkerregion zwischen der ATPase-Domäne und in der regulatorischen Domäne liegen, und die wahrscheinlich sowohl an der korrekten Faltung der regulatorischen Domäne als auch am Substrattransport wesentlich beteiligt sind (Böhm et al., 2002).
Abbildung 5: Regulation der Aktivität von MalT. Das oligomere MalT stellt die aktive Konformation des Proteins dar, das monomere MalT die inaktive Konformation, die durch Bindung an die repressorischen Proteine stabilisiert wird. Aes liegt wahrscheinlich als Dimer vor, jedoch sind die Daten nicht eindeutig (Nach Boos &
Böhm, 2000).
2.2.3.11 MalY
Durch eine Mutation in einem bei 36 min gelegenen Gen wurde ein Protein entdeckt, in dessen Abwesenheit die Expression der Gene des mal-Regulons herunterreguliert ist. Das betroffene Gen wurde malI benannt für „maltose regulon inducer“, da angenommen wurde, daß sein Produkt an der Synthese eines internen Induktors beteiligt wäre (Ehrmann & Boos, 1987).
MalI ist ein Protein von 34,7 kDa mit Homologien zu den Repressoren GalR, CytR und LacI.
Die hochhomologen Bereiche befinden sich im N-Terminus, der ein Helix-turn-Helix-Motiv enthält, das wahrscheinlich an der DNA-Bindung beteiligt ist. Das Protein besitzt außerdem
