Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleichende Untersuchungen zur Degradation und Biokompatibilität von fluorid- und keramikbeschichteten Magnesiumschwämmen
im Kaninchenmodell
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Mareike Lalk Verden (Aller)
Hannover 2012
Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleichende Untersuchungen zur Degradation und Biokompatibilität von fluorid- und keramikbeschichteten Magnesiumschwämmen
im Kaninchenmodell
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Mareike Lalk Verden (Aller)
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Meyer-Lindenberg Klinik für Kleintiere
Jetzt: Chirurgische und Gynäkologische Kleintierklinik der Ludwig-Maximilians-Universität München
1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. Andrea Meyer-Lindenberg 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hagen Gasse
Tag der mündlichen Prüfung: 03. Dezember 2012
Diese Dissertation wurde im Rahmen des Sonderforschungsbereiches 599 „Zukunftsfähige bioresorbierbare und permanente Implantate aus metallischen und keramischen Werkstoffen“ im Teilprojekt R2 „Magnesiumschwämme als bioresorbierbare Implantate“
angefertigt, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Für meine Familie
Veröffentlichungen
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Ergebnisse dieser Dissertation wurden in international anerkannten Fachzeitschriften mit Gutachtersystem (peer review) zur Veröffentlichung angenommen:
• Materialwissenschaft und Werkstofftechnik / Materials Science and Engineering Technology
Biocompatibility and degradation behaviour of degradable magnesium sponges coated with bioglass – method establishment within the framework of a pilot study
Biokompatibilität und Degradationsverhalten von degradablen, bioglas- beschichteten Magnesiumschwämmen – Methodenetablierung im Rahmen einer Pilotstudie
M. Lalk, J. Reifenrath, D. Rittershaus, D. Bormann, A. Meyer-Lindenberg
- angenommen am 10.11.2010; DOI 10.1002/mawe.201000704
• Journal of Materials Science : Materials in Medicine
Fluoride and calcium phospate coated sponges of the magnesium alloy AX30 as bone grafts: A comparative study in rabbits
M. Lalk, J. Reifenrath, N. Angrisani, A. Bondarenko, J.-M. Seitz, P. P. Mueller, A. Meyer-Lindenberg
- angenommen am 06.11.2012; DOI 10.1007/s10856-012-4812-2
Veröffentlichungen
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Teilergebnisse dieser Dissertation wurden auf folgenden Fachkongressen präsentiert:
• 12th International and Interdisciplinary NRW Symposium, Biomaterials and Biomechanics: Fundamentals and Clinical Applications, Essen,
17. – 19. März 2010; Biomaterialien - Interdisciplinary Journal of Functional Materials, Biomechanics, and Tissue Engineering 2010; 11 (S1) p 56
Biocompatibility and degradation behaviour of degradable magnesium sponges coated with bioglass – method establishment within the framework of a pilot study
M. Lalk, J. Reifenrath, N. Angrisani, D. Bormann, A. Meyer-Lindenberg
• bone-tec 2011, International Bone-Tissue-Engineering Congress, Hannover, 12. – 15. Oktober 2011; Abstracts bone-tec 2011; p 32
Fluoride Coated Sponges of the Magnesium Alloy AX30 as Bone Grafts:
An In-vivo Study in Rabbits
M. Lalk, J. Reifenrath, J. Seitz, G. L. Angrisani, A. Meyer-Lindenberg
• 4th International Symposium Interface Biology of Implants, Warnemünde, 9. – 11. Mai 2012, Abstracts; p 50
In vivo biocompatibility of fluoride and calcium phosphatic coated degradable magnesium sponges in rabbit femurs
M. Lalk, J. Reifenrath, N. Angrisani, A. Bondarenko, J.-M. Seitz, P.P. Mueller, A. Meyer-Lindenberg
Inhaltsverzeichnis
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 9
2 Publikation I: “Biocompatibility and degradation behaviour of degradable magnesium sponges – method establishment within the framework of a pilot study” ... 13
2.1 Abstracts ...14
3 Publikation II: “Fluoride and calcium-phosphate coated sponges of the magnesium alloy AX30: A comparative study in rabbits” ... 16
3.1 Abstract ...17
4 Diskussion ... 18
5 Zusammenfassung... 31
6 Summary ... 34
7 Literaturverzeichnis ... 36
Einleitung
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1 Einleitung
Bei ca. jeder 10. rekonstruktiven Skelett-Operation werden Knochenersatzmaterialien benötigt (VAN DER STOK et al. 2011). Insbesondere Critical Size Defekte, definiert als 2-2,5 fach so lange Defekte wie der Knochendurchmesser (AN u. FRIEDMAN 1998), würden aufgrund überforderter Knochenregeneration ohne Auffüllung zu Nonunions führen (LASANIANOS et al. 2010; GUDA et al. 2011). Aber auch kleinere Defekte können bei Begleiterkrankungen wie Diabetes oder Osteoporose einen Knochenersatz erfordern (PIETRI u. LUCARINI 2007; HANNINK u. ARTS 2011).
Bis heute gelten Auto-, Allo- und Xenografts oder demineralisierte Knochenmatrix als effizientestes Biomaterial zur Versorgung dieser Defekte (YAO u. HO 2009;
DIMITRIOU et al. 2011; VAN DER STOK et al. 2011). Nachteile der Autografts mit z. T. anliegendem Gewebe zum Erhalt der Vaskularisation bestehen einerseits in beschränkter Verfügbarkeit, andererseits im zusätzlichen operativen Eingriff. Dieser bedeutet für den Patienten eine längere Narkosedauer und zusätzliche postoperative Schmerzen (LASANIANOS et al. 2010; VAN DER STOK et al. 2011). Bei Allo- und Xenografts besteht dagegen die Gefahr von Krankheitsübertragungen und Graft- Abstoßungen auf infektiöser oder immunologischer Basis (GOLDBERG u. AKHAVAN 2005; GUGALA et al. 2007; HANNINK u. ARTS 2011). Einem Demineralisierungs- prozess unterzogene Knochenmatrix hingegen setzt zwar die Infektionsgefahr herab, besitzt andererseits aber auch weniger Stabilität (YAO u. HO 2009).
Seit einiger Zeit wird daher sowohl an neuen Behandlungsstrategien wie der Masquelet-Technik, die in einem Zwischenschritt eine biologische Membran als Graftbett erzeugt (KARGER et al. 2012), als auch an neuen Biomaterialien, die dem Knochen ähnliche mechanische Eigenschaften und Struktur aufweisen sollen (NANDI et al. 2010; DIMITRIOU et al. 2011), geforscht. Einige dieser Materialien sind natürlichen Ursprungs wie Kollagenschwämme oder Korallen (O'BRIEN et al. 2005;
YAO u. HO 2009). Die meisten sind jedoch synthetischen Ursprungs und oft zusätzlich mit Cytokinen wie BMP-2, IGF-1 und TGF-beta oder mit mesenchymalen Stammzellen kombiniert (NUSS u. VON RECHENBERG 2008; HENSLEE et al.
2011; CAO et al. 2012). Eine Vielzahl von Granulaten und offenporigen Strukturen
Einleitung
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auf der Basis von Calciumphosphaten oder Polymeren (wie PMMA, PLGA, OPLA) ist bereits kommerziell erhältlich (NUSS u. VON RECHENBERG 2008; NANDI et al.
2010; VAN DER STOK et al. 2011). Jedoch werden gerade ihre ungenügende mechanische Belastbarkeit und beim Abbau auftretende Fremdkörperreaktionen häufig kritisiert (SUGANUMA u. ALEXANDER 1993; HING 2005; GENG et al. 2009).
Poröse Metalle besitzen neben einer Struktur, die Flüssigkeitsdurchtritt sowie Gewebeeinwuchs erlaubt (WEN et al. 2001), den Vorteil hoher Stabilität bei geringem Gewicht (KIRKLAND et al. 2009; BARBAS et al. 2012). Allerdings können selbst relativ inerte Metalle wie Titan bei Verbleib am Implantationsort ein erhöhtes Tumor- oder Metallose-Risiko bergen (MCDONALD et al. 2002; VOGGENREITER et al. 2003; DUNN et al. 2012), weshalb solide Implantate nach vollendeter Heilung oft routinemäßig wieder entfernt werden (RICHARDS et al. 1992). Dieses Vorgehen ist bei porösen, nach Abschluss der Heilung vom Knochen durchbauten Implantaten nicht möglich. Bei einem perfekten Knochenersatz sind daher Implantatdegradation und Knochenwachstum so gut aufeinander abgestimmt, dass jederzeit die benötigte Stabilität und Leitstruktur gegeben sind (HANNINK u. ARTS 2011), am Ende jedoch ein vollständiger Ersatz erfolgt ist (HING 2005). Dieser Effekt wird bei degradablen Implantaten auch als sogenannter schleichender Ersatz („creeping substitution“) bezeichnet (KARAGEORGIOU u. KAPLAN 2005).
Insbesondere das bioresorbierbare Leichtmetall Magnesium gewann aufgrund dem kortikalen Knochen ähnlichen mechanischen Kennwerten (Mg: Elastizitätsmodul 41- 45 GPa, Druckfestigkeit 65-345 MPa; Knochen: Elastizitätsmodul 3-20 GPa, Druckfestigkeit 130-180 MPa) an Interesse (STAIGER et al. 2006; WANG et al.
2012). Im Körper erfüllt Magnesium als Element zusätzlich wichtige Aufgaben, während es bei eventuellem Überschuss über die Nieren ausgeschieden wird (SARIS et al. 2000).
Obwohl bereits viele in vitro Untersuchungen und unterschiedliche Herstellungs- verfahren mit z. T sogar genau vorherbestimmbarer Endstruktur der Implantate
Einleitung
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existieren (WEN et al. 2004; BACH et al. 2007; NGUYEN et al. 2011), wurden in vivo bisher nur unbeschichtete Magnesiumschwämme der Legierung AZ91 in Kaninchen- kniegelenken untersucht (REIFENRATH 2005). Diese degradierten jedoch viel zu schnell für einen Knocheneinwuchs. Da bekannt ist, dass chloridhaltige Medien die Degradation grundsätzlich beschleunigen (STAIGER et al. 2006; MEYER- LINDENBERG et al. 2010) und es sich bei Synovia ebenfalls um ein solches Medium handelt (SCHOLZ et al. 1983), führt möglicherweise allein ein Implantationsort ohne Synoviakontakt zu langsamerem Degradationsfortschritt und damit besserem Einwachsen von Zellen.
Zusätzlich existieren verschiedene werkstoffkundliche Ansätze, um die Korrosionsbeständigkeit und somit die Biokompatibilität von Magnesiumimplantaten zu erhöhen. Zum einen wird das Degradationsverhalten stark durch die Zusammensetzung der Legierungselemente beeinflusst (WITTE 2010; REIFENRATH et al. 2011; KRAUS et al. 2012), so dass eine deutlich langsamer degradierende Legierung wie AX30 gewählt werden kann (HUEHNERSCHULTE et al. 2011). Zum anderen können Körperflüssigkeiten abschirmende Beschichtungen die Degradationsgeschwindigkeit deutlich reduzieren und sich gleichzeitig positiv auf die Integration in den Knochen auswirken (WANG et al. 2012). Ein mögliches Beschichtungsmaterial ist Bioglas, das seit Anfang der 1970er erforscht und seit 1985 aufgrund seiner hervorragenden Bioaktivität und Osteokonduktivität klinisch eingesetzt wird (HENCH et al. 1971; HEIKKILÄ et al. 1995; HENCH 2006). Als Alternative kommen bioaktive Calciumphosphatverbindungen in Betracht, die mit Hilfe eines Magnesiumfluorid-Interlayers sehr fest an das darunter liegende Magnesiumimplantat gebunden werden können (JO et al. 2011) und die Knochenbildung und -reifung beschleunigen sollen (XU et al. 2009). Aber auch Magnesiumfluorid allein kann durch Einlagerung in die natürliche Magnesiumhydroxidschicht eine sehr dichte und als Korrosionsbarriere wirksame Schicht bilden (THOMANN et al. 2010; WITTE et al. 2010). Zusätzlich ist die in vielen Fluorid-Studien belegte Osteoidinduktion (MCCORMACK et al. 1993; MOUSNY et al.
2008) möglicherweise für eine bessere Schwammdurchbauung nutzbar.
Einleitung
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Da bislang keine Untersuchungen von beschichteten AX30 Magnesiumschwämmen durchgeführt worden sind und zudem bisher auch keine andere Lokalisation als das Kniegelenk gewählt wurde, waren die Ziele der vorliegenden Arbeit:
a) Methoden zur Untersuchung von Biokompatibilität und Degradationsverhalten von Magnesiumschwämmen mit Beschichtung in unbelastetem spongiösem Knochen zu etablieren
b) Bioglas-, fluorid- und calciumphosphatbeschichtete AX30 Schwämme in vivo zu untersuchen und ihre Eignung als Knochenersatzmaterial zu vergleichen c) Die Ergebnisse mit denen von Leerbohrungen zu vergleichen, um zwischen
operations- und implantatbedingten Veränderungen zu differenzieren und das Ausmaß der Defektheilungsunterstützung durch die Implantate einzuordnen
Publikation I
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2 Publikation I
Biocompatibility and degradation behaviour of degradable
magnesium sponges coated with bioglass – method establishment within the framework of a pilot study
Biokompatibilität und Degradationsverhalten von degradablen, bioglas- beschichteten Magnesiumschwämmen – Methodenetablierung im Rahmen einer Pilotstudie
M. Lalk1*, J. Reifenrath1, D. Rittershaus1, D. Bormann2, A. Meyer-Lindenberg1
1Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, 30559 Hannover, Germany
2Institute of Materials Science, Leibniz University Hannover, An der Universität 2, 30823 Garbsen, Germany
*Corresponding author
Materialwissenschaft und Werkstofftechnik 2010 (Materials Science and Engineering Technology 2010)
Volume 41, Issue 12, Pages: 1025-1034 DOI 10.1002/mawe.201000704
Publikation I
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2.1 Abstracts
Aim of the present study was to establish methods for the evaluation of biocompatibility and degradation behaviour of coated magnesium sponges in cancellous bone. So bioglass coated sponges of the magnesium alloy AX30 were implanted into the femurs of rabbits for an observation period of 6, 12 and 24 weeks, respectively. In the follow up clinical and radiographical examinations and in vivo µ- computed tomographies (XtremeCT) were taken regularly. After euthanasia ex vivo µ-computed tomographies (µCT80) and histological examinations were executed. As result the greater trochanter proved to be a suitable implantation site and all coated magnesium sponges were tolerated well. The radiographs showed no development of gas or severe bone alterations. The XtremeCT depicted the proceeding degradation and accumulations of gas, but turned out to be not as meaningful in exact determination of bone and sponge changes. Better results regarding the degradation state of the sponges were provided by the µCT80 at the end of the test.
After all implantation periods different sized implant residues and newly formed bone around the implant were found. The histological examinations resulted in new bone formation and a mild, decreasing inflammation. The bone-implant-interface could not be evaluated at all localisations, since the remaining implants partly coiled up during microtome sectioning. In conclusion the chosen methods are suitable for usage in further studies. But supplement of the cutting and grinding method according to Donath and Breuner is required to examine the bone-implant-compound.
Keywords: sponge, bioglass coating, in vivo, magnesium alloy, resorbable
Ziel dieser Studie war die Methodenetablierung zur Untersuchung von Biokompatibilität und Degradationsverhalten von Magnesiumschwämmen mit Beschichtung in spongiösem Knochen. Es wurden bioglasbeschichtete Schwämme der Magnesiumlegierung AX30 für 6, 12 und 24 Wochen in Kaninchenfemora implantiert. Darauf folgten regelmäßige klinische und radiologische Untersuchungen, in vivo (XtremeCT) und ex vivo (µCT80) µ-Computertomographien und histologische Untersuchungen. Der Trochanter major erwies sich als geeigneter Implantationsort
Publikation I
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und die beschichteten Magnesiumschwämme waren gut verträglich. Die Röntgen- aufnahmen zeigten weder Gasentwicklung noch gravierende Knochen- veränderungen. Das XtremeCT stellte Degradationsfortschritte und Gas dar, stellte sich aber als wenig aussagekräftig bezüglich der exakten Bestimmung der Umbauvorgänge von Implantat und Knochen heraus. Bessere Ergebnisse bezüglich des Degradationsfortschritts der Schwämme lieferte hingegen das µCT80 am Versuchsende. Nach allen Implantationszeiten wurden unterschiedlich große Schwammresiduen und neu gebildeter Knochen nachgewiesen. Die histologischen Untersuchungen ergaben neben der Knochenneubildung milde, abnehmende Entzündungsreaktionen. Die Knochen-Implantat-Grenzflächen konnten nicht an allen Lokalisationen untersucht werden, da sich das Implantatmaterial während des Schneidevorgangs am Mikrotom z. T. herauslöste. Insgesamt eignen sich die gewählten Methoden für die Verwendung in weiteren Studien. Zusätzlich ist jedoch die Einführung der Trenn-Dünnschliff-Methode nach Donath und Breuner zur Untersuchung des Implantat-Knochen-Verbundes wichtig.
Schlüsselwörter: Schwamm, Bioglasbeschichtung, in vivo, Magnesiumlegierung, resorbierbar
Publikation II
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3 Publikation II
Fluoride and calcium-phosphate coated sponges of the magnesium alloy AX30 as bone grafts: A comparative study in rabbits
Mareike Lalk1*, Janin Reifenrath1, Nina Angrisani1, Alexandr Bondarenko2, Jan- Marten Seitz3, Peter P. Mueller4, Andrea Meyer-Lindenberg5
1Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, 30559 Hannover, Germany
2Department of Pathology, Dnipropetrovs‘k State Medical Academy, str. Zhovtneva ploshcha 14, 49005 Dnipropetrovs‘k, Ukraine
3Institute of Materials Science, Leibniz Universität Hannover, An der Universität 2, 30823 Garbsen, Germany
4Department of Gene Regulation and Differentiation,Helmholtz Centre for Infection Research, Inhoffenstrasse 7, 38124 Braunschweig, Germany
5Clinic for Small Animal Surgery and Reproduction, Centre of Clinical Veterinary
Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Ludwig Maximilian University Munich, Veterinärstraße 13, 80539 München, Germany
*Corresponding author
Journal of Materials Science: Materials in Medicine DOI 10.1007/s10856-012-4812-2
Publikation II
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3.1 Abstract
Biocompatibility and degradation of magnesium sponges (alloy AX30) with a fluoride (MgF2 sponge, n=24, porosity 63 ± 6 %, pore size 394 ± 26 µm) and with a fluoride and additional calcium-phosphate coating (CaP sponge, n=24, porosity 6 ± 4 %, pore size 109 ± 37 µm) were evaluated over 6, 12 and 24 weeks in rabbit femurs. Empty drill holes (n=12) served as controls. Clinical and radiological examinations, in vivo and ex vivo µ-computed tomographies and histological examinations were performed. Clinically both sponge types were tolerated well. Radiographs and XtremeCT evaluations showed bone changes comparable to controls and mild gas formation. The µCT80 depicted a higher and more inhomogeneous degradation of the CaP sponges. Histomorphometrically, the MgF2 sponges resulted in the highest bone and osteoid fractions and were integrated superiorly into the bone.
Histologically, the CaP sponges showed more inflammation and lower vascularization.
MgF2 sponges turned out to be better biocompatible and promising, biodegradable bone replacements.
Keywords: magnesium alloy, sponge, resorbable, porous, coating, in vivo, osteoid, biocompatibility, bone replacement
Diskussion
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4 Diskussion
Poröse Magnesiumimplantate stellen aufgrund der guten Biokompatibilität und -degradabilität des Leichtmetalls Magnesium eine neue Klasse von Knochenersatz-
materialien und ein aktuelles Forschungsgebiet dar (WITTE et al. 2006b; BACH et al.
2007; NGUYEN et al. 2011).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Methoden zur Untersuchung beschichteter Magnesiumschwämme im unbelasteten spongiösen Knochen zu etablieren und anschließend in einer ersten Untersuchung die Eignung von zwei unterschiedlich beschichteten Schwämmen einer definierten Magnesiumlegierung als Knochen- ersatzmaterial hinsichtlich Degradationsverhalten und Biokompatibilität zu ermitteln.
Dafür wurde das New Zealand White-Kaninchen als Tiermodell ausgewählt, da es in der orthopädischen Forschung bereits etabliert ist (AN u. FRIEDMAN 1998;
REIFENRATH et al. 2011). Eine Pilotstudie mit bioglasbeschichteten Schwämmen (BG-Schwämme) diente zu Beginn zur Überprüfung der Praktikabilität und der Effektivität der gewählten Methoden. Dieses Vorgehen hat sich auch in anderen Studien bewährt (HACKENBROICH et al. 2007; VON DER HÖH 2008; REMENNIK et al. 2011). Die Ergebnisse dieser Pilotstudie zeigten, dass sich der Implantationsort in den Trochanteres majores der Femora und die Zeiträume von sechs, 12 und 24 Wochen mit den sich einschließenden klinischen, radiologischen und in vivo µ- computertomographischen Untersuchungen mit dem XtremeCT für die Studie eigneten. Auch die präoperativen Untersuchungen der Schwämme und die postmortalen Untersuchungen der Schwamm-Knochen-Verbunde mit dem höher auflösenden µCT80 sowie Teile der Histologie erwiesen sich als durchführbar und sinnvoll, so dass ein Großteil der Methoden in die Hauptstudie übernommen und z.T.
erweitert wurde. Aufgrund der in der Pilotstudie beobachteten Spaltbildung zwischen Schwamm und Knochen infolge zu schneller Degradation der BG-Schwämme, wurden in der Hauptstudie jedoch neu entwickelte, langsamer degradable Magnesiumschwämme mit einer Fluorid- (MgF-Schwämme) bzw. einer Fluorid- mit zusätzlicher Calciumphosphat-Beschichtung (CaP-Schwämme) verwendet. Als
Diskussion
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Kontrollgruppe dienten Leerbohrungen ohne Implantat, wie es auch von WITTE et al.
(2006b) beschrieben wurde.
In der prae operationem durchgeführten µ-computertomographischen Untersuchung der BG-Schwämme der Pilotstudie war weder über den Schwellwert noch optisch eine klare Unterscheidung zwischen Beschichtung und Schwamm möglich, so dass diese Untersuchung wie bei WITTE et al. (2006b) hauptsächlich zur Überprüfung des Verbleibs herstellungsbedingter Salzpartikel oder massiver, bereits vor der Implantation stattgefundener Korrosion diente. BG-Schwämme mit deutlichen Salzpartikelresiduen oder starker Korrosion konnten somit im Vorfeld identifiziert und aussortiert werden. Bei den MgF- und CaP-Schwämmen war im µCT eine Differenzierung der unterschiedlichen Schwammbestandteile (CaP-Beschichtung, Schwamm, hypodenses Material, Luft) gut möglich, so dass das µCT für umfangreiche Berechnungen der verschiedenen Materialanteile und, wie in zahl- reichen anderen Studien (COSTA-PINTO et al. 2008; OLIVEIRA et al. 2008), zur Implantatcharakterisierung genutzt werden konnte. Dabei fiel auf, dass die CaP- Schwämme ein deutlich höheres Volumen, eine höhere Steganzahl und höhere Korrosion, aber dafür geringere Porosität und Porengrößen als die MgF-Schwämme aufwiesen. Da Untersuchungen mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX) weitere Aussagen zur Oberflächenbeschaffenheit erwarten ließen, wurde dieses Analyseverfahren in die Hauptstudie mit eingeschlossen. Aus den Analysen resultierte bei den MgF- Schwämmen eine offenporige Oberfläche mit verschieden hohen Fluor-Anteilen an unterschiedlichen Stellen, was eine erfolgreiche Fluordeposition auf dem Schwamm bestätigte. Da auch die Ursprungsschwammelemente Magnesium, Aluminium und Calcium stets nachgewiesen wurden, war die Durchgängigkeit der Beschichtung jedoch nicht vollständig gesichert. Bei den CaP-Schwämmen trat dagegen eine relativ ebene Oberfläche mit deutlichen Calcium-, Phosphor- und Sauerstoff-Peaks auf, was auf große Anteile Calciumphosphat hinwies.
Insgesamt zeigten sowohl die µCT- als auch die REM/EDX-Untersuchungen der Hauptstudie, dass sich durch die zusätzliche Beschichtung mit Calciumphosphat die
Diskussion
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Oberfläche des Ausgangsmaterials verändert hat und dass dadurch auch in den Eigenschaften deutlich unterschiedliche Implantate entstanden sind. Demzufolge waren mit großer Wahrscheinlichkeit auch Einflüsse auf das Verhalten der Schwämme in vivo zu erwarten.
In den klinischen Untersuchungen zeigte sich eine ebenso gute klinische Verträglichkeit der AX30 Magnesiumschwämme, wie sie in der Literatur vielfach auch für andere Geometrien und Legierungen beschrieben wurde (THOMANN et al. 2010;
ERDMANN et al. 2011; REMENNIK et al. 2011; KRAUS et al. 2012; LI et al. 2012).
In allen Gruppen kamen nur in den ersten Tagen post operationem geringgradige Rötungen, Schwellungen oder Gasansammlungen vor, wobei es sich um nach einem operativen Eingriff übliche Befunde handelt (WITTE u. BARBUL 1997). Außer einer vorübergehenden Serombildung bei einem BG-Schwamm und zwei kurzzeitig palpablen Gasblasen bei CaP-Schwämmen wurden auch im weiteren Verlauf keine negativen Reaktionen wie Wundinfektionen, Nahtdehiszenzen oder Lahmheiten fest- gestellt. Somit können alle Schwämme als klinisch gut verträglich eingestuft werden.
Als bildgebende in vivo Verfahren wurden das Röntgen und die µ-computertomographische Untersuchung im XtremeCT eingesetzt. Die
Röntgenuntersuchung war einfach und ohne Anästhesie durchführbar. Allerdings konnten in dem spongiösen Knochen, wie auch eine Studie mit soliden Magnesiumimplantaten zeigte (VON DER HÖH et al. 2009), die Implantate nicht klar dargestellt werden und war dieses Verfahren somit nicht für die Untersuchung der Schwammdegradation oder -integration in den Knochen geeignet. Jedoch konnten, wie in anderen Magnesium-in vivo-Studien (VON DER HÖH et al. 2009; ERDMANN et al. 2011; HAMPP et al. 2012) und einer Studie von DAOUD et al. (1999) teilweise auch, die Gasbildung sowie grobe Knochenveränderungen und knöcherne Muskelmetaplasien treffend abgebildet werden. Das in vivo µCT besitzt gegenüber den Röntgenbildern neben einer deutlich höheren Auflösung (Auflösung Röntgen 100µm, Auflösung XtremeCT 41µm) den Vorteil der überlagerungsfreien Darstellung und ermöglicht so eine bessere Beurteilung der knöchernen Integration und zusätzlicher Parameter wie z.B. der Implantatposition und -korrosion (HUEHNERSCHULTE et al. 2011; ULLMANN et al. 2011). Für eine exakte
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Beurteilung einzelner Trabekel und der genauen Schwammstruktur war die Auflösung des in vivo µCTs jedoch nicht ausreichend.
Direkt nach der Operation wurde mit dem µCT als erstes die korrekte Platzierung der Schwämme und Leerbohrungen überprüft, die von grundsätzlicher Relevanz für ihre Einbeziehung in die Studie war. Für alle Schwämme und die Leerbohrungen konnte nachgewiesen werden, dass sie, wie geplant, größtenteils im spongiösen Knochen lagen und keinen Kontakt zur Markhöhle aufwiesen. Damit konnten auch alle Schwämme in den Degradationsvergleich einbezogen werden, da in keinem Fall vermehrter Kontakt zu einem chloridhaltigen Medium bestand, das die Degradation nachgewiesenermaßen verstärkt (STAIGER et al. 2006; MEYER-LINDENBERG et al. 2010).
Als erster in vivo-Verlaufsparameter wurde in beiden Verfahren die Gasbildung beurteilt. Sie ist bei der Untersuchung von Magnesiumimplantaten besonders wichtig, da in der Literatur hinlänglich beschrieben wurde, dass beim Abbau von Magnesium und seinen Legierungen Wasserstoff entsteht (VON DER HÖH et al. 2009;
MUELLER et al. 2010; ERDMANN et al. 2011; JO et al. 2011; HAMPP et al. 2012).
Wasserstoff im Gewebe ist jedoch nur in dem Maße anzutreffen, in dem die Produktion den Abtransport durch Diffusion und Blutfluss übersteigt (WITTE et al.
2008). Bei den CaP-Schwämmen ergaben Palpation, Röntgenbilder und in vivo µCT- Untersuchungen eine deutlich stärkere Gasbildung, während sie bei den MgF- Schwämmen deutlich geringer war und bei den BG-Schwämmen sogar nur ausnahmsweise in einem Fall im in vivo µCT erkennbar war. Bei den Leerbohrungen trat, wie zu erwarten, keine Gasentwicklung auf. Insgesamt konnten in der vorliegenden Studie in Übereinstimmung mit der gegenwärtigen Literatur (WITTE et al. 2007; ERDMANN et al. 2011; HAMPP et al. 2012; KRAUS et al. 2012) keine klinisch negativen Effekte aufgrund der bis maximal zur 16. Woche festgestellten Gasbildung nachgewiesen werden.
An knöchernen Zubildungen waren wie bei VON DER HÖH et al. (2009) in fast allen Fällen periostale Zubildungen in der Bohrlochumgebung nachweisbar. Da diese Zubildungen auch bei den Leerbohrungen regelmäßig und in gleichem Ausmaß zu
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beobachten waren, ist es wahrscheinlich, dass sie durch die mechanische Manipulation beim Aufbohren des Knochens hervorgerufen wurden. Auch VON DER HÖH et al. (2009) vermuteten bereits implantatunabhängige Ursachen. Weitere knöcherne Strukturen bildeten sich in allen Gruppen regelmäßig im Operations- bereich am Ansatz des Musculus gluteus superficialis. Da auch diese bei allen Schwämmen und auch den Leerbohrungen auftraten, war ihre Entstehung vermutlich ebenfalls auf das Operationsprocedere zurückzuführen. Laut Literatur entsteht derartige heterotope oder orthotope Ossifikation z.B. durch wiederholte Irritationen in stark beanspruchter Muskulatur (DAOUD et al. 1999; KAN u. KESSLER 2011). Diese könnten in der eigenen Studie durch das Nahtmaterial und/oder Bohrmehl verursacht worden sein. In Tiermodellen werden zur Erzeugung von heterotoper Ossifikation auch osteoinduktive Calciumphosphat-Keramikpartikel genutzt (KAN u. KESSLER 2011), was die besondere Größe der Knochenstrukturen bei den CaP-Schwämmen in der vorliegenden Arbeit erklären könnte.
Bezüglich der knöchernen Integration zeigten alle Schwämme im XtremeCT in den ersten vier bis sechs Wochen nur geringen Knochenkontakt und somit eine mäßige Integration. Danach verstärkte sich der Kontakt bei den MgF-Schwämmen deutlich.
Bei den BG-Schwämmen und den CaP-Schwämmen entwickelten sich wie bei den reinen Magnesiumimplantaten von JO et al. (2011) meistens große Spalten zwischen Implantat und Knochen, so dass deren Integration aufgrund zu schneller Degradation als vergleichbar schlecht einzustufen ist.
In vorhergehenden Arbeiten hat sich gezeigt, dass sich das deutlich höher auflösende µCT80 (Auflösung 10µm), im Gegensatz zum XtremeCT, sehr gut zur Untersuchung der genauen Art des Implantat-Knochen-Kontaktes und einzelner Knochentrabekel eignet (VON DER HÖH et al. 2009; THOMANN et al. 2010).
Zusätzlich bestand hier die Möglichkeit den Schwamm exakt zu konturieren und in einer dreidimensionalen Berechnung das Ausmaß der Degradation und des mineralisierten Knochens im Inneren des Schwammes zu erfassen. Nachteile dieser zerstörungsfreien Methode bestehen allerdings in einer sehr langen Scandauer, einem geringen messbaren Probenvolumen und der Tatsache, dass mit diesem Gerät keine in vivo Untersuchungen durchgeführt werden können.
Diskussion
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Alle im µCT80 gewonnenen Ergebnisse werden nachfolgend von der Knochenperipherie zum zentral gelegenen Schwamm hin beschrieben und diskutiert.
Der schnellste kortikale Bohrlochschluss trat bei den Leerbohrungen auf, gefolgt von dem der BG- und MgF-Schwämme und schließlich dem der CaP-Schwämme. Diese Befunde passen zu einer Theorie von HENSLEE et al. (2011), nach der ein Scaffold die freie Migration von Osteoprogenitorzellen und somit die Knochenregeneration behindert, denn danach würde das kompakteste Material, was in dieser Arbeit die CaP-Schwämme waren, zur stärksten Behinderung führen.
Ein weiterer Unterschied der Knochenreaktion auf die verschieden beschichteten Schwämme bestand in der Entwicklung der um den Schwamm herum liegenden Spongiosa. Diese wies bei allen schwammtragenden Trochantern zwischenzeitlich eine sehr feinmaschige Struktur auf. Allerdings hatten alle BG- und MgF-Schwämme nach 24 Wochen wieder eine physiologisch weitmaschige Struktur erreicht, wohin- gegen bei den CaP-Schwämmen nach 24 Wochen fein- und weitmaschige Struktur noch in gleicher Häufigkeit vorkamen. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die BG- und MgF-Schwämme den CaP-Schwämmen in der Verträglichkeit überlegen sind. Insgesamt scheint das Phänomen der vorübergehenden Bildung einer unorganisiert erscheinenden, feinmaschigen Spongiosa nicht sehr häufig aufzutreten, da nur in einer weiteren Studie von XU et al. (2009), in der ein Zusammenhang zur Stimulation verschiedener Wachstumsfaktoren hergestellt wurde, davon berichtet wurde.
Beim optischen Vergleich der Knochentrabekel, die sich direkt am oder im Schwamm befanden, fielen bei den MgF-Schwämmen zu allen drei Untersuchungszeitpunkten vor allem die geringe Dicke und z.T. einzelne Inseln auf. Möglicherweise beruht diese geringe Trabekeldicke darauf, dass eventuell anliegendes Osteoid kaum mineralisiert ist (MOUSNY et al. 2008) und daher im µCT nicht knochendicht erscheinen würde. Dagegen waren die nach sechs Wochen bei den BG- Schwämmen gebildeten Trabekel denen der Leerbohrungen vergleichbar, und bei den CaP-Schwämmen traten ebenfalls nach sechs Wochen die dicksten, aber zugleich auch die wenigsten Trabekel auf. Sowohl bei den BG-Schwämmen als auch
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bei den CaP-Schwämmen bestätigte das µCT80, dass nach längeren Untersuchungszeiten in der Regel nur wenige oder sogar keine Trabekel einen Schwammkontakt aufwiesen. Mit Hilfe der Knochenanteilsberechnung, die bei den MgF- und den CaP-Schwämmen aufgrund der klaren Abgrenzungsmöglichkeit zwischen Implantat und Knochen möglich wurde, bei den BG-Schwämmen jedoch nicht möglich war, konnten diese Beobachtungen quantifiziert und die bessere Integration der MgF-Schwämme in Form eines hochsignifikanten Anstiegs des Knochenanteils am Restschwamm belegt werden. Den CaP- und BG- Beschichtungen fehlte also ein weit über die ersten vier Wochen hinausgehender Langzeiteffekt in Bezug auf die von XU et al. (2009), JO et al. (2011) und HENCH (2006) für mindestens diesen Zeitraum beschriebene Bioaktivität, die laut dieser
Literatur eine Stimulation der Osteoblastenadhäsion, -proliferation und -differenzierung und darüber ein höheres Knochen-Implantat-Kontakt-Verhältnis
bewirkt.
Zur Abschätzung, wie lange ein Knochenersatzmaterial in der Lage ist, seine Aufgabe als Stabilisator und Leitstruktur zu erfüllen, ist es wichtig, sein Degradations- verhalten in vivo zu untersuchen, da sich häufig gezeigt hat, dass in vivo und in vitro Ergebnisse in diesem Punkt nicht vergleichbar sind (WITTE et al. 2006a; REMENNIK et al. 2011; LI et al. 2012). Insbesondere die Volumen-, Form- und Dichteentwicklung sind in diesem Zusammenhang relevante und oft untersuchte Parameter (JO et al.
2011; WANG et al. 2011).
Von dem ursprünglichen 6 Wochen-Volumen waren bei den MgF-Schwämmen nach 24 Wochen noch 44 %, bei den CaP-Schwämmen noch 20 % und bei den BG- Schwämmen noch 13 % vorhanden. Alle Schwämme zeigten also eine deutliche, aber dennoch geringere Volumenreduktion als die unbeschichteten Schwämme aus einer AZ91-Legierung von WITTE et al. (2006b), von denen am Ende des gleichen Untersuchungszeitraumes nichts mehr übrig war. Die Formveränderungen der Schwämme spiegelten die Volumenveränderungen wieder, denn die MgF- Schwämme wiesen erst nach 24 Wochen deutliche Änderungen auf, während bei den BG-Schwämmen und den CaP-Schwämmen bereits nach 6 Wochen Form- veränderungen und nach 12 Wochen ein völliger Formverlust zu sehen waren. Somit
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konnten alle Beschichtungen ihren Zweck, die Korrosion zu verlangsamen, grundsätzlich erfüllen, die reine Fluoridbeschichtung stellte sich jedoch als effektivste Beschichtung heraus. Ein beachtenswerter Aspekt in Bezug auf die CaP- Beschichtung war außerdem, dass die Volumenabnahme der Beschichtung selbst zum Ende des Versuchszeitraumes hin fast stagnierte, wohingegen der Schwamm an sich sehr wohl weiter degradierte. Das führt zu der Überlegung, dass Teile der Beschichtung möglicherweise aus Calciumphosphatstrukturen vergleichbar mit bekanntermaßen schwer degradierbarem Hydroxylapatit bestehen (HING 2005).
Zusätzliche Untersuchungen zur Klärung dieser Frage bleiben jedoch weiteren Studien vorbehalten.
In Bezug auf die Dichte wiesen die MgF-Schwämme einen Abfall und anschließend einen Anstieg der Werte auf, während die CaP-Schwämme einen durchgängigen Anstieg zeigten. Der Abfall bei den MgF-Schwämmen, der im Zusammenhang mit einer Strukturveränderung beobachtet wurde, könnte darauf zurückzuführen sein, dass, wie bereits von HUEHNERSCHULTE et al. (2011) vermutet, Oxide und Hydroxide, also Materialien geringerer Dichte, in die Berechnung eingeflossen sind.
Anschließend könnten diese abgebaut worden sein oder es könnte insgesamt zu einem Implantatabbau mit gleichzeitiger Einlagerung von magnesiumhaltigen Calciumphosphat-Präzipitaten gekommen sein, so dass die Dichte wieder anstieg.
Derartige Calciumphosphat-Präzipitate können laut XU et al. (2009) in phosphat- haltigen Medien wie den Körperflüssigkeiten aus Magnesiumlegierungen entstehen und sorgten in der vorliegenden Arbeit bei den CaP-Schwämmen aufgrund des besonders phosphathaltigen Milieus vermutlich von Beginn an für den Dichteanstieg.
Ein Vergleich mit der Dichte der BG-Schwämme ist nicht möglich, da dort aufgrund der fehlenden Unterscheidungsmöglichkeit zwischen Schwamm und Beschichtung eine Gesamtdichte, die über den Verlauf relativ gleich blieb, berechnet wurde.
Insgesamt ergab die Degradationsuntersuchung im µCT80, dass die MgF- Schwämme den BG- und CaP-Schwämmen vom Abbauverhalten her überlegen waren, da sie als einzige über einen langsamen, aber stetig fortschreitenden Abbau mit langer Formbeständigkeit verfügten. Somit stehen sie, wie gewünscht, relativ lange, aber nicht permanent als Leitstruktur zur Verfügung.
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Um eine abschließende Aussage über die Art der Knochenreaktion und die Biokompatibilität eines Knochenersatzmaterials zu treffen, sind histologische Untersuchungen unerlässlich (AN et al. 2003; NUSS u. VON RECHENBERG 2008). Der besondere Nutzen der dazu in der Pilotstudie verwendeten Mikrotom- schnitte liegt in ihrer geringen Dicke von wenigen µm, da sich so nur sehr wenige Zellen überlagern und die Zellen entsprechend genau beurteilbar sind (YANG et al.
2003; WITTE et al. 2007; VON DER HÖH et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit stellte sich jedoch heraus, dass diese Technik für die Untersuchung von Magnesiumschwämmen als Implantat-Knochen-Verbund ungeeignet ist, da sich die Schwämme beim Schneiden stets aufrollten und somit die wichtigen Bereiche des Schwamminterfaces und –interstitiums nicht mehr untersucht werden konnten. Die Hoffnung, dass dieser bereits von JANNING et al. (2010) für Magnesium- vollimplantate beschriebene Effekt, bei einem nicht soliden, eventuell etwas nachgiebigeren Schwammmaterial nicht auftreten würde, hat sich leider nicht erfüllt.
In der Hauptstudie wurde daher auf die Trenndünnschliff-Technik nach DONATH u.
BREUNER (1982) zurückgegriffen, die zwar zu deutlich dickeren Schnitten (~50µm) führte, aber wie bereits in anderen Knochenimplantat-Studien den Implantat- Knochen-Verbund erfolgreich bewahrte und einer Untersuchung zugänglich machte (THOMANN et al. 2010; HAMPP et al. 2012; HUEHNERSCHULTE et al. 2012).
Zur Untersuchung der Art der Knochenreaktion wurde zunächst die Knochen- neubildung in der Schwammumgebung betrachtet. Sie setzte bei den MgF- Schwämmen genauso früh wie bei den Leerbohrungen ein, war aber stärker und hielt deutlich länger an, was dem gewünschten Ziel einer vermehrten Knochenmenge durch Nutzung eines Implantates entgegenkommt. Die Reaktion auf die BG- und die CaP-Schwämme glich dagegen eher der von konventionellen Implantaten und Scaffolds mit Hydroxylapatit-Oberfläche, da sich eine Entwicklung von hauptsächlich Bindegewebe über Knochenumbau mit hoher Osteoklastenbeteiligung zu Knochenneubildung zeigte (RYHÄNEN et al. 1998; SUSKA et al. 2008; GUDA et al.
2011; WANG et al. 2011) .
Auch im Interface-Bereich stellten die MgF-Schwämme ihre Überlegenheit unter Beweis, da sich größtenteils über die Osteoidbildung der in der Literatur häufig
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beschriebene enge Implantat-Knochen-Kontakt entwickelte (XU et al. 2009; WITTE et al. 2010; JO et al. 2011; KRAUS et al. 2012). Im Unterschied dazu dominierte Bindegewebe das Interface bei den CaP-Implantaten durchgängig und bei den BG- Schwämmen bis inklusive Woche 12. Bindegewebe kann in Abhängigkeit von den eingelagerten Zellen laut ANDERSON et al. (2007) zwar ein Hinweis auf eine beginnende Integration sein, da bei beiden Schwammtypen jedoch auch Nekrosezonen und verschiedene Entzündungszellen auftraten, muss von einer schlechteren Biokompatibilität ausgegangen werden. Insgesamt schienen die BG- Schwämme etwas besser verträglich zu sein als die CaP-Schwämme, da sich bei den BG-Schwämmen am Schluss neues Knochenmark im Interface-Bereich befand, das auf relativ abgeschlossene Umbauvorgänge hinweist (BECK 2002; MARCO et al. 2005; KUZYK u. SCHEMITSCH 2011).
Bei der Untersuchung des Interstitiums wurde die schnellste Defektfüllung in der Leerbohrungsgruppe nachgewiesen. Ab Woche 12 konnte jedoch durch Knochen- bildung in Form von Osteoid auch in der MgF-Schwamm-Gruppe die gewünschte Osseointegration und Defektfüllung belegt werden. Im Gegensatz dazu zeigte sich bei den CaP-Schwämmen nur selten Knocheneinwuchs in den Schwamm, und auch bei den BG-Schwämmen dürfte aufgrund der beobachteten Spaltbildung im µCT80 vermutlich kein Knochen in den Schwamm eingewachsen sein.
Für die komplett erhaltenen Präparate von den MgF-Schwämmen, den CaP- Schwämmen und den Leerbohrungen ließen sich die bei der Beurteilung von Schwammumgebung, Interface und Interstitium erhobenen Befunde in der histo- morphometrischen Knochenanteilsberechnung auch in Zahlen fassen. Diese zeigten, dass die Leerbohrungen zu allen Zeitpunkten in der Mitte zwischen den gut integrierten MgF-Schwämmen und den schlechter integrierten CaP-Schwämmen standen. Allerdings war die Knochenneubildungsrate beider Schwämme im Gegensatz zu den Leerbohrungen nach 24 Wochen noch weiter steigend wie man am steigenden Verhältnis von Osteoid zu Knochen ablesen kann.
Insgesamt läßt sich jedoch festhalten, dass die BG- und die CaP-Schwämme, wie die PPF-/PLGA-Scaffolds von HENSLEE et al. (2011) und die Hydroxylapatit-
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Zelluloseschwämme von EKHOLM et al. (2005), die Knochenneubildung eher zu behindern scheinen, während die MgF-Schwämme, wie die Hydroxylapatitscaffolds von GUDA et al. (2011) und die Kollagen-Hydroxylapatitscaffolds von KON et al.
(2010), die Osteoneogenese fördern.
Als besonders interessant hat sich in der vorliegenden Arbeit die Untersuchung des Osteoids herausgestellt, das insbesondere bei den MgF-Schwämmen mit signifikantem Anstieg und Dicken von bis zu 220 µm aufgetreten ist. Bei den CaP- Schwämmen lagen ansteigende, aber deutlich geringere Osteoidanteile vor, während bei den nur deskriptiv mikroskopisch ausgewerteten BG-Schwämmen ein Anstieg bis zur 12. Woche und danach ein Abfall auffielen. Osteoid entsteht als intermediäres Produkt bei der physiologischen Knochenneubildung und ist laut RAINA (1972) höchstens 20 µm dick. Unter Fluorideinfluss entsteht jedoch nachgewiesenermaßen mehr Osteoid (SUSHEELA u. JHA 1983; MOUSNY et al. 2008). Als Ursache für eine fehlende Mineralisation nach Fluorideinfluss kommt laut in vitro Untersuchungen möglicherweise die Produktion von strukturell veränderten Proteoglykanen und Matrix-Metalloproteinasen durch die Osteoblasten in Betracht (WADDINGTON u.
LANGLEY 1998, WADDINGTON u. LANGLEY 2003). Desweiteren wurden in anderen Studien auch allgemein nach dem Einsatz von Knochenimplantaten regelmäßig ansteigende Osteoidwerte gefunden (EKHOLM et al. 2005; WITTE et al.
2010; GUDA et al. 2011), was auf der Induktion eines höheren Turnovers durch die Implantate beruhen könnte (MOUSNY et al. 2008; GUDA et al. 2011). Während der Anstieg bei den MgF-Schwämmen hauptsächlich auf den erhöhten Fluoridspiegel zurück zu führen sein dürfte und der bei den BG-Schwämmen auf das erhöhte Remodelling, könnten bei den CaP-Schwämmen beide Varianten beteiligt gewesen sein. Der Abfall bei den BG-Schwämmen ist neben der Knochenmarksbildung in der Schwammumgebung ein weiteres Indiz dafür, dass die Umbauvorgänge zum Ende des Versuchszeitraumes hin bereits wieder abnahmen. Ebenso erklärt auch die frühe Defektauffüllung in der Leerbohrungsgruppe die Abnahme des Osteoidanteils bereits ab Woche 6.
Insgesamt muss jedoch in weiteren Studien untersucht werden, ob nach dem vollständigen Implantatabbau eine Mineralisierung des Osteoids folgt, wie es anhand
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der Übergangszonen vermutet werden kann. Auch muss geprüft werden, ob die zunächst reduzierte Mineralisation keine negativen Effekte auf die Stabilität hat, wie es die Studie von MOUSNY et al. (2008) erwarten lassen könnte.
Da metabolisch aktive osteogene Zellen auf eine ausreichende Sauerstoff- und Nährstoffversorgung aus dem Blut angewiesen sind, um eine direkte Osteogenese betreiben zu können (KARAGEORGIOU u. KAPLAN 2005; NUSS u. VON RECHENBERG 2008; KUZYK u. SCHEMITSCH 2011), wurde die Gefäßversorgung in dieser Arbeit gesondert untersucht. Wie nach den Ergebnissen zur Knochenneubildung erwartet, fanden sich bei den MgF-Schwämmen, die zu der stärksten Neubildung an Knochenmasse geführt haben, auch die meisten Gefäße, sodass die Induktion von Gefäßen prinzipiell als Vorteil angesehen werden kann.
Dass viele Gefäße aber nicht zwangsläufig zum Defektschluss notwendig sind, zeigten wiederum die Leerbohrungen, die mit der geringsten Anzahl zum schnellsten Defektschluss kamen und damit die Befunde von GARCIA et al. (2012) bestätigten, wonach die intrinsische Angiogenese-Antwort für eine zur Heilung ausreichende Vaskularisation in einer Nonunion sorgt.
Als Marker für das Ausmaß der Entzündungsreaktion wurden, wie auch in anderen Studien (ERDMANN et al. 2011; DZIUBA et al. 2012), Fremdkörper-Riesenzellen gewählt. Riesenzellen entstehen aus fusionierten Makrophagen, wenn der abzutransportierende Fremdkörper deren Größe übersteigt, sind mit einer Größe von bis zu 1 mm2 auch in Trenndünnschliffen gut zu erkennen und gelten nach der Implantation degradabler Materialien bei vielen Autoren als Teil der normalen Wundheilungsantwort (NUSS u. VON RECHENBERG 2008). Nur große Anzahlen in Kombination mit vielen neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Plasmazellen und reichlich Bindegewebe gelten als Zeichen für Bioinkompatibilität (NUSS u. VON RECHENBERG 2008). Entsprechend, fanden sich bei den Leerbohrungen kaum Riesenzellen. Bei den MgF-Schwämmen lagen passend zu einem Knochen mit Implantat jeweils wenige Riesenzellen vor, während bei den BG-Schwämmen nur zu Beginn und bei den CaP-Schwämmen durchgängig viele Riesenzellen, jeweils in Kombination mit anderen Entzündungszellen (neutrophile Granulozyten, Lymphozyten und Plasmazellen) und Bindegewebe, vorlagen. Es ergab sich also
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auch bei diesem Parameter die schon mehrfach festgestellte Abstufung der Biokompatibilität der Schwämme.
Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass für eine genaue Untersuchung des Degradationsverhaltens und der Biokompatibilität von beschichteten Magnesiumschwämmen verschiedene Methoden kombiniert werden müssen. In der klinischen Untersuchung können sowohl lokale als auch systemische Effekte erfasst werden, während Röntgenbilder hauptsächlich für einen schnellen Überblick über die lokale Situation geeignet sind. Das in vivo µCT ist in der Lage den Implantatsitz darzustellen und erlaubt eine überlagerungsfreie Untersuchung des umliegenden Gewebes im Verlauf der Untersuchung. Es zeigt jedoch Einschränkungen bezüglich der Darstellung einzelner Knochentrabekel und genauer Schwammstrukturen, weshalb zusätzlich ex vivo Untersuchungen mit dem µCT80, das eine deutlich höhere Auflösung besitzt und ebenfalls eine zerstörungsfreie Untersuchung ermöglicht, ergänzt werden sollten. Für eine abschließende Beurteilung der Biokompatibilität sind histologische Untersuchungen nötig, die an Trenndünnschliffen durchgeführt werden sollten, um den gesamten Schwamm- Knochen-Verbund analysieren zu können.
Mit Hilfe dieser Methoden konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass BG-, MgF- und CaP-Schwämme eine gute klinische Verträglichkeit besaßen und deutlich langsamer als unbeschichtete AZ91 Schwämme degradierten. Aber nur bei den MgF-Schwämmen konnte die Degradationsrate so weit gesenkt werden, dass es bei stetiger Degradation zu der gewünschten Osseointegration kam. Da sie sich zudem durch hohe Vaskularisation, Osteoid- und Knocheninduktion und geringe Entzündungsreaktion auszeichneten, stellen sie ein vielversprechendes Knochen- ersatzmaterial dar, das in weiteren Studien in Critical Size Defekten und über längere Zeiträume getestet werden sollte. Dabei muss insbesondere darauf geachtet werden, ob es nach vollständigem Implantatabbau zu einer guten Mineralisation des vermehrt gebildeten Osteoids kommt.
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5 Zusammenfassung
Mareike Lalk (2012): „Vergleichende Untersuchungen zur Degradation und Biokompatibilität von fluorid- und keramikbeschichteten Magnesium- schwämmen im Kaninchenmodell“
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob und wie unterschiedliche Beschichtungen von AX30 Magnesiumschwämmen die in vivo Degradation, die Biokompatibilität und das Einwachsverhalten des umgebenden Gewebes in den Schwamm beeinflussen, und welche der beschichteten Schwämme sich am besten als Knochenersatzmaterial eignen.
Um zu prüfen, ob die ausgewählte Lokalisation und die verwendeten Untersuchungs- techniken (klinische und radiologische Untersuchungen, in vivo und ex vivo µCT, Histologie) für die Beantwortung der Fragestellung geeignet sind, wurden in einer Pilotstudie zunächst mit Bioglas beschichtete AX30 Schwämme (BG-Schwämme, n=6) in den spongiösen Anteil der Trochanteres majores der Femora von drei New Zealand White Kaninchen eingesetzt und dort für sechs, 12 und 24 Wochen belassen. Die Ergebnisse zeigten, dass sich sowohl die gewählte Lokalisation als auch die Zeiträume und die Untersuchungsverfahren als anwendbar erwiesen, um verwertbare Aussagen zu erhalten, weshalb dieses Studiendesign mit Ausnahme der histologischen Untersuchung auch für die weiterführende Hauptstudie verwendet wurde. Für die histologischen Untersuchungen wurden in der Hauptstudie Querschnitte mit der Trenndünnschliff-Technik nach Donath und Breuner anstatt mit dem in der Pilotstudie verwendeten Mikrotom hergestellt, um den Knochen- Schwamm-Verbund zu erhalten. Diese Umstellung ermöglichte optimierte und umfangreichere Untersuchungen des Schwamminterstitiums und –interfaces sowie des umliegenden Gewebes.
Für die Hauptstudie wurden die AX30 Schwämme statt mit Bioglas mit einer Fluorid- (MgF-Schwämme, n=24) bzw. mit einer Fluorid- und zusätzlicher Calciumphosphat- Beschichtung (CaP-Schwämme, n=24) versehen und mit Leerbohrungen (n=12) verglichen. Vor der Implantation erfolgte in der Hauptstudie eine umfangreiche Charakterisierung der Schwämme mit Hilfe des hochauflösenden µCT80 und eines
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Rasterelektronenmikroskopes mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie zur Elementbestimmung. Dabei wurden in Bezug auf die Grundeigenschaften deutliche Unterschiede zwischen den MgF-Schwämmen (Porosität 63 ± 6 %, Porengröße 394 ± 26 µm, offenporige Oberfläche mit viel Magnesium und Fluor) und den CaP- Schwämmen (Porosität 6 ± 4 %, Porengröße 109 ± 37 µm, recht ebene Oberfläche mit hauptsächlich Calcium, Phosphor und Sauerstoff) festgestellt.
Pro Zeitgruppe wurden jeweils acht MgF- und CaP-Schwämme implantiert, und jeweils vier Leerbohrungen pro Gruppe dienten als Kontrolle.
Alle in Pilot- und Hauptstudie untersuchten Schwämme waren klinisch gut verträglich. Die Röntgen- und in vivo µCT-Untersuchungen zeigten nur vorübergehend geringgradige mit der Degradation einhergehende Gasbildung und den Leerbohrungen vergleichbare Knochenveränderungen. Mittels ex vivo µCT ließ sich eine stärkere Degradation der BG- und CaP-Schwämme im Vergleich zu den MgF-Schwämmen nachweisen. Die MgF-Schwämme zeigten eine deutlich bessere Integration in den Knochen. Die BG- und CaP-Schwämme degradierten in der Regel so schnell, dass es anstatt zur gewünschten Osseointegration zu einer Spaltbildung zwischen dem Schwamm und dem umliegenden Knochen kam. Die histologischen Untersuchungen belegten, dass dieser Spalt bei den BG-Schwämmen bis inklusive Woche 12 und bei den CaP-Schwämmen durchgängig mit Bindegewebe und Entzündungszellen (neutrophile Granulozyten, Lymphozyten und Plasmazellen) gefüllt war. Nach 24 Wochen konnte bei den BG-Schwämmen allerdings neu gebildetes Knochenmark in dieser Lokalisation nachgewiesen werden. Bei den MgF- Schwämmen traten dagegen neben der im Vergleich stärksten Vaskularisation und der gewünschten Osseointegration histomorphometrisch die höchsten Knochen- und Osteoidanteile aller Gruppen und ein hochsignifikanter (p ≤ 0,001) Osteoidanstieg, auch im Zentrum des Schwammes, auf.
Insgesamt konnte die vorliegende Untersuchung zeigen, dass unterschiedliche Beschichtungen einen großen Einfluss auf die in vivo Degradation und die Biokompatibilität von Schwämmen aus der Magnesiumlegierung AX30 haben. Im Hinblick auf einen Einsatz als degradables Knochenersatzmaterial haben sich
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insbesondere die nur mit Fluorid beschichteten Schwämme als vielversprechend erwiesen. Ob diese vielversprechenden Ergebnisse auch an Critical Size Defekten und über längere Zeiträume bestätigt werden können, muss in weiteren Studien geprüft werden. Darüber hinaus sollte auch der Einsatz anderer, noch langsamer degradierender Magnesiumlegierungen oder/und Beschichtungen weiter untersucht werden.
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6 Summary
Mareike Lalk (2012): „Comparative studies on the degradation and biocompatibility of fluoride- and ceramic coated magnesium sponges in a rabbit model“
The present study intended to investigate, if and how different coatings of AX30 magnesium sponges influence the in vivo degradation, the biocompatibility and the ingrowth behavior of the surrounding tissue into the sponge, and which of the coated sponges are best suited as bone replacement material.
To test the suitability of the chosen localization and the used examination techniques (clinical and radiological examinations, in vivo and ex vivo µCT, histology), a pilot study was performed where bioglass coated AX30 sponges (BG sponges, n=6) were implanted into the cancellous part of femur greater trochanters of three New Zealand White rabbits for observation periods of six, 12 and 24 weeks. The results showed the applicability of the chosen localization, the observation periods and the examination techniques to obtain valid statements. Therefore, this study design was also used for the further comprehensive study with changes for the histological examination. To enable the preservation of the implant-bone-compound, in the comprehensive study cross sections for the histological examinations were produced based on the cutting and grinding technique according to Donath and Breuner, instead of the microtome sectioning used in the pilot study. This adjustment allowed optimized and more thorough investigations of the sponge interstitium and interface as well as of the surrounding tissue.
For the comprehensive study the AX30 sponges were equipped with a fluoride coating (MgF sponges, n=24) and with a fluoride and additional calcium-phosphate coating (CaP sponges, n=24) instead of bioglass and were compared with empty drill holes (n=12). Prior to implanting, an extensive characterization of these sponges was performed by means of the high-resolution µCT80 and of a scanning electron microscope with energy dispersive X-ray spectroscopy for determination of elements.
As a result considerable differences regarding the basic properties were observed between the MgF sponges (porosity 63 ± 6 %, pore size 394 ± 26 µm, open-pore
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surface with high amounts of magnesium and fluorine) and the CaP sponges (porosity 6 ± 4 %, pore size 109 ± 37 µm, relatively level surface with calcium, oxygen and phosphor as main elements).
In each time group, eight MgF and CaP sponges were implanted and four empty drill holes per group served as a control.
Clinically all investigated sponges of the pilot and comprehensive study were tolerated well. Radiographs and in vivo µCT evaluations showed only temporarily mild gas formation in conjunction with the degradation and bone changes comparable to controls. Using the ex vivo µCT an increased degradation could be demonstrated for the BG and CaP sponges in comparison to the MgF sponges. The MgF sponges were integrated superiorly into the bone. Generally, the BG and CaP sponges degraded so fast, that instead of the desired osseointegration gap formation between the sponge and the surrounding bone occurred. The histological examinations showed for the BG sponges that this gap is filled with fibrous tissue and inflammatory cells (neutrophilic granulocytes, lymphocytes and plasma cells) until week 12 and for the CaP sponges continuously. However, after 24 weeks newly formed bone marrow was found at this localization for the BG sponges. In contrast, the MgF sponges exhibited the highest vascularization in comparison with the BG and CaP groups. Additionally, in the MgF sponges the desired osseointegration and the histomorphometrically highest bone and osteoid fractions of all groups as well as a highly significant increase in osteoid (p ≤ 0,001) also in the centre of the sponges occurred.
In summary, the present study could show a great influence of different coatings on the in vivo degradation and the biocompatibility of sponges made of the magnesium alloy AX30. Regarding the utilization as degradable bone replacement material especially the merely fluoride coated sponges represent a very promising material.
Further studies are needed to confirm these promising results for critical size defects and over longer time periods. In addition, the use of other, more slowly degrading magnesium alloys and/or coatings should be investigated.
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