Untersuchungen über den Einfluss der akuten Staupevirusinfektion auf die Funktion ex vivo kultivierter kaniner Monozyten

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Untersuchungen über den Einfluss der akuten Staupevirusinfektion auf die Funktion ex vivo kultivierter kaniner Monozyten

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Maren Martin

Hamburg

Hannover 2013

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Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. Veronika Maria Stein Klinik für Kleintiere

1. Gutachterin: PD Dr. med. vet. Veronika Maria Stein 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2013

Diese Arbeit wurde finanziell durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (FOR 1103/TI 309/4-1) unterstützt.

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Für meine Familie

Die Kunst ist, einmal mehr aufzustehen, als man umgeworfen wird.

Winston Churchill

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Vortrag:

1. M. Martin, R. Carlson, A. Tipold, W. Baumgärtner und V. M. Stein

"Akute Staupevirusinfektion reduziert die ROS-Produktion in ex-vivo kultivierten kaninen Monozyten"

21. Jahrestagung der Fachgruppe "Innere Medizin und klinische

Labordiagnostik" der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) 01.-02.02.2013 in München

"Acute distemper virus infection reduces ROS generation of ex vivo cultivated canine monocytes"

American College of Veterinary Internal Medicine (ACVIM) Forum 2013 12.-15. Juni 2013 in Seattle, USA

Posterpräsentation:

"Does monocyte recruitment to the CNS during acute canine distemper virus infection influence the pathogenesis of the disease?"

26^th Symposium of the Europeam Society of Veterinary Neurology (ESVN) und des European College of Veterinary Neurology (ECVN)

26.-28.09.2013 in Paris, Frankreich

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Abkürzungsverzeichnis ...8

1 Einleitung ... 11

2 Literaturübersicht ...13

2.1 Staupevirusinfektion des Hundes ...13

2.1.1 Terminologie und Ätiologie ...13

2.1.2 Klinisches Bild der kaninen Staupevirusinfektion ...13

2.1.3 Pathogenese der kaninen Staupevirusinfektion ...15

2.1.4 Die Rolle des Immunsystems bei der kaninen Staupevirusinfektion ....16

2.1.5 Entstehung von Läsionen im ZNS bei der kaninen Staupevirusinfektion ...17

2.1.6 Staupevirusstämme ...19

2.2 Mikroglia - die Makrophagen des ZNS ...20

3 Material und Methoden...22

3.1 Material...22

3.1.1 Labor-Equipment ...22

3.1.2 Reagenzien und Lösungen ...29

3.1.3 Computer Software ...38

3.1.4 Virus ...39

3.1.5 Tiere...39

3.2 Methoden ...41

3.2.1 Methodik zur Kultivierung kaniner Mikroglia ...41

3.2.2 Methodik zur Charakterisierung kaniner Monozyten ...47

3.2.3 Statistik über die Charakterisierung kaniner Monozyten ...50

4 Ergebnisse ...51

4.1 Ergebnisse der Mikroglia-Isolation ...51

4.2 REACTIVE OXYGEN SPECIES PRODUCTION IS SUPPRESSED IN CANINE DISTEMPER VIRUS INFECTED MONOCYTES USING A VIRULENT STRAIN...62

5 Übergreifende Diskussion ...82

6 Zusammenfassung ...87

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8 Literaturverzeichnis ...92 9 Anhänge ... 110 10 Danksagung ... 125

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Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

Ag Antigen

Ak Antikörper

Aqua bidest. Aqua bidestilata Art.-Nr. Artikelnummer

BSA Bovines Serum Albumin

°C Grad Celsius

CD14/TLR4 Cluster of differentiation 14/Toll-like receptor 4 CD Cluster of differentiation

CDV Canine Distemper Virus Ch.-B. Chargenbezeichnung

cm Zentimeter

CNS central nervous system

CO2 Kohlenstoffdioxid

ctr control

DG Dichtegradientenzentrifugation DHR Dihydrorhodamin 123

DMSO Dimethylsulfoxid DNAse Desoxyribonuclease EDTA Ethylendiamintetraacetat

FACS Fluorescence-activated cell sorter FC Fragment cristalline

FITC Fluorescein-Isothiocyanat FKS Fetales Kälberserum

FL Fluoreszenzkanal

F-Protein Fusionsprotein

FSC Forward scatter

g Gramm

g Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec²) gamPE R-Phycoerythrin-konjugiertes Ziege-anti-Maus

h Stunde

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HBSS Hanks´ gepufferte Salzlösung H-Protein Hämagglutininprotein

HuIgG Humanes Normal-Immunglobulin G IFNα/β Interferon I

IgG Immunglobulin G

KGW Körpergewicht

Ktr Negativkontrolle

l Liter

L-Protein Largeprotein

M Molar

MACS Magnetic-activated cell sorter

m-csf Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor mfi mean fluorescence intensity

MHC I/II Haupthistokompatibilitäts-Komplex Klasse I/II MIF Membran-Immunfluoreszenz

min Minuten

ml Milliliter

mm Millimeter

MM-prf Microglia Medium phenolrotfrei MOI Multipilicity of infection

M-Protein Maxtrixprotein

n.m. nicht messbar

NP Nukleoprotein

N-Protein Nukleokapsidprotein

mv mean value

mw Mittelwert

OND Staupevirusstamm Onderstepoort p.i. post infection

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung pH Potentia Hydrogenii

PMA Phorbol-Myristat Acetat ROS Reaktive Sauerstoffspezies

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P-Protein Phosphorprotein

R252 Staupevirusstamm R252

SLAM signaling lymphocyte activation molecule

SSC side scatter

Std. Stunde

Tab. Tabelle

TNF Tumornekrosefaktor

x Multiplikationszeichen ZNS Zentrales Nervensystem

µl Mikroliter

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Einleitung

Die Staupevirusinfektion des Hundes wird durch das Canine Distemper Virus (CDV) ausgelöst und infiziert immer noch Karnivoren weltweit (DEEM et al., 2000;

PRINGLE, 1999). Zu Beginn der Infektion kommt es zu einer Virusvermehrung in den Zellen des Immunsystems, was zu Apoptose und massiver Immunsuppression führt (KUMAGAI et al., 2004; MCCULLOUGH et al., 1974; SCHOBESBERGER et al., 2005). Daraufhin gelangt das Virus über die Blutbahn zu Magendarmtrakt, Urogenitaltrakt und Atmungsapparat (APPEL, 1969; OKITA et al., 1997) und im weiteren Verlauf auch in das Zentrale Nervensystem (ZNS; KRAKOWKA, 1989;

KRAKOWKA et al., 1987). Dort führt die Staupevirusinfektion zu einer Aktivierung der Mikrogliazellen welche daraufhin ihre funktionellen Eigenschaften und ihren Immunphänotyp ändern, sie produzieren reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), phagozytieren und fungieren als Antigen präsentierende Zellen (STEIN et al., 2004b). Die Produktion von ROS ist ein Mechanismus des Immunsystems infizierte Zellen zu Schädigen und auf den weiteren Zellabbau vorzubereiten. Jedoch kann ROS in einer Umgebung wie dem ZNS, welches sehr anfällig für oxidativen Stress ist, dazu führen, dass sekundär eine Demyelinisierung ausgelöst werden kann (GILGUN-SHERKI et al., 2004, GRIOT et al., 1990, STEIN et al., 2004b). Außerdem führt die Staupevirusinfektion zu einer Migration von Monozyten aus dem peripheren Blut in das ZNS, wo sie als Makrophagen die dort ansässigen Mikroglia bei ihrer Immunantwort unterstützen (GRIOT-WENK et al., 1991a, b; WISNIEWSKI et al., 1972). Nach der Einwanderung in das ZNS ist eine Differentierung zwischen Mikroglia und Makrophagen schwierig, somit ist das Ausmaß der ROS-Bildung des jeweiligen Zelltyps nicht zu unterscheiden und folgedessen auch ihre Bedeutung in der Entstehung der Demyelinisierung oder der Viruspersistenz bei der akuten Staupevirusinfektion. Generell führen virale Infektionen bei Monozyten zu einer Aufregulation des Oberflächenmarkers CD14 und somit zur Aktivierung des CD14/TLR4-Signalwegs, was wiederum zu einer Produktion proinflamatorischer Zytokine führt und zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems (ROLLAND et al., 2006). Eine Studie von Stein et al. (2008) hat gezeigt, dass eine CDV-Infektion von Monozyten in vivo zu einer Aufregulierung des Oberflächenmarkers CD14 führt, welche in ihrer Intensität mit der Schwere der neurologischen Ausfälle und dem

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Ausmass der histopathologisch nachgewiesenen Demyelinisierung im ZNS korrelierte.

Eine Differentierung der Mikroglia und der Makrophagen ist im ZNS schwer, jedoch ist eine Charakterisierung beider Zelltypen unabhängig von einander nötig um ihren Einfluss auf die Pathogenese der akuten Staupevirusinfektion zu evaluieren.

Demnach lag das Ziel der vorliegenden Arbeit zum einen in der Etablierung einer Mikroglia Reinkultur mit anschließender Charakterisierung nach CDV-Infektion und zum anderen in der Charakterisierung ex vivo CDV-infizierter kaniner Monozyten.

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Literaturübersicht

2.1 Staupevirusinfektion des Hundes

2.1.1 Terminologie und Ätiologie

Bei der Staupevirusinfektion des Hundes handelt es sich um eine Infektion mit dem Caninen Distemper Virus aus der Ordnung Mononegavirales, welche zur Familie der Paramyxoviridae und somit zur Gattung Morbillivirus gehören. Zu dieser Gattung zählen auch das Rinderpestvirus, das Morbillivirus der Delphine, sowie das Masernvirus der Menschen (PRINGLE 1999). Das Virion des CDV ist behüllt und enthält ein nicht-segmentiertes einzelsträngiges RNS-Genom negativer Ausrichtung (PRINGLE 1999). Es enthält sechs Strukturproteine: das Nukleokapsid- (N-), Matrix- (M-), Fusions- (F-), Hämagglutinin- (H-), Phosphor- (P-) und das Largeprotein (L-) und zwei Nicht-Strukturproteine (V- und C- Protein) (ORVELL 1980; DIALLO 1990). Die Virulenz verschiedener Stämme und Isolate ist sehr variabel, sie sind jedoch antigenetisch einheitlich (SUMMERS et al. 1984; PRINGLE 1999).

Weltweit kann ein breites Wirtsspektrum an Karnivoren mit dem CDV infiziert werden;

Mitglieder der Familien der Canidae (Hunde, Füchse und Wölfe), Felidae (Löwen, Tiger), Procyonidae (Waschbär) oder Mustelidae (Frettchen, Nerz und Mader) können genau so infiziert werden, wie Pinnipedia (Robben und Seelöwen) (APPEL et al. 1994; ROELKE-PARKER et al. 1996; DEEM et al. 2000; KENNEDY et al. 2000).

2.1.2 Klinisches Bild der kaninen Staupevirusinfektion

Abhängig von dem Virusstamm und der Immunantwort des infizierten Tieres können die Ausprägung der klinischen Symptome und der Verlauf der Erkrankung sehr unterschiedlich sein. So ist ein milder Krankheitsverlauf mit geringgradiger Ausprägung der Symptome genauso möglich, wie ein perakuter Krankheitsverlauf, der mit dem Tod des infizierten Tieres enden kann (MCCULLOUGH et al. 1974b;

KRAKOWKA et al. 1975; APPEL et al. 1982; SUMMERS et al. 1984; PARDO et al.

1997; KUMAGAI et al. 2004; CARVALHO et al. 2012).

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Es wird zwischen einer katarrhalischen (respiratorisch und/oder gastrointestinal) und einer neurologischen Form differenziert. Beide Formen können allein, aber auch in Kombination auftreten. Die CDV-Infektion kann akut oder chronisch verlaufen (FRISK et al. 1999; WUNSCHMANN et al. 2000; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005;

BEINEKE et al. 2009; CARVALHO et al. 2012). Unabhängig von der Form der Erkrankung tritt eine massive Immunsuppression mit hochgradiger Leukopenie auf (MCCULLOUGH et al. 1974b; KUMAGAI et al. 2004; SCHOBESBERGER et al.

2005).

Erkrankte Hunde zeigen zuerst unspezifische Symptome auf, wie Lethargie, Anorexie und Apathie gefolgt von einer biphasischen Fieberkurve und Entzündungen der Konjunktiven, Hautproblemen, respiratorischen Symptomen wie Nasenausfluss und Husten, aber auch gastrointestinalen Symptomen, wie Durchfall und Erbrechen (WRIGHT et al. 1974; MARTELLA et al. 2008). Die neurologische Form kann durch eine Vielzahl von neurologischen Symptomen geprägt sein, wie Myoklonus, Ataxie, Tremor, Krampfanfällen, sowie Paresen und Plegien der Gliedmaßen (VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005; AMUDE et al. 2007).

Zudem gibt es seltener vorkommende Erscheinungsformen wie die „old dog encephalitis“, das Staupegebiss der jungen Hunde und die „hard pad disease“

(ORMROD 1949; ANDERSON 1950; LOPEZ-PACHECO 1956; APPEL 1970;

DUBIELZIG et al. 1981; RIMA et al. 1987; AXTHELM u. KRAKOWKA 1998; GRONE et al. 2003; KOUTINAS et al. 2004; HEADLEY et al. 2009).

Die "old dog encephalitis" betrifft meist Hunde mit einem Alter von über sechs Jahren, bei denen es nach einer akuten CDV-Infektion zu einer Viruspersistenz im ZNS kommt, die nach einiger Zeit der Remission wieder aufflammen kann. Daraus resultiert eine seltene chronische Form der Polioenzephalitis, bei der klassischerweise Neurone und Astrozyten, vor allem im Kortex und im Hirnstamm, betroffen sind (NESSELER et al. 1999). Als Ort der Viruspersistenz wird die graue Substanz angesehen (NESSELER et al. 1999).

Bei jungen Hunden, die sich zum Zeitpunkt der CDV-Infektion im Zahnwechsel befinden, befällt das Virus die Ameloblasten. Infolge dessen kommt es zu einer dauerhaften Schädigung des Dentin (DUBIELZIG et al. 1981), wodurch es zur Entstehung des so genannten "Staupegebisses" kommt.

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Zu einer Hyperkeratose der Pfotenballen, der „hard pad disease“, kommt es durch eine CDV-Infektion der Keratinozyten der Epidermisschicht. Die „hard pad disease“

stellt eine weitere Form der Viruspersistenz dar (GRONE et al. 2004; KOUTINAS et al. 2004).

2.1.3 Pathogenese der kaninen Staupevirusinfektion

Das hochkontagiöse CDV wird durch alle Se- und Exkrete infizierter Tiere ausgeschieden und durch direkten Kontakt oronasal aufgenommen (KRAKOWKA et al. 1980b). Dies führt zu einer Primärbesiedelung des Rachens und des oberen Respirationstrakts und somit zu einer initialen Virusvermehrung in den Makrophagen, B- und T-Lymphozyten innerhalb der ersten 24 Stunden nach Infektionsbeginn. Nach zwei bis vier Tagen sind auch die Tonsillen und regionalen Lymphknoten betroffen, von denen ausgehend virämisch das gesamte lymphoretikuläre Gewebe (Knochenmark, Milz, Thymus, Peyersche-Platten, mesenteriale Lymphknoten, Kupferzellen und mononukleäre Zellen der Gefäße von Bronchien und Lunge) infiziert wird. Diese massive Virusvermehrung führt zu einer direkten Zellschädigung mit Apoptose, woraus eine starke Immunsuppression mit Leukopenie (vor allem Lymphopenie) resultiert (APPEL 1969, 1970; KRAKOWKA et al. 1980a;

VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 1995; KUMAGAI et al. 2004; VANDEVELDE u.

ZURBRIGGEN 2005; BEINEKE et al. 2009; CARVALHO et al. 2012). Acht bis zehn Tage nach der Infektion findet eine zweite zellgebundene Virämie statt, bei der aufgrund des epithelialen Zelltropismus des CDV eine Infektion des Respirations-, Magen-Darm- und Urogenitaltrakts erfolgt. Diese ist mit einer massiven Virusvermehrung und -ausscheidung verbunden (APPEL 1969; OKITA et al. 1997).

In das zentrale Nervensystem gelangt das CDV durch die anterograde Wanderung entlang des N. olfactorius, hämatogen als freie Viruspartikel oder zellgebunden an Thrombozyten und Lymphozyten über den Plexus choroideus und zerebrale Gefäße in Endothelzellen der Meningen sowie über den Liquor cerebrospinalis (HIGGINS et al. 1982; VANDEVELDE et al. 1985; RUDD et al. 2006).

Um in das Innere der Zelle zu gelangen, nutzt das CDV verschiedene zelluläre Oberflächenmoleküle. Das signaling lymphocyte activation molecule (SLAM oder CD150) ist ein auf aktivierten Monozyten, B- und T-Lymphozyten und dendritischen

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Zellen exprimierter Rezeptor, an den das Hämagglutininprotein des CDV andockt.

Mit Hilfe des Fusionsproteins wird es ermöglicht, dass die Wirts- und Viruszellmembran verschmelzen und auf diesem Wege kann CDV Zellen des lymphatischen Gewebes infizieren (COCKS et al. 1995; VON MESSLING et al. 2001;

SEKI et al. 2003; LAN et al. 2005; VON MESSLING et al. 2005; SCHWARTZBERG et al. 2009; ZIPPERLE et al. 2010). Auf kaninen Epithelzellen wird das Protein Nectin 4/PVLR4 exprimiert, welches das CDV als Ligand nutzt, um in die Zelle zu gelangen (NOYCE et al. 2012).

2.1.4 Die Rolle des Immunsystems bei der kaninen Staupevirusinfektion

Die hochgradige Leukopenie (vor allem Lymphopenie), hervorgerufen durch den virus-induzierten Zelltod und den Verlust der Lymphozytenproliferation, ist für die Immunsuppression verantwortlich und erhöht die Wahrscheinlichkeit bakterieller Sekundärinfektionen (KRAKOWKA et al. 1980a; KUMAGAI et al. 2004). Während der Phase der akuten Staupevirusinfektion ist die Lymphopenie vor allem durch eine vorübergehende Depletion der CD4⁺ T-Zellen, aber auch der CD8⁺ T-Zellen gekennzeichnet, wobei das Ausmaß der Depletion mit der Schwere der Erkrankung und der Entstehung der Viruspersistenz korreliert (WUNSCHMANN et al. 2000;

SCHOBESBERGER et al. 2005; BEINEKE et al. 2009).

Um eine CDV-Infektion erfolgreich abwehren zu können, wird eine gute humorale und zelluläre Immunantwort benötigt. Die Bildung von Antikörpern (Ak) gegen virale Nukleoproteine im akuten Stadium sowie im späteren Verlauf der Erkrankung gegen virale Hüllproteine ist unabkömmlich (KRAKOWKA et al. 1975; MIELE u.

KRAKOWKA 1983; RIMA et al. 1991). Das virale H-Protein ermöglicht über eine Kopplung an den zellulären SLAM-Rezeptor das Eindringen in die Zellen. Aus diesem Grund ist vor allem die Ak-Bildung gegen dieses Strukturprotein notwendig, um eine effektive Virusabwehr zu gewährleisten. Im Besonderen kann dadurch die Entstehung von Läsionen im ZNS verhindert werden (RIMA et al. 1991).

Interferon I (IFNα/β) wird vom angeborenen Immunsystem freigesetzt, um das erworbene Immunsystem zu aktivieren, so dass dieses die Virusproteinsynthese in infizierten Zellen hemmt, virale RNA abbaut und benachbarte Zellen aktiviert

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(STARK et al. 1998; PALM u. MEDZHITOV 2009). Das IFN-Signal kann durch eine Infektion mit einem hochvirulenten CDV-Stamm gestört werden (RÖTHLISBERGER et al. 2010).

2.1.5 Entstehung von Läsionen im ZNS bei der kaninen Staupevirusinfektion Die CDV-Infektion des ZNS ist meist mit einem klinisch sehr kritischen Zustand verbunden, da es zu einer Vielzahl neurologischer Ausfälle kommen kann, welche auch in Abwesenheit systemischer Symptome auftreten können (VANDEVELDE u.

ZURBRIGGEN 2005; AMUDE et al. 2007).

Die CDV-Infektion kann bei der selten vorkommenden "old dog encephalitis" zu einer Polioenzephalitis der grauen Substanz führen. Klassischerweise führt die CDV-Infektion jedoch zu einer demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis. Daher ist die Staupevirusinfektion ein gut etabliertes Tiermodel für die Multiple Sklerose beim Menschen (KOESTNER 1975; COOK et al. 1978).

Bei CDV-infizierten Tieren sind Läsionen vor allem in der weißen Substanz des Kleinhirns, in der periventrikulären weißen Substanz, sowie in der weißen Substanz des Großhirns und im Rückenmark beschrieben (BAUMGÄRTNER et al. 1989;

BATHEN-NOETHEN et al. 2008). Diese Läsionen können je nach zeitlichem Auftreten in akut, chronisch und rezidivierend eingeteilt werden (MCCULLOUGH et al. 1974a; SUMMERS et al. 1979; HIGGINS et al. 1982). Läsionen, die im ZNS durch eine akute Staupevirusinfektion entstehen, sind auf eine direkte Aktivität des CDV im ZNS zurückzuführen und treten vermehrt bei jungen immunsupprimierten Tieren auf (SUMMERS et al. 1995).

Die chronische Form der CDV-Infektion führt zu einer Viruspersistenz in der weißen Substanz ohne demyelinisierenden Charakter (VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 1995). Bei einer Viruspersistenz im ZNS und in den Zellen des lymphatischen Gewebes kann es zu einem späteren Zeitpunkt unter bestimmten Bedingungen zu einem Wiederaufflammen der Erkrankung und somit zu Rezidiven kommen (KRAKOWKA et al. 1975; MULLER et al. 1995; ZURBRIGGEN et al. 1995a;

ZURBRIGGEN et al. 1995b).

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Das CDV weist generell einen Tropismus für lymphatisches Gewebe auf (APPEL et al. 1982; CERRUTI-SOLA et al. 1983). Im ZNS wurde das CDV in Mikroglia, Oligodendrozyten, Astrozyten, Neuronen, Aldynoglia und Zellen des Plexus choroideus nachgewiesen (ORLANDO et al. 2008). Die Infektion der Oligodendrozyten durch das CDV ist noch nicht ausreichend geklärt. Einige Oligodendrozyten Vorläuferzellen sind besonders empfindlich gegenüber bestimmten Staupevirusstämmen (PEARCE-KELLING et al. 1991), wobei in ausgereiften Oligodendrozyten eine CDV-Infektion nur zu einer nicht-zytolytischen Infektion führt, da es in diesen immaturen Zellen nur zu einer viralen Transkription, nicht aber zu einer viralen Translation kommt (HIGGINS et al. 1982; SUMMERS u. APPEL 1987;

BLAKEMORE et al. 1989; ZURBRIGGEN et al. 1998). Astrozyten werden zu einem großen Anteil infiziert, dort findet die hauptsächliche Virusvermehrung im ZNS statt (MUTINELLI et al. 1989). Außerdem wird postuliert, dass das Astrozytennetzwerk vom CDV genutzt wird, um sich entlang der Zellfortsätze effektiver auszubreiten und somit größere Distanzen im ZNS zu überwinden. Durch diesen Mechanismus kann es der Immunantwort des Wirts leichter entkommen und zur Entstehung der Viruspersistenz beitragen (ZURBRIGGEN et al. 1995a; ZURBRIGGEN et al. 1995b;

WYSS-FLUEHMANN et al. 2010).

In der akuten Phase der Infektion wird ein Anschwellen der Astrozyten und des Myelins beobachtet, gefolgt von der Phagozytose des Myelins und Vakuolisierung der weißen Substanz (VANDEVELDE et al. 1985; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005).

Zur Entstehung der Demyelinisierung im akuten Stadium der CDV-Infektion gibt es mehrere Hypothesen. Die erste Hypothese postuliert, dass durch die Infektion der Oligodendrozyten eine primäre Demyelinisierung entsteht. Durch die Infektion des CDV wird der Zellmetabolismus der Oligodendrozyten verändert und es kommt durch einen direkten Zellschaden zur Zerstörung des Myelins (VANDEVELDE u.

ZURBRIGGEN 2005). Eine zweite Hypothese schreibt der Mikroglia eine zentrale Rolle zu. Durch das CDV wird die Mikrogliazelle aktiviert, und die daraus resultierende Interleukin-8-Sekretion steuert das Einwandern von CD8⁺-Lymphozyten (TIPOLD et al. 1999). Die Aktivierung resultiert zudem bei der Mikroglia in einer Aufregulation der MHC II- und CD44-Expression und einer erhöhten Phagozytoseaktivität. Außerdem werden zytotoxische Stoffe, wie freie

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Radikale (ROS) und andere proteolytische Enzyme gebildet. Dieses Reaktionsprofil aktivierter Mikroglia kann zu einer Schädigung benachbarter Zellen führen. Vor allem Oligodendrozyten zeigen eine selektive Vulnerabilität für ROS (GRIOT et al. 1990), wodurch das Myelin geschädigt wird, degeneriert und eine sekundäre Demyelinisierung stattfindet (STEIN et al. 2004b; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005).

Die Prädilektionsstellen für eine Demyelinisierung sind entlang der weißen Substanz der Sehbahn, im Zerebellum, im Rückenmark und im periventrikulären Gewebe der weißen Substanz, vor allem aber an dem Ependym des vierten Ventrikels zu finden (HIGGINS et al. 1982). Weniger häufig sind Läsionen in der grauen Substanz zu finden, wo es durch die Infektion von Neuronen und deren Nekrose zu einer Polioenzephalomalazie kommen kann. (HIGGINS et al. 1982; VANDEVELDE u.

ZURBRIGGEN 1995). Entzündliche Veränderungen des Parenchyms bei der akuten Staupevirusinfektion sind kaum vorhanden, da perivaskuläres cuffing nicht zu beobachten ist (VANDEVELDE et al. 1985).

2.1.6 Staupevirusstämme

Es wurden bereits verschiedene virulente Staupevirusstämme isoliert, beispielsweise der Snyder Hill, der Cornell A75-17 und der Ohio R252 Virusstamm (GILLESPIE u.

RICKARD 1956; MCCULLOUGH et al. 1974a; MCCULLOUGH et al. 1974c). Die Virusstämme unterscheiden sich in ihrer Ausprägung der klinischen Symptome bei den infizierten Hunden. Beispielsweise führt eine Infektion mit dem R252 Virusstamm (R252) klinisch zu einer Vielzahl an neurologischen Symptomen, bei dem Snyder Hill Virusstamm werden im Gegensatz hauptsächlich Krampfanfälle beobachtet (SUMMERS et al. 1984). Klassischerweise verläuft eine R252 Infektion subakut und weist histologisch eine Demyelinisierung in der weißen Substanz auf, vor allem auf der Höhe des vierten Ventrikels (SUMMERS et al. 1984). Zudem korreliert bei der R252-Infektion das Alter des Tieres mit der Mortalität, denn je jünger die Tiere zum Zeitpunkt der Infektion sind, desto höher ist die Mortalitätsrate (KRAKOWKA u.

KOESTNER 1976).

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Der apathogene Virusstamm Onderstepoort (OND) wird als Impfstamm genutzt und führt bei infizierten Tieren nicht zur Entstehung von neurologischen Symptomen (STETTLER et al. 1997). Ursprünglich wurde dieser Virusstamm von Green and Carlson, (1945) als Wildtyp isoliert. Nach mehrfacher Passage in Frettchen wurde das Virus an Hühnereier adaptiert. Es hat die Fähigkeit eine Vielzahl von Zelllinien zu infizieren und führt in der Zellkultur zu einer Zytolyse und Virusvermehrung durch budding (STETTLER et al. 1997).

2.2 Mikroglia - die Makrophagen des ZNS

Mikrogliazellen wurden erstmals von Rio-Hortega entdeckt und als eigenständige Zellen im ZNS charakterisiert (RIO-HORTEGA 1939). Es sind verschiedene Formen der Mikrogliazellen beschrieben, denn je nach Aktivierungsgrad ändert sich nicht nur ihr morphologisches, sondern auch ihr funktionelles Bild. Die ruhende Mikroglia ist klein und oval mit unterschiedlich langen Zellausläufern und zytoplasmatischen Einschlusskörperchen (MORI u. LEBLOND 1969). Sie wird im Gehirn gesunder adulter Tiere gefunden (PERRY u. GORDON 1988). Amöboide Mikroglia sind histologisch gekennzeichnet durch eine irreguläre Morphologie mit Pseudopodien und dünnen Filopodien-ähnlichen Zellausläufern (LING 1976a, b) und sind im Gegensatz zu den ruhenden Mikroglia in fetalem und postnatalem Gehirn zu finden (GIULIAN 1987). Die reaktive Mikroglia enthält histochemische und ultrastrukturelle Eigenschaften der amöboiden und der ruhenden Mikroglia. Sie ist klein, rund bis stabförmig, ohne Zellausläufer und wird vermehrt in verletzen Gehirnregionen gefunden (MATTHEWS u. KRUGER 1973a, b). Dieser Zelltyp kann durch seine Migrationseigenschaft in verletzte Regionen des ZNS einwandern und dort proliferieren (GRAEBER et al. 1988; GONZALEZ-SCARANO u. BALTUCH 1999).

Die amöboide und die reaktive Mikroglia besitzen die Fähigkeit der Phagozytose und ROS-Produktion, wobei diese Eigenschaften bei der reaktiven Mikroglia deutlich ausgeprägter sind als bei der amöboiden Mikrogliazelle (TORVIK 1975; LING 1977;

BRIERLEY u. BROWN 1982) Bei der akuten Staupevirusinfektion spielen die Mikrogliazellen bei der Entstehung demyelinisierender Läsionen im ZNS eine entscheidende Rolle. Im Gehirn führt die CDV Infektion zu einer Aktivierung der Mikrogliazelle, worauf hin diese ihr Reaktionsprofil verändert und durch eine erhöhte

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ROS Produktion die umliegenden Oligodendrozyten schädigen kann, so dass eine Demyelinisierung sekundär hervorgerufen wird (STEIN et al. 2004b). Zudem werden Monozyten aus dem peripheren Blut rekrutiert, um nach ihrer Einwanderung im ZNS die dort ansässigen Mikroglia bei ihrer Immunantwort zu unterstützen (WISNIEWSKI et al. 1972; GRIOT-WENK et al. 1991b, a). Nach Einwanderung ist eine Differenzierung zwischen Mikrogliazellen und eingewanderten Monozyten/Makro- phagen nur sehr schwer möglich, da ihre Oberflächenmarker identisch sind (DIJKSTRA et al. 1985).

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Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Labor-Equipment Geräte

autoMACS^pro Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Durchflusszytometer FACSCalibur mit

Apple Macintosh-Computer

Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland

Eismaschine, “Scotsman”, AF 10 AS Tepa Service- und Vertriebs GmbH, Barsbüttel, Deutschland

Elektrische Säge, Oscillow GL 2000/83 Nr. 67790

PRO-MED Instrumente GmbH, Tuttlingen, Deutschland

Gefrierschrank (-20 °C), Premium NoFrost

Liebherr-International Deutschland GmbH, Biberach

an der Riss, Deutschland Gefrierschrank, ultra low

vip series - 86 °C, MDF-U50V

SANYO Sales & Marketing Europe GmbH, München, Deutschland GenPure Reinstwasser-

Aufbereitungssystem

TKA, Thermo Electron LED GmbH, Niederelbert, Deutschland

Kühlschrank, „profi-line“ Liebherr-International Deutschland GmbH, Biberach,

an der Riss, Deutschland

Kühlschrank, K3120, “Comfort” Liebherr-International Deutschland GmbH, Biberach

an der Riss, Deutschland

Laborwaage Omnilab, OL 1500-P OMNILAB–LABORZENTRUM GmbH &

Co. KG, Bremen, Deutschland Laborwaage, LabStyle 204 Mettler-Toledo GmbH,

Gießen, Deutschland

Lichtmikroskop, Wilovert S Helmut Hund GmbH, Wetzlar, Deutschland

(23)

23 Magnetrührer mit Heizplatte,

Typ MR 3001

Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland

pH Meter, pH300 Hanna Instruments Deutschland

GmbH, Kehl am Rhein, Deutschland Pipetten, einstellbar (0,1 – 1000 µl) Brand GmbH & Co. KG,

Wertheim, Deutschland

Pipettierhelfer, accu-jet Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland

Pipettierhelfer, Handystep Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland

Reagenzglasschüttler, “REAX control” Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland

Stanzer groß (Art.-Nr. 54742)

M.C. Mieth Manufacturing, Inc., Port Orange, USA

Stanzer klein, Harris Uni-Core-5.00 Ted Pellar Inc., Redding, USA Wasserbad mit Einhängethermostat Julabo Labortechnik GmbH,

Seelbach, Deutschland

Material für das sterile Arbeiten

Bunsenbrenner, gasprofi WLD-TEC GmbH, Göttingen, Deutschland

CO2-Brutschrank, MCO-18AIC (UV) SANYO Sales & Marketing Europe GmbH, München, Deutschland Mikrobiologische Sicherheitsbank,

Herasafe KS

Thermo Fischer Scientific GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Pinzette BD660 Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland UV-Lampe (Art.-Nr. NU-959-400E) INTEGRA Bioscience GmbH,

Fernwald, Deutschland

(24)

24 Perfusionsmaterial

Arterienklemme (Art.-Nr. BH804R) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland DocCheck Advance II Stethoskop

(Art.-Nr. 100.100.1)

DocCheck Medizinbedarf und Logistik GmbH, Weil im Schönbuch,

Deutschland Handschuhe Novaglove-Latex

(Art.-Nr. 905452, Ch.-B. 118668)

Noba Verbandsmittel Danz GmbH &

Co. KG, Wetter, Deutschland Infusionsbesteck,

Typ: IV-Standard-Luer Lock

(Art.-Nr. 4062955, Ch.-B. 1G12218SIB)

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Kanülen, BD Microlance 3, 18G (Art.-Nr. 304662, Ch.-B. 0802 05)

Knochensplitterzange (Art.-Nr. F0626)

Aesculap AG,

Tuttlingen, Deutschland

Messer, TWIN Master Zwilling J.A. Henckels AG, Solingen, Deutschland

Peha-haft

(Art.-Nr. 9324370)

PAUL HARTMANN AG, Heidenheim, Deutschland

Pinzette, anatomisch (Art.-Nr. BD 27)

Aesculap AG,

Tuttlingen, Deutschland Pinzette, chirurgisch

(Art.-Nr. BD 557)

Aesculap AG,

Tuttlingen, Deutschland Präzisionspinzette, anatomisch

(Art.-Nr. AE 160-12)

Geomed Medizin-Technik GmbH & Co.

KG, Tuttlingen, Deutschland Präzisionspinzette, chirurgisch

(Art.-Nr. BD 512)

Aesculap AG,

Tuttlingen, Deutschland Schere, klein

(Art.-Nr. BC 111)

Aesculap AG,

Tuttlingen, Deutschland Skalpellklingen, Größe 10

(Art.-Nr. 5518059, Ch.-B. E3250486)

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Skalpellklingenhalter

(Art.-Nr. BB73)

Aesculap AG,

Tuttlingen, Deutschland Spritze, 2 ml

(Art.-Nr. SS+T02ES1, Ch.-B. 11 163/02)

Terumo Deutschland GmbH, Eschborn, Deutschland

(25)

25 Spritze, 5 ml

(Art.-Nr. SS+T05ES1, Ch.-B. 12 202/1507)

Spritze, 10 ml

(Art.-Nr. SS+T10ES1, Ch.-B. 11 264/1686)

Spritze, 20 ml

(Art.-Nr. 4606205V, Ch.-B. 1K04048)

Transversalsägeblatt (Art.-Nr. GC500R)

Aesculap AG,

Tuttlingen, Deutschland Venenverweilkatheter,

VasoVet, 103 ml / min

(Art.-Nr. 4269355, Ch.-B. 9D01258317)

Venenverweilkatheter, VasoVet, 36 ml/ min

(Art.-Nr. 4269102, Ch.-B. 1A 12258332)

Verbandsschere (Art.-Nr. BC 283R)

Aesculap AG,

Tuttlingen, Deutschland Verlängerungsschlauch

Typ Heidelberger 140 cm

(Art.-Nr. 4097300, Ch.-B. 2A23018401)

Labormaterial 6-Wellplatten

(Art.-Nr. 92406, Ch.-B. 20090122)

TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz

12-Wellplatten

(Art.-Nr. 92412, Ch.-B. 20110071)

48-Wellplatten (Art.-Nr. 677102)

Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Aclar Film, 203 x 318 cm

(Art.-Nr. 10501-10)

Ted Pellar Inc., Redding, USA

Becherglas, mehrere Größen OMNILAB–LABORZENTRUM GmbH &

Co. KG, Bremen, Deutschland Beschwerungsring,

Innendurchmesser 48 mm (Art.-Nr. 214-1942)

VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland

(26)

26 Beschwerungsring,

Innendurchmesser 57 mm (Art.-Nr. 214-1944)

VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Brühsieb Gourmet, Durchmesser 8 cm

(Art.-Nr. 0645079990)

Württembergische Metallfabrik AG (WMF), Geislingen/Steige, Deutschland EDTA-Röhrchen, 4,5 ml

(Art.-Nr. 32.332)

SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

Erlenmeyerkolben, mehrere Größen OMNILAB–LABORZENTRUM GmbH &

Co. KG, Bremen, Deutschland Filteraufsatz 500 ml, „rapid“ – Filtermax

(Art.-Nr. 99505, Ch.-B. 20110036)

Flasche 500 ml, „rapid“ – Filtermax (Art.-Nr. 94507, Ch.-B. 20010259)

Glasflaschen, Plastibrand, verschiedene Größen

OMNILAB–LABORZENTRUM GmbH &

Co. KG, Bremen, Deutschland Labortücher

Kimtech Science, 21 x 20 cm, 2-lagig (Art.-Nr. 115-2235, Ch.-B. 007998)

VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland

Locher, Leitz 5008 Esselte Leitz GmbH & Co KG, Stuttgart, Deutschland

Parafilm M, 4 IN. X 250 FT. Roll (Art.-Nr. 291-1213)

VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Pasteur Pipetten, 150 mm

(Art.-Nr. 747715)

Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland

Petrischale ohne Nocken (Art.-Nr. 450 2000)

Pipettenspitzen, 0,1 – 20 µl (Art.-Nr. 7023 12)

Pipettenspitzen, 2 – 200 µl (Art.-Nr. 7023 15)

Pipettenspitzen, 50 – 1000 µl (Art.-Nr. 7023 20)

Plättchen Stanzer, 11 mm (Art.-Nr. 54742)

Ted Pellar Inc., Redding, USA

(27)

27 Präzisions-Dispenser-Tip,

Plastibrand, 2,5 ml

(Art.-Nr. 702379, Ch.-B. 409856)

Präzisions-Dispenser-Tip, Plastibrand, 5 ml

(Art.-Nr. 702376, Ch.-B. 410255)

Präzisions-Dispenser-Tip, Plastibrand, 25 ml

(Art.-Nr. 702380, Ch.-B. 315399)

Reaktionsgefäß mit Deckel, Eppendorf Safe-Lock Gefäß, 0,5 ml

(Art.-Nr. 0030 121.023, Ch.-B. A143175/1321)

Eppendorf AG,

Hamburg, Deutschland

Reaktionsgefäß mit Deckel, Eppendorf Safe-Lock Gefäß, 2 ml

(Art.-Nr. 0030 120.094)

Eppendorf AG,

Hamburg, Deutschland Röhrchen für das Durchflusszytometer,

5 ml (Art.-Nr. 55.1579)

SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Röhrchen, steril, 15 ml

(Art.-Nr. 62.554.502, Ch.-B. 0042801)

SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Röhrchen, steril, 50 ml, Cellstar-Tubes

(Art.-Nr. 227 261, Ch.-B. E10110AS)

Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Serologische Glasauslaufpipetten,

5 ml (Art.-Nr. 27112)

Serologische Glasauslaufpipetten, 10 ml (Art.-Nr. 27113)

Serologische Glasauslaufpipetten, 25 ml (Art.-Nr. 27115)

Serologische Pipette, steril, 1 ml (Art.-Nr. 86.1251.001, Ch.-B. 6027E)

SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Serologische Pipette, steril, 5 ml

(Art.-Nr. 86.1253.001, Ch.-B. 1272E)

(Art.-Nr. 86.1254.001, Ch.-B. 1287E)

(Art.-Nr. 86.1685.001, Ch.-B. 1292K)

SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

(28)

28 Serologische Pipette,

steril, 50 ml, Cellstar

(Art.-Nr. 768180, Ch.-B. 11050801)

Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Sterile Spritzenfilter, 0,2 µm

Zelluloseazetat

(Art. Nr. 514-0061, Ch.-B. 1145753)

VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Vakuum Filtrationsprinzip 150 ml

(Art.-Nr. 99150, Ch.-B. 20090194)

Vernichtungsbeutel (Art.-Nr. 86.1197)

SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Wheaton Potter-Elvehjem Gewebe-

Handhomogenisator mit PVC-Überzug, 10 ml

(Art.-Nr. 9-0914)

neoLab Migge Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg, Deutschland

Zählkammer nach Türk (Art.-Nr. 719505)

Zellkulturflasche, CELLSTAR (Art.-Nr. 690 160, Ch.-B. E10070FA)

Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland

Zentrifugen

Zentrifuge „Allegra6KR“ Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland

Zentrifuge „Rotina 35R“ Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland

(29)

29 3.1.2 Reagenzien und Lösungen

Reagenzien

Brenztraubensäure (Art.-Nr. 107360)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Bovines Serum Albumin

(Art.-Nr. A4503, Ch.-B. 041M1801V)

Dulbecco´s modifiziertes Eagle Medium (DMEM) Pulver (Art.-Nr. 12800-017)

Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany

Ethanol

(Art.-Nr. 1.00986.100, Ch.-B. K28967886-111)

Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Fetales Kälberserum (FKS)

eine Stunde bei 56 °C inaktiviert (Art. Nr. 10270-106, Ch.-B. 40F5173)

Gibco, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland

Gentamycin

(Art.-Nr. G1522-10ML)

Glukose

(Art.-Nr. G7021)

Ham´s F12 Nutrient-Mix (Art.-Nr. N6760)

Hände-Desinfektionsmittel, Sterillium (Art.-Nr. 976600, Ch.-B. 325087)

BODE CHEMIE GmbH, Hamburg, Deutschland

Hanks´- gepufferte Salzlösung (HBSS) Lösung

(Art.-Nr. H4385, Ch.-B. 051M6004)

Heparin-Natrium-25000-ratiopharm (Art.-Nr. 3029843, Ch.-B. L16825)

Ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland

HEPES

(= N- [2-hydroxyethyl] piperazin-N-2- ethansulfonazid

(Art.-Nr. H-3375, Ch.-B. 110K5419)

Histopaque 1,119 (Art.-Nr. 11191-100ML, Ch.-B. 126K6002)

Insulin

(Art.-Nr. I4011-50MG)

(30)

30 Kaliumchlorid (KCl)

(Art.-Nr. 1.04936.0500, Ch.-B. K31517236 309)

Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)

(Art. Nr. 1.04873.0250, Ch.-B. A397373 251)

Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

L-Glutamin

(Art.-Nr. G8540-10MG)

Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (m-csf), (Art.-Nr. 216-MC)

R&D Systems Inc., Minneapolis, USA

Microglia Medium (MM-prf) (Art.-Nr. 1901-prf, Ch.-B. 8727)

ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, USA

Narcodorm (182,3 mg/ml Pentobarbital) (Art.-Nr. E1705, Ch.-B. 11B15-5)

CP-Pharma Handelsgesellschaft GmbH, Burgdorf, Deutschland Natriumazid (NaN3),

Molekulargewicht: 65.01 g/mol (Art.-Nr. 71289, Ch.-B.

351939/1012397)

Fluka Chemika übernommen von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Natriumbicarbonat (NaHCO3)

(Art.-Nr. 55761, Ch.-B. 050M0129V)

Natriumcarbonat (Na2CO3)

(Art.-Nr. 1.06392.0500, Ch.-B. A185092 937)

Natriumchlorid (NaCl) (Art.-Nr. 1.06404.1000, Ch.-B. K42150704 116)

Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) (Art.-Nr. 1.06586.0500, Ch.-B.

F1169586 306)

Natriumhydroxid (NaOH) 1 N (Art.-Nr. 1.09137.1000, Ch.-B. HC616601)

Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Pancoll, 1,077 g/ml

(Art.-Nr. P04-60500,

Ch.-B. 6161011 und 8851112)

PAN BIOTECH GmbH, Aidenbach, Deutschland

Paraformaldehyd (Art.-Nr. 76240 )

(31)

31 Penicillin (G-)Streptomycin (10.000 U/ml + 10 mg/ml), CellCulture

(Art.-Nr. P0781)

Percoll, steril

(Art.-Nr. 17-0891-01, Ch.-B. 10041457)

GE Healthcare GmbH, Solingen, Deutschland

Phenolrot

(Art.-Nr. BP3532, Ch.-B. 054K3721)

Progesteron

(Art.-Nr. P8783-1G)

Putreszin

(Art.-Nr. P5780-5G)

Salzsäure (HCl) 1 N (Art.-Nr. 1.09057.1000, Ch.-B. HC622391)

Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Saponin

(Art.-Nr. A18820, Ch.-B. 10130141)

Alfa Aecar GmbH und Co., Karlsruhe, Deutschland

Selen

(Art.-Nr. S5261-10G)

Sterofundin Infusionslösung

(Art.-Nr. 8646960, Ch.-B. 120118151)

Transferrin (Art.-Nr. T8158)

Trypanblau

(Art.-Nr. T-6146, Ch.-B. 25H50266)

(32)

32 Lösungen

Dissoziationspuffer:

NaCl KCl MgCl2

CaCl2

89,4 g/l 37,3 g/l 40,0 g/l 25,3 g/l Hanks´- gepufferte Salzlösung:

NaCl KCl Glucose KH2PO4

Na2PO4

Phenolrot Aqua bidest.

+ Zusatz von:

FKS

Na2CO3, 7,5%

um den pH-Wert auf 7,3-7,4 einzustellen

8,0 g 0,4 g 1,0 g 60,0 mg 47,5 mg 17,0 mg ad 1000 ml 20,0 ml 4,7 ml

Kollagenase-DNAse-Puffer:

(pro 8 g Gehirnmaterial)

DNAse Aqua bidest.

Kollagenase

Dissoziationspuffer

(Kollagenase, SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland;

DNAse, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) 4.000 Units

8,00 ml 45,6 mg 0,8 ml

(33)

33 Lösung zum Lysieren von

Erythrozyten:

doppelt konzentrierte Phosphat- gepufferte Salzlösung (2 x PBS)

Aqua bidest. ad 1000 ml

MACS-Puffer:

EDTA-PBS FKS

PBS

40 ml 0,5 ml ad 100 ml Membran-Immunfluoreszenz (MIF)

-Puffer:

PBS mit 1% BSA und 0,01% NaN3

BSA

NaN3, 10%

PBS

1,00 g 0,01 g ad 100 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung

(PBS): (pH 7,4)

NaCl KCl Na2HPO4

KH2PO4

Aqua bidest.

8,00 g 0,20 g 1,15 g 0,20 g ad 1000 ml

(34)

34 Sato-Medium:

(für 1 Liter Medium) Ham´s F12 Nutrient-Mix Hepes

DMEM Pulver Brenztraubensäure NaHCO3

Transferrin Insulin (5 mg/ml) Aqua tridest.

Glukose L-Glutamin

Penicillin-Streptomycin Putreszin

Progesteron Selen

vor Gebrauch:

Phenolrot Gentamycin + Zusatz von:

FKS

Na2CO3, 7,5%

um den pH-Wert auf 7,3-7,4 einzustellen

5,32 g 2,38 g 6,68 g 0,055 g 2,438 g 0,005 g 1 ml 1000 ml 6 g 0,0292 g 1,25 ml 0,1 ml 0,02 ml 0,01 ml 3,18 ml 1,2 ml 20,0 ml 4,7 ml

Sterofundin Infusionslösung:

NaCl KCl

CaCL2 x 2 H2O MgCl2 x 6 H2O

Natriumlactat – Lösung Aqua ad inj.

5,55 g 0,30 g 0,37 g 0,20 g

10,09 g (≈ 5,05 g Natriumlactat) 1000 ml

(35)

35 Reagenzien zur Isolierung von Mikroglia

CD11b (Mikroglia) MicroBeads Maus / Mensch

(Art.-Nr. 130-093-634, Ch.-B. 5111005005)

Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland

Histopaque 1,119 (Art.-Nr. 11191-100ML, Ch.-B. 126K6002)

MACS-Puffer (Kap. 3.1.2.)

Percoll, steril

(Art.-Nr. 17-0891-01, Ch.-B. 10041457)

GE Healthcare GmbH, Solingen, Deutschland

Enzyme

Collagenase von Clostridium histolyticum,

EC 3.4.24.3, lyophilisiert

(Art.-Nr. 1.102PZU/mg, Ch.-B. 100675)

SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland

Desoxyribonuclease I (DNAse I, EC 3.1.21.1), Typ IV: aus Rinderpankreas (Art.-Nr. D5025, Ch.-B. 31K7659)

Reagenzien für die indirekte Membran-Immunfluoreszenz

MIF-Puffer (Kap. 3.1.2.)

Primärantikörper (monoklonal) Humanes Normal-Immunglobulin G (HuIgG)

(Ch.-B. 015 177.01)

verwendete Verdünnung 1:16

Serum- und Impfinstitut Bern (Berna), Bern, Schweiz

Maus-anti-Hund CD18 verwendete Verdünnung 1:5

Prof. Peter F. Moore,

University of California, Davis, CA, USA Maus-anti-Hund CD11b

(Art.-Nr. MCA1777F,Ch.-B. 280709) verwendete Verdünnung 1:5

Serotec, MorphoSys AbD GmbH, Düsseldorf, Deutschland

(36)

36 Ratte-anti-Hund CD45

konjugiert mit Biotin

(Art.-Nr. MCA1042B, Ch.-B. 0903) verwendete Verdünnung 1:10

R-Phycoerythrin-konjugiertes CD14 Clone TüK4

(Art.-Nr. R0864, Ch.-B. 108) verwendete Verdünnung 1:8

BIOZOL Diagnostica Vertrieb GmbH, Eching, Deutschland

Sekundärantikörper

Aufgereinigtes R-Phycoerythrin- konjugiertes F(ab´)2-fragment Ziege-anti-Maus (gαm-PE) IgG (Art.-Nr. 115-116-072, Ch.-B. 96050) verwendete Verdünnung 1:100

Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe Ltd., Newmarket, England

Streptavidin-konjugiertes Fluoreszin- Isothiocyanat (Isomer 1; FITC);

STAR2B

(Art.-Nr. 710002, Ch.-B. 0906) verwendete Verdünnung 1:100

Isotypkontrolle Maus IgG1

(Art.-Nr. MCA928, Ch.-B. 0310) verwendete Verdünnung 1:5

Ratte IgG2b konjugiert mit Biotin (Art.-Nr. MCA 1125B, Ch.-B. 1107) verwendete Verdünnung 1:10

Maus IgG2a

konjugiert mit R-Phycoerythrin, Clone PPV-04

(Art.-Nr. 21275524, Ch.-B. 273104) verwendete Verdünnung 1:15

Immunotools,

Friesoythe, Deutschland

(37)

37

Reagenzien für die intrazelluläre Staupevirus-Antigen-Färbung Saponin

(Art.-Nr. A18820)

Alfa Aeser, GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Paraformaldehyd (Art.-Nr. 76240 )

Primärantikörper (monoklonal) Humanes Normal-Immunglobulin G (HuIgG)

(Art.-Nr. 009-000-002Ch.-B. 98054) verwendete Verdünnung 1:16

Johnson ImmunoResearch Laboratories Europe Ltd., Suffolk, England

D110

Ein aus der Maus und über den Zellkulturüberstand gewonnener Antikörper, der an ein Epitop des CDV-Nukleokapsid-Proteins bindet.

Er ist gegen Fixation und Einbettung unempfindlich.

Verwendete Verdünnung 1:16 (BOLLO et al. 1986)

Sekundärantikörper

Aufgereinigtes R-Phycoerythrin- konjugiertes F(ab´)2-fragment Ziege-anti-Maus (gαm-PE) IgG (Art.-Nr. 115-116-072, Ch.-B. 96050) verwendete Verdünnung: 1:50

Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe Ltd., Newmarket, England

Material für den Test der ROS-Bildung der Monozyten Phorbol Myristat Acetat (PMA)

(Art.-Nr. P9268)

(zuerst in Dimethylsulfoxid auf eine Konzentration von 1 mmol einstellen und dann weiter in PBS verdünnen auf eine finale Konzentration von 100 nmol)

Dihydrorhodamin 123 (DHR) (Art.-Nr.D1054)

(1,5 mg/ml verdünnt in Dimethylsulfoxid und dann weiter verdünnt in PBS auf eine finale Konzentration von 15 µg/ml)

(38)

38 Material für die Durchflusszytometrie

Nukleinsäurefarbstoff: TO-PRO-3 1 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (Art.-Nr. 642/661)

Molecular probes, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland Reinigungs- und Desinfektionslösung:

FACSClean (Art.-Nr. 340345, Ch.-B.

1109001013)

Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Spüllösung: FACSRinse

(Art.-Nr. 340346, Ch.-B. 0924300006)

Trägerlösung: FACSFlow

(Art.-Nr. 342003, Ch.-B. 1125700032)

Waschlösung: CellWash

(Art.-Nr. 349524, Ch.-B. 1002900030)

Material für das autoMACS^pro MACS BSA Stock Solution (Art.-Nr. 130-091-376)

Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland MACS Chill Racks

(Art.-Nr. 130-092-952)

Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Magnetsäulen: autoMACS Columns

(Art.-Nr. 130-021-101)

Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Reinigungs- und Desinfektionslösung:

autoMACS Washing Solution (Art.-Nr. 130-092-987)

Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Separationspuffer: autoMACS Running

Buffer (Art.-Nr. 130-091-221)

Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Spüllösung: autoMACS Rinsing Solution

(Art.-Nr. 130-091-222)

Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland

3.1.3 Computer Software

Cell-Quest Pro Version 6.0 -Software (für Apple Macintosh Computer)

(39)

39 3.1.4 Virus

Staupevirus R252,

Passage 11, vom 26.01.2011, Virustiter: TCID 50 x 10^4,5 ad 100 µl

Dr. S. Krakowka Staupevirus Onderstepoort,

Passage XI, vom 01.03.2011, Virustiter: TCID 50 x 10^4,5 ad 10 µl

Dr. von Messling

Der virulente Staupevirusstamm R252 wurde freundlicherweise von Dr. S. Krakowka und der avirulente Staupevirusstamm Onderstepoort wurde freundlicherweise von Dr. von Messling zur Verfügung gestellt. Das Virus wurde auf Verozellen gezüchtet und unter pathogen-freien Bedingungen gewonnen. Die Lagerung fand bei -80 °C statt.

3.1.5 Tiere

Die Hunde, deren Gehirnmaterial für die Isolation und Charakterisierung der Mikroglia verwendet wurden, stammten aus dem Patientengut der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (siehe Tab. 1). Die Besitzer entschieden sich für eine Euthanasie ihrer Hunde, da diese an unterschiedlichen Erkrankungen mit infauster Prognose erkrankt waren.

Tabelle 1: Darstellung der für die Charakterisierung der Mikroglia rekrutierten Hunde

Hund Rasse Gewicht des verwendeten

Gehirnmaterials

1 Dackel-Mischling 26,1 g

2 Havaneser 29 g

3 Mischling 61,6 g

4 Beagle 60,4 g

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Für die Charakterisierung kaniner Monozyten wurden zehn gesunde adulte Hunde der Rasse Beagle in einem Alter von ein bis sechs Jahren zur Beprobung herangezogen. Fünf von ihnen gehörten zu den Blutspendehunden der Klinik für Kleintiere, die anderen fünf Hunde wurden vom Institut für Pharmakologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. Die Allgemeinuntersuchung sowie das Blutbild der für die Studie verwendeten Hunde waren unauffällig. Die Genehmigung der Studie wurde von der Landesregierung erteilt (Regierungspräsidium Hannover, Deutschland, Bewilligungsnummer 33.9-42502-05-12A275) und die Probengewinnung und Untersuchung der zehn Hunde wurde entsprechend der Maßgabe des Deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt.

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41 3.2 Methoden

3.2.1 Methodik zur Kultivierung kaniner Mikroglia Isolation kaniner Mikroglia

Die angewandte Isolationsmethode kaniner Mikroglia beruht auf einer von Stein (STEIN 2001; STEIN et al. 2004a) für den Hund modifizierten Methode nach Sedgwick et al. (1991).

Den Hunden wurde ein peripherer Venenverweilkatheter gelegt, über den zuerst Heparin (150 IE/kg KGW) und dann Pentobarbital (60 mg/kg KGW) intravenös injiziert wurde. Daraufhin trat der sofortige Tod der Hunde ein, welcher mittels Auskultation des Herzens bestätigt wurde. Unmittelbar nach dem Tod wurde eine Thorakotomie durchgeführt, um die Perfusion über den linken Herzventrikel zu beginnen. Das Abklemmen der Vena cava caudalis unterbrach den Blutfluß zu den abdominalen Organen und das Eröffnen des linken Herzohrs ermöglichte das Abfließen des Blutes und später auch der Perfusionslösung. Der Hund wurde für 30 bis 45 Minuten mit 1 l kalter Sterofundin Infusionslösung perfundiert. Nachdem die Perfusion abgeschlossen war, wurde mittels Kraniotomie das Gehirn entnommen und in eiskalte sterile Hanks´gepufferte Salzlösung (HBBS-Lösung) mit fetalem Kälberserum (FKS) überführt.

Die folgenden Schritte wurden unter einer mikrobiologischen Sicherheitsbank durchgeführt, um Kontaminationen zu vermeiden. Die Meningen wurden anschließend vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und das restliche Gehirnmaterial gewogen. Zur Dissoziation wurde das Gehirnmaterial zunächst mit einer Skalpellklinge zerkleinert und danach durch ein Sieb gerieben und mit HBBS-Lösung verdünnt. Der Gewebebrei wurde daraufhin mit Hilfe eines Gewebehomogenisator weiter zerkleinert und weiter aufgeschlossen um dann in ein 50 ml Röhrchen überführt zu werden. Drei Waschschritte mit HBSS-Lösung mit anschließender Zentrifugation bei 170 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 4 °C folgten.

Der Gewebebrei wurde mit Kollagenase-DNAse-Puffer (1 ml pro 1 g Gehirnmaterial) versetzt und für 60 Minuten im Wasserbad bei einer Temperatur von 37 °C verdaut.

Danach wurde die gewonnene Zellsuspension zweimal mit HBSS-Lösung

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gewaschen und bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert.

Zur Anfertigung des Dichtevorgradienten wurde das Zellpellet in 45 ml Percoll der Dichte 1,030 g/ml resuspendiert und mit 5 ml Percoll der Dichte 1,124 g/ml unterschichtet, um dann anschließend bei 1250 x g bei einer Temperatur von 20 °C für 5 Minuten bei geringster Beschleunigungs- und Bremsstufe zentrifugiert zu werden. Nach der Zentrifugation befanden sich Myelin und Zelldebris auf der obersten Schicht des Gradienten und wurden verworfen, nur Zellen auf Percoll der Dichte 1,124 g/ml wurden gewonnen und in HBBS-Lösung resuspendiert.

Zellseparation mittels Dichtegradientenzentrifugation

Nach erneutem Waschen und Zentrifugieren bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C wurde das gewonnene Zellpellet mit 5 ml HBSS-Lösung resuspendiert und auf die Hauptgradienten verteilt. Pro 8 g ursprünglichem Gehirnmaterial wurde ein Hauptgradient gegossen. Der Hauptgradient bestand aus fünf übereinander geschichteten Dichten. Zuerst wurde 5 ml Percoll der Dichte 1,124 g/ml in ein 50 ml Röhrchen vorgelegt, darauf wurden 12 ml Percoll der Dichte 1,077 g/ml, gefolgt von weiteren 12 ml Percoll der Dichte 1,066 g/ml, 8 ml Percoll der Dichte 1,050 g/ml und 8 ml Percoll der Dichte 1,030 g/ml. Die erstellten Gradienten wurden bei 1250 x g für 25 Minuten bei einer Temperatur von 20 °C bei geringster Beschleunigungs- und Bremsstufe zentrifugiert.

Die Zellen auf den Percoll-Dichten 1,077 g/ml und 1,066 g/ml wurden geerntet und mit HBBS-Lösung resuspendiert, um erneut bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert zu werden. Anschließend wurden die Zellen mit Trypanblau angefärbt und in der Zählkammer nach Türk auf Anzahl und Vitalität untersucht. Die verbleibende Zellsuspension wurde erneut bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert.

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43 Separation mittels autoMACS^pro

Das Zellpellet wurde in 80 µl Magnetic-activated cell sorter (MACS) -Puffer pro 10⁷ Zellen resuspendiert und mit 20 µl CD11b MicroBeads pro 10⁷ Zellen für 15 Minuten bei 4-8 °C inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit MACS-Puffer und Zentrifugation bei 300 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C wurde das Zellpellet in 500 µl MACS-Puffer pro 10⁸ Zellen resuspendiert, bevor es in ein 15 ml Röhrchen überführt wurde, um mit dem autoMACS^pro zweimal separiert zu werden. Die positive Zellfraktion wurde dann mit Trypanblau angefärbt und erneut in der Zählkammer nach Türk auf Anzahl und Vitalität untersucht. Die restlichen Zellen der positiven Fraktion wurden bei 300 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert und das Zellpellet in Microglia Medium (MM-prf) überführt und zur weiteren Bebrütung in den Brutschrank mit einem Gehalt von 5 % Kohlenstoffdioxid (CO2) und einer Temperatur von 37 °C gelegt.

Lichtmikroskopische Zählung der Zellzahl

10 µl der isolierten Zellsuspension wurden mit 90 µl 0,4 % Trypanblau verdünnt, wovon 10 µl in die Zählkammer nach Türk überführt wurden. Lebende Zellen mit einer intakten Zellwand stellten sich farblos dar, tote Zellen erschienen blau, da der Farbstoff durch die zerstörte Zellwand in den Interzellularraum gelangen konnte. Die Zellzahl der lebenden Zellen wurde ermittelt, indem drei der mittelgroßen Quadrate mit einer Länge von 1 mm und einer Tiefe von 0,1 mm auszählt wurden, was einen Rauminhalt pro Quadrat von 0,1 mm³ widerspiegelte. Der Mittelwert der drei gewonnenen Zellzahlen wurde mit dem Faktor zehn multipliziert, um die Zellzahl der verdünnten Suspension pro 1 µl wiederzugeben. Um die Verdünnung mit zu berücksichtigen, wurde das Ergebnis erneut mit 10.000 multipliziert, um die Zellzahl pro 1 ml der unverdünnten Zellsuspension zu errechnen.

Herstellung der Dichten mit Percoll

Um Vor- und Hauptgradienten zu gießen, mussten vorher die benötigten Dichten hergestellt werden. Dazu wurde Percoll mit 1,5 M NaCl-Lösung in einem Verhältnis von 1:10 vermischt. Die Dichte dieser isotonen Lösung entsprach 1,124 g/ml. Zur Herstellung der weiteren unterschiedlichen benötigten Dichten (1,077 g/ml,

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1,066 g/ml, 1,050 g/ml und 1,030 g/ml) wurde HBSS-Lösung nach Herstelleranweisungen hinzugefügt.

Prinzip des autoMACS^pro

CD11b MicroBeads sind superparamagnetische Teilchen, die an CD11b-Antikörper gekoppelt sind. Bei Zugabe der CD11b MicroBeads zu der Zellsuspension bindet der CD11b-Antikörperteil der MicroBeads an die CD11b-Oberflächenmarker der Mikrogliazellen. Das autoMACS^pro separiert die Zellen anhand der CD11b-Expression. Dazu passiert die Zellsuspension mit den CD11b MicroBeads- gekoppelten und den nicht gekoppelten Zellen eine magnetisch aufgeladene Säule, an der die gekoppelten Zellen aufgrund der superparamagnetischen MicroBeads haften bleiben. Nachdem die negative Fraktion, also die nicht gekoppelten Zellen, die Säule passiert hat und in einem Röhrchen aufgefangen wurde, schaltet das autoMACS^pro die Magnetsäulen aus und die positive Fraktion wird in ein separates Röhrchen abgegeben. So wird innerhalb weniger Minuten eine weitere Aufreinigung der vorher mittels Dichtegradienten separierten Mikrogliapopulation erreicht.

Infektion kaniner Mikroglia mit Staupevirus

Die Zellmenge der kultivierten Mikroglia wurde gedrittelt und in jeweils eine Vertiefung einer separaten 12-Wellplatte gegeben. Die Virusstämme R252 und Onderstepoort wurden jeweils mit 0,1 multiplicity of Infection (MOI) eingesetzt. Es wurden separate Platten für die verschiedenen Virusstämme und die Negativkontrolle verwendet um Kontaminationen zu vermeiden. Zu den Zellen in der Vertiefung der ersten Wellplatte wurde der Virusstamm R252, in die Vertiefung der zweiten Wellplatte der Virusstamm Onderstepoort und in die Vertiefung der dritten Wellplatte wurde als Negativkontrolle HBBS-Lösung hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde im Brutschrank bei 37 °C und 5 % Kohlenstoffdioxidgehalt wurden die infizierten Zellen in 15 ml Röhrchen überführt und dreimal mit HBBS-Lösung gewaschen und jeweils für zehn Minuten bei 170 x g zentrifugiert. Danach wurden die Zellsuspensionen der drei Zellpopulationen (R252, Onderstepoort und Negativkontrolle) jeweils in vier Teile geteilt. Ein Teil wurde direkt weiter bearbeitet und die anderen drei Teile wurden in jeweils eine eigene

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Vertiefungen einer 6-Wellplatten überführt und kamen zur weiteren Bebrütung in den Brutschrank bei 37 °C und 5 % Kohlenstoffdioxidgehalt. Nach zwei, vier und sechs Stunden wurden jeweils die Zellen einer Vertiefung der 6-Wellplatten von jedem Versuchsansatz zur weiteren Bearbeitung entnommen.

Kultivierung kaniner Mikroglia

Die gewonnenen Mikroglia wurden in eine mit einem Kulturmedium gefüllte Zellkulturflasche überführt und in einen Brutschrank mit 37 °C und einem Kohlenstoffdioxidgehalt von 5 % verbracht. Einen, drei und acht Tage nach dem Beginn der Kultivierung wurde jeweils ein Mediumwechsel durchgeführt.

Indirekte Membran-Immunfluoreszenz

Durch den Nachweis der Expression der Oberflächenmoleküle CD11b, CD18 und CD45^low, welche in ihrer Kombination spezifisch für die kaninen Mikroglia sind (STEIN 2001), soll die Reinheit der isolierten Mikrogliazellpopulation ermittelt werden.

Nachdem die Zellsuspension auf eine Zellzahl von 2 x 10⁵Zellen pro 50 µl PBS eingestellt wurde, wurden mittels humanem Immunglobulin G (IgG) unspezifische Bindungen geblockt, um Hintergrundfluoreszenzen zu reduzieren. Danach wurden die Zellen gleichmäßig in fünf Röhrchen aufgeteilt und wie folgt beschriftet:

Nativkontrolle, Isotypkontrolle, Sekundärantikörperkontrolle, Teströhrchen CD11b und CD45^low sowie Teströhrchen CD18 und CD45^low. In das Isotypkontroll-Röhrchen wurden die Isotypkontrollen Ratte IgG2b konjugiert mit Biotin und Maus IgG1

pipettiert. In die Röhrchen der Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle wurde MIF-Puffer hinzugefügt und in die beiden Teströhrchen wurde ihrer Beschriftung entsprechend der Primärantikörpern Ratte-anti-Hund CD45 konjugiert mit Biotin, Maus-anti-Hund CD11b und Maus-anti-Hund CD18 pipettiert. Alle Röhrchen wurden für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Darauf folgten zwei Waschschritte mit MIF-Puffer mit anschließender Zentrifugation über sechs Minuten bei 200 x g. Anschließend erfolgte die Zugabe der Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus IgG konjugiert mit R-Phycoerythrin und Fluoreszin-Isothiocyanat konjugiert mit Streptavidin in alle