Aus dem Institut für Virologie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung des IBV-Spike-Proteins:
Bindungseigenschaften und Lokalisation in eukaryotischen Zellen
THESE
zur Erlangung des Grades eines PHILOSOPHICAL DOCTOR
Ph.D.
durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Christine Winter
aus Jork
Hannover 2005
Meinen Eltern
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Georg Herrler
1. Gutachter: Prof. Dr. Georg Herrler
2. Gutachter: Prof. Dr. Peter Valentin Weigand 3. Gutachter: Prof. Dr. Thomas F. Schulz Externer Gutachter: PD Dr. John Ziebuhr
Tag der mündlichen Prüfung: 10. November 2005
Diese Arbeit wurde im Rahmen des Graduiertenkollegs 745 durch die DFG gefördert.
1 Einleitung ... 1
1.1 Coronaviren...1
1.1.1 Taxonomie ... 1
1.1.2 Strukturproteine der Coronaviren... 3
1.1.3 Replikation ... 6
1.2 Das Virus der Infektiösen Bronchitis der Hühner ...7
1.2.1 Ätiologie ... 7
1.2.2 Epidemiologie und Klinik... 8
1.2.3 Bekämpfung ... 9
1.2.4 Das IBV-Spike-Protein... 11
1.3 Sialinsäuren als Rezeptordeterminanten für Viren ...13
2 Zielsetzung ... 17
3 Material ... 19
3.1 Zelllinien ...19
3.2 Virus...20
3.3 Bakterien ...21
3.4 Plasmide ...21
3.5 Zellkulturmedien ...22
3.6 Bakterienkulturmedien ...24
3.7 Puffer und Lösungen ...24
3.8 Synthetische Oligonukleotide...28
3.9 Restriktionsendonukleasen und andere Enzyme ...28
3.10 Antikörper...29
3.11 Lektine ...30
3.12 DNA ...31
3.13 Kits ...31
3.14 Substrate ...31
3.15 Transfektionsreagenzien...32
3.16 Chemikalien...32
4 Methoden... 35
4.1 Zellkulturtechnik ...35
4.1.1 Vero-Zellen ... 35
4.1.2 Vero E6-Zellen... 35
4.1.3 BHK-21-Zellen ... 35
4.1.4 BSR-T7/5-Zellen ... 35
4.1.5 LLC-PK1- Zellen ... 36
4.1.6 CHO-Zellen... 36
4.1.7 Herstellung primärer Hühnernierenzellkulturen... 36
4.1.8 Anlegen von Gefrierkulturen und Auftauen von Zellen ... 36
4.1.9 DAPI-Test ... 37
4.2 Virusanzucht ...37
4.2.1 IBV-Beaudette ... 37
4.2.2 IBV-M41... 38
4.2.3 Sendai-Virus ... 38
4.2.4 BRSV... 38
4.2.5 Influenza A... 39
4.3 Methoden zur Virustiterbestimmung...39
4.3.1 KID50-Bestimmung für IBV-Beaudette... 39
4.3.2 Plaquetest für IBV-Beaudette ... 40
4.3.3 Plaquetest für Sendai-Virus ... 41
4.3.4 Plaquetest für Influenza-A-Virus ... 42
4.3.5 Hämagglutionations-Test für IBV-M41... 42
4.4 Molekularbiologische Methoden ...43
4.4.1 Amplifikation von DNA mit Hilfe der PCR ... 43
4.4.2 Mutagenese ... 45
4.4.3 Reinigung von DNA-Fragmenten... 47
4.4.4 Bestimmung der DNA- bzw. RNA-Konzentration mittels UV-Absorption . 48 4.4.5 Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen... 48
4.4.6 Agarosegelelektrophorese ... 48
4.4.7 Extraktion von DNA aus Agarosegelen... 49
4.4.8 Dephosphorylierung linearisierter DNA... 50
4.4.9 Ligation von DNA... 50
4.4.10 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Bakterien... 50
4.4.11 Hitzeschocktransformation chemisch kompetenter E.coli XL-1 Blue ... 51
4.4.12 Kolonie-PCR ... 51
4.4.13 Präparation von Plasmid-DNA ... 52
4.4.14 Sequenzierung... 53
4.5 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen...53
4.6 Immunologische Protein-Nachweis-Methoden ...54
4.6.1 Immunfluoreszenztest... 54
4.6.2 Antikörper Uptake assay... 55
4.6.3 Kolokalisation des S-Proteins mit Markerproteinen ... 55
4.6.4 Lysieren von transfizierten Zellen ... 56
4.6.5 Oberflächenbiotinylierung mit anschließender Präzipitation ... 56
4.6.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)... 57
4.6.7 Western Blot ... 57
4.6.8 Immunchemische Detektion von Proteinen ... 58
4.7 Desialylierung von Zellen...58
4.8 Herstellung eines Antiserums in Kaninchen ...59
5 Ergebnisse ... 61
5.1 Untersuchungen zu den Bindungseigenschaften des IBV-S-Proteins...61
5.1.1 Bedeutung von Sialinsäuren auf der Oberfläche von Zellkulturen bei einer IBV-Infektion ... 61
5.1.2 Prüfung auf Spezifität der Neuraminidase-Behandlung ... 62
5.1.3 Einfluss der Neuraminidase-Behandlung auf den Virustiter... 64
5.1.4 Endogene Resialylierung nach Neuraminidase-Behandlung ... 65
5.1.5 Bedeutung von α 2,3 gebundenen Sialinsäuren auf der Oberfläche von Zellkulturen bei einer IBV-Infektion ... 66
5.1.6 Untersuchung zur Expression von α 2,3 gebundenen Sialinsäuren auf Zellkulturen ... 67
5.1.7 Infektion von CHO-Zellen mit IBV ... 68
5.1.8 Vergleich von IBV mit anderen Viren ... 70
5.2 Zelluläre Lokalisation des IBV S-Protein ...73
5.2.1 Klonieren des IBV S-Proteins in den Vektor pTM1 ... 73
5.2.2 Expression des IBV S-Proteins in BSRT-7/5-Zellen ... 74
5.2.3 Herstellung von verschiedenen S-Protein Mutanten und Klonierung dieser in die Vektoren pTM1 und pCG1... 74
5.2.4 Untersuchung der S-Protein-Konstrukte in Zelllysaten ... 78
5.2.5 Untersuchung der IBV-S Konstrukte im Immunfluoreszenztest ... 79
5.2.6 Darstellung der S-Protein Konstrukte im Phasenkontrast... 83
5.2.7 Nachweis der Lokalisation der S-Protein-Mutanten durch Oberflächenbiotinylierung ... 85
5.2.8 Untersuchung zur Endozytose... 86
5.2.9 Kolokalisationsstudien des IBV S-Proteins ... 87
6 Diskussion... 91
6.1 Bedeutung der Sialinsäurebindungseigenschaft des IBV-S-Proteins ...91
6.1.1 Bindung des S-Proteins an α2,3-gebundene Sialinsäuren ... 95
6.2 Intrazelluläre Lokalisation des IBV S-Proteins ...97
6.2.1 Bewertung der Expression der IBV-S-Konstrukte mit dem Vektor pTM1. 97 6.2.2 Bewertung der Expression der IBV S-Konstrukte mit dem Vektor pCG1. 99 6.2.3 Bedeutung der Sequenz YYTTF als Retentions-oder Endozytosesignal 101 6.2.4 Kolokalisationstudien des IBV Spike-Proteins ... 104
7 Zusammenfassung ... 107
8 Summary ... 109
9 Literaturverzeichnis... 111
10 Anhang ... 125
1 Einleitung
1.1 Coronaviren
1.1.1 Taxonomie
Die Familie Coronaviridae umfasst eine Gruppe behüllter Viren mit einem unsegmentierten ca. 30 000 Nucleotide großen RNA-Genom positiver Polarität. Sie fallen durch ihr charakteristisches Erscheinungsbild im Elektronenmikroskop auf und wurden 1968 als eigenständige Gruppe definiert (TYRRELL et al., 1968). Im Jahr 1975 wurden diese Viren als Familie der Coronaviren durch das internationale Komitee für Virustaxonomie (ICTV) anerkannt (TYRRELL et al., 1975). Zur Familie gehören zwei Genera, Coronavirus und Torovirus. (CAVANAGH und HORZINEK, 1993). Diese beiden Genera weisen hinsichtlich Organisation und Expression ihrer Genome Gemeinsamkeiten auf, zeigen aber Unterschiede in Bezug auf die Gestalt der Virionen und der Größe der Genome.
Die Familien Coronaviridae und Arteriviridae wurden 1996 von der ICTV zur Ordnung Nidovirales zusammengefasst (CAVANAGH, 1997; ENJUANES et al., 2000). Seit 2003 wird auch die Familie Roniviridae in die Ordnung Nidovirales mit einbezogen (GONZALEZ et al., 2003). Der Name „Nido“ (lat.: nidus, deutsch: Nest) leitet sich von der besonderen Replikationsstrategie ab, die für die Mitglieder der Ordnung Nidovirales charakteristisch ist. Während des Infektionsverlaufs wird in der infizierten Zelle ein 3´-coterminales „nested set“ von subgenomischen mRNAs gebildet, von denen jeweils nur das Gen am 5´-Ende der mRNA translatiert wird (DE VRIES et al., 1997; VAN VLIET et al., 2002).
Tabelle 1: Phylogenetische Verwandtschaft der Coronaviren
Gruppe1 Gruppe2 Gruppe3 Nicht eingeteilt HCoV-229E
TGEV PEDV CCoV FIPV FCoV
HCoV-OC43 BCoV
MHV RtCoV
IBV TCoV
SARS-CoV
Die Abkürzungen geben die Namen der Coronaviren wieder und sind im Abkürzungsverzeichnis erklärt.
Untersuchungen zu serologischer und phylogenetischer Verwandschaft zwischen einzelnen Vertretern der Familie Coronaviridae haben ergeben, dass sich die Coronaviren in Gruppen einteilen lassen (Tabelle 1). Vertreter der Gruppen 1 und 2 infizieren nur Säugetiere, während in Gruppe 3 die aviären Coronaviren eingeordnet sind. Das Anfang 2003 neu entdeckte SARS-assozierte Coronavirus (SARS-CoV) unterscheidet sich phylogenetisch von den bisher bekannten Coronaviren, so dass vorgeschlagen wurde, das SARS-CoV entweder in eine 4. Gruppe einzuordnen oder es einer Untergruppe der Gruppe 2 Viren zuzuordnen (MARRA et al., 2003;
SNIJDER et al., 2003)
Coronaviren sind stark wirtsspezifisch und zeigen außerdem auch einen starken Gewebstropismus. Die meisten Coronaviren infizieren Epithelgewebe des Respirations- oder Darmtraktes von Säugetieren und Vögeln. Dies kann leichte bis schwere Krankheitsbilder hervorrufen, die meist durch respiratorische oder Magen- Darm-Symptome gekennzeichnet sind (Tabelle 2).
Tabelle 2: Übersicht über die durch Coronaviren hervorgerufene Erkrankungen Gruppe Virus Wirt Respiratorische
Erkrankung
Enterische Erkrankung
Hepatitis Neurologische Erkrankung I HcoV-
229E
Mensch X a)
TGEV Schwein X CCoV Hund X FCoV Katze X
FIPV Katze X X X X II HcoV-
OC43
Mensch X
MHV Maus X X X X BCoV Rind X
RbCoV Kaninchen X
III IBV Huhn X
TCoV Pute X X
? SARS- CoV
Mensch X X
a) Die Kreuze stehen für die hauptsächlich auftretenden Erkrankungserscheinungen.
Coronaviren sind behüllte, pleomorphe, oft sphärische Partikel mit einem Durchmesser von 60-200 nm. Die Viruspartikel tragen in ihrer Hülle ca. 20 nm große keulenförmige Projektionen. Diesen sogenannten Spikes verdanken die Viren ihren Namen, denn im elektronenmikroskopischen Bild scheinen die Viren von einem Strahlenkranz (lat.: corona) umgeben zu sein (SIDDELL et al., 1983)
Das RNA-Genom der Coronaviren ist nicht segmentiert und positiv-strängig. Es codiert für 4-5 Strukturproteine und eine Reihe von Nichtstrukturproteinen. Alle Coronavirusgenome codieren für das große Oberflächenglykoprotein (S- oder Spike Protein), ein kleineres Hüllprotein (E-Protein), das Membran-Protein (M-Protein) und ein Nucleocapsid-Protein (N-Protein). Die entsprechenden Gene sind in der genannten Reihenfolge im Genom (5´zu 3´) angeordnet. Die RNA ist polyadenyliert, trägt eine CAP-Struktur und bildet zusammen mit dem N-Protein das Nucleocapsid (LAI und CAVANAGH, 1997).
1.1.2 Strukturproteine der Coronaviren
Die N-Proteine der Coronaviren besitzen ein Molekulargewicht von 45 bis 63 kDa und sind 377 bis 455 Aminosäuren lang. Trotz einiger Ähnlichkeiten sind die N-
Proteine unterschiedlicher Coronavirusspezies nur begrenzt homolog (LAPPS et al., 1987). Das N-Protein erfüllt mehrere Aufgaben während des viralen Replikationszyklus (LAUDE und MASTERS, 1995). Es bildet zusammen mit der genomischen RNA den Ribonukleoproteinkomplex (DAVIES et al., 1981).
Gemeinsam mit dem M-Protein formt das N-Protein das innere Core (ESCORS et al., 2001; RISCO et al., 1996).
Die M-Proteine der Coronaviren sind Glycoproteine mit einem Molekulargewicht von 20 – 38 kDa. Das M-Protein kann entweder N- oder O-glykosidisch glykosyliert sein.
So trägt das M-Protein von IBV, TGEV, HCoV-229E und FIPV nur N-glykosidisch gebundene Zuckerseitenketten, während Vertreter der Gruppe 2 wie MHV, HCoV- OC43 und BCoV O-glykosidisch gebundene Zuckerseitenketten tragen. (ROTTIER, 1995). Sowohl in virusinfizierten Zellen als auch bei Einzelexpression wird das M- Protein nicht an die Zelloberfläche transportiert. Es wird in intrazellulären Kompartimenten zurückgehalten. (KLUMPERMAN et al., 1994; KRIJNSE-LOCKER et al., 1994). Coexpressionsstudien mit M- und E-Protein zeigen, dass allein diese beiden Proteine ausreichen, um „virus-like particles“ zu bilden (BOS et al., 1996; KIM et al., 1997; VENNEMA et al., 1996).
Das E-Protein, welches auch als kleines Envelope-Protein der Coronaviren bezeichnet wird, besitzt ein Molekulargewicht von ca. 9,1 bis 12,4 kDa (SIDDELL, 1995). Es wurde zu Beginn der 90er Jahre bei IBV gezeigt, dass das E-Protein ein integrales Membranprotein darstellt (LIU und INGLIS, 1991). Wird das E-Protein einzeln exprimiert, so wird es für einige Stunden in den Prä-Golgi-Kompartimenten zurückgehalten. Dort kann es über eine periphere Domäne mit dem M-Protein interagieren und hält dieses bei Coexpression ebenfalls im Prä-Golgi-Kompartiment zurück (LIM und LIU, 2001).
Dem S- oder Spike-Protein verdanken die Coronaviren ihren Namen. Es bildet die ca. 20 nm großen Oberflächenprojektionen, die im elektronenmikroskopischen Bild das Viruspartikel kranzförmig umgeben. Es ist für die Bindung an den zellulären Rezeptor und die Fusion mit der Wirtszelle verantwortlich. Es handelt sich beim S-
Protein um ein Typ 1 Membran-Protein; es ist also gekennzeichnet von einer Ektodomäne am Amino-Terminus, einem kurzen Membrananker und einem ebenfalls kurzen cytoplasmatischen Abschnitt am Carboxy-Terminus. Die Größe des Glykoproteins variiert bei den einzelnen Coronavirusspezies zwischen 1160 (IBV) und 1452 (FIPV) Aminosäuren. Das ungespaltene S-Protein hat ein Molekulargewicht von 170 bis 220 kDa. Das S-Protein enthält zahlreiche N- Glykosylierungsstellen (bis zu 35 bei FIPV), die zum größten Teil auch durch Oligosaccharide besetzt sind. Je nach Coronavirusspezies kann das S-Protein in zwei Untereinheiten, die S1- und S2-Untereinheiten proteolytisch gespalten werden.
Bei einigen Coronaviren wie TGEV wird das S-Protein nicht gespalten (CAVANAGH, 1995). Vergleicht man die Aminosäuresequenzen der einzelnen S-Proteine, so zeigt sich, dass die S1-Untereinheit im Gegensatz zur S2-Untereinheit sehr stark variiert.
Das S-Protein ist das Hauptantigen und induziert die Bildung neutralisierender Antikörper. Die Epitope befinden sich dabei übrwiegend auf der S1-Untereinheit (DELMAS und LAUDE, 1990). In der Aminosäuresequenz der S2 Untereinheit findet man zwei Regionen mit heptad repeats, die auf eine coiled coil-Struktur hinweisen (DE GROOT et al., 1987; RASSCHAERT und LAUDE, 1987). Daher wird angenommen, dass es sich bei den Oberflächenprojektionen um Multimere, wahrscheinlich Homotrimere handelt (CAVANAGH, 1995).
Vertreter der Gruppe 2 Coronaviren (Tabelle 1) besitzen noch ein weiteres Oberflächenglykoprotein, die Hämagglutinin-Esterase (HE). Das HE-Protein fungiert als rezeptorzerstörendes Enzym. Es hat wie auch das HEF-Protein der Influenza-C- Viren 9-O-Acetylesterase Aktivität (VLASAK et al., 1988a;b). Das HE-Protein weist auf Aminosäureebene eine deutliche Homologie von 30% mit dem HEF-Protein des Influenza-C-Virus auf. Da das S-Protein der Gruppe 2 Coronaviren BCoV und HCoV- OC43 eine stärkere Bindungsaffinität zu Neu5,9Ac2 aufweist als das HE-Protein (KUNKEL und HERRLER, 1993; SCHULTZE et al., 1991a;b), liegt die Funktion des HE-Proteins vermutlich nicht darin, die Bindung des Virus an die Zelle zu vermitteln, sondern in der Inaktivierung der Rezeptor-Determinante N-Acetyl-9-O- Acetylneuraminsäure auf der Oberfläche der Zelle und des Virus. Ähnlich wie für Influenzaviren beschrieben wird dadurch sowohl die Bildung von Virusaggregaten
verhindert als auch das Loslösen von der infizierten Zelle und somit die Virusausbreitung erleichtert.
1.1.3 Replikation
Alle Schritte der Coronavirus-Replikation laufen im Zytoplasma der infizierten Zelle ab. Coronavirus-Replikation ist gekennzeichnet von einem einzigartigen diskontinuierlichen Transkriptionsmechanismus. Dieser ist noch nicht eindeutig verstanden. Von der genomischen RNA werden zunächst zwei Polyproteine pp1a und pp1ab translatiert. Die Expression des letzteren erfordert einen durch einen Pseudoknoten verusachten Leserastersprung. Aus den Polyproteinen entstehen durch proteolytischen Abbau verschiedene Nicht-Strukturproteine, zu denen auch die RNA-abhängige RNA-Polymerase gehört. Durch die Aktivität dieses Enzyms wird als nächstes das gesamte Genom in einen Negativ-Strang umgeschrieben, wobei die Positiv-Strang-RNA als Matrize dient. Man geht davon aus, dass die diskontinuierliche Transkription bereits während der Synthese der subgenomischen Negativ-Strang-RNAs abläuft. Dieses Modell wird dadurch unterstüzt, dass die Existenz transkriptionell aktiver, subgenomischer Negativ-Strang-RNA´s nachgewiesen werden konnte, die die antileader-Sequenz tragen (SNIJDER et al., 2003). Die diskontinuierliche Transkription der subgenomischen mRNAs wird wahrscheinlich durch „transkriptions regulierende Sequenzen,“ kontrolliert. Die subgenomischen RNAs bilden ein sogenanntes „nested set“ und sind dadurch gekennzeichnet, dass alle das gleiche 3´Ende aufweisen. Es wird jedoch jeweils nur der am 5´Ende liegende Leserahmen in ein Protein übersetzt (Übersicht siehe SAWICKI und SAWICKI, 2005) Die so gebildeten Strukturproteine müssen dann zu einem neuen Viruspartikel zusammengesetzt werden. Dazu komplexiert das N- Protein mit der genomischen RNA zu den helikalen Nucleokapsiden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass bei den Coronaviren die Virusfreisetzung Nukleokapsid- unabhängig ablaufen kann. Die Coexpression von M-Protein und E-Protein reicht aus, um „virus-like particles“ zu bilden (VENNEMA et al., 1996). Es wurde sogar berichtet, dass die Einzelexpression des E-Proteins zur Freisetzung von E enthaltenden Partikeln führt (CORSE und MACHAMER, 2000; MAEDA et al., 1999).
Das M-Protein wird über eine Interaktion mit dem E-Protein im Prä-Golgi-
Kompartiment zurückgehalten (LIM und LIU, 2001). Hier kommt es zu einer Bindung des N-Proteins an die carboxyterminale Domäne des M-Proteins. Der Ort der Virusfreisetzung ist sehr wahrscheinlich das intermediäre Kompartiment zwischen ER und Golgi-Apparat (ERGIC) (RISCO et al., 1998; TOOZE et al., 1984). Die neuen Viruspartikel werden in das Lumen des ERGIC abgeschnürt und durch Transportvesikel über den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche transportiert, wo sie in die Umgebung entlassen werden.
1.2 Das Virus der Infektiösen Bronchitis der Hühner
1.2.1 Ätiologie
Aufgrund seiner morphologischen und biochemischen Eigenschaften wird das Virus der Infektiösen Bronchitis der Hühner in die Familie Coronaviridae eingeordnet (TYRRELL et al., 1968). Im Elektronenmikroskop zeigt sich der Erreger mit annähernd runder, häufig aber auch pleomorpher Gestalt. An der Oberfläche sind die für Coronaviren typischen keulenförmigen Fortsätze (Spikes) zu finden (BERRY et al., 1964). Das Genom des Virus der infektiösen Bronchitis besteht aus einer einsträngigen, nicht segmentierten RNA, die als Plus-Strang vorliegt und eine Länge von über 27 600 Basen aufweist.
1.2.2 Epidemiologie und Klinik
Die Infektiöse Bronchitis wurde erstmals 1931 in North Dakota, USA, als neuartige Erkrankung der Atemwege bei wenige Tage alten Küken beschrieben. (SCHALK und HAWN, 1931). Ab dem Jahre 1948 wurde auch in anderen Ländern aufgrund von klinischen und pathologisch-anatomischen Befunden, sowie später auch durch Erregernachweis und serologischen Tests über das Vorkommen der Infektiösen Bronchitis berichtet. In Deutschland wurde 1950 eine neuartige Erkrankung der Atemwege bei Hühnern festgestellt (SASSENHOFF, 1950). Man vermutet, dass es sich hierbei um die Infektiöse Bronchitis gehandelt hat. Wenig später wurde über das Vorkommen der Infektiösen Bronchitis aus allen Kontinenten berichtet.
Als natürliche Wirte der Infektiösen Bronchitis gelten Hühner und nach Berichten aus dem Jahre 1983 auch Fasane (SPACKMAN und CAMERON, 1983). Eine Übertragung auf den Menschen ist nicht bekannt (ALMEIDA und TYRRELL, 1967).
Nach der natürlichen Infektion mit einem virulenten IBV-Stamm beträgt die Inkubationszeit 18-36 Stunden. Bei Küken mit maternaler Immunität kann es jedoch auch erst nach 6 Tagen zu Symptomen kommen. Als Zielorgane des Bronchtitis- Virus dienen vor allem die Schleimhäute der Atemwege und des Eileiters. Einige Stämme zeigen auch einen ausgeprägten Nierentropismus. Während hoch eiadaptierte Stämme sich auf Trachea und Bronchien beschränken, führen
N S
M
RNA
CAP
AAE
Membran
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines IBV-Partikels. S= Spike Protein, M= Membran- Protein, E= Envelope-Protein, N= Nukleokapsid-Protein. Das im Zentrum gezeigte Genom trägt am 5´Ende eine Cap-Struktur und am 3´Ende eine poly-A-Sequenz.
pathogene Stämme zu einer Virämie. Die Erkrankung dauert in der Regel 1-2 Wochen. Bei bis zu 6 Wochen alten Küken wird auch Mortalität beobachtet, die bei voller Empfänglichkeit bis zu 25% betragen kann. Erkranken voll empfängliche Tiere, die jünger als 2 Wochen alt sind, so kann es zu einer irreversiblen Schädigung des Eileiters kommen, was zu sogenannten „falschen Legern“ führt. Bei Küken tritt die Infektiöse Bronchtitis vor allem als typische Erkrankung der Atemwege auf, was auch die Namensgebung erklärt. Der Name führt aber oft zu Fehldeutungen, da bei Legehennen meist die Schädigungen des Legeapparates überwiegen. Oft ist das Absinken der Legeleistung das einzige Symptom. Bakterielle und Mycoplasmen- bedingte Sekundärinfektionen können die Diagnose erschweren.
Infizierte Küken leiden infolge der Schleimhautschwellung im Syrinxbereich unter Atemnot, zeigen Schnabelatmung und geben klagende Laute von sich. Dies kann aber oft nur bei Stallruhe oder in der Nacht wahrgenommen werden. Starke Ansammlung von Schleim kann zum Ersticken führen. Seit Einführung von Impfprogrammen in Elterntierherden und in der Aufzucht treten jedoch nur noch vereinzelt Todesfälle auf. Bei Legehennen kommt es in Folge der Erkrankung zu einem Legerückgang, der je nach Erregervirulenz bis zu 92% betragen kann (BROADFOOT et al., 1954). Im Legedarm kommt es entzündungsbedingt zu einer pH-Verschiebung in den sauren Bereich, was zu dünnschaligen und missgebildeten Eiern führt.
Bei Infektionen mit nephropathogenen Bronchitis-Virusstämmen treten respiratorische Beschwerden in den Hintergrund. Von der Nephritis-Nephrose Form der Bronchitis werden besonders wenige Wochen alte Jungtiere betroffen. Todesfälle kommen in der 2. Krankheitswoche vor, die Todesrate wird mit 15-60% angegeben (CUMMING, 1969a;b).
1.2.3 Bekämpfung
Eine spezifische Behandlung der Infektiösen Bronchitis ist nicht möglich, daher kann nach Krankheitsausbruch lediglich versucht werden, die Beschwerden zu lindern und Sekundärinfektionen, vor allem durch E. coli, zu vermeiden. Nach einem ca. drei Wochen dauernden Legerückgang ist mit ungefähr 10-20 % nicht wieder legenden Hühnern zu rechnen. Schwerpunkt der Bekämpfung der hochkontagiösen Infektiösen
Bronchitis muss in hygienischen und immunprophylaktischen Vorkehrungen liegen.
Die regelmäßige und vollständige Räumung des Stalles und gründliche Stalldesinfektion vor jeder Neueinstallung von Küken („all in, all out“) sollte selbstverständlich sein. Das wenig resistente, behüllte Bronchitisvirus lässt sich leicht mit allen gebräuchlichen Desinfektionsmitteln abtöten. Legehennen sind aufgrund der langen Verweildauer im Bestand und des Risikos durch Personenverkehr (Eiersammeln) von einer Infektion besonders bedroht. Eine befriedigende Absicherung gelingt nur durch vorbeugende Impfung der Tiere.
Weltweit hat die Impfung gegen die Infektiöse Bronchitis die größte Bedeutung im Kampf gegen wirtschaftliche Verluste. DieTatsache, dass Bronchitisvirusstämme durch Passagen im embryonierten Hühnerei die Virulenz für Hühner und Küken verlieren, führte zur Attenuierung von Virusstämmen, die als Impfstoffe eingesetzt werden. Es bewährten sich zunächst Stämme des Massachusetts-Typs. Trotz Entwicklung guter Lebend- und Inaktivat-Vakzinen macht vor allem das Auftreten vieler Serotypen und Varianten einen vollständigen Schutz schwierig. Neue Serotypen entstehen durch Rekombination (JIA et al., 1995; WANG et al., 1993) oder durch spontane Mutation (WANG und KHAN, 2000). Die ersten Bronchitisviren, die beschrieben wurden, gehörten zum Massachusetts-Typ (SCHALK und HAWN, 1931) gefolgt vom Conneticut-Serotyp in den 50er Jahren. Seitdem sind viele Serotypen beschrieben worden.
Tabelle 3: wichtige IBV Serotypen
Massachusetts 41 (1941)a) IBV-T (1963) D-3128 (1983)
Conneticut (1956) JMK (1964) PL-84084 (1986) Iowa 97/609 (1958) Florida (1971) IBV-G (1986)
H 52 (1960) D-274/ D-207 (1977) 793B oder 4/91 (1991) Holte, Gray (1962) D-1466/D-212 (1978) 614/1 (1994)
a) In Klammern ist das Jahr der Erstisolierung angegeben.
In Broilerbeständen wird überwiegend mit attenuierten Lebend-Impfstoffen vakziniert.
Abhängig von der Situation vor Ort wird der Impfstoff ab dem ersten Lebenstag als Spray oder später über das Trinkwasser verabreicht. Oftmals reicht eine einzige
Impfung aus, doch bei persistierenden Problemen wird die Impfung auch wiederholt.
In Elterntierherden und Legehennenbeständen werden sowohl Lebend-Impfstoffe wie auch inaktivierte Impfstoffe eingesetzt. Dies ist notwendig, da die Inaktivate ohne vorhergegangene Lebendimpfung wenig wirksam sind. Bei der gleichzeitigen Verabreichung verschiedener Variantviren als Lebendvakzine kommt es zur Virusinterferenz und somit zu einer einseitigen Hemmung der Virusvermehrung (WINTERFIELD und FADLY, 1975). Die heute angewendeten Impfstrategien scheinen recht effektiv zu sein, dennoch treten immer wieder Probleme mit IBV- Infektionen in geimpften Beständen auf. Daher besteht nach wie vor ein Bedarf an neuen Kontrollstrategien gegen die Infektiöse Bronchitis. Eine Methode, die zur Zeit viel diskutiert wird, ist die in ovo-Applikation von Impfstoff. Im Jahre 1995 wurde beschrieben, dass IB-Lebend-Vakzinen über das Ei appliziert werden können (WAKENELL et al., 1995); doch es zeigte sich, dass die Schlupfrate deutlich zurückging (CHEW et al., 1997). Dies scheint darauf zu beruhen, dass alle IBV- Stämme, auch die attenuierten, sich im Embryo vermehren und diesen töten können.
Die Entwicklung von neuartigen Impfstoffen hat bei IBV noch keinen durchschlagenden Erfolg gebracht. Es wurden IBV-Gene mit Baculovirus exprimiert (BRESLIN et al., 2001) und Impf-Versuche mit rekombinanten Fowlpox- und Adenoviren durchgeführt (JOHNSON et al., 2003; YU et al., 2001). Außerdem wurden Experimente zur DNA-Vakzinierung unternommen (KAPCZYNSKI et al., 2003). Es wurde sogar über die Expression des S1-Proteins in transgenen Kartoffeln berichtet (ZHOU et al., 2003). Seit dem Jahr 2001 steht auch für IBV ein rekombinantes System zur Verfügung (CASAIS et al., 2001). Dieses wurde auch genutzt, um attenuierte Viren zu erzeugen, die das Spike-Protein eines pathogenen Stamms exprimierten. In Belastungsversuchen erwiesen sich die mit diesem Virus geimpften Tiere gegen eine Infektion mit dem pathogenen Stamm geschützt (HODGSON et al., 2004).
1.2.4 Das IBV-Spike-Protein
Das Spike-Protein von IBV ist ca. 20 nm lang und das tropfenförmige Ende ist ca. 10 nm breit. Es hat unter den S-Proteinen aller Coronaviren mit 1160 Aminosäuren die kürzeste Aminosäuresequenz. Es enthält zahlreiche Glykosylierungsstellen, die
anscheinend auch für die Verknüpfung mit Oligosacchariden genutzt werden. So sind in der S1-Untereinheit 16 und in der S2-Untereinheit 12 potentielle Glykosylierungsstellen zu finden. Die Glykane werden über Asparagine verknüpft, es handelt sich also um N-Glykosylierung (CAVANAGH, 1983a). Das S-Protein von IBV kann in die beiden Untereinheiten S1 und S2 gespalten werden. Dies ist jedoch abhängig vom Virusstamm und von der Wirtszelle. So wurde bei IBV-Stämmen, die in embryonierten Hühnereiern oder auf Hühnernierenzellen vermehrt wurden, nahezu 100% gespaltenes S-Protein gefunden (CAVANAGH und DAVIS, 1987; STERN und SEFTON, 1982). Der IBV Beaudette-Stamm, auf Verozellen vermehrt, zeigt hingegen 70% gespaltenes S-Protein (CAVANAGH et al., 1986). Bestimmung der S- Protein-Aminosäuresequenzen von verschiedenen IBV-Stämmen zeigt, dass es sich um eine multibasische Spaltstelle handelt, die eine der folgenden Sequenzen haben kann: RRFRR, RRSRR, RRHRR, oder GRHRR (BINNS et al., 1985; BINNS et al., 1986; CAVANAGH et al., 1986; CAVANAGH et al., 1988; JORDI et al., 1989;
NIESTERS et al., 1986). Das S-Protein ist über die S2-Untereinheit mit der viralen Membran verbunden. Diese membranverankerte Untereinheit enthält zwei heptad repeats, die eine coiled coil-Struktur vermuten lassen. Dieses deutet auf eine Struktur des S-Proteins als Homotrimer hin (CAVANAGH, 1995). Die S1-Untereinheit enthält die meisten der antigenen Epitope des S-Proteins, welches insgesamt das Hauptantigen von IBV darstellt. Virus-neutralisierende Antikörper wurden durch Immunisierung mit gereinigtem S-Protein erzeugt, sowie durch Impfung mit Vektoren, die das S-Protein exprimierten (TOMLEY et al., 1987). Virus, von dem die S1- Untereinheit durch Behandlung mit Harnstoff entfernt wurde, induziert keine neutralisierenden Antikörper mehr (CAVANAGH, 1983b). Die große Variabilität der Sequenz in der S1-Untereinheit ist maßgeblich für das Auftreten vieler IBV-Serotypen verantwortlich. Dies führt zu praktischen Schwierigkeiten in der Geflügelindustrie, da der Bedarf an neuen Impfstoffen und Bekämpfungsstrategien ungebrochen ist.
Das S-Protein ist verantwortlich für die Bindung an die Wirtszelle. Für IBV ist noch kein Rezeptormolekül bekannt, das eine Infektion vermitteln kann. Eine Behandlung von IBV mit Neuraminidase bewirkt, dass das Virus über das S-Protein an Erythrozyten binden und eine Hämagglutinationsreaktion verursachen kann (BINGHAM et al., 1975; SCHULTZE et al., 1992). Die Behandlung von Erythrozyten
mit Neuraminidase unterbindet die Hämagglutination. Resialylierungsexperimente zeigen, dass α-2,3-gebundene Sialinsäuren auf Erythrozyten als Rezeptor- Determinanten fungieren. Es scheint, dass die Virionen erst von anhaftenden Sialoglykokonjugaten mittels Neuraminidase befreit werden müssen, um eine Bindung an die Sialinsäuren auf der Erythrozytenoberfläche zu ermöglichen. Eine Rolle der Sialinsäure-Bindungsaktivität bei der Infektion von Zellen wurde bislang nicht gezeigt. Nach der Bindung an eine permissive Zelle vermittelt das S-Protein auch die Fusion der Virusmembran mit der Zellmembran. Es wurde beschrieben, dass die Fusion stammabhängig verläuft. So wird die Infektion des Stammes UK/123/82 nicht durch lysosomtrope Agenzien beeinflusst. Dies spricht für einen Eintritt des Virions über Fusion mit der Plasmamembran, während IBV-Beaudette anscheinend mit Endosomenmembranen verschmilzt, sobald diese ein leicht saures Mileu aufweisen. Die Viren werden bei diesem Stamm somit zunächst über Endozytose aufgenommen (LI und CAVANAGH, 1990; LI und CAVANAGH, 1992).
IBV zeigt einen ausgeprägten Wirts- und Zelltropismus. Dieser wird vom S-Protein vermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes IBV, welches das Spike- Protein eines anderen Stammes exprimiert, einen veränderten Zelltropismus aufweist; es werden nur Zellen infiziert, die der Ursprungstamm des Spike-Proteins infizieren kann (CASAIS et al., 2003).
1.3 Sialinsäuren als Rezeptordeterminanten für Viren
Viren sind auf Wirtszellen zur eigenen Reproduktion angewiesen. Der Rezeptor stellt die essentielle Eintrittspforte für den viralen Lebenszyklus dar. Viren haben sich im Laufe der Evolution sehr unterschiedliche Zelloberflächen-Moleküle, unabhängig von deren Struktur oder Funktion, als Rezeptoren ausgesucht. Das Vorkommen von Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen ist mitentscheidend für den Wirts- und Gewebstropismus, sowie für die Pathogenität.
Die erste Virus-Rezeptor-Determinante, die entdeckt wurde, ist die N- Acetylneuraminsäure (Neu5Ac). Sie dient u.a. Influenza-A und –B-Viren als Erkennungsstruktur (GOTTSCHALK, 1958). Die verschiedenen Derivate der
Neuraminsäure, die in ihrer Gesamtheit Sialinsäuren genannt werden, sind saure Zuckermoleküle mit negativer Ladung, die an terminaler Position auf Zuckerketten von Glykoproteinen und Glykolipiden sitzen. Es gibt über 40 Neuraminsäurederivate.
Sie unterscheiden sich durch verschiedene Acetylierungen und andere Modifikationen. Sie können durch verschiedene Bindungstypen mit dem nachfolgenden Zuckermolekül verknüpft sein.
www.siue.edu
Abbildung 2: Strukturformeln der N-Acetylneuraminsäure, die in verschiedenen Bindungsarten mit Galactose bzw. Neu5Ac verbunden sind
Sialinsäuren erfüllen mehrere Funktionen. Einerseits stellen sie lebenswichtige Moleküle für den Organismus dar, in dem sie eine wichtige Rolle im Zellreifungs- und Alterungsprozess spielen. Alternde Zellen verlieren mit der Zeit ihre Sialinsäuren auf der Oberfläche. Diese Veränderung wird von Rezeptoren z.B. auf Phagozyten erkannt, die diese Zellen dann „entsorgen“. Andererseits werden Sialinsäuren von Patho-Organismen „missbraucht“, die diese Zucker als Rezeptoren erkennen, was lebensbedrohliche Infektionen zur Folge haben kann (Übersicht siehe SCHAUER, 2000). Die Bindung von Influenzaviren über ihr Hämagglutinin an Sialinsäure ist mittlerweile sehr gut charakterisiert. Hinweise auf die Lokalisation der Bindungsstelle auf dem HA-Molekül wurden durch Kristallisationsstudien gefunden. Hier zeigt sich, dass die Sialinsäure in einer „Tasche“ des Moleküls binden kann (SAUTER et al., 1992; WEIS et al., 1988). Influenza-C-Viren erkennen eine andere Sialinsäure, die N- Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure (Neu5,9Ac2) (ROGERS et al., 1986). Auch für viele weitere Viren und Bakterien sind Sialinsäuren als Rezeptordeterminante beschrieben. Das Sendai-Virus, ein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae, bindet an ein Sialoglykoprotein (SUZUKI et al., 1985) und einige Mitglieder der Familien Reoviridae, Rotaviridae und Polyomaviridae verfügen über eine Sialinsäure- Bindungsaktivität. (FERNANDES et al., 1994; ROLSMA et al., 1994). Auch für einige Coronaviren wurden Sialinsäure-bindende Eigenschaften beschrieben. Hier sind vor allem Vertreter der Gruppe 2 zu nennen, das bovine Coronavirus und das humane Coronavirus OC-43. Sie erkennnen Neu5,9Ac2 als Rezeptor (SCHULTZE et al., 1990; SCHULTZE und HERRLER, 1992; VLASAK et al., 1988b). Auch für TGEV, ein Vertreter der Gruppe 1, ist zusätzlich zur Bindung an den Rezeptor Aminopeptidase N noch eine Sialinsäurebindungseigenschaft beschrieben, die vor allem für die Enteropathogenität von TGEV von Bedeutung zu sein scheint (KREMPL et al., 1997;
SCHWEGMANN-WESSELS et al., 2003). Auch für IBV ist bekannt, dass es über das Spike-Protein an Sialinsäuren auf der Oberfläche von Erythrozyten binden und dadurch Hämagglutination auslösen kann (BINGHAM et al., 1975; SCHULTZE et al., 1992). Bemerkenswert ist, dass behüllte Viren, die ausschließlich über Sialinsäuren an die Zelle binden, ein zusätzliches Glykoprotein in ihrer Membran tragen, das rezeptorzerstörende Eigenschaften besitzt. Bei den Influenza-A- und –B-Viren und den Paramyxoviren sind dies Neuraminidasen, die Sialinsäuren von den
Zuckerketten abspalten. Viren, die Neu5,9Ac2 erkennen, besitzen eine 9-O- Acetylesterase, die eine Hydrolyse der Acetylgruppe am C9-Atom der Sialinsäure bewirkt. Man nimmt an, dass durch die rezeptorzerstörenden Enzyme ein
„Klebenbleiben“ der Viren an der Zelloberfläche nach dem Freisetzen und die Aggregat-Bildung der Viruspartikel vermieden wird.
2 Zielsetzung
Das Spike-Protein von IBV ist als Hauptantigen bereits gut charakterisiert. Von vielen verschiedenen Serotypen sind die Aminosäure-Sequenzen der Spike-Proteine bestimmt worden, deren Unterschiede vor allem in Bezug auf serologische Eigenschaften wurden beschrieben. Dies ist durch die enorme wirtschaftliche Bedeutung der Erkrankung Infektiöse Bronchitis in der Geflügelindustrie und die durch Massentierhaltung notwendig gewordenen Impfmaßnahmen zu erklären. Die Funktionen des Spike-Proteins von IBV aus viraler Sicht sind bisher jedoch noch ungenügend beschrieben.
Während für zahlreiche Coronaviren bekannt ist, welche zellulären Moleküle als Rezeptor dienen und eine Bindung an die Zelle und schließlich den Eintritt in diese ermöglichen, ist für IBV noch kein Oberflächenmolekül bekannt, das als Bindungspartner fungiert. Die Bindung der Coronaviren an den zellulären Rezeptor wird bei allen Vertretern über das Spike-Protein vermittelt. Diese Protein-Rezeptor- Interaktion stellt den ersten und essentiellen Schritt zur Einleitung des viralen Reproduktionszyklus dar.
Die Reifung der Coronaviruspartikel findet nicht wie bei anderen Viren an der Plasmamembran infizierter Zellen, sondern an inneren Membranen statt. Vieles spricht dafür, dass das intermediäre Kompartiment zwischen Endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat Ort der Virusknospung ist. Von anderen Coronaviren wie z.B.: TGEV ist bekannt, dass das S-Protein in der Zelle zurückgehalten und nicht an die Zelloberfläche transportiert wird. Um eine genauere Untersuchung der Rezeptor-Bindungstelle des IBV-S-Proteins zu ermöglichen, ist es notwendig, dass dieses an der Zelloberfläche exprimiert wird. Dadurch wird ein Einbau in virale Vektoren, die an der Oberfläche der Zelle knospen, möglich. So kann ein IBV-Spike- Protein beispielsweise in VSV Pseudotypen eingebaut werden.
Ziel dieser Arbeit war es, Eigenschaften des IBV-Spike-Proteins näher zu untersuchen, die für den viralen Lebenszyklus von wichtiger Bedeutung sind. Dies erfolgte in zwei Bereichen:
• Die erste Bindung an zelluläre Oberflächenstrukturen sollte untersucht werden. Als Ansatz diente die mit Erythrozyten gezeigte Sialinsäurebindungseigenschaft des S-Proteins. Es sollte untersucht werden, ob Sialoglykokonjugate auch auf Zellkulturen als Rezeptordeterminante eine Rolle spielen und ob die Bindung an diese Zucker eine Infektion vermitteln kann.
• Eine Einzelexpression des Spike-Proteins sollte zeigen wie es in der Zelle transportiert bzw. lokalisiert wird, und welche Sequenzbereiche und gegebenenfalls Aminosäuren des S-Proteins dabei eine Rolle spielen. Die in dieser Arbeit gezeigten Transportuntersuchungen stellen die Vorraussetzung für eine spätere Charakterisierung der Bindungstelle des S-Proteins mittels Pseudotypen. Diese Pseudotypen können dann genauer untersucht werden, z.B. durch den Einbau von mutierten Proteinen.
3 Material
3.1 Zelllinien
Vero-Zellen
Vero-Zellen stammen aus dem Nierengewebe der grünen Meerkatze (African green monkey). Die Zelllinie wurde von Herrn PD Dr. Zimmer, Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt.
Vero-E6-Zellen
Vero-E6-Zellen stammen ebenfalls aus dem Nierengewebe der grünen Meerkatze (African green monkey). Sie wurden zur Verfügung gestellt von der Collection of Cell Lines in Veterinary Medicine (CCLV) der Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten (Friedrich Löffler Institut), Insel Riems, mit der Katalognummer RIE 929.
BHK-21-Zellen
Diese etablierte Zelllinie leitet sich ab vom Nierengewebe des syrischen Hamsters Mesocricetus auratus (baby hamster kidney). Die Zelllinie wurde von Herrn PD Dr.
Zimmer, Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt.
BSR-T7/5-Zellen
Diese Zelllinie ist ein Abkömmling der BHK-21-Zelllinie. BSR-T7/5-Zellen exprimieren stabil die T7-RNA-Polymerase (BUCHHOLZ et al., 1999). Die Zelllinie wurde von Herrn Prof. Conzelmann aus dem Max-von-Pettenkofer-Institut, München, zur Verfügung gestellt.
LLC-PK1-Zellen-
Hierbei handelt es sich um Schweinenierenzellen (ATCC CRL-1392, 1994). Sie wurden von Frau Dr. Schwegmann-Weßels, Institut für Virologie, StiftungTierärztliche Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt.
CHO-E6-Zellen
Hierbei handelt es sich um Zellen aus dem Ovargewebe eines Hamsters (Chinese Hamster Ovary). Die CHO-E6 Zellen wurden von Frau Prof. Gerardy-Schahn aus dem Institut für Zelluläre Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt
CHO-LEC2
Die CHO-LEC2 Zellen stellen eine Mutante der CHO-Ausgangszellen dar. Sie besitzen einen Defekt im CMP-Sialinsäure-Transportsystem. CHO-LEC2 Zellen wurden von Frau Prof. Gerardy-Schahn, Medizinische Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
CHO-6B2
Die CHO-6B2 Zellen stellen ebenfalls einen Abkömmling der Ausgangs-CHO-Zellen dar. Diese Zellen besitzen den gleichen Defekt im CMP-Sialinsäure- Transportersystem wie die CHO-LEC2-Zellen, exprimieren aber stabil CMP-SA-Tr, einen CMP-Sialinsäure-Transporter, der den Defekt teilweise wieder aufhebt.
3.2 Virus
Virus der infektiösen Bronchitis der Hühner (IBV)
Der apathogene IBV-Beaudette-Stamm (Beaudette US), sowie der pathogene M41- Stamm wurden von Dr. Dave Cavanagh, Compton Laboratory, UK, zur Verfügung gestellt
Bovines respiratorisches Synzytialvirus (BRSV)
Der Stamm ATue51908 wurde von Herrn Prof. Conzelmann aus dem Max-von- Pettenkofer-Institut, München, zur Verfügung gestellt.
Sendai-Virus
Der Sendai-Z-Stamm wurde von Herrn PD Dr. Zimmer, Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt.
Influenza A
Der Schweineinfluenza-Stamm A/sw/Bakum/909/93(H3N2) stammt aus der Außenstelle für Epidemiologie der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover (Bakum)
3.3 Bakterien
XL1-Blue E. coli
Die E.coli-Bakterien wurden vermehrt und durch spezifische Waschschritte chemisch kompetent gemacht. Die Bakterien wurden von Herrn PD Dr. Zimmer, Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt.
3.4 Plasmide
pTM1
Dieses Plasmid (MOSS et al., 1990) wurde von Herrn PD Dr. Zimmer, Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt.
Der Vektor ermöglicht die Expression der codierten Proteine in Säugetierzellen ohne Beteiligung des Zellkerns. pTM1 besitzt einen starken T7-Promotor und einen T7- Terminator, die beide von Vaccinia-Virus-Thymidinkinase-Sequenzen flankiert werden. Die multiple cloning site befindet sich zwischen dem T7-Promotor und dem T7-Terminator. Bei der Transkription werden mRNAs ohne Cap-Strukturen gebildet.
Um dennoch eine effiziente Translation zu erhalten, beinhaltet der Vektor pTM1 die IRES- (internal ribosome entry side)-Sequenz des Encephalomyocarditis-Virus. Zur Selektion von plasmidhaltigen Bakterienzellen, enthält der Vektor eine Ampicillin- Resistenz
Für die Proteinexpression mit Hilfe dieses Vektors wurde die Zelllinie BSR-T7/5 verwendet. Dabei handelt es sich um modifizierte BHK-21-Zellen, die stabil die T7- Polymerase exprimieren (BUCHHOLZ et al., 1999).
pCG1
Dieses Plasmid (CATHOMEN et al., 1995) wurde von dem Institut für Virologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. Die Expression von Fremdproteinen steht bei diesem Vektor unter Kontrolle des Zytomegalievirus (CMV)-Promotors. Zwischen dem CMV-Promotor und der multiple cloning site befindet sich ein Intron des ß-Globin-Gens aus dem Kaninchen, welches die Expression der unterschiedlichen S-Konstrukte über den Zellkern von Säugetierzellen ermöglicht. Zur Selektion der plasmidtragenden Bakterien besitzt der Vektor eine Ampicillin-Resistenz.
3.5 Zellkulturmedien
EDulb (Dulbecco’s Minimal Essential Medium), pH 6,9
EDulb-Fertigpulver 13,53 g
NaHCO3 2,2 g
Aqua bidest. ster. ad 1 l
EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium), pH 7
EMEM-Fertigpulver 9,6 g
NaHCO3 2,2 g
Aqua bidest. ster. ad 1000 ml
Medium 199 1x mit Hank´s Salzen Biochrom
Ham’s F12 mit Glutamax Biochrom
Das Fertigpulver wurde von der Firma GIBCO BRL Life Technologies bezogen und unter Zusatz von 0,06 g Penicillin G und 0,05 g Streptomycin Sulfat (Sigma) pro Liter Medium verwendet.
Versen-Trypsin 0,125%, pH7
NaCl 8,0 g
KCl 0,20 g
Na2HPO4 x 12 H2O 2,31 g
KH2PO4 x 2 H2O 0,20 g
CaCl2 0,13
MgSO4 x 7 H2O 0,10 g
Trypsin 1,25 g
Versen (EDTA) 1,25 g
Streptomycin 0,05 g
Penicillin 0,06 g
Aqua bidest. ster. ad 1 l
Alle Reagenzien für die Zellkultur wurden nach ihrer Herstellung sterilfiltriert.
Fetales Kälberserum (FKS) Biochrom
Mycoplex Fetales Kälberserum PAA Laboratories Nicht-essentielle Aminosäuren Biochrom
3.6 Bakterienkulturmedien
LB-Medium, pH 7
Trypton 10 g
NaCl 10 g
Hefe-Extrakt 5 g
Reinstwasser ad 1 l
Bei Bedarf wurden 20 g Agar-Agar/l Medium zugefügt. Das LB-Medium wurde autoklaviert und bei RT gelagert. Zur Herstellung von LB-Agar-Platten musste das Medium in der Mikrowelle erhitzt, im Wasserbad auf 48°C abgekühlt und in Petrischalen gegossen werden. Ampicillin wurde erst unmittelbar vor dem Gießen der Platten zugegeben (50 mg/l Medium).
3.7 Puffer und Lösungen
10 x TBE-Puffer
TRIS 108,0 g
Borsäure 53,4 g
EDTA 7,4 g
Reinstwasser ad 1 l
10 x TAE-Puffer pH 8,0
TRIS 40 mM
Natriumacetat x 3 H2O 20 mM
Reinstwasser ad 1 l
PBS pH 7,5
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
NA2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,12 g
MgCl2 x 6 H2O 0,1 g
CaCl2 x 2 H2O 0,132 g
Reinstwasser ad 1 l
PBSM pH 7,5 8 g
NaCl 0,2 g
KCl 1,15 g
NA2HPO4 0,2 g
KH2PO4 ad 1 l
Reinstwasser
PBSM 0,1% Tween
PBSM 2 l
Tween 2 ml
10 x SDS-Laufpuffer für Polyacrylamidgele
SDS 10 g
Tris 30 g
Glycin 144 g
Reinstwasser ad 1 l
Sammelgellösung für Polyacrylamidgele (5ml)
H2O 3,4 ml
Acrylamidlösung 30% 0,83 ml
1M Tris HCl, pH 6,8 0,63 ml
10% SDS (in H2O) 50 µl
10% APS (in H2O) 50 µl
TEMED 10 µl
Trenngellösung (10%) für Polyacrylamidgele(10ml)
H2O 4 ml
Acrylamidlösung 30% 3,3 ml
1M Tris HCl, pH 8,8 2,5 ml
10% SDS (in H2O) 100 µl
10% APS (in H2O) 100 µl
TEMED 16 µl
2 x SDS-Probenpuffer
Tris HCl, pH 6,8 100 mM
SDS 4%
Glycerin 20%
Bromphenolblau 0,02%
Anodenpuffer I pH 9,0
1M Tris 300 ml
Ethanol 200 ml
H2O 500 ml
Anodenpuffer II pH 7,4
1M Tris 25ml
Ethanol 200 ml
H2O 775 ml
Kathodenpuffer pH 9,0 5,25 mg
Aminocapronsäure 25 ml
1M Tris 200 ml
Ethanol 775 ml
H2O
NP40-Lysispuffer pH 7,5
Natriumdesoxycholat 0,5%
Nonidet P40 1%
Tris HCl, pH 7,5 50 mM
NaCl 150 mM
bei Bedarf: Protesae-inhibitor „Complete“ 1 Tablette
MES Puffer pH 6,5
MES 0,05 M
NaCl 0,1 M
CaCl 0,02 M
CaCl2-Puffer für chemisch kompetente Bakterien, pH 7,0
CaCl2 0,9 g
Glycerin 15 ml
Pipes 0,3 g
Reinstwasser ad 100 ml
3.8 Synthetische Oligonukleotide
Die verwendeten Oligonukleotide wurden von MWG Biotech AG in Ebersberg synthetisiert und mit einer Konzentration von 10 pmol/µl in der PCR benutzt.
Tabelle 4: Primersequenzen
Nr. Name Sequenz des Primers 5‘> 3‘
1. IBVBd.S_S(EcoRI) TTT GAA TTC ATG TTG GTA ACA CCT CTT TTA CTA CTG ACT C 2. IBVBd.S_AS(BamHI) TTT GGA TCC TCA AAC AGA CTT TTT AGG TCT GTA TTG TTC 3. IBVBd.S_501-520 ATA TTT AAA TGG TGA TCT TG
4. IBVBd.S_1001-1020 AAA CTA TTA ATA ATG GCT TG 5. IBVBd.S_1501-1520 TCT GGT GGT AAA TTA GTA GG 6. IBVBd.S_2001-2020 TAG TAA TGT TAG CAC TGG TG 7. IBVBd.S_2501-2520 AGA CTA TGG CAT CAC TTA AT 8. IBVBd.S_3001-3020 GTT ACG CTT ACT TCT TGT CA
9. IBVBd. S-8_AS TTT GGA TCC TCA TTC AGT TAC CAC ATC GTT ATC AAA AGT CGT 10. IBVBd.SAatII_S CTG CAG GAG ACG TCG TTA CGC TTA CT
11. IBVBd.SAatII_AS TAA GCG TAA CGA CGT CTC CTG CAG TA 12. IBVBd.S_2900-2920 GCC CGC TAA TGG TAG GGG TA
13. IBVBd:S_S-Tail TTT GGA TCC TCA ACC ACA CTT ACT CAT TAG AGG CAT AAT GCC 14. IBVS_Y/A_S GAA ATC TTC TGC TGC CAC GAC TTT TGA
15. IBVS_Y/A_AS AAA AGT CGT GGC AGC AGA AGA TTT CTT 16. IBV_S(Y/A)1_S GAA ATC TTC TGC TTA CAC GAC TTT T 17. IBV_S(Y/A)1_AS AGT CGT GTA AGC AGA AGA TTT CTT 18. IBV_S(Y/A)2_S ATC TTC TTA TGC CAC GAC TTT TGA T 19. IBV_S(Y/A)2_AS AAA AGT CGT GGC ATA AGA AGA TTT
20. IBV_S_S(BamHI) CGC CGC GGA TCC ATG TTG GTA ACA CCT CTT TTA CTA GTG ACT
3.9 Restriktionsendonukleasen und andere Enzyme
EcoRI Gibco BRL
BAMHI MBI Fermentas
AATII MBI Fermentas
BSRGI New England Biolabs
XhoI MBI Fermentas
T4 DNA-Ligase (5U/µl) MBI Fermentas
Pfu DNA-Polymerase rekombinant (2,5 U/µl)
MBI Fermentas
Taq Polymerase (5U/µl) MBI Fermentas
CIAP (calf intestine alkaline phosphatase. 1U/µl)
MBI Fermentas
Streptavidin-Peroxidase (HRP)- Komplex
Amersham/Pharmacia
Vibrio cholerae-Neuraminidase Dade Behring
Clostridium Perfringens-Neuraminidase Sigma Streptococcus pneumoniae-Neuraminidase Sigma
3.10 Antikörper
Anti-IBV-Beaudette aus Kaninchen Wurde selbst hergestellt Anti-IBV-M41-S mAb A38 Wurde von Dr. Dave
Cavanagh, Compton, UK zur Verfügung gestellt Anti-IBV-M41-M mAb C124 Wurde von Dr. Dave
Cavanagh, Compton, UK zur Verfügung gestellt Anti-WSN polyklonal aus Kaninchen Wurde von PD Dr. Zimmer
zur Verfügung gestellt Anti-Parainfluenza 1 aus der Ziege Acris Antibodies Anti-RSV-Fusion protein aus der Maus Serotec
Anti-Ergic p53 Wurde von
Dr. Schwegmann-Weßels zur Verfügung gestellt.
Anti-Kaninchen-Immunglobulin aus Esel, FITC-gekoppelt
Amersham/Pharmacia
Anti-Kaninchen-Immunglobulin aus Esel, biotinyliert
Amersham/Pharmacia
Anti-Maus-Immunglobulin aus Schaf, FITC-gekoppelt
Amersham/Pharmacia
Anti-Maus-Immunglobulin aus Schaf, biotinyliert
Amersham/Pharmacia
Anti-Kaninchen HRP gekoppelt DAKO Anti-Digoxigenin FITC gekoppelt Roche
Anti-Huhn FITC gekoppelt Sigma
Anti-Huhn HRP gekoppelt Sigma
Anti-Kaninchen Cy3 gekoppelt Sigma
3.11 Lektine
Sambucus nigra-Agglutinin, Digoxigenin- gekoppelt DIG Glycan differentiation kit, Roche
Maakia amurensis-Agglutinin, Digoxigenin-gekoppelt DIG Glycan differentiation kit, Roche
Peanut agglutinin, FITC-gekoppelt Sigma
3.12 DNA
IBV-Beaudette UK S-Protein-DNA Wurde von Dr. Dave Cavanagh, Compton, UK zur Verfügung gestellt
pER-EGFP-DNA Wurde von Dr. Frank van
Kuppeveld, Nijmegen University, Niederlande, zur Verfügung gestellt.
pEGFP-Golgi- DNA Wurde von Dr. Eric
Snijder, LUMC, Leiden, Niederlande zur Verfügung gestellt.
3.13 Kits
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen QIAfilter Plasmid MIDI und MAXI Kit Qiagen DIG Glycan Differentiation Kit Roche
BCA Protein Assay Pierce
3.14 Substrate
BM Chemoluminescence Blotting Substrate (POD)
Roche
Super Signal West Dura Extended Duration Substrate
Pierce
AEC-(3-Amino-9-Ethylcarbazol)
2 mg AEC auf 300 µl Dimethylformamid einwiegen.
Auf 5 ml 50 mM Natriumacetatpuffer gibt man 300 µl der Stocklösung und 150 µl H2O2.
Sigma
3.15 Transfektionsreagenzien
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen
3.16 Chemikalien
Aceton Roth Acrylamidlösung 30% „rotiphorese Gel 30“ Roth
Agar-Agar Roth Agarose Biozym Aminocapronsäure Sigma
Ampicillin Roth
Ammoniumpersulfat (APS) BIO-RAD
Blocking-Reagenz Roche
Borsäure Roth
Bovines Serum-Albumin Sigma
Calciumchlorid Roth Complete, Proteaseinhibitorcocktail Roche
1,4-Diazobicyclol [2.2.2] octane (DABCO) Sigma
Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth
Dinatriumhydrogenphosphat Roth
1,4-Dithiotreitol (DTT) Roth
dNTP MBI Fermentas
EDTA Roth Essigsäure Roth Ethanol Merck Ethidiumbromid Sigma
Gene Ruler 100 bp Leadder Plus MBI Fermentas
Glucose Roth Glycerin Roth Glycin Roth
G418 Sulfat (Geniticin) Calbiochem
Isopropanol Roth Kaliumdihydrogenphosphat Roth
Kaliumchlorid Roth Lambda DNA/ EcoR1 + Hind III, Marker 3 MBI Fermentas
Leupeptin Roche Magnesiumchlorid Roth
Magnesiumsulfat Roth 2-Mercaptoethanol Fluka
Methanol Roth Methylcellulose Sigma
Mowiol Calbiochem Natriumacetat Merck
Natriumchlorid Roth Natriumdesoxycholat Roth
Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth
Natriumdihydrogenphosphat Roth Natriumhydrogenphosphat Roth
Natriumhydroxid Roth N,N,N‘,N‘-Tetramethylendiamin (TEMED) Roth
Nonidet P40 Roche
Paraformaldehyd Fluka
Pefablock SC Roche
Penicillin / Streptomycin Gibco BRL
Pepstatin Roche Protein-A-Sepharose Sigma
Proteinmarker (Rainbow) Amersham/Pharmacia
Saccharose Roth Salzsäure Roth
Sea Plaque Agarose Biozym
Streptavidin Agarose Pierce
Sulfo-NHS-Biotin Pierce Tris-Hydroxymethylaminomethan (TRIS) Roth
Triton X 100 Roth
Tween 20 Roth
4 Methoden
4.1 Zellkulturtechnik
Alle Zellkulturen wurden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden in T75 Zellkulturflaschen (Nunc) kultiviert und zweimal pro Woche passagiert. Dazu wurden die Zellen mit PBSM gewaschen und dann mit ca. 1 ml V-Trypsin pro Flasche bei 37°C für 5-10 min inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden in 10 ml serumhaltigem Medium resuspendiert und wurden, je nach Zellart, im Verhältnis 1:5 bis 1:20 passagiert. Die übrige Zellsuspension wurde für Versuche gezählt und ausgesät.
4.1.1 Vero-Zellen
Vero-Zellen wurden in EDulb mit 5% FKS inkubiert.
4.1.2 Vero E6-Zellen
Vero E6-Zellen wurden in EDulb mit 5% FKS inkubiert.
4.1.3 BHK-21-Zellen
BHK-21-Zellen wurden in EMEM mit 3-5% FKS und 1% nicht-essentieller Aminosäuren kultiviert.
4.1.4 BSR-T7/5-Zellen
BSR-T7/5-Zellen wurden in EMEM mit 3-5% FKS und 1% nicht essentieller Aminosäuren kultiviert. Nach jedem Passagieren wurden 200 bzw. 400 µl (im Wechsel) G418 dem neuen Medium zugefügt. Geniticin diente zur Selektion der stabil T7-Polymerase exprimierenden Zellen.
4.1.5 LLC-PK1- Zellen
LLC-PK1-Zellen wurden in EDulb mit 5% FKS inkubiert.
4.1.6 CHO-Zellen
Alle CHO-Zellen wurden mit EDulb plus Ham´s F12 Medium im Verhältnis 1:1 und 5% FKS inkubiert.
4.1.7 Herstellung primärer Hühnernierenzellkulturen
19 Tage alten SPF-Hühnerembryonen wurde nach Dekapitation unter sterilen Kautelen das retroperitoneal gelegene Nierengewebe entnommen und dreimal in einem Zentrifugenröhrchen mit sterilem, kaltem PBS gewaschen. Dann wurde das Nierengewebe in einen Erlenmeyerkolben überführt und mit Versen-Trypsin ca. 10 min auf dem Magnetrührer bei 37°C verdaut. Die trübe Zellsuspension wurde in 50ml-Zentrifugenröhrchen überführt, die bereits zu einem Drittel mit serumhaltigem Medium 199 gefüllt waren. Nach dem Abzentrifugieren der Zellen bei ca. 250 x g für 10 min wurden die Zellpellets in Medium 199 resuspendiert und durch sterile Gaze oder Zellfilter (Falcon) filtriert. Die Zellen wurden dann in einer Konzentration von ca.
2 x 105 Zellen pro ml ausgesät. Hühnernierenzellen wurden in Medium 199 mit 5- 10% FKS inkubiert.
4.1.8 Anlegen von Gefrierkulturen und Auftauen von Zellen
Zur Konservierung von Zelllinien wurden Gefrierkulturen angelegt, die bei –80°C gelagert wurden. Konfluent gewachsene Zellen in einer 75 cm²-Zellkulturflasche wurden abtrypsiniert, in 9 ml Medium aufgenommen und für fünf Minuten bei 400 x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet wurde in 2,7 ml Medium + 10% FKS resuspendiert und 0,3 ml DMSO wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden in 1ml-Portionen bei –80°C eingefroren.
4.1.9 DAPI-Test
Mit dem DAPI-Test wurden die Zellkulturen regelmäßig alle zwei bis vier Wochen auf Mycoplasmen untersucht. Die Zellen wurden auf Deckgläschen dünn ausgesät und nach einigen Stunden mit PBS gewaschen, nachdem sie sich auf dem Deckgläschen abgesetzt hatten. Dann wurde 250 µl DAPI-Lösung (1:1000 in Ethanol) auf jedes Deckgläschen gegeben und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit bidest. H20 gewaschen und mit einem Tropfen Mowiol auf einen Objektträger überführt. Im Fluoreszenzmikroskop wurden die Zellen auf das Vorhandensein von Mycoplasmen untersucht.
Zusätzlich zum DAPI-Test wurden die Zellen alle zwei Monate im Mycoplasmen- ELISA der Firma Roche untersucht. Hier wurde nach Hersteller-Angaben verfahren.
Positiv auf Mycoplasmen getestete Zellen wurden entsorgt.
4.2 Virusanzucht
4.2.1 IBV-Beaudette
Im Gegensatz zu den meisten anderen IBV-Stämmen lässt sich der Beaudette- Stamm auf permanenten Zelllinien vermehren. Dazu wurden Vero-Zellen in eine T125 Zellkulturflasche ausgesät und am nächsten Tag mit IBV-Beaudette infiziert.
Zunächst wurden die Zellen mit PBS oder serumfreiem Medium gewaschen; dann wurde das Inokulum, 5 ml serumfreies Medium mit ca. 104 –105 PFU, auf die Zellen gegeben und für eine Stunde bei 37°C auf einem Schwenker inkubiert.
Anschließend wurde das virushaltige Medium abgenommen und durch 30 ml serumfreies Medium ersetzt. Die infizierten Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2
inkubiert und es wurde im Abstand von ca. 12 Stunden der ZPE kontrolliert. In der Regel wurde bereits nach 24 Stunden geerntet. Zu diesem Zeitpunkt waren im Mikroskop großflächige Syncytien sichtbar, wobei sich der größte Teil der Zellen noch nicht abgelöst hatte. Der Überstand wurde abgenommen und bei 2500 x g und 4°C zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der klare Überstand wurde in 1ml
Portionen aliquotiert und zunächst in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei –80°C gelagert.
4.2.2 IBV-M41
Der M41-Stamm lässt sich nicht auf permanenten Zellen vermehren. Deshalb wurden zur Anzucht embryonierte Bruteier verwendet. Die SPF-Hühnereier (VALO SPF) wurden zehn Tage bei 37°C vorbebrütet und geschiert und abgestorbene bzw.
unbefruchtete Eier aussortiert. Zur Infektion wurden die Eier oberflächlich mit Bacillol desinfiziert und es wurde mit einer weitlumigen Kanüle ein Loch in den stumpfen Pol des Eis gestanzt. Je 0,1 ml der in PBS verdünnten Virussuspension wurde mittels Spritze und Kanüle in die Allantoishöhle injiziert. Die Einstichstelle wurde anschließend mit Alleskleber verschlossen und die infizierten Eier wurden bei 37°C im Eiinkubator bebrütet. Nach 24 Stunden erfolgte ein erstes Schieren der Eier und bereits abgestorbene Eier wurden bei 4°C gelagert, um einen Titerverlust zu vermeiden. Nach 48 Stunden wurden die restlichen Eier kalt gestellt. Nach weiteren fünf Stunden waren die Embryonen abgestorben und es konnte mit der Ernte begonnen werden. Dazu wurden die Eier oberflächlich desinfiziert und mit einer Pinzette eröffnet. Die Ernte erfolgte unter einer sterilen Werkbank. Die klare Allantoisflüssigkeit wurde mit einer Pipette abgesaugt und anschließend auf Eis gelagert. Um grobe Bestandteile zu entfernen, wurde bei 2750 x g und 4°C zentrifugiert. Die Allantoisflüssigkeit wurde danach aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.
4.2.3 Sendai-Virus
Das in dieser Arbeit verwendete Sendai-Virus wurde von Dr. Schwegmann-Wessels vermehrt.
4.2.4 BRSV
Das in dieser Arbeit verwendete BRS Virus wurde von Frau Dr. Köhl vermehrt und titriert.
4.2.5 Influenza A
Da der porcine Influenza-Stamm A/sw/Bakum/909/93(H3N2) sich auf Schweinezellen vermehren lässt, wurden LLCPK1-Zellen in eine T125 Zellkulturflasche ausgesät und am nächsten Tag mit dem o.g. Influenzavirus-Stamm infiziert. Zunächst wurden die Zellen zweimal mit PBS oder serumfreiem Medium gewaschen; dann wurde das Inokulum, 5 ml virushaltiges Medium, auf die Zellen gegeben und für eine Stunde bei 37°C auf einem Schwenker inkubiert. Dem Medium wurde acetyliertes Trypsin hinzugesetzt. Anschließend wurde das virushaltige Medium abgenommen und durch 30 ml serumfreies Medium ersetzt, welches ebenfalls acetyliertes Trypsin enthielt (1 mg pro ml). Die infizierten Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und es wurde im Abstand von ca. 24 Stunden der ZPE kontrolliert. In der Regel wurde nach 48 Stunden geerntet, zu diesem Zeitpunkt war im Mikroskop ein deutlicher ZPE sichtbar. Der Überstand wurde abgenommen und bei 2500 x g und 4°C zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der klare Überstand wurde in 1ml-Portionen aliquotiert und zunächst in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei –80°C gelagert.
4.3 Methoden zur Virustiterbestimmung
4.3.1 KID50-Bestimmung für IBV-Beaudette
Bei dieser Methode erfolgt die Messung der infektiösen Einheiten der Virussuspension über das Anlegen einer Verdünnungsreihe in Schritten von 10 (ganzzahlig logarithmische Verdünnungsreihe zur Basis 10), die in mindestens 4 Probanden pro Verdünnungsstufe auf eine “Alles oder nichts Reaktion“ getestet wird.
Es handelt sich also um eine Endpunkt-Verdünnungsmethode. Dazu wurden Vero- Zellen in eine Mikrotiterplatte ausgesät und am nächsten Tag wurden die IBV Beaudette Verdünnungsstufen, 200 µl pro Vertiefung, auf die Zellen gegeben und bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach vier Tagen wurde die Titration abgelesen. Hierbei
wurden die Vertiefungen gezählt, in denen der Zellrasen vollständig zerstört war. Der Virustiter wurde mit der Titer-Kalkulation nach Kärber berechnet:
Log VD50 = L1,0 – Lint (S – 0,5)
4.3.2 Plaquetest für IBV-Beaudette
Der Plaquetest dient zur Quantifizierung infektiöser Viruspartikel in einer Suspension.
Die Ausbreitung von Viren durch Diffusion wird durch Überschichtung der Zellen mit halbfestem Agarmediumgemisch bzw. Methylcellulose verhindert, so dass sich die Viren nur von Zelle zu Zelle ausbreiten können. Im Zellrasen entsteht ein „Plaque“, welcher von den virusinfizierten Zellen gebildet wird. Diese Plaques kann man durch Färbung sichtbar machen. Der Virustiter wird in „plaque forming units“ pro ml (pfu/ml) angegeben.
Vero-Zellen wurden in einer Mikrotiterplatte (Costar) ausgesät (2,5 x 105 Zellen/ml, 0,1 ml pro Vertiefung), so dass am nächsten Tag der Boden der Vertiefungen mit einem konfluenten Monolayer bedeckt war. Dann wurden von der zu testenden Virussuspension zwei parallele Verdünnungsreihen (ganzzahlig logarithmische Verdünnungsreihe zur Basis 10) angelegt. Nachdem die Zellen mit Medium oder PBS gewaschen worden waren, wurden je 50 µl der Verdünnungsstufen auf die Vertiefungen gegeben. Auf je eine Vertiefung pro Titrationsreihe wurden 50 µl virusfreies Medium gegeben; diese diente als Negativkontrolle. Nach einer Inkubation bei 37°C auf dem Schwenker für eine Stunde wurden je 200 µl Methylcellulose in EDulb + 2% FKS als Überschichtungsmedium auf jede Vertiefung gegeben. Nach 24 Stunden wurde die Methylcellulose von der Mikrotiterplatte abgenommen und die Platte zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 0,1 ml Paraformaldehyd für 20 min fixiert, gefolgt von einem Wasch- und Inkubationsschritt mit 0,1M PBS-Glycin für 15 min. Die Zellen wurden für 5 min mit 0,2% PBS-Triton-X- 100 permeabilisiert. Um die Plaques zu quantifizieren, wurde das Virusantigen jeder Vertiefung mit 50 µl Anti IBV Beaudette Serum (1:200 verdünnt) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei gründlichen Waschschritten wurde als Zweitantikörper FITC-gekoppelter Anti-Kaninchen-Antikörper, ebenfalls 1:200 verdünnt, in je 50µl-Portionen auf die Zellen gegeben und für eine Stunde bei
Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach drei gründlichen Waschritten konnten die Plaques unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgezählt werden.
4.3.3 Plaquetest für Sendai-Virus
Vero-Zellen wurden in einer Mikrotiterplatte (Costar) ausgesät (2,5 x 105 Zellen/ml, 0,1 ml pro Vertiefung), so dass sich am folgenden Tag ein konfluenter Zellrasen gebildet hatte. Nach Herstellung zweier Virusverdünnungsreihen in 10er-Schritten (ganzzahlig logarithmische Verdünnungsreihe zur Basis 10) mit serumfreiem Medium, das acetyliertes Trypsin (1 mg pro ml) enthielt, wurde das Kulturmedium abgenommen und die Zellen mit Medium oder PBS gewaschen. Von jeder Verdünnungsstufe wurden 40µl auf je zwei Vertiefungen gegeben, also vier Titrationsreihen/Probe. Auf je eine Vertiefung pro Titrationsreihe wurden nur 40 µl virusfreies Medium gegeben; diese diente als Negativkontrolle. Die Mikrotiterplatte wurde für 60 Minuten im Brutschrank auf dem Schwenker inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 0,2 ml Methylcellulose in EDulb + 2% FKS als Überschichtungsmedium in jede Vertiefung. Die Mikrotiterplatten wurden für 24 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Die Methylcellulose wurde von der Mikrotiterplatte abgenommen und die Platte zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 0,1 ml Paraformaldehyd für 20 min fixiert, gefolgt von einem Wasch- und Inkubationsschritt mit 0,1M PBS-Glycin für 15 min. Die Zellen wurden für 5 min mit 0,2% PBS-Triton-X- 100 permeabilisiert. Virusantigen wurde mit 50 µl des Anti-Parainfluenza-Virus Serums (1:500 verdünnt) detektiert, wobei die Inkubation für 60 min erfolgte. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden als Zweitantikörper je 50µl eines Peroxidase- gekoppelten Anti-Ziege-Antikörpers (1:500 mit PBS verdünnt) verwendet. Nach einer weiteren Inkubationsperiode von einer Stunde wurden die Zellen dreimal gewaschen und mit 0,1 ml AEC-Substrat pro Vertiefung für 10 min gefärbt. Beim letzten Waschschritt wurde Wasser verwendet und anschließend konnten die rötlich angefärbten Plaques unter dem Lichtmikroskop ausgezählt werden.
