4.6.1 Immunfluoreszenztest
Der Immunfluoreszenztest wurde verwendet, um Antigen in transfizierten und infizierten Zellen sichtbar zu machen. Um ein Ablösen der auf Deckgläschen ausgesäten Zellen in den einzelnen Arbeitsschritten zu verhindern, wurden die Zellen zunächst fixiert. Hierzu wurde 3% Paraformaldehyd verwendet, welches die Zellmembranen bei der Fixation intakt lässt, so dass es möglich ist Proteine, die sich auf der Zelloberfläche befinden, zu färben, während intrazelluläre Proteine von den Antikörpern nicht erreicht werden. Nach dem 20-minütigen Fixieren der Zellen bei Raumtemperatur wurden die Zellen einmal mit 0,1 M Glycinlösung gewaschen und anschließend 5 Minuten mit 0,1 M Glycinlösung inkubiert. Dieser Schritt diente dazu, überschüssiges Paraformaldehyd zu binden und zu entfernen. Sollten auch die intrazellulären Proteine gefärbt werden, mussten die Zellen vor der Antikörperinkubation permeabilisiert werden. Dies geschah mit 0,2 % Triton-X-100, das für fünf Minuten auf den Zellen belassen wurde. Der erste Antikörper wurde in 1% BSA verdünnt hiervon je 30 µl pro Deckgläschen wurden auf Parafilm in einer feuchten Kammer pipettiert. Die Deckgläschen mit den Zellen wurden dann mit der Zellseite nach unten auf die Antikörper-Tropfen gelegt. Die Inkubation erfolgte eine Stunde bei Raumtemperatur. Zum Waschen wurden die Deckgläschen wieder in die 24 Napf-Platte überführt, wobei die Zellseite nach oben zeigte. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Deckgläschen wieder in die feuchte Kammer überführt, wobei nun der Sekundär-Antikörper in 1% BSA verdünnt in Tropfen auf Parafilm pipettiert wurde. Die Inkubation dauerte auch hier eine Stunde, erfolgte aber im Dunkeln, um ein Ausbleichen des Konjugates zu verhindern. Nach gründlichem Waschen mit PBS und bidest. H2O (um Salze zu entfernen) wurden die
Deckgläschen mit Mowiol auf einem Objektträger eingebettet. Die Betrachtung erfolgte in einem Zeiss Axioplan 2-Fluoreszenzmikroskop.
4.6.2 Antikörper Uptake assay
Um eine Endozytose von viralem Protein sichtbar zu machen, kann man sich die Technik der Immunfluoreszenz (4.6.1) im Antikörper Uptake assay zu Nutze machen.
BSRT7/5-Zellen wurden auf Deckgläschen ausgesät und am folgenden Tag mit der entsprechenden S-Protein-DNA transfiziert (4.5). Nach 12 Stunden Inkubation wurden die Zellen vorsichtig mit PBS gewaschen und mit 100 µl Anti-Beaudette-Serum (in Medium 1:200verdünnt) je Ansatz für eine Stunde auf Eis inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die Zellen mit serumfreiem Medium überschichtet und je ein Ansatz pro Konstrukt wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Ein weiterer Ansatz pro Konstrukt wurde auf Eis belassen und diente als Kontrolle. Nach dreimaligem Waschen wurde der erste Sekundärantikörper (Cy3-gekoppelter Anti-Kaninchenantikörper) 1:200 verdünnt in je 100 µl auf die Vertiefungen gegeben. Mit diesem Antikörper wurden die Zellen wieder eine Stunde auf Eis inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die Zellen mit Methanol Aceton fixiert und anschließend mit dem zweiten Sekundär-Antikörper (FITC-gekoppeltem Anti-Kaninchen-Antikörper) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das endozytierte bzw. an der Oberfläche verbliebene Virusantigen wurde im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.
4.6.3 Kolokalisation des S-Proteins mit Markerproteinen
Um eine Kolokalisation des S-Proteins mit Markerproteinen nachzuweisen, wurden BHK-21-Zellen bzw. BSRT7/5-Zellen mit der S-Protein-DNA und gleichzeitig mit der DNA transfiziert (4.5), die zur Expression eines ER- oder Golgi-Marker-Proteins führte. Nach 24 Stunden wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Das S-Protein wurde mit dem monoklonalen A38 Antikörper und Rhodamin Red X-gekoppeltem Anti-Maus-Antikörper gefärbt. Da die Markerproteine für ER und Golgi-Apparat GFP-gekoppelt waren, mussten diese nicht angefärbt werden. Die Zellen wurden im Fluoreszenzmikroskop untersucht und die Lokalisation von S-Protein und
Markerproteinen wurden einzeln fotografiert. Um eine Kolokalisation mit dem ERGIC p53 Protein zu zeigen, wurden die Zellen mit der S-Protein-DNA transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Das S-Protein wurde mit Anti-Beaudette Serum und FITC gekoppeltem Anti-Kaninchen-Antikörper nachgewiesen.
Das ERGIC-p53-Protein wurde mit dem Anti-p53-Antikörper und Rhodamin Red X gekoppeltem Ani-Maus-Antikörper gefärbt. Auch hier wurden die nachgwiesenen Proteine getrennt voneinander mittels Fluoreszenzmikroskopie fotografiert. Um eine potentielle Kolokalisation des S-Proteins mit den Markerproteinen zu zeigen, wurden die Bilder identischer Zellen, die jeweils beide zu untersuchenden Proteine exprimierten, mit Hilfe des Programms COREL PHOTO PAINT übereinandergelagert.
4.6.4 Lysieren von transfizierten Zellen
Um die Expression von Proteinen in transfizierten Zellen nachzuweisen, wurden diese 12-24 Stunden nach Transfektion zunächst dreimal mit kaltem PBS gewaschen. Dann wurden je 2 ml PBS pro Vertiefung auf die Zellen gegeben und die Zellen mit einem Zellschaber von der Oberfläche abgelöst. Die Zellen von je zwei Vertiefungen (Doppelansatz) wurden in ein 10 ml Röhrchen überführt. Die Zellen wurden bei 3500 x g für fünf Minuten bei 4 °C pelletiert. Das Pellet wurde dann in je 100 µl NP-40-Lysis Puffer mit Proteaseinhibitoren resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis lysiert. Um Zelltrümmer zu entfernen, wurde das Lysat 30 Minuten bei 20000 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand konnte in der SDS-PAGE aufgetrennt werden oder wurde bei –20 °C eingefroren.
4.6.5 Oberflächenbiotinylierung mit anschließender Präzipitation
Um zu bestimmen, ob ein Protein auf der Zelloberfläche exprimiert wird, wurden die Proteine auf der Zellmembran mit Sulfo-NHS-Biotin markiert. Dazu wurden mit den S-Protein-Konstrukten transfizierte Zellen nach 12 Stunden zunächst mit PBS gewaschen und dann mit 0,5 mg/ml Sulfo-NHS- Biotin für 20 Minuten bei 4 °C auf dem Schwenker inkubiert. Zur Inaktivierung des überschüssigen Biotins wurden die Zellen anschließend mit 0,1 M Glycinlösung gewaschen und mit dieser 15 Minuten
auf Eis inkubiert. Nun erfolgte die Lyse der Zellen. Dazu wurden die Zellen mit je 250 µl NP40-Lysis-Puffer plus Protease-Inhibitoren (Complete®) pro Vertiefung für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Lysate wurden in 1,5 ml Gefäße mit der Pipette überführt. Durch Zentrifugation bei 20000 x g bei 4°C für 30 Minuten wurden die Zelltrümmer aus dem Überstand entfernt. Zum Präzipitieren der Oberflächenproteine wurde je 50 µl gewaschene Streptavidinagarose (Pierce) in ein neues 1,5 ml Gefäß gegeben und der Überstand hinzugefügt. Während der Präzipitation über Nacht bei 4°C auf dem Schüttler banden die biotinylierten Oberflächenproteine an das an die Agarose gekoppelte Streptavidin. Nach dreimaligem Waschen mit NP-40-Lysis Puffer durch wiederholtes Abzentrifugieren der Agarose bei 20000 x g wurden die Proteine von der Agarose durch Erhitzen in 50 µl Probenpuffer auf 96°C für zehn Minuten abgekocht. Die Agarose wurde durch Abzentrifugieren bei 20000 x g für fünf Minuten pelletiert und der Überstand konnte nun über SDS PAGE aufgetrennt werden oder wurde bei –20 °C eingefroren.
4.6.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Um Proteine nach ihrer molekularen Masse aufzutrennen, wurde die diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese verwendet.
(LAEMMLI, 1970). Es wurden entweder selbst gegossene Gele oder Novex precast gels der Firma Invitrogen verwendet. Die 50 x 80 x 0,75 mm großen Trenngele hatten eine Acrylamidkonzentration von 8-10%. Die Auftrennung der Proteine erfolgte bei 80-100 Volt in Miniproteingelkammern der Firma Keutz bzw. Invitrogen, bis der Farbstoff des SDS-Probenpuffers aus dem Gel herausgelaufen war. Als Vergleichsproteine wurden Rainbowmarker von Amersham, Protein precision marker plus von Biorad und Page Ruler Marker von Fermentas benutzt.
4.6.7 Western Blot
Um die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran zu übertragen, wurde das Semi Dry Blot-Verfahren (KYHSE-ANDERSEN, 1984) verwendet. Zwischen die Graphit Elektroden der Blotkammer (Firma Keutz) wurden
das Gel und die Nitrocellulosemembran zwischen in Puffern getränkten Filterpapieren folgendermaßen angeordnet:
sechs Blatt Filterpapier getränkt in Anodenpuffer I, drei Blatt Filterpapier, getränkt in Anodenpuffer II, Nitrocellulose getränkt in bidest. H2O, Trenngel und neun Blatt Filterpapier, getränkt in Kathodenpuffer. Der Transfer erfolgte für 60 min bei einer Stromstärke von 0,8 mA/cm². Um freie Bindungsstellen abzusättigen wurde die Membran über Nacht bei 4°C mit Blockingreagent (0,5g auf 100 ml PBSM, Firma Roche) inkubiert.
4.6.8 Immunchemische Detektion von Proteinen
Die auf der Nitrocellulosemembran immobilisierten Proteine wurden mit einem indirekten immunologischen Nachweis mit spezifischen Antikörpern detektiert. Dazu wurde die Membran dreimal zehn Minuten mit PBSM-0,1% Tween gewaschen. Das Detergenz sorgte für eine gewisse Renaturierung der Proteine. Dann wurde 1 ml des ersten Antikörpers Anti-Beaudette-Kaninchen (1:200 verdünnt in PBSM) in einem dünnen Film auf die Membran gegeben und mit einem Streifen Parafilm überdeckt.
Die Inkubation erfolgte eine Stunde bei 4 °C. Um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, wurde erneut dreimal zehn Minuten mit PBS 0,1% Tween gewaschen. Als Zweitantikörper wurde Peroxidase-gekoppelter Anti-Kaninchen-Antikörper (1:1000 verdünnt) in 10 ml auf die Membran gegeben und bei 4°C für eine Stunde leicht geschwenkt. Nach erneutem Waschen wurde die an die Proteine gebundene Peroxidase durch Substratzugabe (Supersignal) im Chemiimager (BIO-RAD) sichtbar gemacht.