Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler Spongiformer Enzephalopathien der Ziege
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Susanne Freyse
Karlsburg
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Martin H. Groschup
Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger, Friedrich-Loeffler-Institut Insel Riems
1. Gutachter: Prof. Dr. Martin H. Groschup
2. Gutachter: Prof. Dr. Martin Ganter
Tag der mündlichen Prüfung: 17. April 2012
Diese Arbeit wurde im Rahmen eines von der Europäischen Union geförderten Forschungs- projektes durchgeführt.
Meiner lieben Familie
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZU&GSVERZEICH&IS... VII ABBILDU&GSVERZEICH&IS ...XI TABELLE&VERZEICH&IS ... XII
1 EI&LEITU&G... 1
2 LITERATURÜBERSICHT... 2
2.1 Das Prion-Protein ... 2
2.1.1 Das Prion-Gen... 2
2.1.2 Das zelluläre Prion-Protein ... 2
2.1.3 Die pathologische Isoform des Prion-Proteins... 3
2.1.4 Prionenmodelle ... 3
2.1.5 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien im Überblick ... 4
2.2 Stammcharakterisierung der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien .. 5
2.2.1 Die Inkubationszeit und der Einfluss der Speziesbarriere ... 6
2.2.2 Die Bedeutung proteinbiochemischer Parameter... 6
2.2.2.1 Das Glykosylierungsverhältnis und die molekulare Masse ... 7
2.2.2.2 Die Immunoreaktivität des pathologischen Prion-Proteins... 8
2.2.2.3 Die Proteinase K-Stabilität des pathologischen Prion-Proteins ... 8
2.3 Scrapie bei Schaf und Ziege... 9
2.3.1 Das klinische Bild ... 9
2.3.2 Der Einfluss des Genotyps des Prion-Gens ... 10
2.3.2.1 Das Prion-Gen des Schafs ... 10
2.3.2.2 Das Prion-Gen der Ziege ... 11
2.3.3 Übertragungswege der Scrapie bei Schaf und Ziege ... 12
2.3.4 Die Pathogenese der Scrapie... 14
2.3.4.1 Die Pathogenese der Scrapie im Schaf... 14
2.3.4.2 Die Pathogenese der Scrapie in der Ziege... 15
2.3.5 Möglichkeiten der prämortalen Diagnostik von Scrapie bei Schaf und Ziege ... 15
2.4 Die Histopathologie von Scrapie ... 16
2.5 Scrapie in der Immunhistochemie ... 17
2.6 Atypische Scrapie bei Schaf und Ziege... 18
2.7 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder ... 20
2.7.1 Die Histopathologie der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie der Rinder ... 20
2.8 Die atypische Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder ... 21
2.9 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie bei Schaf und Ziege ... 21
2.10 Die Diagnostik von Boviner Spongiformer Enzephalopathie und Scrapie ... 23
2.11 Zusammenfassende Darstellung... 25
3 TIERE, MATERIAL U&D METHODE& ... 26
3.1 Tiere ... 26
3.1.1 Damaskusziegen aus Zypern... 26
3.1.1.1 Voruntersuchungen ... 26
3.1.2 Ziegen der BSE-Pathogenesestudie ... 28
3.2 Versuchsablauf ... 30
3.2.1 Sektion der Damaskusziegen aus Zypern ... 30
3.2.2 Untersuchungen an Proben der Damaskusziegen ... 30
3.2.3 Die BSE-Pathogenesestudie... 31
3.2.3.1 Tierhaltung ... 34
3.2.3.2 Inokulat... 34
3.2.3.3 Inokulation... 34
3.2.3.4 Kontrolltiere ... 35
3.2.3.5 Entnahme von Tonsillen- und Rektumbioptaten... 35
3.2.3.6 Entnahme von Blutproben... 36
3.2.3.7 Nachzucht ... 36
3.2.3.8 Sektion... 37
3.2.3.9 Untersuchung des in den Sektionen entnommenen Probenmaterials... 39
3.2.3.10 Schnelltestdiagnostik... 40
3.3 Histologische Methoden ... 40
3.3.1 Herstellung der histologischen Präparate... 40
3.3.1.1 Die serielle Schnitttechnik... 41
3.3.2 Lichtmikroskopische Untersuchung ... 42
3.3.3 Auswertung der mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitte ... 42
3.3.4 Immunhistochemische Methoden ... 43
3.3.4.1 Immunhistochemische Färbungen... 43
3.3.4.2 Auswertung der immunhistologischen Präparate... 43
3.4 Proteinbiochemische Methoden ... 44
3.4.1 Herstellung von Gehirnhomogenaten ... 44
3.4.2 Fällung mit Phosphorwolframsäure ... 44
3.4.3 Methanolfällung ... 45
3.4.4 Proteinauftrennung mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese ... 46
3.4.5 Westernblot und Immunochemie ... 46
3.4.5.1 Bestimmung des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen Masse... 47
3.4.5.2 Bestimmung der Antikörperbindungsverhältnisse ... 47
3.4.5.3 Der diskriminatorische FLI-Immunoblot ... 48
3.4.6 Langzeit-Proteinase K-Resistenz von PrPSc... 49
3.5 Kontrollen und Referenzmaterial ... 50
3.6 Statistische Analyse ... 50
4 ERGEB&ISSE... 51
4.1 Caprine Isolate der Ziegen aus Zypern ... 51
4.1.1 Ergebnisse der Voruntersuchungen ... 51
4.1.1.1 Ergänzende Daten zu den Ziegen mit PrPSc-reaktivem Schnelltestbefund ... 51
4.1.1.2 Ergänzende Daten zu den Ziegen mit PrPSc-negativem Schnelltestbefund ... 51
4.1.2 Biochemische Charakterisierung (FLI-Test) der caprinen Isolate aus Zypern ... 53
4.1.2.1 Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse ... 53
4.1.2.2 Bestimmung der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc... 53
4.1.2.3 Bestimmung des Antikörperbindungsverhältnisses ... 55
4.1.2.4 Differenzierung zwischen Scrapie und Boviner spongiformer Enzephalopathie mittels FLI-Test ... 57
4.1.3 Bestimmung der Langzeit-Proteinase K-Resistenz... 58
4.1.4 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen... 60
4.1.4.1 Histopathologische Auswertung der Obexregion... 60
4.1.4.2 Immunhistochemische Auswertung der Obexregion ... 62
4.1.4.3 Immunhistochemische Auswertung ausgewählter Gewebe ... 65
4.1.5 Statistische Betrachtung aufgetretener Polymorphismen des Prion-Gens ... 68
4.2 Pathogenesestudie Bovine Spongiforme Enzephalopathie in der Ziege... 70
4.2.1 Untersuchung der Tonsillen- und Rektumbioptate ... 70
4.2.2 Ergebnisse der Sektionen ausgewählter Tiere 6 bis 14 Monate post inoculationem . 70 4.2.2.1 Ergebnisse des Schnelltests und der proteinbiochemischen Untersuchungen ... 72
4.2.2.2 Ergebnisse immunhistochemischer Untersuchungen ... 72
4.2.3 Ergebnisse der Sektionen ausgewählter Tiere 24 und 25 Monate post inoculationem... 74
4.2.3.1 Klinik der 24 und 25 Monate post inoculationem sezierten Tiere ... 74
4.2.3.2 Ergebnisse des Schnelltests und der proteinbiochemischen Untersuchungen ... 75
4.2.3.3 Histopathologische Ergebnisse - Auswertung der Obexregion... 78
4.2.3.4 Immunhistochemischer PrPSc-Nachweis – Auswertung der Obexregion ... 78
4.2.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung der Nachgeburtsproben ... 80
5 DISKUSSIO& ... 81
5.1 Ziel der Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler Spongiformer Enzephalopathien der Ziege ... 81
5.2 Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate aus Zypern... 81
5.2.1 Der Einfluss des Prion-Gen-Genotyps ... 83
5.2.2 Proteinbiochemische Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate ... 85
5.2.2.1 Differenzierung der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie von Scrapie mittels FLI-Test ... 85
5.2.2.2 Langzeit Proteinase K-Verdau ... 86
5.2.3 Histologische Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate ... 87
5.2.3.1 Histopathologische und immunhistologische Veränderungen in der Obexregion 87 5.2.3.2 Immunhistologische Bewertung ausgewählter Gewebe... 87
5.3 Die Pathogenesestudie zur Bovinen Spongiformen Enzephalopathie der Ziegen 90 5.3.1 Erkenntnisse zur Inkubationszeit, Klinik und Dauer der Klinik ... 91
5.3.2 Einfluss des Prion-Gen-Genotyps auf die BSE-Erkrankung bei Ziegen ... 92
5.3.3 Pathogenese der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie bei Ziegen... 93
5.3.4 Biopsien als prämortale Diagnostikmöglichkeit ... 94
5.3.5 Übertragung der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie über die Plazenta... 95
5.3.6 Die Obexregion in der Diagnostik ... 96
5.3.6.1 Histopathologie und Immunhistologie ... 96
5.3.6.2 Immunoblot (FLI-Test) ... 96
5.4 Kritische Beurteilung zur Bewertung des Untersuchungsmaterials und der Untersuchungsmethoden ... 96
5.4.1 Bewertung der proteinbiochemischen Methoden ... 97
5.4.2 Bewertung der immunhistochemischen Methoden... 98
6 ZUSAMME&FASSU&G... 100
7 SUMMARY... 102
8 LITERATURVERZEICH&IS ... 104
8.1 Gesetze und Verordnungen ... 130
9 A&HA&G ... 132
9.1 Material ... 132
9.1.1 Antikörper gegen das Prion-Protein... 132
9.1.1.1 Konjugate ... 132
9.1.1.2 Vorbehandlung für die in der Immunhistologie verwendeten Antikörper ... 133
9.2 Histologische Methoden ... 133
9.2.1 Protokolle ... 133
9.2.1.1 Gewebeinfiltrationsautomat, Standardprotokoll ... 133
9.2.1.2 Entparaffinisierung und Rehydrierung der histologischen Schnitte... 133
9.2.1.3 Dehydrierung der histologischen Schnitte ... 134
9.3 Schemata zur Auswertung von histologisch untersuchten Schnitten ... 134
9.4 Tabellarische Übersichten über die in den Sektionen entnommenen Proben .... 135
9.5 Protokolle zur Fraktionierung der in der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Blut- und Milchproben... 138
9.5.1 Protokoll zur Fraktionierung von caprinem Citrat-Vollblut ... 138
9.5.2 Protokoll zur Verarbeitung von Serumproben ... 139
9.5.3 Protokoll zur Fraktionierung von capriner Vollmilch... 139
9.6 Ergebnistabellen ... 140
9.6.1 Damaskusziegen aus Zypern... 140
9.6.1.1 Ergebnisse des FLI-Tests ... 140
9.6.1.2 Ergebnisse des Langzeit Proteinase K-Verdaus ... 141
9.7 Puffer und Lösungen... 142
9.8 Rezepte... 147
9.9 Arzneimittel... 148
9.10 Chemikalien ... 148
9.11 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 150
Abkürzungsverzeichnis
A Ampère
Abb. Abbildung
A. bidest. Aqua bidestillata
AE arbiträre Einheiten
AK Antikörper
AS Aminosäuren
BFAV Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere
bov bovine
BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CJK Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
CO2 Kohlendioxid
C-terminal Carboxy-terminal
DAB Diaminobenzidin
DM&V Nucleus parasympathicus nervi vagi, dorsal motor nucleus of the vagus E&S enterisches Nervensystem
EU Europäische Union
Fa. Firma
FLI Friedrich-Loeffler-Institut
g gravitation
GALT gut-associated lymphoid tissue, darmassoziiertes lymphatisches Gewe- be
Ggl. Ganglion
gr. Gramm
GSS-Syndrom Gerstmann-Sträussler-Scheincker-Syndrom
h Stunde(n)
H Histidin
H.-E. Hämatoxylin-Eosin
I Isoleucin
IAH Institute for Animal Health, Edinburgh, United Kingdom
IgG Immunglobulin G
IHC Immunhistochemie
i. m. intramuskulär
I&RA Institut National de la Recherche Agronomique, Tours bzw. Toulouse, France
i. v. intravenös
IVS Institute of Veterinary Services, Nicosia, Cyprus
K Lysin
Kap. Kapitel
kDa Kilo-Dalton
k. P. kein Probenmaterial
Ln. Lymphonodus
Ln. retroph. Lymphonodus retropharyngealis medialis
Lnn. Lymphonodi
LRS lymphoretikuläres System
M molar
M. Musculus
MAK monoklonaler Antikörper
MDT Magen-Darm-Trakt
Met Methionin
min Minute(n)
MM molekulare Masse
Mon. p. i. Monate post inoculationem
&. Nervus
&aOH Natriumhydroxid, Natronlauge
&BF neutral buffered formalin, neutral-gepuffertes Formalin
&cl./&cll. Nucleus/Nuclei
&RL Nationales Referenzlabor
&-terminal Amino-terminal
O.I.E. Office International des Epizooties ORF open reading frame, offener Leserahmen
P Prolin
p Signifikanzwert
p. a. pro analysi
p. i. post inoculationem
PK Proteinase K
PMCA protein misfolding cyclic amplification P&S peripheres Nervensystem
p. part. post partum
PP Peyer` Platte(n)
PR&P Prion-Gen
prox. proximal
PrP Prion-Protein
PrPc zelluläres Prion-Protein PrPSc pathologisches Prion-Protein
PTA phosphotungic acid, Phosphorwolframsäure PVDF-Membran Polyvinylidenfluorid-Membran
Q Glutamin
R Arginin
RAMALT recto-anal mucosa associated lymphoid tissue, lymphatisches Gewebe der rektoanalen Schleimhaut
rER raues endoplasmatisches Retikulum rpm revolutions per minute
RT Raumtemperatur
S Serin
s. S. siehe Seite
SDS sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
sec Sekunde(n)
shp sheep
s. o. siehe oben
sog. so genannte
Tab. Tabelle
TBS Tris-buffered-saline, Tris-gepufferte Salzlösung TME Transmissible Mink Enzephalopathie
TRI-PLOT triangular diagram plotting spreadsheet
TSE/n Transmissible Spongiforme Enzephalopathie/n
u. und
u. a. unter anderem
usw. und so weiter
u. v. m. und vielem mehr
V Volt
v. a. vor allem
vCJK Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
vgl. vergleiche
w/v weight-volume ratio
z. Bsp. zum Beispiel
Z&S Zentrales Nervensystem
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Modell zur protein-only-Theorie von Prusiner…...4
Abb. 2 Schematische Darstellung des PrPSc von Scrapie… ...9
Abb. 3 Spongiforme Veränderungen des Neuropils und Vakuolisierung… ...17
Abb. 4 Scrapiefälle (cases) bei Ziegen von 2002… ...24
Abb. 5 Schematische Darstellung der an den Proben…...31
Abb. 6 Zeitlicher Ablauf der BSE-Pathogenesestudie………..…..………...…...33
Abb. 7 Schematische Darstellung der Entnahmeorte von Proben…...40
Abb. 8 Schema zur seriellen Schnitttechnik der Proben… ...42
Abb. 9 Altersstruktur der Damaskusziegen aus Zypern mit…...52
Abb. 10 Vergleichende Darstellung der Glykosylierungsmuster der 25…...54
Abb. 11 Vergleich des Quotienten der Signalintensiät des……….………56
Abb. 12 Standorte der Herden (A-Q) der Zypernziegen… ...58
Abb. 13 Darstellung der Stabilität von PrPSc nach… ...59
Abb. 14 Vergleichende Darstellung der Proteinase K-Resistenz des PrPSc… ...60
Abb. 15 Schematische Abbildung eines Querschnitts durch den…...61
Abb. 16 Graduelle Ausprägung vakuolärer Veränderungen in den… ...63
Abb. 17 Graduelle Ausprägung der PrPSc-Ablagerungen in den… ...64
Abb. 18 Befunde der Ziege ZYP 40: PrPSc-Ablagerungen… ...67
Abb. 19 Scrapie-positive Ziege ZYP 27: geringgradige, feinkörnig…...67
Abb. 20 ZYP 24 (Obexbefund PrPSc-negativ): feinkörnige bis… ...68
Abb. 21 Einzelbefund geringgradiger, fein- bis grobkörniger PrPSc-Ablagerungen…..72
Abb. 22 Einzelbefund geringgradiger, fein- bis grobkörniger PrPSc-Ablagerungen…..73
Abb. 23 Immunoblot zur Bestimmung des Glykosylierungsmusters, der…...77
Abb. 24 Vergleichende Darstellung der Glykosylierungsmuster der vier… ...77
Abb. 25: Grad der histopathologischen Veränderungen (A) und… ...79
Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Übersicht zu den Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien… ...5
Tab. 2 Wichtige Polymorphismen auf dem Prion-Gen (PRNP) von…...11
Tab. 3 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien von Schaf, Ziege… ...25
Tab. 4 Übersicht der 25 im BioRad-Schnelltest PrPSc-reaktiv… ...27
Tab. 5 Übersicht der 17 im BioRad-Schnelltest PrPSc-negativ…...28
Tab. 6 Anamnestische Daten aller Ziegen der BSE-Pathogenesestudie…...29
Tab. 7 Übersicht über die immunhistochemisch, histopathologisch und… ...32
Tab. 8 Übersicht zu den Formalin- und Tiefgefrierproben…...37
Tab. 9 Sektionszeitpunkte der Ziegen aus der BSE-Pathogenesestudie… ...38
Tab. 10 Parameter für die Einstufung eines TSE-Isolats…...49
Tab. 11 Übersicht der wichtigsten positiven Referenzen (Hirnstammmaterial)… ...50
Tab. 12 Anamnestische Daten der Damaskusziegen aus Zypern… ...52
Tab. 13 Scrapie-Isolate der Damaskusziegen aus Zypern mit…...57
Tab. 14 Übersicht der im Langzeit-Proteinase K-Resistenztest untersuchten…...59
Tab. 15 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung von Gewebeproben….66 Tab. 16 Vergleich der Ziegen aus Zypern mit… ...70
Tab. 17 Verhältnis PrPSc-positiver Follikel zur Gesamtanzahl der… ...71
Tab. 18 Übersicht zu den Befunden der in… ...73
Tab. 19 Inkubationszeit, klinische Anzeichen und Zeitraum der… ...74
Tab. 20 Ergebnisse des IDEXX Herd Chek-Schnelltests und… ...75
Tab. 21 Übersicht über die in der Immunhistochemie…...132
Tab. 22 Übersicht über die Vorbehandlungen der in…...133
Tab. 23 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Ausprägungsgrades…...134
Tab. 24 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils…...134
Tab. 25 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils…...134
Tab. 26 Übersicht über die bei den Sektionen… ...135
Tab. 27 Übersicht über die bei den Sektionen… ...136
Tab. 28 Übersicht über die bei den Sektionen… ...137
Tab. 29 Vergleich der klassischen caprinen und ovinen…...140
Tab. 30 Glykosylierungsverhältnisse der di-, mono- und unglykosylierten…...141
1 Einleitung
Scrapie und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) gehören zu den Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien (TSEn) und stellen neurodegenerative, progressiv und letzt- endlich tödlich verlaufende Erkrankungen bei kleinen Wiederkäuern und Rindern dar. Scra- pie wurde erstmalig 1732 (MC GOWAN et al. 1922) beschrieben, während BSE erst wesent- lich später Erwähnung fand (WELLS et al. 1987). Scrapie tritt unter natürlichen Bedingun- gen bei Schafen und Ziegen auf. Als Ursache für das Auftreten von BSE bei Rindern wird die Verfütterung von ungenügend erhitzten Tiermehlen an die Wiederkäuer in Großbritan- nien vermutet. Im Gegensatz zu Scrapie ist BSE eine zoonotische Erkrankung, welche beim Menschen die tödlich verlaufende Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJK) verursacht.
Die Empfänglichkeit der kleinen Wiederkäuer für Scrapie ist abhängig vom Genotyp. Bei Schafen sind partiell resistente Genotypen gegen die Erkrankung beschrieben worden. Diese bekannten genetischen Resistenzen werden züchterisch genutzt, um Scrapie-freie Schafher- den zu etablieren. Auch bei Ziegen ist eine Abhängigkeit vom Genotyp für die Scrapie- Empfänglichkeit nachgewiesen. Aufgrund einer weitaus größeren genetischen Diversität ge- staltet sich die Aufnahme gezielter Zuchtprogramme bei Ziegen jedoch vergleichsweise schwierig. Der erste natürlich aufgetretene BSE-Fall in kleinen Wiederkäuern wurde bei ei- ner französischen Ziege diagnostiziert (ELOIT et al. 2005), nachdem bereits die BSE- Infektion von Schaf und Ziege experimentell gezeigt werden konnte (FOSTER et al. 1993).
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung natürlicher capriner Scrapie- Fälle aus Zypern und der Differenzierung dieser von capriner BSE. Des Weiteren wurde die Pathogenese von BSE bei Ziegen untersucht. Nach der oralen Inokulation von Ziegen unter- schiedlicher Genotypen konnten Erkenntnisse zur pathogenetischen Verteilung, zu Übertra- gungswegen und den Möglichkeiten prämortaler Diagnostik in Abhängigkeit vom Genotyp gewonnen werden.
Im Sinne des Verbraucherschutzes helfen diese Erkenntnisse u. a. spezifiziertes Risikomate- rial zu definieren, die sinnvolle Nutzbarkeit prämortaler Diagnostikmethoden abzuschätzen, BSE von Scrapie mittels diskriminatorischer Tests zu unterscheiden und resistentere Genoty- pen in den europäischen Ziegenherden zu etablieren.
2 Literaturübersicht
2.1 Das Prion-Protein 2.1.1 Das Prion-Gen
Das Prion-Protein wird durch das Prion-Gen (PRNP) kodiert. Das PRNP liegt bei Schaf, Zie- ge und Rind auf dem Chromosom 13 (IANNUZI et al. 1998) und ist heute eines der am häu- figsten sequenzierten Gene. Es beinhaltet in Abhängigkeit von der jeweiligen Säugetierart zwei oder drei Exons, wobei das letzte Exon den für das gesamte Prion-Protein kodierenden open reading frame (ORF) enthält. Die Kodons des ORF kodieren bei den Bovidae und Cer- vidae für die 256 Aminosäuren (AS) des Prion-Proteins, welches nach der posttranslationalen Modifikation als vollständig prozessiertes Prion-Protein eine Größe von 210 AS aufweist. Für das PRNP sind bei zahlreichen Tierarten Polymorphismen bekannt. Zwei Arten der Poly- morphismen wurden bisher beschrieben. Zum einen handelt es sich um Polymorphismen ein- zelner Nukleotide, welcher in der Regel den Austausch einzelner Aminosäuren bewirken, und zum anderen um Insertionen oder Deletionen von Oktapeptid-Kopien (octapeptid repeats) in der Amino-(N)-terminalen Domäne (GOLDMANN 2008).
2.1.2 Das zelluläre Prion-Protein
Das Prion-Protein (PrPc) ist ein 33-35 kDa großes zelluläres Glykoprotein, welches bei ver- schiedenen Tierspezies und beim Menschen beschrieben wurde. Seine biologische Funktion ist bis heute nicht endgültig geklärt. Strukturell besteht das PrPc aus drei α-helikalen Regio- nen, von denen zwei über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind, sowie aus einem zweisträngigen antiparallelen β-Faltblatt und einem flexiblen, unstrukturierten N-Terminus (RIEK et al. 1996, 1997). Es wird im rauen endoplasmatischen Retikulum (rER) synthetisiert und über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert, wo es durch einen Glyko- sylphosphatidylinositol-Anker in der Zellmembran verankert wird. Das humane PrPc kann am Asparagin auf Position 181 und 197, das murine PrPc an den Positionen 180 und 196 variabel glykolysiert sein. Die Glykosylierung beeinflusst das Verhalten des PrPc im intrazellulären Kreislauf zwischen der Zelloberfläche und endozytotischen Kompartimenten (CANCELLOTTI et al. 2005). Das Prion-Protein kann in di-, mono- und ungklykosylierter Form vorliegen. Es ist in milden Detergenzien löslich und wird durch die Proteinase K (PK)
vollständig verdaut (OESCH et al. 1985). Bei PrP-Knockout-Mäusen konnte gezeigt werden, dass sich diese Tiere normal entwickeln, fortpflanzen und keine Verschlechterung der Lernfä- higkeit aufweisen (BÜELER et al. 1992; MANSON et al. 1994, 1995). Des Weiteren ist be- kannt, dass PrPc vor oxidativem Stress schützt (BROWN et al. 1997, 1999 a; KLAMT et al.
2001), Kupfer bindet (HORNSHAW et al. 1995 a, b; BROWN et al. 1997, 1999 b) und bei der Neurogenese und Differenzierung von Neuronen mitwirkt (STEELE et al. 2006), sowie in der Zellerkennung eine Rolle zu spielen scheint (PRUSINER 1989). Es greift auch in die Re- gulierung der zirkadianen Aktivität und des Schlafrhythmus ein (TOBLER et al. 1996). PrPc wird außerdem als Mediator für die Ablagerung bzw. als Rezeptor von β-Amyloid an Sy- napsen bei der Alzheimer-Erkrankung (neurodegenerative Erkrankung des Menschen) disku- tiert (LAURÉN et al. 2009; KESSELS et al. 2010).
2.1.3 Die pathologische Isoform des Prion-Proteins
Wie das zelluläre Prion-Protein weist auch die pathologische Isoform des Prion-Proteins (PrPSc) in der Primärstruktur dieselbe Aminosäuresequenz mit einer identischen molekularen Masse auf, worauf eine fehlende Immunogenität zurückgeführt wird. Deutliche Unterschiede zeigen sich in der Struktur und in den biochemischen Eigenschaften. So ist beim PrPSc der Anteil der β-Faltblattstrukturen mit 43 % deutlich größer als beim PrPc (3 %), worin die stär- kere Tendenz zur Selbstaggregation und Fibrillenbildung begründet ist (PAN et al. 1993). Die fibrillären Aggregate können elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden und werden als Scrapie-assoziierte Fibrillen (SAF) oder „prion rods“ bezeichnet (PRUSINER et al. 1983).
Das PrPSc erweist sich als resistenter gegenüber der Lösung in Detergenzien und der Verdau- ung mit Proteinase K (PK). Beim PK-Verdau werden vom PrPSc ca. 70 Aminosäuren N- terminal abgespalten, wodurch sich die molekulare Masse des PK-resistenten PrPSc auf 27-30 kDa verringert. Dieses PrPSc, welches auch als PrP27-30 bezeichnet wird, bleibt infektiös und weist im Westernblot eine charakteristische Verschiebung („shift“) auf. Die größere PK- Resistenz der pathologischen Isoform wird in zahlreichen Routinetests zum Nachweis von PrPSc genutzt.
2.1.4 Prionenmodelle
Im Jahr 1982 beschrieb PRUSINER mit der „ protein-only-Theorie“ das Prion-Protein (PrPSc) als auslösendes Agens der TSE-Erkrankungen. Das Prion-Protein, auch als „proteinaceous
infectious particle“ bezeichnet, initiiert die Umfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrPc) in die pathogene Form (s. Abb. 1). Damit tritt PRUSINER der noch heute von DIRINGER et al.
(1994) und MANUELIDIS et al. (1994, 1995) vertretenen Virus-Theorie entgegen, welche einen „slow“-Virus als Ursache der TSE-Erkrankungen favorisiert und er widerspricht der Virino-Theorie (DICKINSON u. OUTRAM 1988), nach welcher eine sehr kleine behüllte, Scrapie-spezifische Nukleinsäure die Erkrankungen auslöst und sich aufgrund ihrer geringen Größe der Detektion entzieht. Für die Theorie von PRUSINER spricht, dass PrPSc in Verbin- dung mit der Scrapie-Infektion steht (1982), dass PrP-Knockout-Mäuse nicht an Scrapie er- kranken (BÜELER et al. 1993), und dass bis heute der Nachweis einer TSE-spezifischen Nukleinsäure nicht gelungen ist. Außerdem bleiben die Eigenschaften der verschiedenen TSE-Erkrankungen (Stämme) auch nach vollständiger Zerstörung aller Nukleinsäuren erhal- ten und der experimentelle Beweis für die Virino-Theorie steht noch immer aus. Allerdings ist auch die „protein-only-Theorie“ nicht unumstritten, da PrPSc nicht immer infektiös ist, und dies die Frage nach einem unbekannten Agens aufwirft, welches an der Infektion mit beteiligt sein könnte (LASMEZAS et al. 1997; BARRON et al. 2007; PICCARDO et al. 2007).
Zelluläres Prionprotein (PrPC) Pathologisches Prionprotein (PrPSc) Konversion
Scrapie-assoziierte Fibrillen (SAF) Aggregation
Abb. 1 Modell zur protein-only-Theorie von Prusiner (GOVAERTS et al. 2004).
2.1.5 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien im Überblick
Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEn) sind infektiöse, neurodegenerative Er- krankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), die durch die Akkumulation des pathologi- schen Prion-Proteins gekennzeichnet sind. Nach einer monate- bis jahrelangen Inkubations- zeit folgt ein progredienter Krankheitsverlauf, der stets tödlich endet. Die pathologischen Veränderungen im ZNS sind durch die Trias Ablagerung von PrPSc, Vakuolisierung und Glio- se gekennzeichnet. Eine Immunantwort des Wirtsorganismus auf das PrPSc fehlt jedoch voll-
ständig. TSEn kommen beim Menschen und zahlreichen Säugetierspezies vor und sind kli- nisch insbesondere durch Sensibilitätsstörungen, Ataxien und Demenzerscheinungen gekenn- zeichnet. Sie können in Folge einer Infektion oder sporadisch auftreten oder genetisch bedingt sein. Einen Überblick über alle bekannten TSEn und deren Aetiologien gibt Tab. 1.
Tab. 1 Übersicht zu den Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien bei Mensch und Säugetie- ren und Angaben zu ihrer Aetiologie
Transmissible Spongiforme Enzephalopathien Aetiologie Mensch
Kuru Infektion
Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
-iatrogen Infektion
-sporadisch unbekannt
-familiär-genetisch Mutation
-neue Variante Infektion
Gerstmann-Sträussler-Scheincker-Syndrom Mutation
Fatale Familiäre Insomnie Mutation
Säugetiere
Scrapie Infektion
Atypische Scrapie unbekannt
Bovine Spongiforme Enzephalopathie Infektion
Atypische Bovine Spongiforme Enzephalopathie unbekannt
(vermutlich sporadisch)
Transmissible Nerz-Enzephalopathie Infektion
Feline Spongiforme Enzephalopathie Infektion
Chronische Auszehrungskrankheit der Hirschartigen Infektion Spongiforme Enzephalopathie der exotischen Wildwiederkäuer Infektion
2.2 Stammcharakterisierung der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien Obwohl die Aminosäuresequenz des pathologischen Prion-Proteins unverändert bleibt, konn- ten verschiedene TSE-Stämme isoliert werden. Sie unterscheiden sich nach Art der Klinik, den Inkubationszeiten, der Übertragbarkeit, den neuropathologischen Veränderungen (Läsi- onsprofil), den Inaktivierungseigenschaften und ihren biochemischen Charakteristika wie PK- Resistenz und PK-Schnittstelle sowie dem Glykoprofil des PrPSc. Bereits 1961 beschrieben PATTISON und MILLSON einen durch starken Pruritus („scratching“-Syndrom) und einen von allgemeiner Depression dominierten („drowsy“-Syndrom) Scrapie-Stamm bei Ziegen.
Auch bei nachfolgenden Passagen dieses Stammes in Ziegen setzten sich die jeweiligen klini- schen Formen fort. Als Hintergrund wurden zwei unterschiedliche Scrapie-Stämme vermutet.
Vergleichbares wurde für die Transmissible Nerz-Enzephalopathie (TME) bei Hamstern be- schrieben. Der sog. „Hyper“-Stamm führte zu Übererregbarkeit und zerebellärer Ataxie, wäh- rend der sog. „Drowsy“-Stamm Lethargie und Ataxie verursachte (BESSEN u. MARSH 1992 a, b, 1994).
2.2.1 Die Inkubationszeit und der Einfluss der Speziesbarriere
Wird die TSE von einer Spezies auf eine andere übertragen, so bewirkt die sog. Speziesbarrie- re anfänglich verlängerte Inkubationszeiten, eine variierende Klinik und histopathologische Veränderungen sowie eine verminderte Übertragungsrate der TSE bei den Rezipienten (PATTISON et al. 1965). Die Inkubationszeit ist definiert als Zeitintervall zwischen der In- fektion und dem Auftreten klinischer Symptome. Sie gilt als Stammcharakteristikum für TSE- Erkrankungen. Erfolgen mehrere Passagen von TSEn innerhalb einer Spezies bzw. Mauslinie, so verkürzt sich die Inkubationszeit und die histopathologischen Veränderungen bleiben kon- stant. Mit der intrazerebralen Übertragung von TSE-Stämmen auf definierte Mauslinien ge- lang es somit, die Übertragbarkeit, die Inkubationszeit und histopathologischen Läsionsprofile des Erregers zu bestimmen und diesen näher zu charakterisieren.
Einen wesentlichen Einfluss auf die Übertragbarkeit hat die primäre Aminosäuresequenz des Prion-Proteins der unterschiedlichen Spezies, denn eine Übertragung gelingt umso leichter, je ähnlicher sich die Primärsequenzen sind (PRUSINER et al. 1990; BÜELER et al. 1994). Al- lerdings erklärt dies nicht, warum einige der TSEn (z. Bsp. BSE) auf mehrere Spezies über- tragbar sind. Weitere Einflussfaktoren können daher nicht ausgeschlossen werden (COLLINGE et al. 1999; HILL u. COLLINGE 2004). Durch die Verwendung von transgenen Mäusen, welche z. Bsp. das ovine (CROZET et al. 2001; VILOTTE et al. 2001), das bovine (SCOTT et al. 1997; BUSCHMANN et al. 2000) oder das murine PrPc überexprimieren (FISCHER et al. 1996), konnten die Speziesbarriere und die Inkubationszeiten stark reduziert werden. Der Mausbioassay dient bis heute als sensitivster Test in der TSE-Diagnostik.
2.2.2 Die Bedeutung proteinbiochemischer Parameter
Zur Charakterisierung von TSE-Stämmen mittels proteinbiochemischer Methoden wird das Glykosylierungsverhältnis, die molekulare Masse, die Immunoreaktivität sowie die PK- Stabilität des PrPSc bestimmt. Anhand dieser Parameter kann einerseits eine Diskriminierung der BSE-Stämme von den Scrapie-Stämmen vorgenommen werden, und andererseits die Cha-
rakterisierung der einzelnen Scrapie-Stämme erfolgen, weshalb diese Methodik eine Alterna- tive zu den sehr zeitaufwendigen Mausbioassays darstellt. Die Methodik basiert auf der par- tiellen Resistenz des PrPSc gegen den Verdau durch die PK. Während PrPc durch PK ausge- hend vom N-terminalen Ende vollständig verdaut wird, werden von der pathologischen Form 62 Aminosäuren (AS) N-terminal abgetrennt und es verbleibt ein PK-resistentes „Core“- Fragment von 141 AS (OESCH et al. 1985). Durch den PK-Verdau verschiebt sich die mole- kulare Masse des PrPSc im Immunoblot von 33-35 kDa auf 27-30 kDa.
2.2.2.1 Das Glykosylierungsverhältnis und die molekulare Masse
Die Bestimmung des Anteils der di-, mono- und unglykosylierten Form des PrPSc am Gesamt- signal (Glykosylierungsverhältnis) erfolgt nach Auftrennung des PK-verdauten Gehirnmateri- als in der Gelelektrophorese (SDS-Gel) und der Darstellung der PrPSc-Fragmente im Immu- noblot. KASCSAK et al. beschrieben erstmals 1985 deutliche Unterschiede im Glykosylie- rungsverhältnis muriner Scrapie-Stämme. Bei Kuru, dem GSS-Syndrom und iatrogener bzw.
sporadischer CJK dominiert die monoglykosylierte Form, bei vCJK und Rinder-BSE die diglykosylierte Form (COLLINGE et al. 1996; SOMERVILLE et al. 1997; KUCZIUS et al.
1998). Vergleichbar zu Rinder-BSE dominierte bei oviner BSE ebenfalls die diglykosylierte Form (STACK et al. 2002; NONNO et al. 2003; LEZMI et al. 2004; THURING et al. 2004;
GRETZSCHEL et al. 2005), was einen deutlichen Unterschied zu den meisten Scrapie- Stämmen darstellte. Trotzdem ist anhand des Glykosylierungsmusters die Diskriminierung der BSE v. a. von natürlich vorkommenden Scrapie-Stämmen nicht immer eindeutig möglich, da auch letztere eine dominierende diglykosylierte Form des PrPSc aufweisen können (BARON et al. 1999). Weitere Unterschiede fanden sich nach dem PK-Verdau für die mole- kulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc von TSE-Stämmen, denn diese war für Scrapie vorwiegend größer als für BSE (HILL et al. 1998; BARON et al. 2000; STACK et al.
2002). Neben dem TSE-Stamm und den Wirtseigenschaften üben der Genotyp des Empfän- gertiers (SOMERVILLE et al. 1999), die Gewebeart der untersuchten Probe (RUBENSTEIN et al. 1991), und bei ZNS-Proben der genaue Entnahmeort in den verschiedenen Gehirnregio- nen (SOMERVILLE et al. 1999, 2005) einen Einfluss auf das Glykoprofil aus. Darüber hin- aus stellte sich das Glykosylierungsmuster in Abhängigkeit von den verwendeten Antikörpern different dar (GROSCHUP et al. 2000; SWEENEY et al. 2000), weshalb auch methodisch bedingte Effekte bei der Auswertung zu berücksichtigen sind.
2.2.2.2 Die Immunoreaktivität des pathologischen Prion-Proteins
Da das PrPSc der verschiedenen TSE-Stämme unterschiedliche Schnittstellen für die PK be- sitzt, ergibt sich für die zur Detektion verwendeten Antikörper ein unterschiedlicher Grad der Bindung an die Proteolyseprodukte (s. Abb. 2, S. 9). Diese Besonderheit wurde im sog. FLI- Test zur Diskriminierung von Scrapie und BSE bei kleinen Wiederkäuern genutzt (GRETZSCHEL et al. 2005). Die Detektion von PrPSc in Schaf- und Rindermaterial erfolgt dabei mit dem monoklonalen Antikörper (MAK) P4, welcher N-terminal im Bereich der PK- Schnittstelle das PrPSc bindet, sowie mit dem MAK L42, welcher im PrPSc weiter C-terminal bindet. Das PrPSc aus mit Scrapie infizierten Schafen wird nach dem PK-Verdau durch beide Antikörper detektiert, während das Epitop des MAK P4 auf dem PrPSc aus mit BSE infizier- ten Schafen und Rindern durch den PK-Verdau fast vollständig zerstört wird und daher durch diesen Antikörper nur noch schwach oder gar nicht mehr zu detektieren ist. Die Bestimmung des Quotienten aus der Intensität des MAK P4- und des MAK L42-Signals liefert schließlich den entscheidenden Parameter des FLI-Tests zur Diskriminierung von Scrapie und BSE bei kleinen Wiederkäuern (GRETZSCHEL et al. 2005). Vergleichbare Bindungseigenschaften wie der MAK L42 zeigte auch der MAK 6H4, welcher von STACK et al. (2002) eingesetzt wurde.
2.2.2.3 Die Proteinase K-Stabilität des pathologischen Prion-Proteins
Die Stabilität gegenüber dem PK-Verdau ist, wenn auch nur eingeschränkt, ein weiteres Cha- rakteristikum von PrPSc zur Differenzierung von TSE-Stämmen, da diese teilweise sehr deut- lich variieren kann. So zeigte beispielsweise bei Schafen das PrPSc atypischer Scrapiefälle eine geringere PK-Stabilität als das PrPSc klassischer Scrapiefälle (BUSCHMANN et al. 2004 a), und auch das PrPSc der Rinder-BSE wies eine vergleichsweise geringere PK-Resistenz auf (KUCZIUS u. GROSCHUP 1999; SWEENEY et al. 2000). Neben originärem Gehirnmaterial der jeweiligen Donorspezies wurde auch Maus-passagiertes Gehirnmaterial mittels PK ver- daut, wobei ein geringer Einfluss der Mauslinie auf die PK-Stabilität nicht auszuschließen war (KUCZIUS u. GROSCHUP 1999). Für experimentelle Scrapie-Stämme von Hamster und Maus, deren Differenzierung anhand des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen Masse des PrPSc nicht gelang, konnte somit eine Unterscheidung anhand der PK-Stabilität erfolgen (SAFAR et al. 1998; KUCZIUS u. GROSCHUP 1999).
Proteinase K
MAK P4 MAK L42
Scrapie-PrPSc BSE-PrPSc AS 96 -97
AS 81-89
89-104 shp* 145-163 shp*
145-163 shp*
Abb. 2 Schematische Darstellung des PrPSc von Scrapie und BSE mit den unterschiedlichen Protei- nase K-Schnittstellen (Pfeile). Der MAK L42 detektiert beide Proteine, während der MAK P4 nur Scrapie nicht aber BSE detektieren kann, da er weiter aminoterminal bindet. AS = Aminosäure, BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, MAK = monoklonaler Antikör- per, *Epitope der Antikörper, shp = sheep
2.3 Scrapie bei Schaf und Ziege
Scrapie wurde im Jahr 1732 in Großbritannien bei Schafen und im Jahr 1942 bei Ziegen erst- malig beschrieben (MC GOWAN et al. 1922; CHELLE et al. 1942). Scrapie ist damit die am längsten bekannte Erkrankung der TSEn. Sie tritt, mit Ausnahme von Australien und Neusee- land, weltweit bei Schafen und Ziegen auf und wurde nach einem klinischen Hauptsymptom
„to scrape“ (kratzen) benannt.
2.3.1 Das klinische Bild
Klinisch kann beim Schaf zum einen die pruritische Form, welche durch einen ausgeprägten Juckreiz und massiven Wollverlust gekennzeichnet ist, auftreten, und zum anderen die paraly- tische Form, welcher die pruritische Komponente fehlt. Neben einem hypermetrischen Gang, der zu dem Namen „Traberkrankheit“ führte, sind Kachexie und deutliche Verhaltensände- rungen zu beobachten. Nach einer Klinikdauer von ca. drei bis vier Monaten kommt es schließlich zum Tod der Schafe (CAPUCCHIO et al. 2001).
Bei Ziegen sind die Symptome häufig weniger stark ausgeprägt. Wie bei den Schafen sind v. a. die drei- bzw. vierjährigen Tiere von der Erkrankung betroffen (PARRY 1983; WOOD et al. 1992). Am häufigsten treten bei klinisch auffälligen Tieren Hyperästhesien, Ataxien und Pruritus auf, weniger häufig dagegen wurden u. a. Konditionsverlust bei erhaltener Fresslust, Speicheln und Schwermelken beobachtet (HOURRIGAN et al. 1969; WOOD et al. 1992). Im Gegensatz zu Schafen zeigen erkrankte Ziegen häufig ein aggressives Verhalten und beißen
sich selbst oder ihre Artgenossen (CAPPUCHIO et al. 2001).
2.3.2 Der Einfluss des Genotyps des Prion-Gens
Die Sequenz des PRNP von Schaf und Ziege erreicht eine Homologie von mehr als 99 Pro- zent (%) und ist stark konserviert (GOLDMANN et al. 1996; BILLINIS et al. 2002). Abwei- chend vom am häufigsten vorkommenden Genotyp, dem sog. Wildtyp-Genotyp, wurden so- wohl bei Schafen als auch bei Ziegen zahlreiche Polymorphismen im PRNP beschrieben, welche einen entscheidenden Einfluss auf die Inkubationszeit und Pathogenese von TSE- Erkrankungen bei diesen Tierarten haben und zur Ausbildung von Resistenzen führen können.
Die Polymorphismen im PRNP bewirken vermutlich sterische Konformationsänderungen im Prion-Proteinmolekül, was wiederum die Neigung zur Umfaltung in die pathologische Form beeinflusst (COHEN et al. 1994; HUANG et al. 1994; PRUSINER et al. 1997). Die wichtig- sten Polymorphismen beider Tierarten sind in Tab. 2 (S. 11) zusammengefasst.
2.3.2.1 Das Prion-Gen des Schafs
Den größten Einfluss auf die Empfänglichkeit von Schafen für Scrapie besitzen die Poly- morphismen der Kodons 136, 154 und 171 (HUNTER et al. 1996). Auf dem Kodon 136 kann dabei für Valin (V) oder Alanin (A), auf dem Kodon 154 für Arginin (R) oder Histidin (H) und auf dem Kodon 171 für R, Glutamin (Q) oder H kodiert werden (GOLDMANN et al.
1990, 1991; BELT et al. 1995). Die Genotypen der Schafe lassen sich nach ihrem Resistenz- potential in fünf Genotypklassen einteilen. Die Genotypen werden dabei durch die Abkürzung der kodierten Aminosäuren für die Kodons 136, 154 und 171 angegeben, die Allele werden durch einen Schrägstrich getrennt. Die Einteilung der Schafgenotypen erfolgt in Klassen zwi- schen der Genotypklasse 1 (A136R154R171/ARR), welcher die gegenüber einer Scrapie- Infektion genetisch resistentesten Tiere zugeordnet sind und der Genotypklasse 5 (A136H154Q171/VRQ, A136R154H171/VRQ, A136R154Q171/VRQ oder V136R154Q171/VRQ), welcher die hochempfänglichen Tiere angehören, die möglichst nicht zur Zucht verwendet werden sollten. Vor dem Hintergrund dieser Erkenntnisse versucht man mit Hilfe von Zuchtpro- grammen (u. a. in England, den Niederlanden, Deutschland u. Frankreich) die Häufigkeit des V136R154Q171-Allels in den europäischen Schafherden zu verringern und die des A136R154R171- Allels zu erhöhen, um die genetische Resistenz der Herden gegenüber klassischer Scrapie zu erhöhen und somit Scrapie in den Herden zu dezimieren bzw. ganz auszulöschen.
Tab. 2 Wichtige Polymorphismen auf dem Prion-Gen (PRNP) von Schaf und Ziege. Für die Spezies Ziege sind bekannte Effekte der Polymorphismen aufgeführt.
PRNP Schaf PRNP Ziege
Kodon
Wildtyp Polymorphismus Wildtyp Polymorphismus Effekt
136 Valin (V) Alanin (A)
142 Isoleucin
(I)
Methionin (Met)
Verlängerung der Inkuba- tionszeit von BSE/Scrapie
146 Asparagin
(N)
Serin (S)
Asparaginsäure (D)
Resistenz gegenüber Scrapie erhöht 154 Arginin
(R)
Histidin (H)
Arginin (R)
Histidin (H)
Verlängerung der Inkuba- tionszeit von Scrapie 171 Glutamin
(Q)
Arginin (R)
Histidin (H)
211 Arginin
(R)
Glutamin (Q)
Resistenz gegenüber Scrapie erhöht
222 Glutamin
(Q)
Lysin (K)
Resistenz gegenüber Scrapie erhöht
240 Serin (S) Prolin (P) fraglich
BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, grau hinterlegt = Leerfeld
2.3.2.2 Das Prion-Gen der Ziege
Trotz der großen genetischen Homologie des PRNP kleiner Wiederkäuer, unterscheiden sich die Polymorphismen, die speziell bei der TSE-Resistenz der Ziege eine Rolle spielen, teilwei- se deutlich von denen der Schafe (s. Tab. 2). Für das PRNP der Ziege wurden bisher 42 Po- lymorphismen beschrieben, wovon neun als sog. stille Mutationen vorliegen (VACCARI et al. 2009). Im Gegensatz zum Schaf sind bei Ziegen für das Kodon 136 (GOLDMANN et al.
1996) keine Polymorphismen bekannt und ein Q/R-Polymorphismus des Kodon 171 wurde bisher nur in einer griechischen Ziege beschrieben (BOUZALAS et al. 2010). Die wichtigsten Polymorphismen befinden sich auf den Kodons 142, 146, 154, 211 und 222. Für Ziegen, die auf dem Kodon 142 für Methionin (Met) anstatt für Isoleucin (I) kodierten, wurde eine ver- längerte Inkubationszeit der Scrapie-Erkrankung beschrieben, wobei sowohl die homozygoten als auch heterozygoten Ziegen empfänglich für Scrapie blieben. Ein vergleichbarer Einfluss dieses Polymorphismus zeigte sich auch bei mit BSE-infizierten Ziegen (GOLDMANN et al.
1996). Der AS-Austausch von Arginin zu Histidin am Kodon 154, welcher bei Schafen für einen moderaten Schutz sorgt, führt bei Ziegen zu verlängerten Inkubationszeiten und partiell
protektiven Effekten gegenüber Scrapie (BILLINIS et al. 2002; VACCARI et al. 2006;
PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007). Der Asparagin (N)/Serin (S)- bzw. Asparaginsäure (D)- Polymorphismus auf Position 146 konnte in Europa bisher nur bei Ziegen auf Zypern beschrieben werden. Die Aminosäuren Serin oder Asparaginsäure bewirken hier eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber Scrapie in heterozygoter Ausprägung und die Polymorphismen in homozygoter Ausprägung wurden bisher nur bei gesunden Tieren gefunden (PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007, 2010). Für den R/Q-Polymorphismus am Kodon 211 konnten BARILLET et al. (2009) erstmals zeigen, dass heterozygote Ziegen eine größere Resistenz gegen Scrapie besitzen. In Italien sind Arginin und Lysin am Kodon 222 sehr stark in der Ziegenpopulation verbreitet. Keines der heterozygoten R/K-Tiere war an Scrapie er- krankt, was ebenfalls auf eine erhöhte Resistenz hindeutet (ACUTIS et al. 2004; VACCARI et al. 2006). Allerdings wurden in Frankreich Scrapie-positive heterozygote Tiere dieses Ge- notyps beschrieben, was eine vollständige Resistenz dieses Genotyps ausschließt (BARILLET et al. 2009). Weitere Polymorphismen wie der AS-Austausch von Serin nach Prolin am Ko- don 240 konnten bisher nur bei der Ziege beschrieben werden. Die Rolle des Kodons 240 für die TSE-Empfänglichkeit der Ziege scheint jedoch unbedeutend, denn GOLDMANN et al.
(1996) und PAPASAVVA-STYLIANOU et al. (2007) konnten diesen AS-Austausch nicht mit der Verlängerung der Inkubationszeit von Scrapie assoziieren. Die Bedeutung der Er- kenntnis von BARILLET et al. (2009), dass eine erhöhte Resistenz der heterozygot am Ko- don 142 (Met/I) kodierenden Ziegen ausschließlich in Verbindung mit homozygoter Ausprä- gung des Prolin am Kodon 240 zu finden war, bleibt dagegen noch zu klären.
2.3.3 Übertragungswege der Scrapie bei Schaf und Ziege
Scrapie ist infektiös und kontagiös. Die Übertragung von Scrapie auf Schaf und Ziege erfolgt unter natürlichen Voraussetzungen auf dem oralen Weg. Experimentell sind u. a. auch die intrazerebrale und die intraperitoneale Infektion möglich. Adulte Schafe infizieren sich auf dem natürlichen Weg v. a. durch die Aufnahme (oral) der infektiösen Nachgeburt, welche die Weiden kontaminiert, oder durch den direkten Kontakt zu infizierten Tieren (PATTISON 1972, 1974; HADLOW et al. 1982; HOURRIGAN u. KLINGSPORN 1996; RYDER et al.
2004). Bedingt durch eine hohe Stabilität des PrPSc in der Umwelt ist ein Ansteckungsrisiko über Jahre gegeben (BROWN u. GAJDUSEK 1991; WIGGINS 2009).
Die maternale Übertragung von Scrapie auf die Lämmer konnte schon sehr früh belegt wer- den (PATTISON 1972, 1974). Ob es sich bei dieser vertikalen Übertragung aber um eine in- trauterine oder perinatale Infektion der Lämmer handelt, ist bis heute ungeklärt. Im fetalen Trophoblasten der Plazenta Scrapie-positiver Schafe konnte PrPSc bereits nachgewiesen wer- den (RACE et al. 1998; ANDREOLETTI et al. 2002), wobei sich die PrPSc–Ablagerungen ausschließlich in den Plazenten von Lämmern eines empfänglichen Genotyps befanden, was darauf hindeutet, dass die Genotypen der Nachkommen Einfluss auf den Übertragungserfolg von Scrapie haben (ANDREOLETTI et al. 2002; TUO et al. 2002; ALVERSON et al. 2006;
LACROUX et al. 2007). Allerdings konnte PrPSc bislang weder im Fetus selbst noch im Ute- rus der Muttertiere nachgewiesen werden (FOOTE et al. 1993; TUO et al. 2002; WANG et al. 2001), weshalb die Ansteckung der Lämmer im perinatalen Zeitraum wahrscheinlicher erscheint (ANDREOLETTI et al. 2002).
Eine weitere Ansteckungsquelle im peripartalen Zeitraum stellt die Milch der Schafe dar. So gelang der PrPSc-Nachweis bereits in der Milch subklinischer Tiere (KONOLD et al. 2008 b;
LACROUX et al. 2008; MADDISON et al. 2009), und die Übertragung von Scrapie auf Schaflämmer mit der Milch konnte ebenfalls gezeigt werden (KONOLD et al. 2008 b). PrPSc– Ablagerungen waren sowohl im Euter als auch in den Lymphonodi mammarii detektierbar (LIGIOS et al. 2005; LACROUX et al. 2008). HUNTER et al. (2002) gelang es, Scrapie mit- tels Blut auf Schafe zu übertragen. LIGIOS et al. (2005) und SISÓ et al. (2006) wiesen PrPSc in der Niere von Schafen nach und VASCELLARI et al. (2007) und MADDISON et al.
(2010) gelang der PrPSc-Nachweis in der Speicheldrüse und in Sekreten der Maulhöhle von Schafen. Weiterhin konnten KARIV-INBAL et al. (2006) PrPSc im Urin von experimentell infizierten Hamstern nachweisen.
Ziegen infizieren sich vorrangig über den direkten Kontakt zu Schafen (HOURRIGAN et al.
1969) oder durch die Nutzung von zuvor durch Schafe beweidete Flächen. Eine entscheiden- de Rolle spielt dabei vermutlich die Kontamination der Umwelt durch infektiöse Nachge- burtsanteile (Plazenta). Auch wenn PrPSc bereits in der Mamma von Ziegen nachgewiesen werden konnte (GONZÁLEZ et al. 2010 a), was für eine Übertragung von Scrapie mit der Milch spricht, gelang der PrPSc-Nachweis bisher weder in den Nieren noch in den Speichel- drüsen von Ziegen.
2.3.4 Die Pathogenese der Scrapie
Auf welchem Weg das PrPSc ins Gehirn gelangt, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Nach der oralen Aufnahme erfolgt zumeist die Akkumulation des PrPSc im darmassoziierten lymphatischen Gewebe (gut associated lymphoid tissue, GALT). Danach kommt es zur Aus- breitung im nicht darmassoziierten lymphatischen Gewebe und im peripheren Nervensystem (PNS), bis PrPSc schließlich auch im zentralen Nervensystem (ZNS) nachweisbar ist. Es wird vermutet, dass die Verbreitung des PrPSc dabei sowohl auf dem lymphatischen und hämato- genen als auch auf dem neuronalen Weg erfolgt.
2.3.4.1 Die Pathogenese der Scrapie im Schaf
Beim Schaf akkumuliert das PrPSc im Verlauf der Pathogenese zuerst in der Tonsille und den Peyer` Platten (PP) des Darms, wobei die PP des Ileums als erstes betroffen waren und daher auch als primäre Eintrittspforte für Scrapie diskutiert wurden (ANDREOLETTI et al. 2002;
RYDER et al. 2009). Nachfolgend kann sich Scrapie innerhalb von drei bis sechs Monaten auf das gesamte GALT des Magen-Darm-Trakts (MDT) ausbreiten und akkumuliert schließ- lich in den tributären Gebieten des GALT wie dem Lymphonodus retropharyngealis medialis (Ln. retroph.) und den Lymphonodi (Lnn.) mesenteriales (RYDER et al. 2009) sowie in einem Großteil weiterer peripherer Lymphknoten und der Milz (JEFFREY et al. 2001 b; VAN KEULEN et al. 2002). Ob die Beteiligung des GALT an der Pathogenese allerdings grund- sätzlich notwendig ist, bleibt zu bezweifeln, da bei klinisch an Scrapie erkrankten Schafen zwar Ablagerungen im ZNS detektiert werden konnten, das LRS dieser Tiere aber nicht be- troffen war (VAN KEULEN et al. 1996; ANDREOLETTI et al. 2000; JEFFREY et al. 2002).
Nach der Akkumulation und Replikation im LRS konnte PrPSc auch im enterischen Nerven- system (ENS) nachgewiesen werden, wobei ausgehend vom ENS des Ileums und Duodenums schließlich auch weiter kranial bzw. kaudal im Magen-Darm-Trakt gelegene Anteile des ENS PrPSc-positiv getestet wurden (VAN KEULEN et al. 1999, 2000; ANDREOLETTI et al.
2000). Es wird daher zum einen vermutet, dass Nervenfasern, welche die Follikel innervieren, das PrPSc auf neuronalem Weg zum ENS und schließlich weiter ins ZNS transportieren (BEEKES u. MCBRIDE 2000; RACE et al. 2000). Zum anderen wird der direkte Transport des PrPSc über Nervenendigungen der Tunica mucosa ins ENS diskutiert (HEGGEBØ et al.
2003; JEFFREY et al. 2006 a). Anschließend könnte Scrapie über den #ervus (N.) vagus als
parasympathischen Nerven und/oder den sympathischen #. splanchnicus ins Rückenmark aufsteigen, was den Nachweis von PrPSc im #ucleus (Ncl.) parasympathicus nervi vagi (DMNV) sowie im Ganglion (Ggl.) coeliacum (es enthält sympathische und parasympathi- sche Faseranteile) und in den sympathischen Wurzelzellen der intermediolateralen Säule des Rückenmarks erklären würde (VAN KEULEN et al. 2000). Neben der neuronalen Ausbrei- tung ist zusätzlich die Ausbreitung auf dem hämatogenen Wege nicht auszuschließen. Für diesen alternativen Weg spricht einerseits der Nachweis von PrPSc-Ablagerungen in lymphati- schen Geweben, welche nicht zum tributären Gebiet des Eintrittsortes von PrPSc gehören, und in der Milz, die keine afferenten Lymphe erhält, sowie andererseits der Nachweis der Über- tragbarkeit von Scrapie durch das Blut infizierter Schafe (VAN KEULEN et al. 2000;
HUNTER et al. 2002; RYDER et al. 2009).
2.3.4.2 Die Pathogenese der Scrapie in der Ziege
Über die Pathogenese von Scrapie bei Ziegen ist bisher nur vergleichsweise wenig bekannt. In den 60-iger Jahren zeigten PATTISON u. MILLSON (1960, 1962) in Übertragungsversuchen dass eine Vielzahl von Gewebeproben, u. a. auch die Milz, das Pankreas und die Leber von intrazerebral mit Scrapie infizierten Ziegen nach der intrazerebralen Inokulation in caprine Rezipienten infektiös waren. Nach der intraperitonealen Inokulation von Ziegen konnte Infek- tiosität zuerst im LRS, später im MDT und schließlich im Rückenmark und im Hirnstamm nachgewiesen werden (HADLOW et al. 1974). In aktuelleren Untersuchungen ließ dann der Nachweis von PrPSc im lymphatischen und neuronalen Gewebe des MDT sowie im darm- unabhängigen LRS und dem ZNS der Ziegen Ähnlichkeiten zur Pathogenese von Scrapie bei Schafen erkennen. Es gelang, wenn auch nur vereinzelt, der Nachweis von PrPSc in den PP des Ileums und Jejunums sowie zusätzlich im ENS von Ziegen. Eine breite Beteiligung des LRS konnte ebenfalls nachgewiesen werden, wobei vorrangig die Tonsille und der Ln.
retroph. betroffen waren. Mit zunehmender Ausbreitung des PrPSc im LRS wurde auffallend häufig auch das lymphatische Gewebe des Rektums PrPSc-positiv getestet (VALDEZ et al.
2003; GONZÁLEZ et al. 2009, 2010 a).
2.3.5 Möglichkeiten der prämortalen Diagnostik von Scrapie bei Schaf und Ziege Die prämortale Diagnostik ermöglicht die Detektion und Tilgung präklinischer Tiere. Eine Methode der prämortalen Detektion von TSEn stellt die Untersuchung von Bioptaten lympha-
tischer Gewebe wie der Tonsille (SCHREUDER et al. 1996, 1998; Jeffrey et al. 2001 b), des 3. Augenlids (O´ROURKE et al. 1998, 2000; THURING et al. 2000) oder aus dem Rektum (GONZÁLEZ et al. 2005) dar, welche mittels immunhistochemischer Methoden oder im Westernblot untersucht werden. Aussagekräftig für die diagnostische Fragestellung sind dabei jedoch lediglich positive Ergebnisse. So konnte Scrapie beispielsweise bei 97 % von klinisch auffälligen Schafen mittels Rektalbiopsie festgestellt werden. Von präklinischen Tieren konn- ten außerdem 86 % als PrPSc-positiv ermittelt werden, wobei die positive Diagnostik teilweise bereits nach etwa der Hälfte der Inkubationszeit gelang (GONZÁLEZ et al. 2006, 2008).
Vergleichbare Ergebnisse konnten auch mit der Untersuchung von Tonsillenbioptaten erzielt werden (SCHREUDER et al. 1996, 1998).
Bei Ziegen akkumuliert PrPSc ebenfalls frühzeitig in der Tonsille, dem Ln. retroph. sowie dem lymphatischen Gewebeanteil der rektoanalen Mukosa (RAMALT), wobei letzterer weniger häufig betroffen war. Dabei stieg mit der Zahl betroffener Gewebe des LRS auch die Wahr- scheinlichkeit des Nachweises von PrPSc-Ablagerungen im Rektum. Bisher gelang der PrPSc– Nachweis in Rektumbioptaten und rektalen Sektionsproben von Ziegen aber äußerst unregel- mäßig und, verglichen mit den Ergebnissen bei Schafen, mit geringerer Erfolgsrate (GONZÁLEZ et al. 2009).
Eine alternative Untersuchungsmethode könnte die Methode der zellfreien Konversion, die protein misfolding cyclic amplification (PMCA)-Methode darstellen, welche sich zunutze macht, dass geringe und vormals nicht detektierbare PrPSc–Mengen die Umfaltung von appli- ziertem PrPc katalysieren. Der Anteil des PrPSc nimmt dabei zu und wird u. a. mittels Immu- noblot detektiert (KOCISKO et al. 1994; SABORIO et al. 2001). Nach ersten erfolgreichen Analysen mit Blut, Urin oder Liquor cerebrospinalis von erkrankten Hamstern (CASTILLA et al. 2005; SAÁ et al. 2006; ATARASHI et al. 2007, 2008), wiesen THORNE u. TERRY (2008) PrPSc erstmals auch im Blut erkrankter Schafe nach. Dabei kam es aber zu spontanen Umfaltungen des PrPc der Negativkontrolle, weshalb die PMCA methodisch als noch nicht ausgereift gilt und noch weiterer Optimierung bedarf.
2.4 Die Histopathologie von Scrapie
Bei an TSE erkrankten Tieren weisen die Gehirne makroskopisch keine Veränderungen auf (MARSH u. KIMBERLIN 1975). In der Histopathologie zeigen sich jedoch in meist bilateral
symmetrischer Ausprägung die drei wesentlichen pathomorphologischen Merkmale vakuoläre Veränderungen, neuronale Degeneration und Gliose (v. a. Astrozytose). Bei den vakuolären Veränderungen wird zwischen der vakuolären Degeneration der grauen Substanz und den einzelnen oder multiplen Vakuolisierungen in den Perikarya der Neuronen unterschieden (s. Abb. 3). Alle pathomorphologischen Veränderungen zusammen ergeben schließlich das pathognomonische Bild. Bei klassischer Scrapie sind histopathologische Veränderungen v. a.
im #cl. parasympathicus n. vagi (DMNV) der Medulla oblongata zu finden, weshalb die Diagnostik vorrangig auf diesen Bereich des ZNS zielt (WOOD et al. 1997).
Abb. 3 Spongiforme Veränderungen des Neuropils und Vakuolisierung einer Nervenzelle (Pfeil) im Obex einer an Scrapie erkrankten Ziege, H.-E.-Färbung, 10-er Objektiv, Balken = 40 µm.
Die neuropathologischen Veränderungen können in ihrem Ausprägungsgrad und der neuro- anatomischen Verteilung je nach Scrapie-Stamm oder, wie bei Schafen, auch in Abhängigkeit vom Genotyp und anderen individuellen Faktoren variieren (WOOD et al. 1997; ZLOTNIK 1958; LIGIOS et al. 2002; BEGARA-MCGORUM et al. 2002). Im Mausmodell dagegen ergeben sich nach der Passagierung von Scrapie-positivem Material und der semiquantitativen Bewertung der vakuolären Veränderungen in den verschiedenen Hirnregionen der Mäusege- hirne stammspezifische Läsionsprofile, anhand derer unter Berücksichtigung der Inkubations- zeiten die Differenzierung von TSE-Stämmen möglich ist (FRASER u. DICKINSON 1968).
Das Läsionsprofil wird dabei u. a. vom Mausstamm und vom Genotyp des Donors beeinflusst (FRASER 1976).
2.5 Scrapie in der Immunhistochemie
Immunhistochemisch können PrPSc–Ablagerungen in den betroffenen Zellen und Geweben der verschiedenen Organe detektiert werden. Anhand ihrer Reaktionsmuster (profiling) und
ihrer Detektierbarkeit durch verschiedene Antikörper (epitope mapping) lassen sich die PrPSc– Ablagerungen u. a. im ZNS näher charakterisieren. So konnten für Scrapie zahlreiche Reakti- onsmuster der PrPSc-Ablagerungen beschrieben werden (MILLER et al. 1993; VAN KEULEN et al. 1995; FOSTER et al. 1996; HARDT et al. 2000; RYDER et al. 2001), wel- che GONZÁLEZ et al. (2002, 2003) zu einem Profil (profiling) zusammen gefasst haben, in dem extrazelluläre (Neuropil-, Gliazell-, Ependymzell- oder Endothelzell-assoziiert) und in- trazelluläre Verteilungsmuster von PrPSc (intraneuronal, intraastrozytär und intramikroglial) Berücksichtigung fanden. Bei Schafen zeigten sich typische Reaktionsmuster unabhängig von der Rasse und dem Genotyp der Tiere, waren aber weitgehend vom TSE-Stamm abhängig (JEFFREY et al. 2001 a; GONZÁLEZ et al. 2002, 2003, 2010 b). Intraneuronale PrPSc- Ablagerungen korrelierten am häufigsten mit dem Auftreten von klinischen Symptomen (GONZÁLEZ et al. 2002, 2003). Mit an unterschiedliche AS-Sequenzen des Prion-Proteins bindenden Antikörpern war es außerdem möglich, verschiedene TSE-Stämme zu detektieren und auf diese Art voneinander zu differenzieren. Bei diesem sog. epitope mapping wurde ext- razelluläres PrPSc, welches als vollständiges Protein vorlag (JEFFREY et al. 1998), durch andere Antikörper detektiert als beispielsweise intrazelluläres PrPSc, welches je nach TSE- Stamm und zellabhängig unterschiedlich stark einer partiellen Proteolyse ausgesetzt war. Auf diese Art war es möglich, natürliche ovine Scrapie-Fälle von oviner BSE und dem experimen- tellen mauspassagierten Scrapie-Stamm SSBP/1 zu unterscheiden (JEFFREY et al. 2001 a, 2003; MARTIN et al. 2005). Bei Ziegen zeigten dagegen BSE, SSBP/1 und CH1641 überra- schend ähnliche Phänotypien. Natürlich vorkommende caprine Scrapie-Fälle wiesen eine gro- ße Variabilität auf, weshalb auch bei Ziegen, ähnlich wie bei Schafen, die Existenz einer Vielzahl von Scrapie-Stämmen vermutet wird (JEFFREY et al. 2006 b).
2.6 Atypische Scrapie bei Schaf und Ziege
Atypische Scrapie wurde erstmals 1998 in norwegischen Schafen nachgewiesen (BENESTAD et al. 2003) und unterschied sich neben veränderten biochemischen und patho- genetischen Eigenschaften von klassischer Scrapie v. a. darin, dass mit Tieren zwischen drei bis zu sechs Jahren ältere und nur einzelne Tiere einer Herde betroffen waren. Atypische Scrapie konnte bei Schafen bereits in einigen Ländern der Europäischen Union (EUROPÄISCHE UNION 2008), in der Schweiz (SEUBERLICH et al. 2007) und auf den Falklandinseln (EPSTEIN et al. 2005) nachgewiesen werden. Bei Ziegen sind u. a. Fälle in
