8 LITERATURVERZEICH&IS
8.1 Gesetze und Verordnungen
Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des europäischen Parlaments und des Rates vom 22.Mai 2001 mit Vorschriften zur Verhütung, Kontrolle und Tilgung bestimmter transmissibler spongifor-mer Enzephalopathien (zuletzt geändert durch Verordnung (EU) #r. 189/2011 der Kommissi-on vom 25. Februar 2011, L53/56)
(Amtsblatt L147/1 vom 31.05.2001) 2002
Verordnung zur fleischhygienerechtlichen Untersuchung von geschlachteten Rindern auf BSE (BSE-Untersuchungsverordnung - BSEUntersV) vom 18. September 2002 (zuletzt geändert durch Artikel 1 der Verordnung vom 13. Juli 2011, BGBl. I S. 1390)
(BGBl. I S. 3730; 2004 I S. 1405)
2005
Verordnung (EG) Nr. 36/2005 der Kommission vom 12. Januar 2005 zur Änderung der An-hänge III und X der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der epidemiologischen Überwachung auf transmissible spongiforme En-zephalopathien bei Rindern, Schafen und Ziegen
(Amtsblatt L10/9 vom 13.1.2005) 2006
Verordnung (EG) Nr. 1041/2006 der Kommission vom 7. Juli 2006 zur Änderung des An-hangs III der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und
des Rates hinsichtlich der Überwachung transmissibler spongiformer Enzephalopathien bei Schafen
(Amtsblatt L187/10 vom 8.7.2006) 2010
Verordnung (EU) Nr. 956/2010 der Kommission vom 22. Oktober 2010 zur Änderung des Anhangs X der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Liste der Schnelltests
(Amtsblatt der Europäischen Union L279/10 vom 23.10.2010)
9 Anhang
9.1 Material
9.1.1 Antikörper gegen das Prion-Protein
Tab. 21 Übersicht über die in der Immunhistochemie und im Westernblot verwendeten Erstantikör-per
Antikörper Epitop Tierart Verdünnung Bezugsquelle Literatur Immunhistochemie
1:10000 VMRD, Pullmann, USA
O’Rourke et al.
• EnVisionTM–System-HorseRadish Peroxidase Labelled Polymer Anti-mouse (Dako, Hamburg)
Konjugate für die Untersuchungen im Westernblot:
• Ziege-Anti-Maus IgG, spezifisch für die H + L-Ketten, mit alkalischer Phosphatase gekoppelt (115-035-062, Dianova, Hamburg)
• Anti-Histidin-Antikörper, RGS – His, zur Detektion des mit einem Histidin-Tag ver-sehenen FLI-Markers (Qiagen, Hilden).
9.1.1.2 Vorbehandlung für die in der Immunhistologie verwendeten Antikörper
Tab. 22 Übersicht über die Vorbehandlungen der in der Immunhistologie verwendeten monoklonalen Antikörper mittels Ameisensäurebad, Blockierung der endogenen Peroxidase durch Was-serstoffperoxid (H2O2), Hitzebehandlung im Autoklaven, verschiedener Puffermedien oder Proteinase K (PK)-Verdau
Antikörper Ameisensäure Methanol +H2O2
Autoklav
(121 °C, 3 bar) Puffer PK-Verdau
6C2 30 min 30 min 20 min Zitratpuffer,
(pH 6,0)
F99 30 min 30 min 20 min Zitratpuffer,
(pH 6,0)
L42 15 min 30 min PK-Puffer
5 min PK-Puffer, 15 min PK-Gebrauchslösung bei 37 °C
min = Minute, grau hinterlegt = Leerfeld
9.2 Histologische Methoden 9.2.1 Protokolle
9.2.1.1 Gewebeinfiltrationsautomat, Standardprotokoll
Formalin (NBF) 30 Minuten 37°C
Ethanol 70 %-ig 1 Stunde 37°C
Ethanol 80 %-ig 1 Stunde 37°C
Ethanol 96 %-ig I u. II je 1 Stunde 37°C
Isopropanol 96 %-ig I u. II je 1 Stunde 37°C
Xylol I u. II je 1 Stunde 37°C
Paraffin I, II u. III je 1 Stunde 60°C
9.2.1.2 Entparaffinisierung und Rehydrierung der histologischen Schnitte
Xylol I u. II je 5 Minuten
Isopropanol 96 %-ig I u. II je 3 Minuten
Ethanol 96 %-ig 2 Minuten
Ethanol 70 %-ig 2 Minuten
Ethanol 50 %-ig 2 Minuten
9.2.1.3 Dehydrierung der histologischen Schnitte Ethanol 50 %-ig 2 Minuten Ethanol 70 %-ig 2 Minuten
Ethanol 96 %-ig 2 Minuten
Isopropanol 96 %-ig I u. II je 2 Minuten
Xylol I u. II je 3 Minuten
9.3 Schemata zur Auswertung von histologisch untersuchten Schnitten
Tab. 23 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Ausprägungsgrades vakuolärer Verände-rungen (VakuolisieVerände-rungen, spongiforme VerändeVerände-rungen) in den Kerngebieten der Obexregi-on (nach Färbung mit Hämatoxylin-Eosin)
geringgradig ≤ 5 Vakuolen (10- er Objektiv) mittelgradig 5-10 Vakuolen (10- er Objektiv) hochgradig > 10 Vakuolen (10- er Objektiv)
Tab. 24 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils PrPSc-exprimierender Folli-kel/Ganglien an der Gesamtanzahl der untersuchten FolliFolli-kel/Ganglien in der immunhisto-chemischen Untersuchung des lymphoretikulären Systems/enterischen Nervensystems geringgradig weniger als 30 % der untersuchten Follikel/Ganglien positiv
mittelgradig weniger als 50 % der untersuchten Follikel/Ganglien positiv hochgradig mehr oder gleich 50 % untersuchten der Follikel/Ganglien positiv
Tab. 25 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils PrPSc-exprimierender Zellen an der Gesamtzellzahl der Gewebestruktur für die immunhistologischen Untersuchungen der Obex-region
+ geringgradig einzelne positive Zellen, maximal 20 % der Gesamtzellzahl ++ mittelgradig viele positive Zellen, maximal 60 % der Gesamtzellzahl +++ hochgradig (fast) alle Zellen positiv, 80-100 % der Gesamtzellzahl
9.4 Tabellarische Übersichten über die in den Sektionen entnommenen Proben
Tab. 26 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Kopfes und des Magen-Darm-Trakts
Proben des Kopfes Proben des Magen-Darm-Trakts
Gl. mandibularis Lnn. ruminales
Ln. mandibularis Lnn. lienales
Ggl. cervicale craniale* Rumen*
Ggl. nodosum* Reticulum*
N. facialis* Abomasum*
M. masseter Omasum*
Gl. parotis Lnn. jejunales* (kranial)
Ln. retropharyngealis medialis* Lnn. jejunales* (kaudal/nahe Ileum)
Maulschleimhaut Duodenum*
Lingua* Jejunum proximalis
Nasenschleimhaut Jejunum distalis
Tonsillae Ileum*
Palpebra III* Jejunale Peyer` Platte*
N. opticus* Ileale Peyer` Platte*
Gl. lacrimalis Ileozäkaleingang
Retina/Bulbus oculi* Colon proximalis
M. retractor bulbi Colon medialis
Chiasma opticum* Lnn. colici*
Hypophyse* Rectum*
Ggl. trigeminale* Plexus pelvinus
Respiratorisches Epithel Faeces
*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; Ggl. = Ganglion, Gl. = Glandula, Ln./Lnn. = Lymphonodus/Lymphonodi, M. = Musculus, N. = Nervus
Tab. 27 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Tierkörpers
Proben des Tierkörpers
Vesica urinaria* M. supraspinatus
Pancreas M. biceps brachii
Lien* N. radialis
Ren* N. medianus
Gl. suprarenalis* Plexus brachialis*
Ggl. coeliacum* Ln. subiliacus*
Ggl. mesentericum craniale* Lnn. cervicales superficiales*
M. psoas major* Thymus
Lnn. iliaci mediales* Thyreoidea
Hepar* N. sympaticus
Vesica fellea N. vagus*
Lnn. hepatici Oesophagusschleimhaut
Aorta Pulmones*
N. phrenicus Ggl. stellatum*
N. splanchnicus major* Lnn. bronchomediastinales
M. longissimus dorsi* Cor*
N. ischiadicus* Septum cordis
N. fibularis communis Medulla ossium femoralis
N. saphenus Penis/Prostata
M. semitendinosus* Mamma/Ovar
M. quadriceps vastus lateralis* Placenta*
Lnn. poplitei Uterus*
M. triceps brachii* Lnn. mammarii1
*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; 1Proben nur bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; Ggl. = Ganglion, Gl. = Glandula, Ln./Lnn. = Lymphonodus/Lymphonodi, M.
= Musculus, N. = Nervus
Tab. 28 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Zentralen Nervensystems
Proben des Zentralen &ervensystems
C 1 – 2* L 5 – L 6
C 2 – 3 Cauda equina
C 3 – 4 Cerebellum
C 4 – 5 Mesencephalon
C 5 – 6 Pons
C 6 – 7 Medulla cranialis
C 7 – T 2 Obex
T 2 – T 4 Medulla caudalis
T 4 – T 6 Gehirn1 (Anteile cranial der Pons)*
T 6 – T 8* Rhinencephalon
Dorsale Wurzelganglien C1 – C6 Cerebrum frontalis
T 9 – 10 Cerebrum parietalis
T 10 – 11 Cerebrum occipitalis
T 12 – L 1 Basalkerne
L 2 – L 3* Thalamus
L 3 – L 4
*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; 1bei zwei Dritteln der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie und bei allen Damaskusziegen aus Zypern wurde das Gehirn paramedian ge-teilt und konserviert, bei einem Drittel der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie wurde das Gehirn in Einzelproben zerteilt und konserviert; C = Nervi cervicales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae cervica-les, L = Nervi lumbales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae lumbacervica-les, T = Nervi thoracales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae thoracales, grau hinterlegt = Leerfeld
9.5 Protokolle zur Fraktionierung der in der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Blut- und Milchproben
9.5.1 Protokoll zur Fraktionierung von caprinem Citrat-Vollblut
Die Proben sind TSE-steril zu entnehmen. Das Mischungsverhältnis von Citratpuffer und Blut beträgt 1 ml : 9 ml.
1. Gewinnung von Thrombozyten und Plasma aus Citratvollblut:
- entnommene Blutproben für 30 min bei 200 g und Raumtemperatur (RT) ohne Bremse zentrifugieren
- thrombozytenreiches Plasma (Überstand) sehr vorsichtig Abnehmen (Einmalpasteurpipette) - thrombozytenreiches Plasma und verbliebene Erythrozyten für 10 min bei 2000 g und RT ohne Bremse zentrifugieren (Weiterbearbeitung der roten Blutzellen erfolgt unter Punkt 2.
und Punkt 3.)
- Plasma über dem Thrombozytenpellet verwerfen und das Thrombozytenpellet ohne Luftin-sufflation in 2 ml 1 x PBS resuspendieren, auf zwei 1,5 ml-Reaktionsgefäße verteilen und diese für 5 min bei 700 g und RT zentrifugieren
- Überstand verwerfen und Pellets bei -70 °C einfrieren
2. Gewinnung der Leukozyten (buffy coat-Zellen) aus Citratvollblut:
Fortsetzung von Punkt 1.:
- Plasma über Erythrozyten abnehmen und 10 min bei 2000 g und RT zentrifugieren - zellfreies Plasma vorsichtig abnehmen, alliquotieren und bei –70 °C lagern
- buffy coat-Zellen über Erythrozyten abnehmen und Erythozyten-Lysispuffer zugeben (fünf-faches Volumen an Erythrozyten-Lysispuffer zur hypotonen Lyse der Erythrozyten zugeben) invertieren und 5 min bei RT inkubieren
- mit 1 x PBS auf 50 ml auffüllen und für 10 min bei 300 g und RT mit Bremse zentrifugieren - Überstand verwerfen, Leukozytenpellet erneut in 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer resuspendie-ren dann 5 min bei RT inkubieresuspendie-ren, mit 1 x PBS auf 50 ml auffüllen und für 10 min bei 300 g und RT mit halber Bremse zentrifugieren
- Überstand verwerfen, Pellet in 10 ml 1 x PBS resuspendieren auf 50 ml mit 1 x PBS auffül-len und 10 min bei 300 g und RT zentrifugieren
- den Überstand verwerfen das Pellet in 6 ml 1 x PBS resuspendieren, in drei 2 ml-Reaktionsgefäße alliquotieren dann 5 min bei 300 g abzentrifugieren
- Überstand verwerfen und Leukozytenpellet bei –70 °C einfrieren 3. Gewinnung der Erythrozyten aus Citratvollblut
Fortsetzung von Punkt 1.:
- Erythrozyten invertieren, alliquotieren und bei -70 °C einfrieren 9.5.2 Protokoll zur Verarbeitung von Serumproben
Die Proben sind TSE-steril zu entnehmen.
- Serumröhrchen nach Abnahme bei RT für 3-4 h stehen lassen - Röhrchen für 5 min bei 300 g und RT ohne Bremse zentrifugieren - Serumüberstand abnehmen für 10 min bei 2000 g bei RT zentrifugieren - gereinigten Serumüberstand abnehmen, alliquotieren und bei -70 °C lagern 9.5.3 Protokoll zur Fraktionierung von capriner Vollmilch
Die Proben sind TSE- steril zu entnehmen.
- Milch- und Kolostrumproben in PBS mit 10 mM EDTA 1 : 2 bzw. 1 : 5 verdünnen - bei 780 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren
- Rahm mit Einwegteelöffel abnehmen und bei -70 °C einfrieren
- Rest der Probe schwenken bis die Zellen vom Boden vollständig aufgewirbelt sind, dann durch ein 100 µm Zellsieb geben, erneut bei 780 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren
- entrahmte Milch über Zellpellet abnehmen, alliquotieren bei –70 °C einfrieren
- Zellpellet dreimal in PBS mit 10 mM EDTA waschen, zwischen den Waschschritten jeweils bei 1900 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren, danach das Zellpellet bei -70 °C einfrieren - Zellen vor dem Einfrieren in einer Zählkammer zählen
9.6 Ergebnistabellen
9.6.1 Damaskusziegen aus Zypern 9.6.1.1 Ergebnisse des FLI-Tests
Tab. 29 Vergleich der klassischen caprinen und ovinen Scrapie-Isolate und der caprinen, ovinen und bovinen BSE-Isolate nach den Glykosylierungsverhältnissen (4 Gelläufe), dem Antikörper-bindungsverhältnis (2 Gelläufe), der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc sowie deren Differenz zur unglykosylierten Form des PrPSc der internen diglyk., monoglyk. und unglyk. PrPSc = di-, mono- und unglykosylierte Form des PrPSc, MM = mole-kulare Masse, Diff. = Differenz der unglykosylierten Form des PrPSc der Probe zur unglykosylierten Form des PrPSc der internen Scrapie-Referenz, ± = Standardabweichung,*5 Gelläufe, um Abweichun-gen zu reduzieren
141
Ergebnisse des Langzeit Proteinase K-Verdaus
lykosylierungsverhältnisse der di-, mono- und unglykosylierten Form des PrP Sc, molekula-re Masse der unglykosylierten PrP Sc-Form, Langzeit-Proteinase K-Verdau und Antikörper-indungsverhalten von einem caprinen und ovinen BSE-Isolat und fünf ausgesuchten capri-en Scrapie-Isolaten der Zypernziegen
diglyk., monoglyk. und unglyk. PrPSc = di-, mono- und unglykosylierte Form des PrPSc, MM = molekuare Masse, AK = Antikörper,
*Aus Mangel an Material wurde der Mittelwert für den Langzeit-Proteinase K-Verdau der ZYP 21 aus nur drei statt der üblichen 4 Gelläufen ermittelt
9.7 Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben in A. bidest angesetzt und bei RT gelagert.
APS-Lösung (10 %-ig)
Ammoniumpersulfat 1 g
A. bidest. 10 ml
Assay Puffer (10x, pH 9,8)
Tris 24,2 g
MgCl2 2,03 g
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentrati-on verdünnt.
Blotting Puffer
Tris 3,03 g
Glycin 14,4 g
Methanol 200 ml
SDS 2 g
A. bidest. ad 1 l
Bromphenolblaulösung (1 %-ig)
Bromphenolblau 1 g
A. bidest. ad 100 ml
Citratpuffer (pH 7,2; Citratblut)
Trinatrium-Citrat-Dihydrat 19 g
NaCl 4,5 g
A. dest. ad 500 ml
Der pH-Wert wurde mit Zitronensäure eingestellt, die Lösung anschließend steril filtriert.
Lagerung bei 4 °C.
Citratpuffer (1 M, pH 6,0; Methanol-Fällung)
Zitronensäuremonohydrat 21,01 g
A. bidest. ad 100 ml
Der pH-Wert wurde mit Natronlauge eingestellt.
Citratpuffer (0,01 M, pH 6,0; Immunhistologie)
Trinatriumzitrat-dihydrat 2,94 g
A. bidest. ad 1 l Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) vorsichtig eingestellt.
CVL-Puffer (10x, pH 6,8)
SDS 2 g
Tris/HCl-Lösung (1 M, pH 7,4) 5 ml
Mercaptoethanol 5 ml
Sucrose 3 g
1 %-ige Bromphenolblau-Lösung 5 Tropfen
A. bidest. ad 20 ml
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 2x Konzentrati-on verdünnt.
DAB-Lösung
Diaminobenzidintetrahydrochlorid 100 mg Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,1) ad 200 ml Vor Gebrauch filtrieren.
H2O2 (kurz vor Gebrauch zufügen) 70 µl Denaturierungspuffer
SDS 5 g
Mercaptoethanol 10 ml
A. bidest. ad 100 ml
Eosin
Eosin G 10 g
Eisessig 10 Tropfen
Ethanol (50 % v/v) ad 1 l
E-Puffer (10x)
Tris 150 g
Glycin 720 g
SDS 50 g
A. bidest. ad 5 l
Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentration verdünnt.
Erythrozyten-Lysispuffer (pH 7,2-7,3)
NH4Cl 8,0 g
KHCO3 1,0 g
Na2-EDTA 37,2 mg
A. dest. ad 1000 ml
Nach Sterilfiltrierung Lagerung bei 4 °C bis zu 3 Wochen.
Formalin (4 %-ig, neutral gepuffert)
A. bidest. 900 ml
Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat 4 g Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei 8,15 g komplett mit Magnetrührstäbchen lösen
37 %-iges Formalin 100 ml
Hämatoxylin-Lösung
Hämatoxylin 1 g
A. bidest. ad 1 l
vollständig lösen
Natrium-Iodat 0,2 g
Kalium-Aluminiumsulfat 50 g
dazugeben und vollständig lösen
Chloralhydrat 50 g
Zitronensäure-Monohydrat 50 g Mindestens 4 Wochen reifen lassen. Vor Gebrauch filtrieren.
Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,1)
Imidazol 1,36 g
A. bidest. ad 200 ml
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt.
Kaliumchlorid (3 M)
Kaliumchlorid 7,46 g
A. bidest. ad 100 ml
Lysispuffer (Methanolfällung)
Kaliumchlorid 3 M 667 µl
Citratpuffer (pH 6) 1M 500 µl
Magnesiumchlorid 1 M 50 µl
Sarkosin 0,125 g
A. bidest. ad 10 ml
Magermilch (5 %-ig)
Magermilchpulver 5 g
PBS-Tween ad 100 ml
Methanol mit 3 % H2O2
Wasserstoffperoxid, 30 %-ig 20 ml
Methanol 180 ml
Magnesiumchloridlösung (0,1 M)
Magnesiumchloridhexahydrat 2,03 g
A. bidest. ad 100 ml
Magnesiumchloridlösung (1 M)
Magnesiumchloridhexahydrat 20,33 g
A. bidest. ad 100 ml
&atriumazidlösung (10 %-ig)
Natriumazid 0,65 g
A. bidest ad 100 ml
&atronlauge (2 M)
Natriumhydroxid 80 g
A. bidest. ad 1 l
PBS (10x)
Natriumchlorid 400 g
Kaliumchlorid 10 g
Kaliumdihydrogenphosphat 10 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 57,5 g
A. bidest. ad 5 l
Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentration verdünnt.
PBS mit 10 mM EDTA
EDTA (x2H2O) 3,27g
PBS ad 1 l
PBS mit 4 % Sarkosyl (pH 7,4)
Sarkosyl 10 g
PBS ad 250 ml
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt.
PBS-Tween
Tween 20 1 ml
PBS ad 1 l
Pefabloc (0,1 M)
Pefabloc 100 mg
A. bidest. ad 4,17 ml
Lagerung bei –20 °C.
PK-Gebrauchslösung (Histologie, 4 µg/ml PK))
PK-Stammlösung 760 µl
PK-Puffer (1x) 190 ml
PK-Puffer (10x, pH 8,3)
Tris 60,56 g
EDTA 2,92 g
Tween 20 10 ml
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentrati-on verdünnt. Lagerung bei 4-8 °C.
PK-Stammlösung (1 mg/ml)
Proteinase K 100 mg
A. bidest. 100 ml
Lagerung bei – 20 °C.
4 %-ige PTA mit 34 mM MgCl2 (pH 7,4)
PTA 4 g
Magnesiumchloridhexahydrat 691 mg
A. bidest. ad 100 ml
Der pH-Wert wurde mit Natronlauge (NaOH) eingestellt.
SDS-Lösung (10 %-ig)
SDS 1 g
A. bidest. ad 10 ml
Sucrose-DOC-&P40-Lysis-Puffer
Sucrose 10,95 g
NP40 0,5 ml
DOC 0,5 g
A. bidest. ad 100 ml TBS (10x, pH 7,6)
Tris 60,57 g
Natriumchlorid 80 g
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentrati-on verdünnt.
TBS mit 10 % Ziegenserum und 0,03 % &atriumazid Ziegenserum
(hitzeinaktiviert 3 h, 56 °C Wasserbad) 10 ml
Natriumazid (30 %-ig) 300 µl
1x TBS ad 100 ml
Lagerung bei 4-8 °C.
Tris-Puffer
Tris/HCl 0,5 M, pH 6,8
Tris 60,57 g
A. bidest. ad 1 l
Tris/HCl 1,5 M, pH 8,8
Tris 181,71 g
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde jeweils mit Salzsäure (HCl) eingestellt.
Thyroglobulin
Thyroglobulin 50 mg
A. bidest. ad 10 ml
9.8 Rezepte
SDS-Polyacrylamid-Gele
Trenngel, 16 %-ig (zwei Gele) Sammelgel (zwei Gele)
Aqua dest 3,0 ml Aqua dest 6 ml
1,5 M TrisHCl (pH 8,8) 3,75 ml 0,5 M TrisHCl (pH 6,8) 2,5 ml 30 %-ig Bis-Acrylamid 8,0 ml 30 %-ig Bis-Acrylamid 1,3 ml
10 %-ig SDS 750 µl 10 %-ig SDS 500 µl
10 %-ig APS 100 µl 10 %-ig APS 200 µl
TEMED 10 µl TEMED 20 µl
9.9 Arzneimittel
Ketaminhydrochlorid 10% Bremer Pharma GmbH, Warburg Lidocainhydrochlorid 2 % B. Braun Melsungen AG, Melsungen Paraffinum perliquidum WdT eG, Garbsen
Rompun (Xylazinhydrochlorid) 2 % Bayer, Leverkusen
T61 Injektionslösung Intervet Deutschland GmbH, Unterschleißheim 9.10 Chemikalien
Acrylamid – Stammlösung (30 %-ig) mit Bisacrylamid Roth, Karlsruhe (Rotiphorese Gel 30)
Ameisensäure 98 – 100 %-ig Merck, Darmstadt
Ammoniumpersulfat (APS) Merck, Darmstadt
Benzonase Sigma-Aldrich, Steinheim
Bromphenolblau Riedel de Häen, Sigma-Aldrich,
Steinheim
CDP – Star Tropix, Perkin Elmer, Foster City,
USA
Chloralhydrat Merck, Darmstadt
Desoxycholat (DOC) Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim
Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim Dinatriumdihydrogenphosphatmonohydrat Roth, Karlsruhe
Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei Roth, Karlsruhe Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Roth, Karlsruhe
Dodecylsulfat-Natriumsalz (SDS) AppliChem, Darmstadt
Entellan® Merck, Darmstadt
Eosin G Sigma-Aldrich, Steinheim
Essigsäure, 100 %-ig, p. a. (Eisessig) Roth, Karlsruhe
Ethanol pro analysi (p. a.) Roth, Karlsruhe
Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) Serva, Heidelberg
Formalin, 37 %-ig Roth, Karlsruhe
Hämatoxylin Merck, Darmstadt
Imidazol Sigma-Aldrich, Steinheim
Isopropanol p. a. (2-Propanol) Roth, Karlsruhe
Kalium-Aluminiumsulfat Merck, Darmstadt
Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt
Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Kochsalzlösung, isotonisch, 0,9 %-ig Braun, Melsungen
Magermilchpulver Humana Milchunion, Herford
Magnesiumchloridhexahydrat Roth, Karlsruhe
Methanol, 99,8 %-ig Roth, Karlsruhe
Mercapthoethanol Merck, Darmstadt
Natrium-Azid, > 99 %-ig p. a. Roth, Karlsruhe
Natrium-Chlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe
Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat Roth, Karlsruhe
Natrium-Iodat Merck, Darmstadt
Natronlauge (NaOH) Roth, Karlsruhe
N-Lauryl-Sarkosin (Sarkosyl) Sigma, Steinheim
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (Temed) Roth, Karlsruhe
Nonidet P40 (NP-40) Roche, Mannheim
Pefabloc SC® Roche, Mannheim
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich, Steinheim Phosphorwolframsäure (PTA) Sigma-Aldrich, Steinheim Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat (Tween 20) Merck, Darmstadt
Proteinase K Roche, Mannheim
Salzsäure konz. (37 %-ig) (HCl) Riedel de Häen, Sigma-Aldrich, Steinheim
Sucrose Roth, Karlsruhe
Thyroglobulin Sigma, Steinheim
Trinatriumzitrat-dihydrat Roth, Karlsruhe
Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris) Invitrogen, Karlsruhe Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck, Darmstadt
Xylol Roth, Karlsruhe
Ziegenserum INNT, FLI
Zitronensäure-Monohydrat Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim
9.11 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Abzugstisch (TAZ 19) Medite, Burgdorf
Baumschere Gardena, Ulm
Bestecke (Klemmen, Pinzetten, Scheren, u. a.) Heiland, Hamburg; Lenecke, Schortens
Bijoux-Röhrchen ( 7 ml, 30 ml) Sarstedt, Nümbrecht Biopsiezange (Bronchoskopiezange), Chevalier-Jackson Leihgabe, TiHo Hannover Blotting-Apparatur Trans-Blot, Semi Dry BioRad, München
Braunüle (Vasofix 17 G) Heiland, Hamburg
Cover-Plates Life Science Int. GmbH,
Frank-furt/Main
Dampfsterilisator Varioklav Thermo Scientific
Deckgläser Menzel-Gläser, Braunschweig
Dounce Tissue Grinder (7ml) Wheaton, USA
Einbettautomat EG 1140H Leica, Wetzlar
Einbettkassetten, Kunststoff Roth, Karlsruhe
Eindeckautomat CV5030 Leica, Wetzlar
Einwegteelöffel Marktkauf, Greifswald
Einwegkanülen (18G, 20G, 23G) Terumo, Leuven, Belgien Einweglaryngoskopspatel, Heine XP Miller 4 Heine Optotechnik, Herrsching Einwegpetrischalen, quadratisch Sarstedt, Nümbrecht
Einwegpinzetten Lenecke, Schortens
Einwegrektalspekulum Eickmeyer, Tuttlingen
Einwegskalpelle Cutfix Lenecke, Schortens
Einwegspritzen (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 50ml) Heiland, Hamburg Elektrophoreseapparatur, Mini Protean II BioRad, München Gewebeinfiltrationsautomaten ASP 300 Leica, Wetzlar Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml) Eppendorf, Hamburg
Faltenfilter Schleicher & Schuell, Dassel
Feinwaage Ohaus, Giessen
Glaskästen mit Färbegestell für Histologie Roth, Karlsruhe
Immobilon-P Transfermembran Millipore, Bedford, USA Kamera für Lichtmikroskop Zeiss AxioCam HRc Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
Knopfkanüle NOVA-SCB, Sollentuna, Schwe-den
Laryngoskop, Heine F. O. NT 3,5 V Heine Optotechnik, Herrsching
Lichtmikroskop Axiostar Carl-Zeiss Jena GmbH, Jena
Lichtmikroskop Axioskop 2 plus Carl-Zeiss Jena GmbH, Jena Magnetrührer mit Heizung CB162, Stuart VWR, Darmstadt
Maulgatter Heiland, Hamburg
Metalleinbettschälchen Medite, Burgdorf
Mikrotomklingen S 35 Produkte für die Medizin AG,
Köln
Monovetten für Serum (10 ml) Sarstedt, Nümbrecht
Netzteil, Power Pac (200 V, 300 V) BioRad, München
Objektträger (Super Frost, Super Frost Plus) Menzel-Gläser, Braunschweig
pH-Meter MP220 Mettler-Toledo GmbH, Giessen
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen normal (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Roth, Karlsruhe Pipettenspitzen mit Filter (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Roth, Karlsruhe
Pasteurpipetten (5 ml) Roth, Karlsruhe
Probenbeutel, Rotilabo (unterschiedliche Größen) Roth, Karlsruhe
Ribolyser-Röhrchen (7 ml) BioRad, München
Ribolyser-Stahlkugeln, Precellys-Stahl-Kit 2,8 mm peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Ribolyser TeSeE Precess 48 BioRad, München
Röhrchen (15 ml, 50 ml) Sarstedt, Nümbrecht
Rotationsmikrotom RM 2145 Leica, Wetzlar
Sagitalsäge incl. Sternumsägeblatt (Acculan) Krauth u. Timmermann, Hamburg
Schlachtmesser (Dick) Lehrich, Brühl
Schraubdeckeldose (Speichel) Roth, Karlsruhe
Schnelltest HerdChek BSE-Scrapie Antigen (FLI-B 409) IDEXX, Hoofddorp, Niederlande
Skalpellklingen Lenecke, Schortens
Software Quantity One BioRad, München
Spinalkanülen Yale BD-Medical, Heidelberg
Sterilbank (LaminAir 1.8) Heto-Holten, Alleröd, Dänemark
Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg
Tischwaage (EW 150-JM) Kern, Balingen-Frommern
Tischzentrifuge 5804 R Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg
Trimmmessergriff und -klingen Medite, Burgdorf
Versa Doc 5000, Imaging System BioRad, München
Vortex Genie 2 Roth, Karlsruhe
Wägeschalen Merck, Darmstadt
Wärmeschrank (T6030) Heraeus, Hanau
Wasserbad HI 1210 Leica, Wetzlar
Whatman-Chromatographiepapier Whatman, Maldstone, England
Zählkammer nach Neubauer VWR, Darmstadt
Zellsieb (100 µm) BD Biosciences, Heidelberg
Zuchtfutterpellets M-Z Ssniff, Soest
Zusatzfuttermittel für Ziegen Vilomix Tierernährung GmbH, Neuenkirchen Vörden
Danksagung
Zum Gelingen dieser Arbeit hat eine Vielzahl an Personen beigetragen.
Prof. Dr. Dr. h. c. T. C. Mettenleiter möchte ich für die Möglichkeit danken, am Friedrich-Loeffler-Institut Insel Riems meine Dissertation anfertigen zu können.
Prof. Dr. M. H. Groschup möchte ich danken für die Bereitstellung des Themas, die wissen-schaftliche Betreuung und die Schaffung der Voraussetzungen für die umfassende Realisie-rung des Projektes.
Dr. A. Balkema-Buschmann danke ich für die fachliche Beratung und Dr. C. Fast für die wis-senschaftliche Betreuung der Arbeit sowie beiden für Ihre praktische Unterstützung der Pro-jekte.
Dr. M. Eiden gilt mein besonderer Dank, die engagierte Zusammenarbeit hat die Arbeit an dem Thema stets interessant gestaltet.
Für die tatkräftige Unterstützung vor allem bei den aufwendigen Sektionen möchte ich Dr. U.
Ziegler, Dr. M. Keller, M. Kaatz, B. Hammerschmidt, G. Kreplin, J. Herger, U. Duve, D.
Windolph, I. Nedow und allen anderen beteiligten Mitarbeitern des INNT danken. Dank gilt außerdem R. Ogonowski für die verwaltungsseitige Hilfe, B. Schiller, M. Brinckmann und V.
Netz für die Versorgung der Tiere, Dr. M. Ziller für die statistische Beratung, den Mitarbeite-rinnen der Bibliothek B. Riebe und M. Naß sowie den Kollegen des Friedrich-Loeffler-Instituts aller Standorte für die vielseitige Unterstützung.
Weiterhin danke ich den Europäischen Kooperationspartnern des Projektes GoatBSE und in Zypern für die fachliche Unterstützung und die kollegiale Aufnahme, Dr. T. Kuczius vom Universitätsklinikum in Münster für die methodische Beratung und Prof. M. Ganter von der Tierärztlichen Hochschule in Hannover für die praktische Einführung in die Bioptatentnahme beim Schaf.
B. Strohmeier und K. Tauscher danke ich neben ihrer praktischen Mithilfe für rege fachliche Diskussionen und Ihre freundschaftliche Unterstützung.
Mein ganz persönlicher Dank gilt abschließend meinem Vater und meiner ganzen Familie, insbesondere dem Mann meines Herzens C. Niedermeyer und meiner Tochter Martha.