Aus der Abteilung Nephrologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Deletion der Protein Kinase C Beta(PKC β) Isoform schützt vor renaler Hypertrophie aber nicht vor Albuminurie im
streptozotocin induzierten diabetischen Mausmodell
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Daniel Overheu
aus Hildesheim
Hannover 2007
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 03.07.2007
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter Suermann
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Hermann Haller Dr. med. Matthias Meier
Referent: Prof. Dr. med. Georg Brabant
Korreferent: Prof. Dr. med. Hans Heinrich Kreipe Tag der mündlichen Prüfung: 03.07.2007
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Tobias Welte
Prof. Dr. med. Carlos Guzman
PD Dr. med. Frank Gossé
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...3
1.1 Klassifikation des Diabetes mellitus...3
1.2 Inzidenz und Prävalenz des Diabetes mellitus ...5
1.3 Vaskuläre Komplikationen des Diabetes mellitus...5
1.3.1 Makrovaskuläre Komplikationen des Diabetes mellitus ...5
1.3.1.1 Arteriosklerose...5
1.3.1.1.1 Allgemeines ...5
1.3.1.1.2 Entstehung arteriosklerotischer Veränderungen...6
1.3.2 Mikrovaskuläre Komplikationen des Diabetes mellitus...8
1.3.2.1 Diabetische Retinopathie ...8
1.3.2.2 Diabetische Polyneuropathie ...10
1.3.2.3 Diabetische Nephropathie...11
1.4 Molekulare Mechanismen diabetischer mikrovaskulärer Komplikationen...13
1.4.1 Advanced Glycolisation Endproducts (AGEs)...13
1.4.2 Oxidativer Streß...15
1.4.3 Proteinkinase C...17
1.4.3.1 PKC Isoforme und ihre Aktivierung ...17
1.4.3.2 Zelluläre Effekte der PKC Aktivierung ...18
1.4.3.2.1 Veränderungen der vaskulären Kontraktilität und des Blutflusses ...18
1.4.3.2.2 Basalmembranverdickung und extrazelluläre Matrixveränderungen...19
1.4.3.2.3 Vaskuläre Permeabilität, Zellwachstum und Angiogenese ...20
1.4.3.2.4 Aktivitätsveränderungen der Na+ K+ ATPase...21
2 Hypothese ...22
3 Material...23
3.1 Maus SV129 mit Knockout für PKC β ...23
3.2 Maus SV129 Wildtyp ...23
3.3 Zentrifugen ...23
3.4 Kreatininmessgerät ...23
3.5 Albumin ELISA Kit ...24
3.6 ELISA Reader ...24
3.7 Blutzuckermessgerät...24
3.8 Wärmeschrank ...24
3.9 Rotationsmikrotom ...24
3.10 Kryomikrotom ...24
3.11 Wärmebad für histologische Schnitte...24
3.12 Einbettungsautomat für Paraffinschnitte ...25
3.13 Mikroskop...25
3.14 Bildverarbeitungssoftware...25
3.15 Färbelösungen...25
3.16 Antikörper für Immunhistologie...27
3.17 Chemikalien...28
3.18 Gefäße und Labormaterial ...28
4 Methoden ...29
4.1 Aufzucht der Versuchstiere und Versuchsablauf ...29
Inhaltsverzeichnis
4.2 Gewinnung von Spot Urin...29
4.3 Gewinnung einer Blutprobe...30
4.4 Induktion einer diabetischen Stoffwechsellage ...31
4.5 Organentnahme und Perfusion der Mäuse...32
4.6 Albumin ELISA...33
4.7 Messung der Kreatininkonzentration im Mausurin ...36
4.8 Aufbereitung der Nierenblöcke für die histologischen Kryo und Paraffinschnitte.36 4.8.1 Vorbereitung zur Paraffinfixierung ...36
4.8.2 Paraffinfixierung im Automaten...36
4.8.3 Schneiden und Fixieren der Paraffinblöcke...37
4.8.4 Schneiden und Fixieren der Kryopräparate ...37
4.9 Übersichtsfärbung nach Masson Goldner ...37
4.10 Spezifische Immunfärbungen ...39
4.11 Semiquantitative Auswertung der Immunhistochemie...40
4.12 Bestimmung des glomerulären Volumens...40
5 Ergebnisse...42
5.1 Klinische Daten ...42
5.1.1 Blutzucker...42
5.2 Albuminurie...42
5.3 Immunhistologie und semiquantitative Auswertung...44
5.3.1 Perlecan ...44
5.3.2 VEGF...46
5.3.3 Nephrin ...48
5.4 Körper und Nierengewicht ...51
5.4.1 Körpergewicht ...51
5.4.2 Nierengewicht...51
5.4.3 Nieren /Körpergewichtsquotient und glomeruläres Volumen ...52
5.5 Extrazelluläre Matrixbildung...54
5.5.1 Übersichtsfärbung nach Masson Goldner ...55
5.5.2 Fibronectin...56
5.5.3 Kollagen Typ III und Typ IV...57
5.6 Expression des profibrotischen Zytokins TGF β1...60
6 Diskussion ...65
7 Zusammenfassung ...74
8 Literaturverzeichnis ...75
9 Abbildungs und Tabellenverzeichnis ...81
10 Veröffentlichungen ...83
11 Anhang...84
Abkürzungen
Abkürzungen
AGEs = Advanced Glycolisation Endproducts AGE Rx = AGE Rezeptor Nr. x
AK = Antikörper
Ang II = Angiotensin II ATP = Adenosintriphosphat
ChAglyCD3 = aglycosylated human IgG1 antibody directed against CD3 cPL = zytosolische Phospholipase
CTGF = connective tissue growth factor DAG = Diacylglycerol
dest. = destillata
DHAP = Dihydroxyacetonphosphat DNS = Desoxyribonucleinsäure
EIA = Enzymimmunoessay
ELISA = enzym linked immunosorbent assay
Fa. = Firma
G = Gauge
GADA = Glutamatdecarboxylase
GAPDH = Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase GBM = glomeruläre Basalmembran
GFAT = D Fructose 6 Phosphate Amidotransferase GFR = glomeruläre Filtrationsrate
GlcNAc = N Acetylglucosamin
Gln = Glutamin
Glu = Glutamat
HbA1c = Glycohämoglobin
HPSG = Heparansulfatproteoglycan HRP = Meerrettichperoxidase IAA = Insulin Autoantikörper ICA = Inselzell Antikörper iNOS = induzierbare NOS i.p. = intraperitoneal
KO = Knockout
LDL = low density lipoprotein
MAPK = mitogen activated protein kinase MODY = maturity onset diabetes of the young
mRNA = messenger RNA
MSA = Mäuseserumalbumin
N. = Nervus
NAD = Nicotinamidadenindinukleotid
NADPH = Nicotinamidadenindinukleotidphosphat NF = nuclear factor
nNOS = neurale NOS
NO = Stickstoffmonoxid
NOS = NO Synthetase
oLDL = oxidiertes LDL
p = statistische Signifikanz
Abkürzungen
PAS = perjodic acid Schiff
pAVK = periphere arterielle Verschlußkrankheit PCR = polymerase chain reaction
PDGF = platelet derived growth factor
PG = Prostaglandin
PKC = Protein Kinase C
PL = Phospholipase
RAGE = receptor for advanced glycolisation endproducts RBF = renaler Blutfluss
RNA = Ribonukleinsäure ROS = reactive oxygen species
RT = Raumtemperatur
STZ = Streptozotocin
SPF = spezifiziert pathogenfrei TGF = transforming growth factor UDP = Uridindiphosphat
USRDS = United States Renal Data System
VT = durchschnittliches glomeruläres Volumen VEGF = vascular endothelial growth factor
VEGF R = VEGF Rezeptor
WT = Wildtyp
WT 1 = Wilms’ Tumor Supressor 1
1. Einleitung
1 Einleitung
1.1 Klassifikation des Diabetes mellitus
Unter dem Begriff Diabetes mellitus werden eine Gruppe von pathophysiologisch unterschiedlichen Erkrankungsbildern zusammengefasst, die mit dem klinischen Symptom einer Hyperglykämie einhergehen. Aufgrund einer unterschiedlichen Pathogenese werden insgesamt vier verschiedene Unterformen unterschieden: immunogener Insulinmangeldiabetes (Diabetes mellitus Typ 1), insulinresistenter Diabetes mellitus (Typ 2), andere spezifische Diabetesformen (Diabetes mellitus Typ 3) und Gestationsdiabetes (Diabetes mellitus Typ 4).
Unter einem Diabetes mellitus Typ 1 versteht man eine irreversible Destruktion der pankreatischen Betazellen, welche durch immunogene Mechanismen verursacht ist.
Diagnostisch lässt sich ein humoraler Immunmechanismus durch die Bestimmung von typischen Antikörpern wie Inselzell Antikörper (ICA), Insulin Autoantikörper (IAA), Antikörper gegen das Enzym Glutamatdecarboxylase (GADA) oder die Tyrosinkinase IA 2 beim Diabetes mellitus Typ 1 belegen. Zielantigene sind wie oben angeführt unterschiedliche Zellstrukturen der Beta Zelle im Pankreas und das Eiweißmolekül Insulin selbst [2]. Diese Antikörper sind bereits Monate bis Jahre vor dem Ausbruch eines Diabetes mellitus Typ 1 im Blut der Betroffenen nachweisbar und können schon bei Kindern ab einem Alter von zwei Jahren nachgewiesen werden. [3].
Dem Diabetes mellitus Typ 2 liegen wahrscheinlich eine Vielzahl von Glukoseutilisationsstörungen meist auf der Postrezeptorebene der peripheren Insulinrezeptoren sowie eine Sekretionsstörung der Beta Zelle zugrunde. Eine genetische Komponente mit zahlreichen involvierten Genloci wird postuliert, obwohl monogenetische Varianten extrem selten sind [4]. Die Konkordanzrate bei eineiigen Zwillingen schwankt
1. Einleitung
zwischen 30 bis 70%, jedoch scheinen Umweltfaktoren, Ernährung und körperliche Aktivität entscheidend für die phänotypische Ausprägung der genetischen Suszeptibilität zu sein [5].
Ferner werden weitere Formen des Diabetes mellitus unterschieden, welche als Typ 3 zusammengefasst werden. Hierunter fallen zum Beispiel die genetischen Betazelldefekte mit Mutationen in Bereichen der hepatonukleären Transkriptionsfaktoren im Glukokinase Gen (MODY Diabetes), dem Insulinpromotorfaktor 1 oder mitochondrialer DNS. Weiterhin führen Erkrankungen des exokrinen Pankreas im Verlauf ebenfalls zu Störungen der endogenen Pankreasfunktion mit Einschränkung der Insulinsekretion und Hyperglykämie (pankreopriver Diabetes mellitus). Ferner können medikamenteninduzierte Zustände, Infektionen oder Intoxikationen durch insulinantagonistische Wirkungen diabetische Stoffwechselzustände hervorrufen [5].
Hormonell bedingte Störungen des Glukosestoffwechsels mit Ausprägung eines Diabetes mellitus während und infolge einer Schwangerschaft werden als sogenannter Gestationsdiabetes (Diabetes mellitus Typ 4) bezeichnet und stellen ein wichtiges medizinisches Problem, nicht nur für die werdende Mutter, sondern auch für das ungeborene Kind dar [6]. Gesichert ist, dass eine mütterliche Hyperglykämie im 1.Trimenon mit einem höheren Risiko für die Entwicklung einer diabetischen Embryopathie, im 2. und 3. Trimenon für die Entwicklung einer diabetischen Fetopathie mit erhöhter Morbidität und Mortalität verbunden ist [6]. Auch die werdende Mutter hat ein hohes Risiko postpartal einen Diabetes mellitus Typ 2 zu entwickeln [7]. Eine entsprechende Lebensführung im Sinne einer Diabetesprävention kann jedoch die Manifestationsrate senken [8].
1. Einleitung
1.2 Inzidenz und Prävalenz des Diabetes mellitus
Nach einer epidemiologische Studie im Bundes Gesundheitssurvey 1998 betrug in Deutschland die Diabetesprävalenz für Männer 4,7% und 5,6% für Frauen im Schnitt aller untersuchten Altersgruppen [9]. Sowohl Inzidenz als auch Prävalenz nehmen mit dem Alter signifikant zu. Jede fünfte Frau im Alter von 70 bis 79 Jahren hat nach den derzeit vorliegenden Daten einen Diabetes mellitus. Die Erkrankung ist in den neuen Bundesländern gerade in den Altersgruppen ab 50 Jahren und älter deutlich häufiger als in den alten Ländern [9]. Etwa ein Viertel der Diabetiker ist insulinabhängig, weit über 40% werden mit oralen Antidiabetika meist in Kombination mit diätetischen Maßnahmen behandelt [9]. Durch alleinige diätetische Maßnahmen ohne weitere Therapieansätze werden nur ca. 15% der Patienten behandelt [9]. Der Anteil an unerkannten Diabetikern in der betrachteten Population wird aufgrund von Blut und Urinmeßwerten (Serum und Uringlukose, Fructosamin, HbA1c) auf mindestens 1% der Gesamtbevölkerung geschätzt. [9]
1.3 Vaskuläre Komplikationen des Diabetes mellitus
1.3.1 Makrovaskuläre Komplikationen des Diabetes mellitus
1.3.1.1 Arteriosklerose
Die Hauptursache von arteriellen Verschlusskrankheiten, die sich im weiteren auf viele Organe und Organsysteme auswirken, ist zu 95% arteriosklerotisch bedingt [1].
Arterielle Durchblutungsstörungen infolge arteriosklerotischer Gefäßveränderungen finden sich bei 2,4% der 35 jährigen Männer und steigen altersbedingt auf 35% bei den 65 jährigen Männern an [1]. Die Prävalenz symptomatischer Veränderungen beträgt für beide
1. Einleitung
Geschlechter etwa 4,5% im Alter von 55–74 Jahren [1]. Häufig besteht eine klinisch relevante Koinzidenz der peripheren arteriellen Verschlußkrankheit (pAVK) mit zerebralen und kardialen Durchblutungsstörungen. 70% der pAVK Patienten weisen z.B. Veränderungen der Arteria carotis interna auf beziehungsweise erleiden doppelt so häufig einen Schlaganfall mit nicht reversiblen neurologischen Defiziten wie Patienten ohne pAVK gleichen Alters [1].
Klassische Risikofaktoren für die Entwicklung arteriosklerotisch bedingter Gefäßveränderungen stellen sowohl Diabetes mellitus als auch arterielle Hypertonie, Nikotinabusus, Hyperlipoproteinämie und Hyperfibrinogenämie/Hyperhomocystinämie dar.
Das Vorhandensein bereits einer der angeführten Risikofaktoren erhöht die Erkrankungswahrscheinlichkeit um den Faktor 2,5 im Vergleich zu Patienten ohne Risikofaktoren [1]. Das Auftreten eines zweiten Risikofaktors erhöht die Wahrscheinlichkeit zu erkranken um das Vierfache und eine Kombination aus drei Faktoren lässt die Erkrankungswahrscheinlichkeit auf das Sechsfache anwachsen [1]. Ein Diabetes mellitus kommt als vaskulärer Risikofaktor eine besondere Rolle zu, da dieser sowohl zu Makro als auch zu Mikroangiopathien führt. Letztere manifestieren sich bei einer Mehrzahl der Betroffenen im Bereich der Retina oder der Niere [1].
Die Entstehung der Arteriosklerose läuft in mehreren Phasen ab und wird heute als chronischer inflammatorischer Prozess verstanden [1]. Nach der „Response to injury“
Hypothese ist der initiale Faktor arteriosklerotischer Umbauvorgänge eine Endothelläsion [1].
Das Endothel bildet eine biologisch Barriere zwischen Blut und Gefäßwand, welches durch Ausschüttung von vasokonstringierenden oder vasorelaxierenden Substanzen den lokalen Gefäßtonus reguliert [1]. Ein wichtiger Regulationsfaktor stellt das Stickstoffmonoxid (NO) dar, welches durch die NO Synthetase (NOS) gebildet wird und zu einer Vasodilatation führt
1. Einleitung
[1]. Diese Endothelfunktion kann durch Serumcholesterin, Strömungsabnormitäten (Scherkräfte bei arterieller Hypertonie), chemische Reize (Nikotin) oder Homozystein gestört werden, so dass es zu einer verminderten Gefäßreagibilität und einer erhöhten Gefäßpermeabilität kommt [1]. Ferner führt die endotheliale Dysfunktion zu einer lokalen Aktivierung der Gerinnungssystems. Desweiteren werden auf der Oberfläche stimulierter Endothelzellen Adhäsionsmoleküle vermehrt exprimiert. Adhärente Monozyten wandern in die Intima und werden dort besonders durch Lipoproteine und glykosylierte Proteine stimuliert und unterhalten lokale Entzündungsreaktionen [1]. Ist die LDL Konzentration erhöht, wird dieses vermehrt in Makrophagen aufgenommen. Beim Überschreiten der Endozytosekapazität wird extrazellulär verbliebenes LDL durch Oxidation toxisch verändert [1]. Das entstandene oxidierte LDL (oLDL) kann Endothel und glatte Muskelzellen verstärkt aktivieren, so dass es unreguliert in Zellen aufgenommen wird und es zur Bildung von Schaumzellen kommt. Durch eine insgesamt gesteigerte Zytokin und Wachstumsfaktorfreisetzung wird die Proliferation von glatten Muskelzellen induziert, welche ihrerseits vermehrt Matrixproteine sezernieren [1]. Die Endothelzellen reißen an mikroskopisch kleinen Stellen ein und bieten somit Thrombozyten eine Möglichkeit sich an thrombogen wirkende, extrazelluläre Matrixproteine anzulagern [5]. Die Läsion fibrosiert mit zentraler Nekrose und schließlich setzen sich Kalksalze in der Nachbarschaft ab. Die entstandenen Plaques verengen das Gefäßlumen und können reißen, so dass frisch angelagerte Thromben die Blutversorgung der angrenzenden Regionen gänzlich abschneiden [1].
1. Einleitung
1.3.2 Mikrovaskuläre Komplikationen des Diabetes mellitus
1.3.2.1 Diabetische Retinopathie
In der Altersgruppe der 30 bis 60 jährigen in den westlichen Industrienationen ist die diabetische Retinopathie die häufigste Ursache für eine Erblindung [5]. Verantwortlich ist im wesentlichen die proliferative diabetische Retinopathie und das diabetische Makulaödem [5].
Eine nichtproliferative Retinopathie tritt meist 8 bis 15 Jahre nach Manifestation des Diabetes mellitus auf und ist gekennzeichnet durch retinale Mikroaneurysmen, Punktblutungen, und sogenannte „cotton whool“ Herde am Augenhintergrund, welche jedoch zunächst keine klinischen Symptome zeigen. Die zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen betreffen den Verlust retinaler Perizyten mit Ausbildung avaskulärer Kapillaren, sowie eine erhöhte Kapillarpermeabilität der retinalen Gefäße, welche gemeinsam mit Veränderungen
Abbildung 1: Entstehung arteriosklerotischer Veränderungen [1]
1. Einleitung
der mikrovaskulären Gefäßstrukturen zur retinalen Ischämie führen [5]. Bei weiterer Progredienz der Erkrankung kommt es im Verlauf zur Ausbildung einer sogenannten proliferativen diabetischen Retinopathie, welche durch eine unkontrollierte Neovaskularisation der retinalen Gefäße gekennzeichnet ist. Diese entsteht als Antwort auf die retinale Hypoxie im Bereich von Makula oder Papille und führt schließlich zu retinalen Gefäßrupturen und Glaskörperblutung mit konsekutiver Fibrosierung der Retina und Netzhautablösung [5].
Eine nichtproliferative Retinopathie geht nicht zwingend in eine proliferative Form über, wobei jedoch die Wahrscheinlichkeit, innerhalb der nächsten fünf Jahre eine proliferative Form zu entwickeln, mit der Schwere der nichtproliferativen Retinopathie zunimmt [5]. Die besten prognostischen Parameter für das Auftreten einer diabetischen Retinopathie sind die Diabetesdauer und die Güte der Diabeteseinstellung. Weitere Risikofaktoren für die Entwicklung einer Retinopathie sind ferner arterielle Hypertonie, Hyperlipidämie, hormonelle Umstellung in Pubertät und Schwangerschaft und Rauchen [5]. Nach einer Erkrankungsdauer von mehr als 20 Jahren tritt bei fast allen Diabetikern eine nichtproliferative Retinopathie auf.
Beim Diabetes mellitus Typ 2 werden bereits zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bei ungefähr 30 Prozent der Patienten retinale Veränderungen nachgewiesen. Dies ist als Zeichen einer langjährig unbemerkten Störung des Glukosestoffwechsel zu werten [5].
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die diabetische Retinopathie und die diabetische Makulopathie keine Spätsymptome eines schlecht eingestellten Diabetes mellitus sind, sondern bei entsprechend prädisponierten Patienten bereits sehr früh als Marker eines vorgeschädigten Gefäßsystems auftreten [10]. Neuere klinische Studien zeigen, dass etwa 80% aller Erkrankten mit Diabetes mellitus trotz modernster Therapiemodalitäten mit guter Blutdruck und Blutzuckerkontrolle nach langer Diabetesdauer zumindest beginnende Veränderungen an der Netzhaut aufweisen [10].
1. Einleitung
1.3.2.2 Diabetische Polyneuropathie
Die diabetische Neuropathie tritt bei ungefähr 50% aller langjährigen Typ 1 und Typ 2 Diabetiker auf [5]. Eine distal sensible diabetische Polyneuropathie kann bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 nach langjähriger Krankheitsdauer bemerkt werden und entsteht bei Patienten mit einem Diabetes mellitus Typ 2 meist nach dem 50. Lebensjahr [5]. Kraniale Mononeuropathien treten hingegen meist als isolierte Paresen des III. und VI. Hirnnerven auf.
In Dreiviertel der klinischen Fälle bleibt die Pupillenfunktion erhalten. Ein lokaler Schmerz am Auge oder Kopfschmerzen sind bei der Hälfte der klinischen Fälle vorhanden [5]. Eine thorakoabdominale Neuropathie ist schmerzhaft, involviert unilateral einen oder mehrere Interkostal oder Lumbalnerven und tritt häufig gemeinsam mit einer asymmetrischen proximalen Neuropathie auf, welche hauptsächlich mit Paresen von Muskeln einhergeht, die vom N. femoralis oder N. obturatorius versorgt werden, sowie mit einem ipsilateralen Verlust des Quadrizepsreflexes [4]. Das sensible Defizit ist gering, wobei der Schmerz an Hüfte und Oberschenkelvorderseite erheblich sein kann [5]. Zusätzlich kann eine autonome Neuropathie auftreten. Hierbei treten die Symptome in Form von kardiovaskulären, gastrointestinalen, urogenitalen und metabolischen Störungen auf [5]. Häufig sind hierbei eine Ruhetachykardie, orthostatische Beschwerden, Gastroparesen und Blasenentleerungsstörungen [5]. Die Behandlung der diabetischen Neuropathie beschränkt sich derzeit auf eine optimale Einstellung des Blutzuckers und eine symptomatische Schmerztherapie, denn statistisch sind gut eingestellte Diabetiker weniger von der diabetischen Polyneuropathie betroffen als schlechter eingestellte Vergleichsgruppen [5]. Eine kausal pathophysiologisch orientierte Behandlungsmodalität besteht derzeit leider noch nicht, obwohl experimentelle Untersuchungen mit einem PKC Isoform selektiven Inhibitor derzeit vielsprechend sind [5].
1. Einleitung
1.3.2.3 Diabetische Nephropathie
Zahlreiche epidemiologische Studien zeigen, dass die diabetische Nephropathie die wichtigste Folgeerkrankung bei Diabetes mellitus darstellt [11, 12]. Die diabetische Nephropathie ist mit einer erhöhten kardiovaskulären Morbidität und Mortalität verbunden [13, 14]. Die mikrovaskulären Schäden der Niere führen zunächst zu einer funktionellen und schließlich einer strukturellen Schädigung mit konsekutivem chronischen Nierenversagen. Der jährliche Report des United States Renal Data System (USRDS) zeigt, dass die diabetes assoziierten Nierenerkrankungen mittlerweile die Hauptursache für das chronische Nierenversagen in den USA darstellen [11]. Diese Erkenntnisse sind durchaus auf Deutschland übertragbar. In einer Studie der Universität Heidelberg wurde festgestellt, dass von allen dialysepflichtigen Patienten der Jahre 1998 bis 2000 mit chronischem Nierenversagen 49 Prozent einen Diabetes mellitus hatten [15].
Verschiedene klinische Interventionsstudien konnten eindeutig belegen, dass hohe Blutglukosespiegel zweifelsfrei zu makro und mikrovaskulären Schädigungen, also auch zur Nierenschädigung führen [13]. Nach epidemiologischen Auswertungen des QUASI Nieren Registers beträgt in Deutschland die Prävalenz der diabetischen Nephropathie bei Patienten unter Nierenersatztherapie 26 Prozent und die Inzidenz 34 Prozent [14]. Davon sind 31 Prozent Typ 2 Diabetiker und 3 Prozent Typ 1 Diabetiker [16]. Obwohl in den letzten Jahren ein deutlich ansteigender Trend bezüglich der Prävalenz der diabetischen Nephropathie zu verzeichnen ist, besteht durch die signifikant erhöhte kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität in diesem Hochrisikokollektiv eine weniger ausgeprägte Zunahme der Inzidenz der diabetischen Nephropathie [16].
Als erste klinische Symptome der diabetischen Nephropathie treten eine renale Hyperfiltration, eine Mikroalbuminurie und eine im weiteren Verlauf progrediente Proteinurie bis hin zum nephrotischen Syndrom auf [5]. Zusätzlich können Zeichen einer
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tubulointerstitiellen Nierenbeteiligung wie eine durch einen hyporeninämischen Hypoaldosteronismus bedingte Hyperkaliämie, eine renale Anämie, eine durch Vitamin D Mangel bedingte Hypokalzämie , eine Hyperphosphatämie sowie eine renal tubuläre Azidose auftreten [5]. Die terminale Niereninsuffizienz entwickelt sich meist in einem langsamen chronischen Verlauf nach Auftreten der ersten klinischen Zeichen einer diabetischen Nierenschädigung, es kann aber auch zu rascheren progredienten Krankheitsverläufen kommen [5].
Beim Diabetes mellitus Typ 1 ist die Mikroalbuminurie als direkte Folge einer Störung der glomerulären Filtrationsbarriere anzusehen, während beim Diabetes mellitus Typ 2 oder bei Patienten mit arterieller Hypertonie diese meist als Zeichen einer generellen Endothelschädigung zu werten ist [17]. Bereits eine hochnormale Albuminurie stellt einen Risikofaktor für die Entstehung einer diabetischen Nephropathie dar [17]. Einzelne Studien geben Hinweise, dass eine gute Stoffwechsel und Blutdruckeinstellung eine bereits manifeste diabetische Nephropathie wieder zurückbilden kann [18, 19].
Im Allgemeinen vergrößern sich die Glomeruli im Rahmen der Hyperfiltration und damit das Nierenvolumen in der sonographischen Untersuchung deutlich [5]. Morphologisch fallen eine Verdickung der glomerulären Basalmembran (GBM) und eine mesangiale Expansion aufgrund einer extrazellulären Matrixakkumulation auf. Im Verlauf nimmt die mesangiale Matrixablagerung mit einer schlechten Stoffwechseleinstellung zu und in der Nierenbiopsie wird nach Kimmelstiel Wilson eine typische eosinophile, PAS positive Glomerulosklerose sichtbar [5].
Sowohl metabolische als auch hämodynamische Faktoren tragen zur Ausbildung einer diabetischen Nephropathie bei. Im Glomerulum führt der erhöhte systemische und intraglomeruläre Blutdruck zu einer direkten Aktivierung von intrazellulären Signaltransduktionskaskaden wie zum Beispiel der Protein Kinase C (PKC), der Mitogen activated protein kinase (MAPK) und von Nuclear Factor χB (NF χB) sowie zur
1. Einleitung
Ausschüttung verschiedener Wachstumsfaktoren und Zytokine wie VEGF, Endothelin und TGF β1 [5]. Genetische Faktoren scheinen ebenfalls eine wesentliche Rolle im Rahmen dieser diabetischen Folgeerkrankung zuzukommen, da nur etwa 20 30% der diabetischen Population eine diabetische Nephropathie im Rahmen der diabetischen Stoffwechselstörung entwickelt [5].
1.4 Molekulare Mechanismen diabetischer mikrovaskulärer Komplikationen
1.4.1 Advanced Glycolisation Endproducts (AGEs)
Advanced Glycosylation endproducts (AGEs) entstehen als Ergebnis einer Serie von biochemischen Reaktionen von Aminosäuren oder Proteinen mit Zuckern (z.B. Glukose).
Diese können sich in der sogenannten Maillard Reaktion zu Schiffschen Basen und weiter zu Amadori Produkten verbinden. Amadori Produkte akkumulieren und bilden schließlich die AGEs. Diese Reaktionen sind nicht enzymatisch vermittelt, sondern entstehen konzentrationsabhängig und werden durch hyperglykämischen Zustände gefördert. Während die Schiffschen Basen und Amadori Produkte noch abbaubar sind, persistieren und akkumulieren AGEs lebenslang im Körper.
1. Einleitung
Glukose + Aminosäure / Protein Schiffsche Base Amadori Produkt AGE
Abbildung 2: Maillard Reaktion (modifiziert nach Fiedler [20])
Beim Diabetes mellitus kommt es aufgrund der chronischen Hyperglykämie zu einer vermehrten Glykosylierung von Struktur und Funktionsproteinen und damit zur Bildung von AGEs. Diese zeigten in verschiedenen Studien insbesondere eine Akkumulation in der Niere, da sie renal eliminiert werden [21]. Allerdings finden sich auch bei gesunden Individuen Amadori Produkte und AGEs mit fortschreitendem Alter. Cooper et al. zeigten, dass die Gabe von Aminoguanidinen bei diabetischen Ratten die Bildung und die renale Akkumulation von AGEs sowohl in der Früh als auch in der Spätphase einer diabetischen Nephropathie reduzieren kann [22].
Als spezifischen zelluläre Bindungspartner für die AGEs wurden verschiedene intrazelluläre und Zellmembranproteine identifiziert. Bekannt sind bisher RAGE (receptor for advanced glycolisation endproducts), AGE R1, AGE R2, AGE R3, Lactoferrin, Lysozym, und der Makrophagen Scavenger Rezeptor. Einige dieser Proteine scheinen als direkte Rezeptoren zu fungieren und konsekutiv verschiedene intrazelluläre Signalwege wie etwa NF χB zu aktivieren [21]. Dem AGE R1 wird eher eine Abbaufunktion der AGEs zugeschrieben. [21, 23]. Untersuchungen an diabetischen NOD Mäusen (Modell für Diabetes mellitus Typ 1) haben gezeigt, dass besonders im proximalen Tubulus AGE Bindungsstellen lokalisiert sind.
1. Einleitung
Diese sprechen auf Gabe von Aminoguanidinen an, konnten jedoch weder den RAGE noch den anderen bisher bekannten Rezeptortypen zugeordnet werden [24]. Infolge der vermehrten NF χB Aktivierung durch AGEs kommt es zu einer vermehrten Expression verschiedener Wachstumsfaktoren und Zytokine, insbesondere TGF β1, VEGF und PDGF, sowie zu einer vermehrten Bildung von Kollagen Typ IV in der diabetischen Niere [21].
1.4.2 Oxidativer Streß
Oxidativer Streß wird allgemein als Schlüsselkomponente in der Entstehung von diabetischen Komplikationen angesehen [25]. Brownlee et al. konnten an kultivierten bovinen Endothelzellen zeigen, dass eine glukose induzierte Aktivierung von ‚reactive oxygen species’ (ROS) mit der Stimulation diverser intrazellulärer Signaltransduktionswege interferiert. Hierzu gehören der Polyol Pathway, der Hexosamin Pathway, der PKC Pathway und die Aktivierung von NF χB [26].
Yan et al. stellten ferner fest, dass die Interaktion von AGEs und RAGE zu einem vermehrten Auftreten von ROS führen [27]. Baynes et al. wiederum zeigten, dass die Hyperglykämie an sich zu Oxidationsvorgängen führt, die wiederum freie Radikale hervorbringen können [25].
Studien von Scivittaro et al. [28] und Ha [29] zeigten, dass AGEs in der Lage sind oxidativen Stress zu induzieren und dass ROS in der Lage sind PKC zu aktivieren. In der Zusammenschau dieser Befunde scheinen PKC und ROS sich gegenseitig zu beeinflussen und zu verstärken, wobei in manchen Fällen die ROS Entstehung PKC abhängig erscheint [29].
Eine direkte Beeinflussung von PKC durch Redoxpotentialänderungen in Sulfhydrylgruppen durch ROS konnte von Gopalakrishna und Jaken gezeigt werden [30]. Bestimmte PKC Isoforme scheinen für eine DAG vermittelte Aktivierung empfänglicher zu werden [30]. Mit Meßmethoden für Marker des oxidativen Stresses und spezifischeren Inhibitoren sind nähere
1. Einleitung
Erkenntnisse über das Zusammenspiel der Oxidationsprodukte und ihre Reaktionspartner in den nächsten Jahren zu erwarten [21].
Brownlee fasste die bisher aufgestellten Hypothesen zu den molekularen Mechanismen einer glukose induzierten Zellschädigung anhand des intrazellulären Glukosestoffwechselmetabolismus universell zusammen [31]. Dieses Postulat vereint die bisher bekannten Hypothesen mit einer glukose induzierten Stimulation des Polyol Pathway, einer vermehrten Bildung von AGEs, einer Aktivierung von PKC Isoformen und einer Stimulation des Hexosamin Pathway. Als verbindendes Element wird die vermehrte Bildung von Superoxid durch die mitochondriale Elektronentransportkette angesehen [26, 32].
Die Aktivierung von PKC durch DAG könnte somit als Zeichen eines gesteigerten Dihydroxyacetonphosphat Levels durch die Hemmung von GAPDH durch ROS begriffen werden. Bestärkt wird diese Ansicht durch Ergebnisse von Brownlee, welche zeigten, dass GADPH Antisense Oligonukleotide in der Lage sind bei normalen, physiologischen Glukosekonzentrationen ebenfalls PKC zu aktivieren [31].
Abbildung 3: Mechanismus hyperglykämischer Zellschädigung (nach Brownlee [31])
1. Einleitung
1.4.3 Proteinkinase C
1.4.3.1 PKC Isoforme und ihre Aktivierung
Die Protein Kinase C (PKC) stellt eine Gruppe von intrazellulären Serin Threonin Kinasen dar [33]. Diese Proteinfamilie besteht aus insgesamt drei Subgruppen (klassisch, neu und atypisch) und mindestens zwölf Isoformen [34]. Zu den klassischen Isoformen der Protein Kinasen C, welche Ca2+abhängig und über Diacylglycerol (DAG) oder Phosphorester aktiviert werden, zählen die Isoforme α, β (mit den beiden alternativen Splicevarianten β I undβ II) undγ. In der Subgruppe der neuen Protein Kinasen C werden die Isoformen δ,ε,η, und θ, welche jeweils Ca2+ unabhängig arbeiten, jedoch ebenfalls DAG bzw. Phosphorester als Co Faktoren für ihre Aktivierung benötigen, zusammengefasst. Als atypische Protein Kinasen C werden die Isoforme ξund λbezeichnet, welche unabhängig von Ca2+, DAG und Phosphorester aktiviert werden [35].
Ein einzelner Genlocus für PKC β kodiert für die beiden unterschiedlichen Splicingvarianten PKC βI und PKC βII [36]. Der Unterschied zwischen den beiden Isoformen besteht in der C terminalen V5 Domäne, die jedoch in ihrer Aminosäuresequenz noch ein 45%ige Übereinstimmung zeigt [36].
In verschiedenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass hohe Blutglukosespiegel mit einer vermehrten Aktivierung von PKC einhergehen [37]. In verschiedenen
Zellkulturmodellen (aortale und retinale Endothelzellen, aortale glatte Muskelzellen, renale Mesangialzellen und Podozyten, Perizyten), welche eine mögliche Rolle in der Vermittlung diabetischer mikro und makrovaskulärer Spätkomplikationen spielen, wurde eine vermehrte Expression und Aktivierung von DAG und PKC unter hohen Glukosekonzentrationen gezeigt [37].
1. Einleitung
Insbesondere die Arbeitsgruppe von King et al. postulierte, dass die Aktivierung der PKC β Isoform diabetische mikrovaskuläre Zellschäden vermittelt. Die verschiedenen PKC Isoforme differieren jedoch in ihrer zellulären Expression und Aktivierung durch hohe Glukosekonzentrationen und sehr stark und wurden daher in verschiedenen experimentellen Ansätzen in den letzten Jahren untersucht. Kikkawa et al. berichteten als Erste über ein vermehrtes Vorkommen von PKC α und –ζ in Mesangiumzellmembranen unter diabetischen Bedingungen [38]. Koya et al. fanden hingegen erhöhte Konzentrationen von PKC α und –βI in Zellkulturen aus Ratten und menschlichen Mesangiumzellen unter hohen Glukosekonzentrationen [39]. Eine Kultivierung von mesangialen Rattenzellen über 48 Stunden in einer 30 mM Glukoselösung zeigte ein vermehrtes Auftreten von PKC δ nach 24 Stunden [40] und eine Erhöhung von PKC α, β2, und –ε nach 48 Stunden [41]. Durch Immunoblotting und Fluoreszenzmarkierung von PKC Isoforme konnten mehrere Forschungsgruppen unabhängig voneinander zeigen, dass verschiedene PKC Isoforme einem glukoseabhängigen Expressions und Aktivierungsmuster durch Translokation an unterschiedliche Zellmembranen unterliegen [38, 39, 42, 43]. Die exakte pathophysiologische Rolle einzelner Isoformen in der Entwicklung diabetischer mikrovaskulärer Komplikationen ist bisher jedoch weiter unklar.
1.4.3.2 Zelluläre Effekte der PKC Aktivierung
Unter hohen Glukosekonzentrationen entfaltet PKC in den verschiedenen mikrovaskulären Zelltypen seine zelluläre Wirkung. Bei Untersuchungen an menschlichen und tierischen Geweben kam es insbesondere zu Veränderungen der vaskulären Kontraktionskraft und des lokalen Blutflusses. In der diabetischen Niere kommt es durch vermehrte Aktivierung von
1. Einleitung
Angiotensin II (Ang II), Stickstoffmonoxid (NO) und vasoaktiven Prostaglandin E2 (PGE2) oder I2(PGI2) zu einer Steigerung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) und des renalen Blutflusses (RBF) [44 46]. Es resultiert eine verminderte Wandspannung der afferenten Arteriolen, welche zu einem chronisch erhöhten glomerulären Filtrationsdruck führt.
Interessanterweise scheint an diesen komplexen Veränderungen eine PKC Aktivierung zumindest beteiligt zu sein [37].
Die Aktivierung von zytosolischer Phospholipase A2 (cPLA2), einem Schlüsselenzym der Arachidonsäureproduktion, ist verantwortlich für die Entstehung von PGE2 und PGI2 [47].
Die cPLA2 wird durch einen PKC und/oder MAPK abhängigen Stoffwechselweg aktiviert [48, 49]. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass die PKC δ Isoform über die p38MAPK Signaltransduktionskaskade ebenfalls in der Lage ist cPLA2zu aktivieren.[50]
Desweiteren steht PKC in einem wichtigen Zusammenhang mit Stickstoffmonoxid (NO).
Unter Hyperglykämie kommt es zu einer PKC vermittelten Überexpression von induzierbarer Stickstoffmonoxidsynthethase (iNOS), welches zu einer Veränderung des Blutflusses und der Gefäßkontraktilität mit nachfolgender renaler Hyperfiltration führt [51, 52]. Weitere Studien zeigen eine Verminderung der mRNA Expression von neuraler Stickstoffmonoxidsynthetase (nNOS) in Mesangiumzellen von diabetischen Ratten. Durch diesen Mechanismus wird die Reninsekretion gehemmt, was sekundär zur Hyperfiltration führt [53]. Eine PKC Aktivierung ist in der Lage wesentliche Veränderungen in der renalen Hämodynamik in Abhängigkeit vom Zelltyp, von der Lokalisation und der Diabetesdauer unterschiedlich zu beeinflussen [47, 54 57].
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Bereits in der Frühphase des Diabetes mellitus findet sich eine Verdickung der kapillären Basalmembran und eine Matrixexpansion als auffälligstes Merkmal struktureller Veränderungen durch eine diabetische Stoffwechsellage [58]. Es kommt zu einer vermehrten
1. Einleitung
Bildung von Kollagen Typ IV, Typ VI und Fibronectin sowie einer verminderten Expression von negativ geladenen Basalmembranbestandteile, der Proteoglykane [59 64]. An der Bildung von Kollagen Typ IV und Fibronectin ist PKC direkt beteiligt [65, 66]. Eine Aktivierung des PKC β Signaltransduktionsweges ist in der Lage über das Zytokin TGF β1 und Ang II die DNA Synthese mesangialer Zellmatrixproteine zu steigern [67 69]. Der zugrunde liegende Mechanismus scheint eine Induktion der Transkriptionsfaktoren und durch PKC zu sein [70]. Diese Protoonkogene regulieren durch die AP1 Bindungsstelle die Gentranskription. Die Promotorregionen von TGF β1, Fibronectin und Laminin enthalten jeweils diese AP1 Bindungsstelle und können somit bei hyperglykämischen Stoffwechsellagen durch direkte PKC Aktivierung vermehrt exprimiert werden [71 74].
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PKC Aktivierung nimmt durch Phosphorylierung von Zytoskelettelementen, welche für die Ausbildung von Tight junctions zuständig sind, und/oder durch Regulierung von Wachstumsfaktoren direkten Einfluss auf die Gefäßpermeabilität [37]. Hempel et al. konnten zeigen, dass bei hohen Glukosekonzentrationen durch Aktivierung von PKC α die Permeabilität von Endothelzellen gesteigert wird [75]. Im Umkehrschluss war es auch möglich durch diverse PKC Inhibitoren die Albuminpermeabilität zu senken [76].
Durch die Aktivierung des PKC Signaltransduktionsweges werden verschiedene Wachstumsfaktoren gesteuert, die Neovaskularisationen induzieren können. Insbesondere VEGF aktiviert in Endothelzellen über Tyrosin Phosphorylierung von Phospholipase Cγ (PLCγ) vermehrt insbesondere die PKC β–Isoformen [77]. Es resultiert sowohl eine vermehrte endotheliale Proliferation, eine gesteigerte Angiogenese als auch eine vermehrte Permeabilität der Endothelzellen, welche insbesondere im Rahmen einer diabetischen Retinopathie klinisch zu beobachten sind. Durch den experimentellen Einsatz eines PKC β
1. Einleitung
spezifischen Inhibitors (Ruboxisaturin®, LY333531) können diese Effekte von VEGF undverhindert werden [78]. Aiello et al. zeigten, dass sowohl intravitreale Injektionen, als auch die orale Gabe eines PKC β spezifischen Inhibitors die diabetische Retinopathie sehr günstig beeinflussen [79]. Eine kürzlich publizierte prospektive, placebo kontrollierte klinische Interventionsstudie mit Ruboxistaurin® konnte allerdings das Fortschreiten einer nicht proliferativen Retinopathie nicht verhinderen [80]. Ein Vorteil durch eine Hochdosistherapie (32 mg Ruboxistaurin® / Tag) versus Placebo konnte für den Visusverlust festgestellt werden [80]. Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen in der Entwicklung beziehungsweise dem Fortschreiten eines diabetischen Makulaödems war nicht vorhanden [80].
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Die Na+ K+ATPase ist für die Zellkontraktion, Zellwachstum und –differenzierung von großer Bedeutung [81]. In neuronalen und vaskulären Geweben von diabetischen Patienten oder Versuchstieren ist Na+ K+ ATPase herunterreguliert. Hierfür ist eine vermehrte Aktivität von cPLA2verantwortlich, welches durch aktivierte PKC gebildet wird [82].
2. Hypothese
2 Hypothese
Aufgrund der oben dargelegten Studienergebnissen aus diversen und
Untersuchungen wurde eine funktionelle Bedeutung der PKC β Isoform in der Entwicklung diabetischer mikrovaskulärer Komplikationen postuliert. Bisher stammen die
Studienergebnisse jedoch ausschließlich von pharmakologischen Interventionsstudien mit dem PKC Inhibitor Ruboxisaturin® (LY333531), welcher über eine ca. 100fach höhere Affinität gegenüber der PKC β Isoform verfügt.
Wir untersuchten deshalb in der vorliegenden Studie die funktionelle Bedeutung der PKC β Isoform in der Entwicklung einer experimentellen diabetischen Nephropathie im Streptozotocin induzierten Mausmodell von PKC β spezifischen Knockout Mäusen im Vergleich zu entsprechenden SV129 Wildtyp Mäusen. Wir prüften die Hypothese, ob PKC β Knockout Mäuse sowohl gegenüber der frühen Entwicklung einer Albuminurie als auch einer TGF β1 induzierten renalen Hypertrophie geschützt sind.
3. Material
3 Material
3.1 Maus SV129 mit Knockout für PKC β
Dieser Mausstamm wurde uns freundlicherweise durch Herrn PD Dr. M. Leitges zur Verfügung gestellt. In diesen Mäusen wurde das Gen, welches für PKC β kodiert in embryonalen Stammzellen durch Einfügen einer Kassette in das zweite Exon des PKC β Gens durch homologe Rekombination unterbrochen [83]. Das Vorhandensein der PKC β Allele in den hetero oder homozygoten Mäusen wurde durch einen Southern DNA Blot nachgewiesen. In den als homozygot identifizierten Tieren wurde der erfolgreiche PKC β Knockout durch einen Immunoblot aus Nierengewebe bestätigt [83].
3.2 Maus SV129 Wildtyp
Diese Tiere stammen aus der eigenen Zucht im Tierlabor an der Medizinischen Hochschule Hannover und entsprechen dem Genotyp der untersuchten PKC β Knockout Mäusen. Diese Tiere sind als entsprechende Kontrolltiere geeignet.
3.3 Zentrifugen
Laborzentrifuge Centrifuge 5415C von Fa. Eppendorf AG Zentrifuge Biofuge 15R von Fa. Heraeus GmbH
3.4 Kreatininmessgerät
Creatinine Analyzer 2 von Fa. Beckmann Coulter Inc.
3. Material
3.5 Albumin ELISA Kit
Albuwell ELISA Kit von Fa. Exocell Inc.
3.6 ELISA Reader
Sunrise von Fa. Tecan Deutschland GmbH
3.7 Blutzuckermessgerät
Glukometer Elite von Fa. Bayer
3.8 Wärmeschrank
Function line von Fa. Heraeus GmbH
3.9 Rotationsmikrotom
RM 2245 von Fa. Leica GmbH
3.10 Kryomikrotom
CM3050S von Fa. Leica GmbH
3.11 Wärmebad für histologische Schnitte
1052 von Fa. GFL GmbH
3. Material
3.12 Einbettungsautomat für Paraffinschnitte
TP 1020 von Fa. Leica GmbH
3.13 Mikroskop
Axioplan 2 Imaging von Fa. Zeiss
3.14 Bildverarbeitungssoftware
Axio Vision Rel. 4.3
3.15 Färbelösungen
+ ,
100 ml Lösung A + 100 ml Lösung B
2g Hämatoxylin 200 ml 96% Alkohol
2,32 g Eisen III chlorid 196 ml Aqua dest.
2 ml 25%iges HCl
3. Material
",
176 ml Aqua dest.
0,35 ml Eisessig 15 ml Xylin Ponceau 5 ml Säurefuchsin 4 ml Azophloxin
1g Xylin Ponceau in 100 ml Aqua dest. gelöst, aufgekocht, nach dem Erkalten filtriert und 1 ml Eisessig zugegeben.
1g Säurefuchsin in 100 ml Aqua dest. gelöst, aufgekocht, nach dem Erkalten filtriert und 1 ml Eisessig zugegeben
0,5g Azophloxin 100ml Aqua dest.
0,2ml Eisessig
#+-,
10g Wolframatophosphorsäure in 100ml Aqua dest. gelöst + 4g Orange G + 90ml Aqua dest.
pH 1,0 ± 0,5
filtriert, 2 Tage stehen gelassen, erneut filtriert
3. Material
. / ,
0,5 g Lichtgrün SF gelblich 250 ml Aqua dest.
0,5 ml Eisessig pH 3,3 ± 0,5
",
Lösung aus: 60% Methanol, 30% Chloroform und 10% Eisessig
*0,
0,005M TrisHCl + 0,015M NaCl, pH 7,4 bis 7,6
*0 ),
Zugabe von 18g NaCl zu 1000ml TBS Stammlösung
3.16 Antikörper für Immunhistologie
Rat anti Perlecan von Research Diagnostics Inc.
TGFβ1 (V): sc 146 (rabbit) von Santa Cruz Biotechnology Inc.
VEGF (a 20): sc 152 (rabbit) von Santa Cruz Biotechnology Inc.
Nephrin NPHN11 A Rabbit anti Rat von Alpha Diagnostic International Kollagen Typ III Rabbit von Fitzgerald Industries International Inc.
Goat Anti Type IV Collagen von Southern Biotechnology Associates Inc.
Fibronectin Antikörper von Fa. Paesel+Lorei Rabbit anti Mouse CTGF von Cell Sciences
3. Material
Cy3 donkey anti rabbit IgG von Fa. Jackson ImmunoResearch Ltd.
Cy3 donkey anti rat IgG von Fa. Jackson ImmunoResearch Ltd.
Cy3 donkey anti goat IgG von Fa. Jackson ImmunoResearch Ltd.
10% normal donkey serum von Fa. Jackson ImmunoResearch Ltd.
3.17 Chemikalien
Äther pro narcosi von Fa. Merck
Avertin 2,5% von Fa. Sigma Aldrich Co.
Flüssigstickstoff von Fa. Linde AG Histowax von Fa. Leica GmbH
Isopentan von Fa. Mallinckrodt Baker Inc.
Natriumcitrat von Fa. Merck
Propanol von Fa. Sigma Aldrich Co.
Ringer Lactat Lösung von Maco Pharma GmbH Streptozotocin (STZ) von Fa. Sigma Aldrich Co.
Xylol von Fa. Sigma Aldrich Co.
3.18 Gefäße und Labormaterial
Eppendorfgefäße Pipetten
Pipettenspitzen
Glaskapillaren alle von Fa. Eppendorf AG
4. Methoden
4 Methoden
4.1 Aufzucht der Versuchstiere und Versuchsablauf
Im eigenen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover wurden männliche PKC β Knockout(KO) Tiere (spezifiziert pathogenfrei) des Stammes SV129 gezüchtet und genotypisiert. Diese wurden im Alter von 8 bis 12 Wochen in den Versuch aufgenommen. Als entsprechende Kontrollgruppe dienten männliche, spezifiziert pathogenfreie Wildtyp(WT) Tieredes Stammes SV129 aus eigener Zucht, die ebenfalls im Alter von 8 bis 12 Wochen in den Versuch aufgenommen wurden. Sowohl von den WT als auch von den KO Tieren wurden jeweils eine nichtdiabetische und eine diabetische Tiergruppe gebildet. Die Aufzucht erfolgt unter Standardbedingungen bei konstanten Licht und Temperaturverhältnissen. Es wurde an die Tiere normales Standardfutter und –wasser zur freien Verfügung gefüttert.
Keines der Tiere erhielt während des Versuchszeitraumes Insulin. Die Tierhaltung erfolgte entsprechend den geltenden Vorschriften des Tierschutzgesetzes und der entsprechenden Erlasse und Verordnungen. Eine Ausnahmegenehmigung für meine Person zur wissenschaftlichen Arbeit mit den Tieren ist durch die Bezirksregierung Hannover erteilt worden.
4.2 Gewinnung von Spot Urin
Zur Gewinnung von Spot Urin wurden die Versuchstiere einzeln und möglichst stressfrei am Schwanz aus dem Käfig gehoben und auf dem Trenngitter abgesetzt. Man greift mit Daumen und Zeigefinger dem Versuchstier in den Nacken, hebt das Tier an und fixiert den Schwanzansatz mit dem kleinen Finger am ulnaren Handballen. Mit der anderen Hand wurde ein vorbereitetes und beschriftetes Auffanggefäß (Epppendorf Gefäß) unter das
4. Methoden
Ausscheidungsorgan des Tieres gehalten, um den abgehenden Urin aufzufangen. Der auf diese Weise gewonnene Spot Urin wurde verschlossen und im Gefrierschrank bei 18°C aufbewahrt.
4.3 Gewinnung einer Blutprobe
Um eine Blutprobe von den Versuchstieren zu gewinnen benötigt man ein Glasgefäß mit Deckel und Schutzgitter, Zellstoff, Äther pro narcosi, heparinisierte Glaskapillaren und beschriftete und heparinisierte Gefäße (Eppendorf Gefäße) zur Probenasservierung. Zur Vorbereitung der Blutentnahme bei den Versuchstieren wurde etwas Äther pro narcosi in ein dafür vorgesehenes Glasgefäß mit Deckel und Schutzgitter gegeben. Dabei ist die Vermeidung des direkten Kontaktes der Tiere mit dem Narkosemittel sehr wichtig. Daher wurde der Boden des Gefäßes mit Zellstofftüchern ausgelegt und die Tiere nur auf dem mit Abstand darüber liegenden Schutzgitter abgesetzt. Die Tiere wurden einzeln in das Glasgefäß gegeben und bis zur eindeutigen Narkose (keine Reaktion auf Schmerzreiz) darin belassen.
Nun wurde das Versuchstier herausgenommen und der Kopf zwischen Daumen und Zeigefinger fixiert. Mittels einer Glaskapillare wurde der retrookuläre Venenplexus punktiert und das Blut in dafür vorbereiteten und beschrifteten Probengefäßen aufgefangen. Nach Entfernen der Kapillare wurden Blutreste mit einem Stück Zellstoff aufgenommen und das Versuchstier bis zum vollständigen Erwachen unter Beobachtung gehalten. Die gewonnenen Proben wurden bei 15.000 U/min zentrifugiert und das Serum mittels einer kleinen Pipette von den festen Blutbestandteilen separiert. Die Serumfraktion wurde bei 18°C eingefroren und gelagert.
4. Methoden
4.4 Induktion einer diabetischen Stoffwechsellage
Das Herstellen einer diabetischen Stoffwechsellage bei den Versuchstieren wurde durch eine zweimalige intraperitoneale (i.p.) Applikation von Streptozotocin (STZ) im Abstand von drei Tagen erreicht, welches zuvor in Natriumcitrat gelöst wurde. Die pro Injektion benötigte Dosis STZ beträgt 125 mg/kg Körpergewicht des Versuchstieres. Um ein frühzeitiges Zerfallen des STZ zu vermeiden, wurde die Lösung jeweils erst kurz vor dem Verabreichen (ca. 10 – 15 Minuten vorher) hergestellt und bis zu ihrem Einsatz kühl gelagert und transportiert. Um die genaue Menge STZ i.p applizieren zu können, wurden die Tiere einzeln am Schwanz aus dem Käfig gehoben, auf einer auf 1g genauen Waage gewogen und dann auf dem Trenngitter des Käfigs abgesetzt. Zur Vermeidung einer Verletzung innerer Organe oder der Applikation des STZ in ein Organ wurde die Maus vor dem Einstich in den Unterbauch in Rücken und Kopf Tief Lage gebracht. Im Anschluß erfolgte der Einstich mit einer Insulinspritze in den Unterbauch im 30° Winkel Richtung kranial und die langsame Applikation der vorbereiteten Lösung. Nach Entfernen der Kanüle wurde die Einstichstelle kurz mit einem Stück Zellstoff unter sanftem Druck bedeckt. Die nichtdiabetischen Kontrolltiere wurden in gleicher Art und Weise behandelt und mit einer reinen Natriumcitratlösung ohne STZ i.p. injiziert.
Zur Kontrolle der diabetischen Stoffwechsellage wurde am Tag 6 eine Messung des Blutzuckerspiegels vorgenommen, welche mit einem handelsüblichen Blutzuckermessgerät erfolgte. Das erforderliche Blut wurde mittels Anritzen der distalen Schwanzspitze mit einer Rasierklinge gewonnen. Falls noch keine diabetische Stoffwechsellage vorlag wurde eine dritte Injektion vorgenommen und der Blutzucker kontrolliert. Eine dauerhafte Blutglukosekonzentration von über 16 mmol/l musste von den diabetischen Versuchstieren erreicht werden, um in den weiteren Versuch aufgenommen zu werden.
4. Methoden
4.5 Organentnahme und Perfusion der Mäuse
Es wurden beschriftete Gefäße vorbereitet mit fortlaufender Nummernfolge, die mit Datum der Entnahme, Inhalt und Fixierungsart beschriftet und in einer Exceltabelle dokumentiert wurden. Die Fixierlösungen (Metharcan, Isopentan (2 Methyl butan ) Lösung) wurden am Vortag vor der geplanten Organentnahme angesetzt. Am Tag der Organentnahme wurden die frischen Fixierlösungen, flüssiger Stickstoff sowie Trockeneis in den Eingriffsraum gebracht.
Der Transport der Tiere erfolgte im Filterkäfig ohne vorheriges Umsetzen, um zusätzlichen Stress zu vermeiden. Es wurde das Mausgewicht bestimmt und dokumentiert, danach wurde eine Narkose mit Avertin 2,5% i.p. (150 l/10g Mausgewicht) eingeleitet. Die Tiere schliefen nach ca. 5 Minuten. Es folgte eine Blutentnahme mittels einer Glaskapillare über den Augenvenenplexus zum Asservieren von Serum zur Blutzucker und Kreatininbestimmung.
Die Urinasservierung wurde über Blasenkatheterisierung nach Eröffnung der Bauchwand mittels einer 1 ml Insulinspritze mit 27 G Nadel durchgeführt. Der Thorax wurde mit zwei seitlichen Schnitten eröffnet. Dann erfolgte die Perfusion über das Herz (linke Kammer) mittels abgestumpfter 21 G (kleines Tier) oder 23 G (großes Tier) Butterfly Kanüle. Zum Abfluss des Blutes wurde die Leber angeschnitten. Bei der Perfusion ist es wichtig, zunächst das Blut aus dem Körper zu spülen. Die Infusion wurde mit ca. 20 ml eisgekühlter Ringer Lactat Lösung bei 150 cm Perfusionshöhe (entspricht 131 mmHg) vorgenommen. Insgesamt dauerte die Perfusion nicht länger als 30 45 Sekunden.
Alle Gewebe (Niere links/rechts, Herz, Aorta, Augen links/rechts, Skelettmuskel, Fettgewebe) wurden schnellstmöglich entnommen und je nach geplanter Verwendung entsprechend vorbereitet. Zunächst wurden die beiden Nieren entnommen. Überflüssiges Fettgewebe wurde entfernt und die Organe einzeln auf einer Wage bis auf 1 mg genau gewogen. Beide Nieren wurden anschließend quer geschnitten mit Hilfe zweier Rasierklingen auf einer Glasscheibe.
Aus der linken Niere wurde mittels dieser Technik eine Querscheibe im Bereich des größten
4. Methoden
Durchmessers entnommen. Die rechte Niere wurde nur im Bereich des größten Durchmessers mittig in zwei Hälften geteilt.
Die Querscheibe der linken Niere wurde für die Immunhistochemie in einem beschrifteten Gefäßen mit Metharcan Fixierlösung bei 4°C immersiert. Der verbleibende Rest wurde in beschrifteten Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff asserviert und im Anschluß bei – 80°C aufbewahrt. Die obere Hälfte der rechten Niere wurde zunächst auf einen ca. 1 cm2 großen Karton abgelegt und in einem Plastikbecher mit ca. 40 °C vorgekühltem Isopentan (2 Metyl Butan) schockgefroren. Die jeweilige Probe wurde anschließend dem Isopentan entnommen und in beschriftete Aluminiumfolie eingeschlagen und im Anschluß bei –80 °C aufbewahrt.
Die untere rechte Nierenhälfte wurde in ein beschriftetes Kryoröhrchen gegeben und mittels flüssigem Stickstoff und anschließender Verwahrung bei 80 °C gelagert.
Herz, Aorta, Augen links/rechts, Skelettmuskel und Fettgewebe wurden jeweils in dafür vorbereitete Kryoröhrchen gegeben und in flüssigen Stickstoff gelagert. Die endgültige Aufbewahrung erfolgte ebenfalls bei 80 °C.
4.6 Albumin ELISA
+1, Einwaage:
0,15 M NaCl
0,01 M Triethanolamin (pH 6,8) 0,05 % Tween 20
Aqua dest.
4. Methoden
#20 ,
1. Urinproben und Reagenzien aus Kühlschrank entnehmen und auf Raumtemperatur kommen lassen.
2. Urinproben 1:10 mit EIA Diluent verdünnen
3. In 7 Eppendorfgefäße 200 l EIA Diluent vorlegen für die Standardreihe
4. 200 l MSA Standard in das erste Eppendorfgefäß geben und jeweils 200 l in die anderen Eppendorfgefäße überführen und gut durchmischen.
5. Die so entstandenen Verdünnungen der Standardreihe werden entsprechend u.a.
Schema in die Albuwell Platte zusammen mit den Urinproben pipettiert
# 1 &)#,
1 2 3 4 usw.
A 100 l Diluent (Negativprobe)
100 l Diluent (Negativprobe)
50 l Probe 1 50 l Probe 1 B 50 l Standard
Verdünnung 1
50 l Standard Verdünnung 1
50 l Probe 2 50 l Probe 2 C 50 l Std. Verd. 2 50 l Std. Verd. 2 50 l Probe 3 50 l Probe 3 D 50 l Std. Verd. 3 50 l Std. Verd. 3 50 l Probe 4 50 l Probe 4 E 50 l Std. Verd. 4 50 l Std. Verd. 4 50 l Probe 5 50 l Probe 5 F 50 l Std. Verd. 5 50 l Std. Verd. 5 50 l Probe 6 50 l Probe 6 G 50 l Std. Verd. 6 50 l Std. Verd. 6 50 l Probe 7 50 l Probe 7 H 50 l Std. Verd. 7 50 l Std. Verd. 7 50 l Probe 8 50 l Probe 8
3/",
1. In alle Wells außer A1 und A2 50 l Rabbit Anti murin Albuminantikörper pipettieren 2. Platte abgedeckt bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren lassen
3. Flüssigkeiten aus der Albuwell Platte abkippen und 10 mal alle Wells mit Waschpuffer auswaschen
4. Methoden
4. Nach den 10 Waschzyklen Platte sanft auf einem Papiertuch ausklopfen, so dass alle Flüssigkeitsrückstände entfernt sind
5. In alle Wells 100 l Anti rabbit HRP Conjugat pipettieren
6. Platte abgedeckt bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren lassen
7. Flüssigkeiten aus der Albuwell Platte abkippen und 10 mal alle Wells mit Waschpuffer auswaschen
8. Nach den 10 Waschzyklen Platte sanft auf einem Papiertuch ausklopfen, so dass alle Flüssigkeitsrückstände entfernt sind
9. In alle Wells 100 l Color Developer geben
10. Platte 10 Minuten lang abgedeckt inkubieren lassen 11. 100 l Color Stopper in alle Wells geben
12. Platte am ELISA Reader bei 450 nm gegen A1 messen
&",
1. Bestimmung der mittleren Absorptionsrate
2. Auftragen einer semilogarithmischen Kurve der Standardverdünnungen mit log[MSA]
versus Absorption. Die Datensätze, die auf der Kurve liegen, zeigen die verwertbaren Datensätze an.
3. Eingeben der Daten in eine logarithmische Gleichung der Form log10[MSA] = m A450 + b und berechnen von [MSA] für jeden Datensatz.
4. Multiplizieren des Ergebnisses mit 10, um die Verdünnung der Urinprobe zu korrigieren.
4. Methoden
4.7 Messung der Kreatininkonzentration im Mausurin
Entsprechend den Herstellerangaben wurde die Kreatinin Konzentration in einer modifizierten Jaffé Reaktion bestimmt. Hierbei reagiert das Kreatinin in einer alkalischen Lösung mit Pikrat zu einem roten Kreatinin Pikrat Komplex. Diese Reaktion wird im Creatinin Analyzer 2 der Fa. Beckmann durch Absorptionsphotometrie gemessen. Die Messung erfolgte bei 520 nm und 560 nm Wellenlänge nach 25,6 Sekunden. Die Differenzrate zwischen diesen beiden Absorptionsmessungen ist proportional zur Kreatininkonzentration der Probe. Das Messergebnis lässt sich direkt am Display des Creatinin Analyzer 2 ablesen.
4.8 Aufbereitung der Nierenblöcke für die histologischen Kryo und Paraffinschnitte
4.8.1 Vorbereitung zur Paraffinfixierung
Die Nierenblöckchen wurden aus der Metharcanfixierlösung heraus in handelsübliche Plastikkäfige gegeben und in Serien in den Paraffinfixierungsautomaten eingehängt.
4.8.2 Paraffinfixierung im Automaten
Die Paraffinfixierung erfolgte mittels des TP 1020 Automaten der Fa. Leica GmbH nach folgendem Protokoll:
1. 3 Std. Propanol 70 % 2. 1 Std. Propanol 80 % 3. 1 Std. Propanol 90 %
4. 1 Std. Propanol 90 % (in neuem Gefäß) 5. 1 Std. Propanol 100 %
4. Methoden
6. 1 Std. Propanol 100 % (in neuem Gefäß) 7. 1,5 Std. Propanol 100 % (in neuem Gefäß) 8. 1 Std. Xylol
9. 1,5 Std. Xylol
10. 1,5 Std. Xylol (in neuem Gefäß) 11. 2 Std. Histowax
12. 2 Std. Histowax (in neuem Gefäß)
4.8.3 Schneiden und Fixieren der Paraffinblöcke
Die fertig in Paraffin fixierten Blöcke wurden am Rotationsmikrotom RM 2245 von Fa. Leica GmbH in 1 m dicke Scheiben geschnitten und mit Hilfe eines Wärmebades auf Objektträgern fixiert und im Wärmeschrank getrocknet.
4.8.4 Schneiden und Fixieren der Kryopräparate
Die Kryopräparate wurden im Kryomikrotom CM3050S von Fa. Leica GmbH in 6 m dicke Scheiben geschnitten, auf einem Objektträger fixiert und eine Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Es erfolgte dann eine 15 minütige Fixierung mit Aceton bei 20 °C. Nach einer kurzen Trockenphase wurden die Schnitte dann mit TBS rehydriert.
4.9 Übersichtsfärbung nach Masson Goldner
1 0 , 3x 5 Minuten in Histoclear
,
3x 3 Minuten 100 % vergällter Ethanol
4. Methoden
2x 2 Minuten 96 % vergällter Ethanol 1x 1 Minute 70 % vergällter Ethanol
4,
2 Minuten Weigertlösung
15 Minuten bläuen mit Leitungswasser 30 Sekunden Massonlösung
30 Sekunden 1%ige Essigsäure 30 Sekunden PWO
30 Sekunden 1%ige Essigsäure
2 Minuten und 15 Sekunden Lichtgrün 15 Sekunden 1%ige Essigsäure
, 2x kurz 96 % vergällter Ethanol
3x 2 Minuten 100 % vergällter Ethanol
3x 2 Minuten Histoclear Histokit zum Eindecken
4. Methoden
4.10 Spezifische Immunfärbungen
Alle zu färbenden Objektträger wurden sortiert, und Kryo Schnitte auf Raumtemperatur gebracht. Ein Objektträger wurde für jede Färbung als Negativkontrolle separat behandelt und erhielt keinen ersten Antikörper.
1. Entparaffinieren der Schnitte (Paraffinschnitte in 50%igem Alkohol, Kryo Schnitte mit E Wasser)
2. 15 min. Trypsinverdau bei 37 °C, dann 15 min. bei RT
3. Waschen der Objektträger mit TBS high salt drei mal fünf Minuten 4. 10 min. mit normal donkey serum 10 % inkubieren lassen
5. Eine Stunde mit erstem Antikörper inkubieren lassen
6. Waschen der Objektträger mit TBS high salt drei mal fünf Minuten 7. Eine Stunde mit zweitem Antikörper im Dunkeln inkubieren lassen 8. Waschen der Objektträger mit TBS high salt drei mal fünf Minuten
9. Eindecken aller Träger mit Vectashield Mounting Medium with DAPI entsprechend der Herstellerangaben der Fa. Vector Laboratories
Folgende erste Antikörper wurden im Verlauf der Gewebeanalysen eingesetzt:
Rat anti Perlecan von Research Diagnostics Inc.
TGFβ1 (V): sc 146 (rabbit) von Santa Cruz Biotechnology Inc.
VEGF (a 20): sc 152 (rabbit) von Santa Cruz Biotechnology Inc.
Nephrin NPHN11 A Rabbit anti Rat von Alpha Diagnostic International Kollagen Typ III Rabbit von Fitzgerald Industries International Inc.
Goat Anti Type IV Collagen von Southern Biotechnology Associates Inc.
Fibronectin Antikörper von Fa. Paesel+Lorei
4. Methoden
Rabbit anti Mouse CTGF von Cell Sciences
Für die Markierung des ersten Antikörpers wurden fluoreszierende Cy3 Anitkörper als zweite Antikörper mit einer Affinität gegenüber rabbit , rat oder goat IgG’s verwendet.
Cy3 donkey anti rabbit IgG Cy3 donkey anti rat IgG Cy3 donkey anti goat IgG
alle von Fa. Jackson ImmunoResearch Ltd.
4.11 Semiquantitative Auswertung der Immunhistochemie
Zur semiquantitativen Auswertung der Zielproteine wurden 50 repräsentative Glomerula von zwei unabhängigen Beobachtern geblindet betrachtet. Es erfolgte eine Einstufung des Antikörperfluoreszenzsignals in drei Kategorien: stark, mittel oder schwach. Die extrazellulären Matrixmoleküle und der CTGF wurden ebenfalls geblindet ausgewertet. Es erfolgte eine Einstufung in einer willkürlichen Maßeinheit auf Grundlage der Färbungsintensität nach folgenden Kriterien: 5: >90%, 4: >70%, 3: >50%, 2: >25% und 1:
>10% positive Reaktionen. Diese Auswertung wurde für alle vier verschiedenen Tierversuchsgruppen in gleicher Weise durchgeführt. Die Ergebnisse wurden jeweils statistisch ausgewertet und graphisch dargestellt.
4.12 Bestimmung des glomerulären Volumens
Zur Bestimmung des glomerulären Volumens wurde die Software AxioVision 4.3 von Fa.
Zeiss verwendet. Die glomeruläre Fläche (AT) wurde gemessen und die durchschnittliche glomeruläre Fläche (T) errechnet. Mit der Formel VT = ß/k x (T)3/2 wurde dann ein
4. Methoden
durchschnitliches glomeruläres Volumen (VT) errechnet, wobei ß = 1,38 (Formkoeffizient für sphärische Partikel) und k = 1,1 (Partikelgrößenverteilungskoeffizient) gesetzt wurden. Das durchschnittliche glomeruläre Volumen (VT) wurde anschließend noch um den Schrumpfungsfaktor der durch die Paraffineinbettung entstanden war (durchschnittlich 48%) korrigiert.
5. Ergebnisse
5 Ergebnisse
5.1 Klinische Daten
5.1.1 Blutzucker
Die Tabelle 1 im Anhang zeigt die durchschnittlichen Blutzuckermeßwerte in mmol/l für die insgesamt vier Versuchsgruppen zum Zeitpunkt 0 (vor STZ respektive Natriumcitrat Injektion) und nach 8 Wochen Diabetesdauer. Die Blutzuckerwerte liegen zum Zeitpunkt 0 im normoglykämischen Bereich und zeigen in allen vier Tiergruppen keine signifikanten Unterschiede. Nach acht Wochen Diabetesdauer stellte sich bei den STZ injizierten WT und KO Tieren eine deutliche hyperglykämische Stoffwechsellage ein. In der diabetischen WT Gruppe fand sich ein Blutzuckerwert von 27,5 ± 7,3 mmol/l, während er in der nichtdiabetischen WT Kontrollgruppe 10,0 ± 3,5 mmol/l betrug. In der diabetischen KO Gruppe lag das Blutzuckerniveau bei 22,6 ± 3,5 mmol/l, während es in den nichtdiabetischen KO Tieren 6,5 ± 1,1 mmol/l betrug. Die Höhe des Blutzuckeranstiegs ist in beiden Gruppen hochsignifikant im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollgruppen (p<0,001).
Die vorliegenden Messergebnisse zeigen, dass eine diabetische Stoffwechsellage in beiden diabetischen Tiergruppen durch die STZ Injektion erreicht wurden, während die schein injizierten Tiere weiter normale Blutzuckerspiegel aufwiesen.
5.2 Albuminurie
Spoturinproben aller vier Versuchstiergruppen wurden mittels Album ELISA und einer Kreatininmessung zum Zeitpunkt 2 Wochen und 8 Wochen nach STZ Injektion untersucht.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind als Albumin Kreatinin Quotient in g/mol für alle
5. Ergebnisse
vier Tiergruppen in der unten angeführten Abbildung 4 dargestellt. Der Mittelwert einer jeden Meßwertspalte ist als dicker Balken dargestellt.
Nach zwei Wochen Versuchsdauer zeigten sich in den mittleren Albumin Kreatinin Quotienten noch keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Tiergruppen.
Sowohl die WT als auch die KO Tiere unterschieden sich nicht in ihrer Albuminurie. Nach acht Wochen Versuchsdauer kam es zu einem signifikanten Anstieg der Albuminurie in den
Abbildung 4: Albuminuriedaten nach zwei und nach acht Wochen Versuchsdauer, **=p<0,01
5. Ergebnisse
diabetischen WT Tieren (WT diabetisch: 36,1 ± 15,1 g/mol versus WT Kontrolle: 11,3 ± 2,3 g/mol; p<0,01). In der Gruppe der diabetischen KO Tiere zeigte sich ebenfalls ein signifikanter Anstieg der Albuminurie (PKC β/ diabetisch: 41,0 ± 30,0 g/mol versus PKC β/ Kontrolle: 10,7 ± 6,8 g/mol; p<0,01).
Diese Befunde zeigen, daß die diabetischen WT Tiere als positive Kontrollgruppe erwartungsgemäß im Verlauf ihrer diabetischen Stoffwechselstörung eine Albuminurie als erstes Zeichen eines diabetes induzierten Schadens der glomerulären Filtrationsbarriere entwickelten. Interessanterweise kam es auch in der Gruppe der diabetischen PKC β Knockout Tiere zu einem signifikanten Anstieg der Albuminurie. Der PKC β Knockout stellt damit keinen Schutz vor der Entwicklung einer Albuminuriedar.
5.3 Immunhistologie und semiquantitative Auswertung
In den weiteren Untersuchungen konzentrierten wir uns auf die Aufklärung der molekularen Mechanismen, welche zu den unterschiedlichen Ergebnissen bezüglich der Entwicklung der Albuminurie und der renalen Hypertrophie in der Gruppe der diabetischen PKC β Knockout Mäuse führte.
5.3.1 Perlecan
Dieses wesentliche Proteoglykan ist u.a. in der glomerulären Basalmembran lokalisiert und wurde mittels Cy3 Antikörperfärbung in einer immunhistochemischen Färbung von Nierengewebe dargestellt. Die Abbildung 5 zeigt eine repräsentative Darstellung für die verschiedenen Versuchsgruppen.
5. Ergebnisse
Abbildung 5: Immunhistologie eines Glomerulum mit Cy3 Antikörper Färbung von Perlecan
In den beiden oberen Abschnitten wird jeweils ein Glomerulum von nichtdiabetischen WT Tieren (linkes oberes Bild) und diabetischen WT Tieren (rechtes oberes Bild) gezeigt. Im nichtdiabetischen Glomerulum findet sich ein starkes Signal für Perlecan, während es nach acht Wochen Diabetesdauer zu einem kompletten Proteinverlust ohne immunhistochemischen Nachweis von Perlecan in den diabetischen WT Tieren kommt. Ähnliche Befunde konnten bereits früher unter diabetischen Bedingungen gezeigt werden [84].
Der untere Abschnitt zeigt jeweils ein repräsentatives Glomerulum von PKC β/ Tieren nach acht Wochen Versuchsdauer aus der nicht diabetischen Tiergruppe (unten links) und der diabetischen Gruppe (unten rechts). Die nichtdiabetischen PKC β/ Tiere zeigten ein den nichtdiabetischen WT Tieren (oben links) vergleichbar starke Anfärbung für Perlecan. Nach acht Wochen Diabetesdauer zeigt sich ebenfalls ein deutlicher Verlust des Proteoglykans Perlecan in der Gruppe der diabetischen PKC β/ Tieren. Der Ausprägungsgrad des Perlecanverlustes entspricht dabei dem der diabetischen WT Tiere.
WT
nicht diabetisch diabetisch
PKCβ
5. Ergebnisse
Es lässt sich zusammenfassen, dass es sowohl in den WT als auch in den KO Tieren zu einem diabetes induzierten Verlust von Perlecan kommt. Der PKC β Knockout schützt nicht vor dem Verlust von diesen funktionell wichtigen negativ geladenen Basalmembranproteinen.
Dies könnte einen molekularen Mechanismus für die persistierende Albuminurie in diesen diabetischen KO Tieren darstellen.
5.3.2 VEGF
Die immunhistologische Darstellung dieses endothelialen Wachstumsfaktors, welcher im Glomerulum am ehesten durch Podoyten produziert und exprimiert wird, erfolgte mittles Cy3 Antikörperfärbung.
WT
PKC β
/nicht diabetisch diabetisch
Abbildung 6A: Immunhistochemie repräsentativer Glomerula mit Cy3 Antikörperfärbung von VEGF
5. Ergebnisse
Abbildung 6B: Semiquantitative Auswertung der VEGF Expression
Die Abbildung 6A zeigt eine immunhistochemische Darstellung jeweils eines repräsentativen Glomerulum von nichtdiabetischen WT (links oben) und nicht diabetischen PKC β/ Kontrolltieren (links unten) nach acht Wochen Versuchsdauer. In den beiden genannten Gruppen fand sich ein insgesamt niedriges Expressionsniveau von VEGF, welches sich zwischen den WT und KO Tieren nicht wesentlich unterschied. Auf der rechten Seite der Abbildung 6A sind jeweils ein repräsentatives Glomerulum der beiden diabetischen Versuchsgruppen, WT Tiere (rechts oben) und PKC β/ Tiere (rechts unten) nach acht Wochen Diabetesdauer dargestellt. Unter diabetischen Stoffwechselbedingungen kam es zu einem deutlichen Anstieg des Expressionsniveau von VEGF in beiden diabetischen Versuchsgruppen (Abbildung 6A). Die Signalintensität nimmt sowohl in den diabetischen WT als auch in den KO Tieren deutlich zu, jedoch zeigt sich in den PKC β/ Tieren nur ein geringfügig niedrigerer Anstieg des Expressionsniveaus von VEGF. Eine semiquantitative
