Ein wesentliches Zytokin, welches die chronische Nierenfibrose reguliert und unter diabetischen Stoffwechselbedingungen renal stimuliert wird, stellt das profibrotische Zytokin Transforming growth factor β1 (TGF β1) dar [93]. Die immunhistochemische Darstellung erfolgte ebenfalls durch eine Cy3 Antikörperfärbung.
WT
PKCβ
nichtdiabetisch diabetisch
Abbidung 13A: Immunhistochemische Darstellung der glomerulären Expression von TGF β1 in den unterschiedlichen Versuchsgruppen
5. Ergebnisse
*p<0,05
Abbildung 13C: Quantitative PCR für TGF β1, +/+ = WT Tiere, / = KO Tiere Abbildung 13B: Semiquantitative Auswertung der TGF β1 Expression (* p<0,05)
5. Ergebnisse
WT
PKCβ
nichtdiabetisch diabetisch
Abbildung 14A: Immunhistochemie repräsentativer Glomerula mit Cy3 Antikörperfärbung von CTGF
Abbildung 14B: Semiquantitative Auswertung der Expression von CTGF
In der Abbildung 13A ist die immunhistochemische TGF β1 Färbung jeweils eines repräsentativen Glomerulums nach acht Wochen Versuchsdauer dargestellt. In der linken Spalte sind wiederum die nichtdiabetischen WT (links oben) und die nichtdiabetischen PKC
5. Ergebnisse
β/ Tiere (links unten) dargestellt. In beiden Tiergruppen sieht man nur ein geringes Expressionsniveau für TGF β1 unter nichtdiabetischen Bedingungen. In der rechten Spalte ist jeweils ein repräsentatives Glomerulum der diabetischen WT (rechts oben) und PKC β/ Tiere (rechts unten) dargestellt. Die Abbildung 13A zeigt eine verminderte glomeruläre Expression von TGF β1 in den diabetischen PKC β/ Tieren gegenüber diabetischen WT Tieren, welche sich auch in der semiquantitaiven Auswertung (Abbildung 13B) findet. Zur Bestätigung dieser semiquantitativen Daten führten wir in Ergänzung eine quantitative PCR durch, deren Ergebnisse in der oben angeführten graphischen Darstellung (Abbildung 13C) gezeigt sind. Es zeigte sich eine signifikant verminderte Expression von TGF β1 RNA in diabetischen PKC β/ Tieren im Vergleich zu diabetischen WT Tieren (p<0,05), welche die PKC β abhängige Regulation von TGF β1 unter diabetischen Stoffwechselbedingungen unterlegt.
Da in vorhergehenden Untersuchungen auch ein Einfluss des connective tissue growth factors (CTGF) auf die Nierenfibrose nachgewiesen wurde untersuchten wir dieses Zytokin in einer weiteren Färbung [84]. In der Abbildung 14A sind in der linken Spalte repräsentative Glomerula der nicht diabetischen WT und PKC β/ Tiere dargestellt. Bei beiden nicht diabetischen Tiergruppen findet sich hier nur eine minimale CTGF Expression. In der rechten oberen Ecke der Abbildung 14A ist ein repräsentatives Glomerulum der diabetischen WT Tiere dargestellt. Deutlich ist die starke CTGF Expression zu erkennen. Im Unterschied hierzu ist in der rechten unteren Ecke ein Glomerulum der diabetischen PKC β/ Tiere dargestellt, bei welchem die CTGF Expression deutlich geringer ist. Die semiquantitative Auswertung der Färbung für CTGF in Abbildung 14B unterstreicht noch einmal deutlich, dass die PKC β/ Tiere vor der Expression des profibrotischen Zytokins CTGF geschützt sind.
In der Zusammenfassung lässt sich festhalten, dass die Deletion von PKC β in diesem diabetischen Knockout Modell zu einer verminderten Expression des profibrotischen
5. Ergebnisse
Zytokins TGF β1 und einer Protektion vor fibrotischen Nierenveränderungen und renaler Hypertrophie führen kann. Interessanterweise kommt es jedoch trotz dieser nachgewiesenen Protektion zu der Entwicklung einer Albuminurie unter chronischen diabetischen Stoffwechselstörungen auch in PKC β/ Mäusen.
6. Diskussion
6 Diskussion
In der vorliegenden Studie konnten wir zeigen, daß die Deletion von PKC β nicht gegenüber funktionellen und strukturellen Veränderungen der glomerulären Filtrationsbarriere mit Entwicklung einer Albuminurie im STZ induzierten, diabetischen Knock out Modell schützt, wie bereits früher für die Deletion von PKC α gezeigt [84]. Interessanterweise zeigte sich jedoch eine signifikant verminderte TGF β1 induzierte renale Hypertrophie und Fibrose in den diabetischen PKC β/ Tieren. Diese und andere Studienergebnisse aus unserer Arbeitsgruppe lassen erkennen, daß eine PKC Isoformspezifität bezüglich der Entwicklung einer diabetischen Nephropathie existiert. Die beiden wesentlichen pathophysiologischen diabetischen Nierenschädigungen, nämlich renale Hypertrophie und Albuminurie, werden durch eine Aktivierung unterschiedlicher PKC Isoform spezifischer Signaltransduktionskasakdenreguliert.
Wir untersuchten in der vorliegenden Studie die funktionelle Bedeutung der PKC β Isoform in der Entwicklung einer diabetischen Nephropathie im Streptozotocin induzierten Mausmodell von PKC β spezifischen Knockout Mäusen im Vergleich zu entsprechenden SV129 Wildtyp Mäusen. Aufgrund früherer Studienergebnissen aus unterschiedlichen undUntersuchungen wurde eine funktionelle Bedeutung einzelner PKC Isoforme in der Entwicklung diabetischer mikrovaskulärer Komplikationen wie der diabetischen Nephropathie postuliert [37, 39, 93 95]. Die funktionelle Bedeutung der einzelnen PKC Isoformen ist jedoch weiter unklar, da verschiedene und Studien zum Teil widersprüchliche Ergebnisse zeigten [93]. Die allgemeine Aktivierung von PKC Isoformenα, βI, βII, δ, ε und ζ wurde in diversen Zellkultur und Tiermodellen durch verschiedene Untersucher gezeigt [41, 42, 96 101]. Durch Immunoblotting und Fluoreszenzmarkierung von PKC Isoformen konnten mehrere Forschungsgruppen unabhängig voneinander zeigen, dass verschiedene PKC Isoforme einem glukose abhängigen Expressions und Aktivierungsmuster
6. Diskussion
durch Translokation an verschiedene Zellmembranen unterliegen [38, 39, 42, 43]. Die Arbeitsgruppe Haller konnte u.a. zeigen, daß es unter diabetischen Stoffwechselbedingungen zu einer gesteigerten Expression und Aktivierung der PKC α Isoform in den Glomeruli, den interstitiellen Kapillaren und in den Endothelzellen großer Arterien kommt [102]. Diverse Forschergruppen haben über die Jahre die Funktion der unterschiedlichen PKC Isoformen mit Hilfe moderner molekularbiologischer Techniken untersucht. Innovative Verfahren, wie isoform spezifische cDNAs (Wildtyp, konstitutiv aktive und dominant negative Formen), Antisense Oligonukleotide, PKC β spezifische Inhibitoren, transgene Mäuse und Knockout Mäuse kamen bisher zum Einsatz [37, 97, 103]. PKC Isoform spezifische Knock out Mausmodelle bieten nun die interessante Möglichkeit die Funktion einzelner PKC Isoforme isoliert in einem intakten Organismus und bei einem bestimmten Krankheitszustand isoliert zu untersuchen [104].
Unterschiedliche PKC Isoformen regulieren wahrscheinlich verschiedene essentielle intrazelluläre Signaltransduktionswege in Bezug auf Proliferation, Differenzierung, Metabolismus und andere zellspezifische Funktionen [37, 97, 103]. Bekannterweise kodiert ein einzelner Genlocus für zwei unterschiedliche PKC β Isoformen (PKC βI und PKC βII), welche durch alternatives Splicing am C terminalen Exon entstehen [36]. Die funktionelle Bedeutung dieser Splicevarianten bleibt jedoch derzeit ebenso unklar wie die einzelner PKC Isoformen. Ganz et al. berichteten zum Beispiel, dass die PKC βII Splicevariante in humanen Nierenbiopsien von Patienten mit proliferativer Glomerulonephritis vermehrt exprimiert wird, welche über eine Schlüsselrolle von PKC βII bei humanen (proliferativen) Nierenerkrankungen spekulieren läßt [105]. Redling et al. konnten vor kurzem nachweisen, dass einzig die PKC Isoformen α, βI und ε in Glomeruli von Mäusenieren exprimiert werden [106, 107]. In Rattennieren fand dieselbe Arbeitsgruppe ebenfalls spezifische Expressionsmuster einzelner PKC Isoformen, was auf eine unterschiedliche PKC Expression in den verschiedenen Nierenanteilen hinweist. In der Zusammenschau dieser
6. Diskussion
Studienergebnisse zeigt sich, dass die zelltypspezifische Expression von PKC Isoformen eine Schlüsselstellung in der funktionellen Rolle des PKC Signaltransduktionsweges einnimmt.
Die erhöhte Expression und Aktivierung der PKC βII Isoform in Aorta, Herz und Glomeruli bei diabetischen Ratten veranlasste King et al. bereits Anfang der 90iger Jahre zu der Hypothese, daß die PKC β Isoform in der Entwicklung diabetischer mikrovaskulärer Komplikationen beteiligt sei [33]. Mit der Entwicklung des PKC β Isoform spezifischen Inhibitors Ruboxistaurin® (LY333531), welcher über eine ca. 100fach höhere Affinität gegenüber der PKC β Isoform verfügt [78], wurden pharmakologische Studien zur PKC Isoformspezifität möglich. King et al. berichtete, dass Ruboxistaurin® (LY333531) die glomeruläre PKC Aktivität inhibiert und die Albuminurie in verschiedenen Tiermodellen dosisabhängig reduziert (IC50 4,7 und 5,9 nM für die PKC βI bzw. PKC βII Splicevariante) [33, 39, 78, 94, 95]. Weiterhin konnten Kelly et al. an einem hypertensiven diabetischen (mRen 2)27 Rattenmodell zeigen, dass die Inhibition der PKC β Isoform durch Ruboxistaurin® (LY333531) sowohl die renale Expression von TGF β1 als auch die Entwicklung von strukturellen Nierenschäden und einer Albuminurie trotz persitierender arterieller Hypertonie und diabetischer Stoffwechsellage vermindern kann [95]. Die offensichtlichen Widersprüche dieser tierexperimentellen pharmakologischen Interventionsstudien zu den vorliegenden Untersuchungsergebnissen bezüglich der Albuminuriedaten liegen am ehesten in einer, vermutlich dosisabhängigen unspezifischen Aktivität des PKC Inhibitors Ruboxistaurin® und/oder einer Redundanz der verschiedenen PKC Isoformen in dem jeweiligen Knock out Modell begründet.
Interessanterweise konnte kürzlich in einer ersten klinischen Pilotstudie die tierexperimentellen Studiendaten von Tuttle et al. auch am Menschen überprüft werden [108].
Eine medikamentöse Therapie mit Ruboxistaurin® (LY333531) (32 mg/Tag p.o.) bei gleichzeitiger Gabe eines Renin Angiotensin Inhibitors über einen Versuchszeitraum von einem Jahr zeigte bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und beginnender Nephropathie
6. Diskussion
keinen signifikanten Vorteil gegenüber einer vergleichbaren Kontrollgruppe unter medikamentöser Behandlung mit Placebo und Renin Angiotensin Inhibitoren [108]. Die Studienergebnisse unserer vorliegenden Arbeit unterstützen diese Aussagen, welche jedoch in Widerspruch zu den früheren Aussagen aus den tierexperimentellen Inhibitorstudien stehen.
Eine spezifische Rolle der PKC β Isoform in der Entwicklung einer Albuminurie konnte in der vorliegenden Untersuchung am STZ induzierten PKC β Knock out Modell sicher ausgeschlossen werden. Erst kürzlich präsentierte auch die Arbeitsgruppe von King et al.
Ergebnisse einer eigenen tierexperimentellen Studie an diabetischen PKC β/ Mäusen, welche ebenfalls eine persistierende Albuminurie bei diabetischen PKC β/ Mäusen zeigen konnte und die im Rahmen unserer Studie erhobenen Ergebnisse untermauert [109]. Als eine mögliche Erklärung für die persistierende Albuminurie wurde von King et al. angeführt, dass die Deletion der PKC β Isoform durch eine verminderte Expression von NADPH Oxidase Komplexen die diabetische Nierenschädigung vermindert [109]. Eine unspezifische, möglicherweise dosisabhängige, Wirkung von Ruboxistaurin® (LY333531) oder zellspezifische Effekte in der diabetischen Niere sind jedoch ebenfalls nicht sicher auszuschließen [42, 91, 103, 110].
Die bisherigen Studienergebnisse stammen ausschließlich von pharmakologischen Interventionsstudien mit Ruboxistaurin® (LY333531) [39, 78, 94]. Im Gegensatz zu diesen pharmakologischen Studien konnte in unserer Arbeit eine Schädigung der glomerulären Filtrationsbarriere mit Entwicklung einer Albuminurie durch die Deletion des PKC β Gens nicht verhindert werden. Unsere Arbeitsgruppe hat jedoch bereits in früheren Arbeiten einen entsprechenden protektiven Effekt von diabetischen PKC α/ Mäusen berichtet, wobei die Deletion von PKC α vor der Entwicklung einer Albuminurie durch die Verhinderung eines Verlusts von negativ geladenen Heparansulfaten und/oder des Schlitzmembranproteins Nephrin führt [84, 90].
6. Diskussion
Bezugnehmend auf die Steno Hypothese, welche den Verlust von negativ geladenen Heparansulfatproteoglykanen wie Perlecan in der glomerulären Basalmembran als Ursache für den Zusammbruch der renalen Filtrationsbarriere und Entwicklung einer Albuminurie bei Diabetes mellitus postuliert [111, 112], konnten wir in einer tierexperimentellen Studie feststellen, daß die diabetischen PKC α/ Tiere vor einem Perlecanverlust geschützt sind [84].
Einen wichtigen pathophysiologischen Einfluss des PKC Signaltransduktionsweges auf die Regulation von Perlecan war bereits früher durch Templeton et al. gezeigt worden [113]. Die vorliegende Arbeit am STZ induzierten Diabetesmodell bei unseren PKC β/ Tieren konnte keine Prävention des Perlecanverlustes zeigen, welches erstmals einen funktionellen Unterschied zwischen diesen beiden wichtigen klassischen PKC Isoformenbeweist.
In der oben angeführten tierexperimentellen Studie konnten wir ferner zeigen, daß der PKC α Signaltransduktionsweg ebenfalls eine wichtige Rolle für die Regulation von glomerulärem VEGF und dessen Rezeptor spielt [90]. VEGF ist ein Zytokin, welches neben einer Regulation der endothelialen Permeabilität und der endothelabhängigen Vasodilatation auch die Angiogenese mitbeeinflusst [85, 87]. Die spezifische Blockade von VEGF durch systemische Antikörpergabe führte im Tierversuch zu einer verminderten Albuminurie bei STZ induzierten diabetischen Mäusen oder diabetischen db/db Mäusen [86, 88]. In unserer früheren Studie konnten wir zeigen, dass STZ induzierte diabetische PKC α/ Tiere vor einer vermehrten Expression von VEGF und seines Rezeptors flt 1 geschützt sind [84]. Die Ergebnisse der aktuellen Studie an diabetischen PKC β/ Tieren zeigen demgegenüber deutlich, dass die PKC β Isoform nicht an der glomerulären Regulation von VEGF beteiligt ist und somit auch keine Prävention einer Albuminurie auftritt wie es von anderen Autoren früher postuliert wurde[39, 94, 95].
Ein weiterer wesentlicher Unterschied in der Rolle der beiden klassischen PKC Isoformen α und β besteht in der Regulation des podozytären Schlitzmembranproteins Nephrin, dessen Deletion zur Ausbildung eines nephrotischen Syndroms vom finnischen Typ führt [89,
6. Diskussion
114]. Frühere Studiendaten aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass diabetische PKC α/ Tiere ebenfalls vor dem Verlust von Nephrin geschützt sind [90]. Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus besteht in einer PKC α abhängigen Downregulation des Nephrinpomoters Wilms` Tumor Supressor 1 (WT 1) [90]. Die aktuellen Daten der vorliegenden Studie am diabetischen PKC β/ Mausmodell können einen vergleichbaren Effekt der PKC β Isoform auf die Expression von Nephrin jedoch nicht zeigen, so daß dieses für die funktionelle Regulation der podozytären Schlitzmembran essentielle Molekül allein über eine PKC α Isoform abhängige Signaltransduktionskaskade reguliert wird.
Die bisherigen Studienergebnisse aus dem diabetischen PKC β/ Mausmodell zeigen demnach, daß, im Gegensatz zur PKC α Isoform, der PKC β Signaltransduktionsweg keinen funktionellen Einfluss auf die drei verschiedenen Kompartimente der glomerulären Filtrationsbarriere – das Endothel (VEGF), die negativ geladene glomeruläre Basalmembran (Heparansulfatproteoglykan Perlecan) und die podozytäre Schlitzmembran (Nephrin), ausübt.
Wir konnten jedoch in der vorliegenden Studie feststellen, dass die Deletion der PKC β Isoform einen präventiven Effekt auf die Entwicklung einer TGF β1 induzierten renalen Hypertrophie und Fibrose am STZ induzierten Diabetesmodell besitzt. Einen entsprechenden protektiven Effekt konnten wir in den diabetischen PKC α/ Mäusen nicht nachweisen [84, 90], so daß die beiden klassischen PKC Isoforme α und β zwei pathophysiologisch wichtige Veränderungen an der diabetischen Niere, die Albuminurie und die renale Hypertrophie, selektiv und isoform spezifischregulieren.
Eine zentrale Rolle von TGF β1 in der Entwicklung einer chronischen Nierenfibrose bei Diabetes mellitus konnte bereits Mitte der neunziger Jahre durch die Arbeitsgruppe von Ziyadeh et al. in mehreren Studien gezeigt werden [115]. In den vorliegenden Daten ist deutlich zu erkennen, dass durch die Deletion von PKC β die glomeruläre Filtrationsbarriere, trotz eindeutiger Hemmung von TGF β1, unter diabetischen Bedingungen zusammenbricht und eine Albuminurie entsteht. Diese isoformspezifischen Unterschiede in der Regulation
6. Diskussion
diabetischer Nierenschäden, nämlich der renalen Hypertrophie und Fibrose und der Albuminurie, werden bestätigt durch Studienergebnisse von Ziyadeh et al., der ebenfalls zeigen konnte, dass eine Langzeithemmung von TGF β1 mit spezifischen Antikörpern im db/db Mausmodell zu einer verminderten mesangialen Hypertrophie und renalen Fibrose führt, während die Albuminurie hiervon unbeeinflusst blieb [92].
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beiden wichtigen pathophysiologischen Vorgänge der diabetischen Nephropathie, Albuminurie sowie renale Hypertrophie und Fibrose, über zwei unterschiedliche PKC Isoform selektive Signalwege reguliert werden. Die PKC α Isoform vermittelt durch eine Störung der glomerulären Filtrationsmembran eine Albuminurie, insbesondere durch einen Verlust von Nephrin und Perlecan sowie eine vermehrte glomeruläre Expression von VEGF und seines Rezeptors flt 1.
Die PKC β Isoform hingegen reguliert über TGF β1 die Ausbildung von extrazellulären Matrixmolekülen. Durch vermehrte Bildung von Fibronectin und Kollagen kommt es zur diabetischen Nierenhypertrophie und –fibrose, welche in diabetischen PKC β/ Tieren deutlich vermindert werden kann. Eine schematische Darstellung der PKC abhängigen molekularen Mechanismen bei diabetischer Nephropathie ist in der unten angeführten Abbildung 15 zusammengefasst.
6. Diskussion
Abbildung 15: Isoformspezifische Regulationswege der PKC bei diabetischer Nephropathie
Für neue pharmakologischen Ansätze zur Behandlung der diabetischen Nephropathie sollte möglicherweise eine duale Blockade der beiden klassischen PKC Isoformen, PKC α und PKC β, angestrebt werden. Weitere tierexperimentelle Studien unter anderem unter
Hyperglykämie
TGF β
Glomerulosklerose
diabetische Nephropathie
Kollagen III, Fibronectin
PR0TEIN KINASE C
PKCα PKCβ
Proteinurie VEGF/VEGF R
Nephrin
HPSG
(Perlecan)
6. Diskussion
Verwendung einer Doppel Knock out Mutante für PKC α und PKC β erscheint in Anbetracht möglicher zellulärer Toxizität sinnvoll und ist in der Zukunft durch unsere Arbeitsgruppe geplant.
8. Literaturverzeichnis
7 Zusammenfassung
Eine Aktivierung der intrazellulären Serin Threonin Kinasen Protein Kinase C (PKC) stellt einen wichtigen pathobiochemischen Mechnismus in der Entwicklung diabetischer Mikroangiopathien dar. King et al. formulierten aufgrund pharmakologischer Studien mit dem PKC β spezifischen Inhibitor Ruboxistaurin® (LY333531) als erste die Hypothese, dass die Aktivierung der PKC β Isoform für die pathologischen Veränderungen an der diabetischen Niere verantwortlich ist. Wir untersuchten deshalb die funktionelle Bedeutung der PKC β Isoform in der Entwicklung einer diabetischen Nephropathie im Streptozotocin induzierten Mausmodell von PKC β spezifischen Knockout Mäusen im Vergleich zu entsprechenden SV129 Wildtyp Mäusen.
Nach acht Wochen Diabetesdauer zeigte sich eine verminderte renale Hypertrophie und eine geringere extrazelluläre Matrixbildung von Fibronectin und Kollagenen bei den diabetischen PKC β/ Tieren. Die weitere molekulare Analyse zeigte eine signifikant niedrigere TGF β1 Expression durch die Deletion des PKC β Gens. Interessanterweise ließ sich eine vermehrte Albuminurie jedoch trotz der Prävention der renalen Hypertrophie in beiden diabetischen Tierstämmen nachweisen. Die Untersuchung des Basalmembran Proteoglycans Perlecan, des Schlitzmembranproteins Nephrin sowie des endothelialen Wachstumsfaktors VEGF zeigten keine Unterschiede zwischen den diabetischen WT und den PKC β/ Tieren. Nephrin und Perlecan waren nach acht Wochen Diabetesdauer kaum mehr nachzuweisen, wohingegen VEGF verstärkt exprimiert wurde.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine diabetes induzierte PKC β Aktivierung eine TGF β1 renale Hypertrophie und –fibrose regulativ vermittelt, jedoch keinen Einfluss auf die Entwicklung einer diabetischen Albuminurie hat.
8. Literaturverzeichnis
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